JP2018138036A - 癌のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】子宮頸癌のスクリーニング方法の提供。【解決手段】被検者から得られたサンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ（１）と、標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、サンプルが子宮頸癌又は子宮頸部の前癌病変を有すると判定するステップ（２）とを含むスクリーニング方法。【選択図】なし
Description
本発明は癌のスクリーニング方法に関する。
子宮頸癌は全世界及び台湾人女性の主な死因の一つであり、２００２年世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によると、子宮頸癌は全世界の女性の癌による死因の第２位で、乳癌の次となる。定期的に子宮頸癌スクリーニング検査を受けることは子宮頸癌を予防する最適な方法であり、従来の子宮頸癌スクリーニング方法は主に下記２種類で、その一つは最もよく行われる子宮頸部細胞診（Ｐａｐ ｓｍｅａｒ）で、もう一つはヒトパピローマウイルス検査（ＨＰＶ ｔｅｓｔｉｎｇ）である。子宮頸部細胞診とは、子宮頸癌を早期に検出するために、子宮頸部の分泌物を採取し、顕微鏡でその中の脱落した上皮細胞に癌病変が発生しているか否かを観察することであり、ＨＰＶ検査とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）又はハイブリッドキャプチャー法（Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ）により検体にヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）が存在するか否かを検出することである。
しかしながら、子宮頸部細胞診（Ｐａｐ ｓｍｅａｒ）では、医師が検体を採取すると共に臨床検査技師／病理医が塗抹標本を判読しなければならず、偽陰性率（Ｈｉｇｈ ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒａｔｅ）が高くなりやすいため前癌病変の診断及び治療が遅延する他、さらに、必要な人材レベルやコストが高すぎて、多くの発展途上国において普及しにくいと考えられる。一方、ヒトパピローマウイルス検査（ＨＰＶ ｔｅｓｔｉｎｇ）は高感度で検出することができるが、偽陽性率（Ｈｉｇｈ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ）が高くなりやすいため、患者に余計な心配を与えるだけでなく、多くの医療資源が偽陽性患者のフォローアップ検査に無駄に使用される。そのため、子宮頸癌検診方法の正確性及び利便性を向上することが、子宮頸癌検診を普及するための重要な課題の一つとなっている。
遺伝子欠失（ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）は腫瘍を形成する重要な要因と考えられてきた。昔から、我々はゲノムにおけるコードがＡＴＣＧの四つの塩基配列に依存するとの観念に慣れており、Ｋｎｕｄｓｏｎは１９７５年初めて二段侵襲説（ｔｗｏ−ｈｉｔ ｔｈｅｏｒｙ）を提出し、一部の同種腫瘍の抑制遺伝子に伴う突然変異又は欠失が発癌又は発癌させやすい可能性があると指摘している。しかしながら、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に影響を与えるその他の情報は、修飾された塩基５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）に存在する可能性があり、哺乳動物細胞における回文配列５’−ＣｐＧ−３’に５−メチルシトシンが存在することが発見された。哺乳動物細胞における「ＣｐＧアイランド」（ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ、ＣＧＩｓ）と呼ばれる領域以外のほとんどのＣｐＧジヌクレオチド対はメチル化されている。ＣｐＧアイランドとは、約１０００個の塩基対（１Ｋｂ）の領域に大量のＧＣ−及びＣｐＧ−を含むものを指し、一般的に遺伝子の近傍に位置し、幅広く表現されている遺伝子のプロモーターの近傍にて発見されている。シトシンのメチル化はＤＮＡの合成後に発生し、メチル基供与体であるｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）のメチル基が酵素によりシトシンの５位の炭素に転移される。この酵素反応はＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＤＮＭＴｓ）により触媒されている。ＤＮＭＴ１は、哺乳類動物の主なメチル基転移酵素であり、ヘミメチル化の位置を複製してフルメチル化に修復する（ｐｏｓｔ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）役割を果たすもので、維持メチル化（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる。逆の場合では、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂが、主に新たな位置に対するメチル化を行って、いわゆるデノボメチル化（ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を実行すると考えられる。
ＣｐＧジヌクレオチド対におけるメチル化欠損（ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、一般的に低メチル化を意味し、癌細胞内の一番目のエピジェネティックな異常（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）であるが、過去数年間の研究によると、部位特異的（例えば、一部の腫瘍抑制遺伝子）な高メチル化（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）がその機能の喪失に関係しており、癌形成時に選択的優位性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ）を付与する可能性がある。プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの高メチル化は、ヒストン修飾（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に伴う遺伝子抑制現象（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によって、クロマチン再構成（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を誘導することができる。染色体欠失及び遺伝子突然変異以外に、プロモーターの高メチル化による腫瘍抑制遺伝子のエピジェネティックな抑制現象（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）もヒト癌においてよく見られる。
