CN107475443A - 子宫颈癌检测套组 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种子宫颈癌检测套组，包含检测PAX1或ZNF582的高度甲基化，以及检测HPV16、或HPV18，并依据检测结果是否为阳性，判断是否罹患子宫颈癌。本发明的检测套组可达成更准确的检出率，以利子宫颈癌患者及早进行治疗。

Description

子宫颈癌检测套组
技术领域
本发明提供一种子宫颈癌检测套组，包含侦测基因PAX1、ZNF582甲基化，以及HPV16、HPV18的感染，以利患者及早治疗。
背景技术
子宫颈癌是造成全球女性死亡率第2高的癌症，其子宫颈细胞癌化所产生的癌症，具有的特性包括细胞异常生长、具侵袭能力和扩散能力；子宫颈癌具有的症状包括阴道异常出血、骨盆疼痛、性行为疼痛等。子宫颈癌约略分为2种类型，大约90％的患者为鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，而约有10％患者为腺癌(adenocarcinoma)，并且有少部分为其他癌症类型。大多数可能的患者以子宫抹片的方法检测是否罹患癌症，另有分子检测的方法以判断癌化与否，现今诊断方法已大幅降低鳞状细胞癌的患者，但仍不容易诊断出腺癌，子宫颈腺癌患者已提高至24％(Wright et al.2013Cancer)。
人类乳突病毒(Human papillomavirus，HPV)可发现于90％的子宫颈癌患者；但并非所有感染HPV的患者皆罹患子宫颈癌，也有现有报导揭示，感染HPV与人类体细胞产生突变并无关联(Wright et al.2013Cancer)。HPV感染人体时，仅于皮肤角质细胞或黏膜(mucous membranes)进行复制，但鲜少出现病征。
HPV依其基因型可区分为多种品系，而其中一类为高风险(high risk)类型，若长时间感染高风险HPV，则有可能形成细胞癌化，其中包括HPV16、HPV18造成约70％的子宫颈癌病例。另有报导指出，高风险类型的HPV可以造成较多的DNA双股断裂，但其中特定类型，包括16/18/31/33/35，其感染的细胞具备较强的DNA修复能力，并且造成细胞癌化(Schutzeet al.2016Oncotarget)。
针对具有侵袭性的子宫颈癌，HPV的筛检可达成高于组织学筛检的60-70％的癌症预防(Ronco et al.2014Lancet)。故依据HPV的感染与否，建立子宫颈癌的筛检方法为重要的医疗研究。现有技术如美国专利US8334098B2、US8828660B2均建立可侦测HPV核酸的技术；US8765418B2也提供使用探针侦测HPV核酸及其基因型的技术。
表征遗传(Epigenetics)外于DNA的遗传讯息，对于细胞型态影响甚广；表征遗传于癌症中的角色近年发表大量研究，其重要性不下于基因(You et al.2012Cancer Cell、Dawson et al.2012Cell、Tam et al.2013Nat Med)。表征遗传包含基因甲基化修饰，其影响细胞的表现型，可存于被修饰过的碱基5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)；基因甲基化修饰又可分为对称型(symmetrical)和非对称型(asymmetrical)，对称型对于细胞表现型影响较大，以回文序列CpG岛(CpG island)方式存在，细胞大多数的CpG双核苷酸都被甲基化，通常出现于基因的启动子上下游2000碱基对的序列胞嘧啶的甲基化发生在DNA合成后，自一甲基捐赠者S-腺核苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine、SAM)将一甲基经酵素转移到胞嘧啶第5个碳的位置上，其反应由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase、DNMTs)执行，负责