最近の疫学における研究によれば、血清葉酸（ｓｅｒｕｍ ｆｏｌａｔｅ、メチル基の主要発生源）の濃度はＨＰＶの感染及び消失と関係が有り、メチルサイクル（ｍｅｔｈｙｌ ｃｙｃｌｅ）の代謝作用において、酵素の遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）も子宮頸部上皮内病変の進展に関わると報告されたことがあり、超遺伝子進化の観念と同じように、ＤＮＡメチル化と子宮頸癌との関連性研究も同様に広く行われている。子宮頸癌のＤＮＡメチル化に対する研究は日々増えており、子宮頸癌のスクリーニング検査としてメチル化の利用可能性が提案されている。遺伝と環境との相互作用の特性により、腫瘍抑制遺伝子のメチル化レベルは遺伝子及び個体群によって異なり、疾患が異なれば異なるメチル化形質（ｍｅｔｈｙｌａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）を有する可能性がある。しかし、子宮頸癌のメチル化形質及びメチル化形質とＨＰＶ遺伝子型との関連性は未知のものであり、子宮頸癌においてどの遺伝子がメチル化されるか、臨床応用の要求を満たすにはどれぐらいの遺伝子が必要なのか、これらの問題は依然として将来確かめる必要のある課題である。
要するに、上記従来の子宮頸癌のスクリーニング方法は依然として多くの欠陥があり、決して好適な設計ではなく、改善しなければならない。
本願の発明者は、以前既に中国台湾（台湾特許公開公報第２００８３１９００号、台湾特許公開公報第２０１０３８７３９号）、中国大陸（中国特許出願第２００８１００９４６５９．２号、中国特許出願第２００９１０１３５５０１．Ｘ号）、マレーシア（ＵＩ２００８５３５４）及び米国（米国特許公開公報第２００８０３１１５７０号、米国特許公開公報第２０１１００４５４６５号）にて、かかる特許出願（以下、前願という）を行っている。本願の癌のスクリーニング方法は、前願を展開したものであり、本願の発明者は新規癌のスクリーニングの生物指標及びそのスクリーニング方法を見つけている。
本発明の目的は、子宮頸癌の一次スクリーニング（ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）として、子宮頸癌のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の別の目的は、子宮頸癌の一次スクリーニングとすることができる他、子宮頸癌の二次スクリーニングとすることもでき、ヒトパピローマウイルス検査（ＨＰＶ ｔｅｓｔｉｎｇ）又は不確定な細胞診結果を補助し、より正確な子宮頸癌のスクリーニング効果を達成する子宮頸癌のスクリーニング方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、子宮頸癌の検出に応用することができるほか、その他の癌（例えば：卵巣癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮内膜癌及び肉腫）の検出にも応用することができ、よって異常検体の判定を補助する癌のスクリーニング方法を提供することである。
上記発明の目的を達成するため、被検体細胞における標的遺伝子のメチル化状態を癌の有無のスクリーニング指標として検出する癌のスクリーニング方法であって、被検体を提供するステップ１と、前記被検体のゲノムＤＮＡにおけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９から選択された少なくとも一つの標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ２と、前記標的遺伝子のメチル化状態の存否に基づき、前記検体が癌又は前癌病変を有するか否かを判定又は治療予後の指標とするステップ３と、を含む。
前記被検体はパパニコロウ塗抹標本、卵巣癌組織、腹水、血液、尿、便、喀痰、口腔粘膜細胞、胃液、胆汁、子宮頸部上皮細胞、又は手術後の癌組織などである。
前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、ＭＳＰ）、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、ＱＭＳＰ）、バイサルファイトシーケンス（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＢＳ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＤＨＰＬＣ）などを含むがそれに限定されない。
前記標的遺伝子ＡＤＲＡ１ＤはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＡＪＡＰ１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＨＳ３ＳＴ２はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＭＡＧＩ２はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４に示すヌクレオチド配列を有する
前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ２はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＰＴＧＤＲはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＳＯＸ１７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＳＹＴ９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９に示すヌクレオチド配列を有する。
前記標的遺伝子ＡＤＲＡ１Ｄのメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０−１１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＡＪＡＰ１のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２−１３に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＨＳ３ＳＴ２のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４−１５に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＭＡＧＩ２のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６−１７に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ２のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８−１９に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＰＴＧＤＲのメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２−２３に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＳＯＸ１７のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２４−２５に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記標的遺伝子ＳＹＴ９のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６−２７に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものである。
前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含む。
また、前記スクリーニング指標及びスクリーニング方法は、さらに子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮内膜癌又は肉腫のスクリーニングに応用することができる。
用語「被検体」とはインビトロでの検出用検体を指し、前記検体は前記パパニコロウ塗抹標本、腹水、血液、尿、便、喀痰、口腔粘膜細胞、胃液、胆汁、子宮頸部上皮細胞、又は手術後の癌組織などのインビトロ検体サンプルを含む。本発明の癌のスクリーニング方法は、これらのインビトロ検体における標的遺伝子のメチル化状態を各種類の癌のスクリーニング指標として検出することである。本発明により提供される癌のスクリーニング方法及びそのスクリーニング指標は、スクリーニング研究者が試験室で検出を行うのに用いられる。
用語「指標遺伝子」とはＣｐＧ配列がメチル化された標的遺伝子を指し、被検体細胞における標的遺伝子のメチル化状態を癌の有無のスクリーニング指標として検出する。
本発明により提供される癌のスクリーニング方法は、前記従来技術と比べ、さらに下記利点を有する。
１．本発明により提供される癌のスクリーニング方法は、インビトロ検体における特定遺伝子のメチル化レベルを癌の有無のスクリーニング指標とし、従来のパパニコロウ塗抹標本及びヒトパピローマウイルス検査（ＨＰＶ ｔｅｓｔｉｎｇ）方法と比べ、本発明における癌のスクリーニング方法の感度及び特異性はいずれも前記両者より高い。
２．本発明により提供される癌のスクリーニング方法は、子宮頸癌の検出に応用するほか、その他の癌（例えば：卵巣癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮内膜癌及び肉腫）の検出にも応用することができ、これにより異常検体の判定を補助する。
以下、本発明について、実施例によりさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を説明するために挙げられた例に過ぎず、本発明の実施を限定するものではない。
実施例１ 材料及び方法
１．材料
試験材料は、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＳＣＣ）および腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡＣ）を含む子宮頸部病変の検体と、正常な子宮頸部の検体とを含むものである。子宮頸部検体（ＳＣＣ＋ＡＣ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝２０）、卵巣検体（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｏｖａｒｙ、ｎ＝１９、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１４）、大腸検体（Ｃａ ｏｆ ｃｏｌｏｎ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１８）、肝臓組織検体（ＨＣＣ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１８）、口腔検体（ｏｒａｌ Ｃａ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１９）、子宮内膜癌検体（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｃａ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝２０）、乳房組織検体（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ、ｎ＝１７、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１７）、肉腫検体（ｓａｒｃｏｍａ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１６）はすべて台北三軍総病院から採取した。各検体のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）はＱＩＡａｍｐ ＤＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出し、その後Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＤＮＡ修飾キット（ＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）によりバイサルファイト処理を行い、全ゲノムにおけるＤＮＡメチル化状態を比較解析している。
１．材料
試験材料は、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＳＣＣ）および腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡＣ）を含む子宮頸部病変の検体と、正常な子宮頸部の検体とを含むものである。子宮頸部検体（ＳＣＣ＋ＡＣ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝２０）、卵巣検体（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｏｖａｒｙ、ｎ＝１９、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１４）、大腸検体（Ｃａ ｏｆ ｃｏｌｏｎ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１８）、肝臓組織検体（ＨＣＣ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１８）、口腔検体（ｏｒａｌ Ｃａ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１９）、子宮内膜癌検体（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｃａ、ｎ＝２０、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝２０）、乳房組織検体（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ、ｎ＝１７、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１７）、肉腫検体（ｓａｒｃｏｍａ、ｎ＝１８、ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝１６）はすべて台北三軍総病院から採取した。各検体のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）はＱＩＡａｍｐ ＤＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出し、その後Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＤＮＡ修飾キット（ＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）によりバイサルファイト処理を行い、全ゲノムにおけるＤＮＡメチル化状態を比較解析している。
２．全ゲノムのメチル化チップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７ ＢｅａｄＣｈｉｐ）を用いてＤＮＡメチル化解析を行う。
癌組織検体と正常な組織検体からそれぞれＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、等濃度（ｎｇ／μｌ）に調整した。それぞれ等濃度とされた癌組織検体ＤＮＡ又は正常な組織細胞検体ＤＮＡをそれぞれ２グループの検出用検体に混合し、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７メチル化チップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により全ゲノムのメチル化レベルを解析した。実験手順はメーカーの取扱説明書に従って行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップスキャナー（Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）及びＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりチップにおける各遺伝子のメチル化レベルを解析する。
癌組織検体と正常な組織検体からそれぞれＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、等濃度（ｎｇ／μｌ）に調整した。それぞれ等濃度とされた癌組織検体ＤＮＡ又は正常な組織細胞検体ＤＮＡをそれぞれ２グループの検出用検体に混合し、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７メチル化チップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により全ゲノムのメチル化レベルを解析した。実験手順はメーカーの取扱説明書に従って行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップスキャナー（Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）及びＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりチップにおける各遺伝子のメチル化レベルを解析する。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７メチル化チップは、１４，４７５個の遺伝子を含み、これらの遺伝子における合計２７，５７８個のＣｐＧサイトのメチル化レベルを検出することができる。ＣｐＧサイトのメチル化レベルに対する解析は、「β値」（β ｖａｌｕｅｓ）の数値により表現される。各ＣｐＧサイトのβ値は０と１の間の値で示され、０は非メチル化を示し、１は１００％のメチル化を示している。
３．バイサルファイト処理（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、ｑＭＳＰ）及びパイロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＤＮＡ修飾キット（ＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を使用してバイサルファイト処理を行う。検体として１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を取り出し、亜硫酸水素ナトリウムでゲノムＤＮＡに対する化学修飾を行った。単鎖ＤＮＡにおいて、非メチル化シトシンはすべて脱アミノ化反応を起こしてウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは修飾されず、５−メチルシトシンの状態を維持する。最後に、反応後の検体ＤＮＡを５５℃のＴＥ緩衝液（ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）７０μｌに溶解し、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行う。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＤＮＡ修飾キット（ＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を使用してバイサルファイト処理を行う。検体として１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を取り出し、亜硫酸水素ナトリウムでゲノムＤＮＡに対する化学修飾を行った。単鎖ＤＮＡにおいて、非メチル化シトシンはすべて脱アミノ化反応を起こしてウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは修飾されず、５−メチルシトシンの状態を維持する。最後に、反応後の検体ＤＮＡを５５℃のＴＥ緩衝液（ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）７０μｌに溶解し、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行う。
また、ヒト末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）の正常なＤＮＡを取ってバイサルファイト処理を行い、非メチル化プロモーター配列を有する対照群とする。
バイサルファイト処理後の１μｇの検体ゲノムＤＮＡ及び対照群ＤＮＡを取り出し、ｑＭＳＰプライマーとプローブで定量的メチル化特異的ＰＣＲ解析を行った。このｑＭＳＰプライマーとプローブは特異的にメチル化遺伝子配列を認識するものであり、各標的遺伝子のｑＭＳＰプライマーとプローブの配列は表１に示す通りである。定量的メチル化特異的ＰＣＲ反応物の全量は２０μｌであり、修飾されたテンプレートＤＮＡを１μｌ、それぞれのプライマーを各２５０ｎＭ、蛍光プローブを２２５ｎＭ及び２Ｘ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ）を含む。混合された反応物をＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ機器に入れ、９５℃にて最初の解離（ｄｅｎａｔｕｒｅ）を１０分間行い、続いて、９５℃にて１５秒の解離（ｄｅｎａｔｕｒｅ）を行った後、６０℃にてアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）と１分間の合成を行って一つの循環とした。この解離、アニーリング及び合成のステップを合計４５回繰り返し、ＳＤＳ ２．３ソフトウェアによりメチル化定量的データ分析を行った。ソフトウェアにおいてｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．１２８に設定すると共に、ｂａｓｅｌｉｎｅを３〜１５の間に設定する。内在性コントロール遺伝子ＣＯＬ２Ａとメチル化特異的遺伝子の定量的データをメチル化インデックス（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｔｈ−Ｉｎｄｅｘ）公式：（１００，００×２）＾（［（ＣＯＬ２Ａ ｏｆ Ｃｔ）−（Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｔ）］）に代入することにより、検体における標的遺伝子のメチル化レベルを算出する。
パイロシーケンスを使用して標的遺伝子断片を解析する目的は、標的遺伝子におけるＣｐＧサイトのメチル化レベルの百分率を正確に定量するためである。パイロシーケンスを行う前に、先にＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ ２．０ソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識のプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅を使用して標的遺伝子におけるＣｐＧサイトの遺伝子断片をカバーした後、パイロシーケンスにより標的遺伝子におけるＣｐＧサイトのメチル化率を検出しなければならない。まず、バイサルファイト処理されたパパニコロウ塗抹標本の細胞又は組織検体ＤＮＡをビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識を含むプライマー対及びＰｙｒｏＭａｒｋ ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）のＰＣＲ反応液に加え、標的断片をＰＣＲ増幅させた後、２．０％の寒天ゲルでＰＣＲ増幅の断片が正しいか否かを確認する。そして、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ２４ Ｖａｃｕｕｍ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡ検体の精製と変性を行い、シーケンスプライマーを加えてからＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ２４ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ）を介してパイロシーケンス及びメチル化解析を行う。
実施例２ メチル化標的遺伝子のスクリーニング
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７Ｋメチル化チップを用いて１４，４７５個の遺伝子をスクリーニングする。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７Ｋメチル化チップを用いて１４，４７５個の遺伝子をスクリーニングする。
（１）高いメチル化率の得点（β値＞０．４と＜０．４）を選択し、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎデータベース（ＧＥＯ７８０３）に結合して、遺伝子濃縮解析（ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｔｈｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＤＡＶＩＤ）により９２個の遺伝子を選択する。
（２）５−ＡＺＣ及びＴＳＡにより癌細胞株（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を処理し、ＱＲＴ−ＰＣＲによりこの９２個の遺伝子を解析し、遺伝子発現が受けるメチル化の影響を確認することで６１個の遺伝子を残す。
（３）検出用検体を混合し、ＭＳＰによりこの６１個の遺伝子におけるＤＮＡメチル化を解析することで２６個の遺伝子を残す。
（４）癌の検体についてＭＳＰによりこの２６個の遺伝子におけるＤＮＡメチル化を解析することで２１個の遺伝子を残す。
（５）癌組織についてＭＳＰによりこの２１個の遺伝子におけるＤＮＡメチル化を解析することで１６個の遺伝子を残す。
（６）癌の検体についてＱ−ＭＳＰによりこの１６個の遺伝子におけるＤＮＡメチル化を解析することで１４個の遺伝子を残す。
パイロシーケンスにより遺伝子のメチル化状態を確認し、最後に選択された９個の標的遺伝子が癌細胞に対して高いメチル化現象を発生する可能性があり、それぞれＡＤＲＡ１Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）、ＡＪＡＰ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）、ＨＳ３ＳＴ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）、ＭＡＧＩ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）、ＰＯＵ４Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）、ＰＯＵ４Ｆ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）、ＰＴＧＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）、ＳＯＸ１７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）及びＳＹＴ９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）であり、その詳しい資料は表３に示す通りである。表３から分かるように、この９個の遺伝子は、ＨＳ３ＳＴ２が大腸癌及び乳癌などと関わる可能性があり、ＰＯＵ４Ｆ２及びＳＯＸ１７が乳癌及び肝臓癌と関わることが知られている以外に、現在、これらの遺伝子と子宮頸癌又はその他の癌との関係を示す研究は極めて少ない。
実施例３ 子宮頸癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によりこの９個の標的遺伝子の子宮頸扁平細胞癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の子宮頸検体（ＳＣＣ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．３４、０．１８、０．１９、２．５８、７．６２、０．７７、０．１６、０．１７及び０．３１）と、子宮頸癌検体（ＳＣＣ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は９１１．３７、１５５８．９７、１０８８．６５、７１３．９２、５３５．０１、１５５２．７１、３０５．８４、２４８．２９及び５５１．８４）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０００１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ａ）、図２（Ａ）、図３（Ａ）、図４（Ａ）、図５（Ａ）、図６（Ａ）、図７（Ａ）、図８（Ａ）及び図９（Ａ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によりこの９個の標的遺伝子の子宮頸扁平細胞癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の子宮頸検体（ＳＣＣ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．３４、０．１８、０．１９、２．５８、７．６２、０．７７、０．１６、０．１７及び０．３１）と、子宮頸癌検体（ＳＣＣ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は９１１．３７、１５５８．９７、１０８８．６５、７１３．９２、５３５．０１、１５５２．７１、３０５．８４、２４８．２９及び５５１．８４）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０００１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ａ）、図２（Ａ）、図３（Ａ）、図４（Ａ）、図５（Ａ）、図６（Ａ）、図７（Ａ）、図８（Ａ）及び図９（Ａ）に示す。
実施例４ 卵巣腫瘍検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の卵巣腫瘍検体におけるメチル化状態を解析した結果、良性卵巣腫瘍の検体（ｏｖａｒｙ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３及びＰＴＧＤＲのメチル化レベル（それぞれの中位数は４．２５、５．１９、０．００、１０．９１、２．０６、３．６０及び１．５７）と、悪性卵巣腫瘍検体（ｏｖａｒｙ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３及びＰＴＧＤＲのメチル化レベル（それぞれの中位数は１３．６２、１０．７６、１１４．３８、３３．０８、４．２８、２１．９７及び２８．４０）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｂ）、図２（Ｂ）、図３（Ｂ）、図４（Ｂ）、図５（Ｂ）、図６（Ｂ）及び図７（Ｂ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の卵巣腫瘍検体におけるメチル化状態を解析した結果、良性卵巣腫瘍の検体（ｏｖａｒｙ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３及びＰＴＧＤＲのメチル化レベル（それぞれの中位数は４．２５、５．１９、０．００、１０．９１、２．０６、３．６０及び１．５７）と、悪性卵巣腫瘍検体（ｏｖａｒｙ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３及びＰＴＧＤＲのメチル化レベル（それぞれの中位数は１３．６２、１０．７６、１１４．３８、３３．０８、４．２８、２１．９７及び２８．４０）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｂ）、図２（Ｂ）、図３（Ｂ）、図４（Ｂ）、図５（Ｂ）、図６（Ｂ）及び図７（Ｂ）に示す。
実施例５ 肝臓癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、５個の標的遺伝子の肝臓癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の肝臓組織の検体（ＨＣＣ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は３５．２９、６．２５、４９．３０、２０．１５及び１９．７０）と、肝臓癌検体（ＨＣＣ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は２０２．１０、５３．７３、２７５．７６、１１１．２５及び１５４．６５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０００１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｃ）、図５（Ｃ）、図７（Ｃ）、図８（Ｂ）及び図９（Ｂ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、５個の標的遺伝子の肝臓癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の肝臓組織の検体（ＨＣＣ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は３５．２９、６．２５、４９．３０、２０．１５及び１９．７０）と、肝臓癌検体（ＨＣＣ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は２０２．１０、５３．７３、２７５．７６、１１１．２５及び１５４．６５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０００１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｃ）、図５（Ｃ）、図７（Ｃ）、図８（Ｂ）及び図９（Ｂ）に示す。
実施例６ 大腸癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、８個の標的遺伝子の大腸癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の大腸組織の検体（ｃｏｌｏｎ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５９．２１、２２８．９７、２９２．９５、１２３．４４、５９１．６４、２４９．７２、８０．１２及び５２．６３）と、大腸癌検体（ｃｏｌｏｎ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は８３．４７、２３１２．９１、２３０１．１２、７９９．４１、１６１５．４８、１０５８．５３、７５１．０６及び６０１．６５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｄ）、図２（Ｃ）、図３（Ｃ）、図４（Ｃ）、図５（Ｄ）、図６（Ｃ）、図８（Ｃ）及び図９（Ｃ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、８個の標的遺伝子の大腸癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の大腸組織の検体（ｃｏｌｏｎ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５９．２１、２２８．９７、２９２．９５、１２３．４４、５９１．６４、２４９．７２、８０．１２及び５２．６３）と、大腸癌検体（ｃｏｌｏｎ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は８３．４７、２３１２．９１、２３０１．１２、７９９．４１、１６１５．４８、１０５８．５３、７５１．０６及び６０１．６５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｄ）、図２（Ｃ）、図３（Ｃ）、図４（Ｃ）、図５（Ｄ）、図６（Ｃ）、図８（Ｃ）及び図９（Ｃ）に示す。
実施例７ 乳癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、９個の標的遺伝子の乳癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の乳癌組織の検体（ｂｒｅａｓｔ Ｃａ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は１１．７８、２２．２８、１１２．８１、２４．５５、３０．２３、３１．２９、４３．６４、１２．０２及び５．５３）と、乳癌検体（ｂｒｅａｓｔ Ｃａ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５７．１９、２６０．９６、２８１．６４、１９３．７０、７７．０６、３１０．３４、３４１．９７、７７．０５及び２５．２４）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｅ）、図２（Ｄ）、図３（Ｄ）、図４（Ｄ）、図５（Ｅ）、図６（Ｄ）、図７（Ｄ）、図８（Ｄ）及び図９（Ｄ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、９個の標的遺伝子の乳癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の乳癌組織の検体（ｂｒｅａｓｔ Ｃａ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は１１．７８、２２．２８、１１２．８１、２４．５５、３０．２３、３１．２９、４３．６４、１２．０２及び５．５３）と、乳癌検体（ｂｒｅａｓｔ Ｃａ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ、ＳＯＸ１７及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５７．１９、２６０．９６、２８１．６４、１９３．７０、７７．０６、３１０．３４、３４１．９７、７７．０５及び２５．２４）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０１を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｅ）、図２（Ｄ）、図３（Ｄ）、図４（Ｄ）、図５（Ｅ）、図６（Ｄ）、図７（Ｄ）、図８（Ｄ）及び図９（Ｄ）に示す。
実施例８ 口腔癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の口腔癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の口腔組織の検体（ｏｒａｌ Ｃａ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は１０．２５、０．００６５、１１５．９８、０．００、３０．２３、１０．４７及び０．００）と、口腔癌検体（ｏｒａｌ Ｃａ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は２６．４４、０．０１０７、３８１．４９、５４．５９、７７．０６、３２．７８及び１０．８５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｆ）、図２（Ｅ）、図３（Ｅ）、図４（Ｅ）、図５（Ｆ）、図７（Ｅ）及び図９（Ｅ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の口腔癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の口腔組織の検体（ｏｒａｌ Ｃａ Ｎ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は１０．２５、０．００６５、１１５．９８、０．００、３０．２３、１０．４７及び０．００）と、口腔癌検体（ｏｒａｌ Ｃａ Ｔ）におけるＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は２６．４４、０．０１０７、３８１．４９、５４．５９、７７．０６、３２．７８及び１０．８５）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図１（Ｆ）、図２（Ｅ）、図３（Ｅ）、図４（Ｅ）、図５（Ｆ）、図７（Ｅ）及び図９（Ｅ）に示す。
実施例９ 子宮内膜癌検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の子宮内膜癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の子宮内膜組織の検体（Ｅｍ Ｎ）におけるＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．００、０．００、０．００、１６．４２、０．３１、０．００及び０．６３）と、子宮内膜癌検体（Ｅｍ Ｔ）におけるＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５３５．７８、１４５６．２３、５０４．１５、２４８．８３、８９．８６、１４８．１９及び０．４３）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図２（Ｆ）、図３（Ｆ）、図４（Ｆ）、図５（Ｇ）、図６（Ｅ）、図７（Ｆ）及び図９（Ｆ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、７個の標的遺伝子の子宮内膜癌検体におけるメチル化状態を解析した結果、正常の子宮内膜組織の検体（Ｅｍ Ｎ）におけるＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．００、０．００、０．００、１６．４２、０．３１、０．００及び０．６３）と、子宮内膜癌検体（Ｅｍ Ｔ）におけるＡＪＡＰ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＭＡＧＩ２、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＴＧＤＲ及びＳＹＴ９のメチル化レベル（それぞれの中位数は５３５．７８、１４５６．２３、５０４．１５、２４８．８３、８９．８６、１４８．１９及び０．４３）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図２（Ｆ）、図３（Ｆ）、図４（Ｆ）、図５（Ｇ）、図６（Ｅ）、図７（Ｆ）及び図９（Ｆ）に示す。
実施例１０ 肉腫検体における標的遺伝子のメチル化解析
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、２個の標的遺伝子の肉腫検体におけるメチル化状態を解析した結果、良性腫瘍の検体（ｓａｒ Ｎ）におけるＭＡＧＩ２及びＰＯＵ４Ｆ３のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．００及び０．３１）と、肉腫検体（ｓａｒ Ｔ）におけるＭＡＧＩ２及びＰＯＵ４Ｆ３のメチル化レベル（それぞれの中位数は５．２０及び８９．８６）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図４（Ｇ）及び図６（Ｆ）に示す。
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、２個の標的遺伝子の肉腫検体におけるメチル化状態を解析した結果、良性腫瘍の検体（ｓａｒ Ｎ）におけるＭＡＧＩ２及びＰＯＵ４Ｆ３のメチル化レベル（それぞれの中位数は０．００及び０．３１）と、肉腫検体（ｓａｒ Ｔ）におけるＭＡＧＩ２及びＰＯＵ４Ｆ３のメチル化レベル（それぞれの中位数は５．２０及び８９．８６）とを示す。この２グループのデータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔにより解析した結果、各グループの間はＰ＜０．０５を満たし、その差は統計学的に有意であった。上記を、図４（Ｇ）及び図６（Ｆ）に示す。
上記の具体的説明は本発明の実施可能な実施例に対する具体的説明であるが、これらの実施例は本発明の特許範囲を限定するものではなく、本発明の範囲を逸脱しない程度の実施又は変更、例えば、被検体における各標的遺伝子のメチル化レベルに対する判定方法などの変化及び等価的実施例は、いずれも本願の特許範囲に含まれるべきである。
Claims (32)
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を子宮頸癌の有無のスクリーニング指標として検出する子宮頸癌のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが子宮頸癌又は子宮頸部の前癌病変を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする子宮頸癌のスクリーニング方法。 - 前記サンプルはパパニコロウ塗抹標本、血液、尿、子宮頸部上皮細胞、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 前記サンプルは異常パパニコロウ塗抹標本であることを特徴とする請求項１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 前記サンプルはヒトパピローマウイルス検査結果が陽性である子宮頸部細胞サンプルであることを特徴とする請求項１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー、又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を卵巣癌の有無のスクリーニング指標として検出する卵巣癌のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが卵巣癌を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする卵巣癌のスクリーニング方法。 - 前記サンプルは卵巣癌組織、腹水、血液、尿、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項８に記載の卵巣癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー、又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項８または９に記載の卵巣癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載の卵巣癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の卵巣癌のスクリーニング方法。
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を大腸癌の有無のスクリーニング指標として検出する大腸癌のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが大腸癌又は大腸の前癌病変を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする大腸癌のスクリーニング方法。 - 前記サンプルは大腸組織、腹水、血液、尿、便、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項１３に記載の大腸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー、又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の大腸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の大腸癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の大腸癌のスクリーニング方法。
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を乳癌の有無のスクリーニング指標として検出する乳癌のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが乳癌を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする乳癌のスクリーニング方法。 - 前記サンプルは血液、尿、乳汁、乳頭分泌物、嚢胞、穿刺及び生検検体、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項１８に記載の乳癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー、又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項１８または１９に記載の乳癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の乳癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の乳癌のスクリーニング方法。
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を子宮内膜癌の有無のスクリーニング指標として検出する子宮内膜癌のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが子宮内膜癌を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする子宮内膜癌のスクリーニング方法。 - 前記サンプルは血液、尿、膣洗浄物、月経血、子宮内膜掻爬組織、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項２３に記載の子宮内膜癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項２３または２４に記載の子宮内膜癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の子宮内膜癌のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の子宮内膜癌のスクリーニング方法。
- 被験者から得られたサンプル細胞における標的遺伝子のメチル化状態を肉腫有無のスクリーニング指標として検出する肉腫のスクリーニング方法であって、
前記サンプルのゲノムＤＮＡにおけるＰＯＵ４Ｆ３を標的遺伝子として前記標的遺伝子のＣｐＧ配列のメチル化状態を検出するステップ１と、
前記標的遺伝子のメチル化状態のレベルが正常なサンプルと比較して高い場合に、前記サンプルが肉腫を有すると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする肉腫のスクリーニング方法。 - 前記サンプルは血液、尿、又は手術後の癌組織のインビトロサンプルであることを特徴とする請求項２８に記載の肉腫のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出方法は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイトシーケンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィー又はパイロシーケンスであることを特徴とする請求項２８または２９に記載の肉腫のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の肉腫のスクリーニング方法。
- 前記標的遺伝子ＰＯＵ４Ｆ３のメチル化状態はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０−２１に示すヌクレオチド配列のプライマー対により検出されたものであり、前記プライマーは少なくとも８０％の配列同一性、相補性、又は少なくとも１０個連続する同じヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の肉腫のスクリーニング方法。
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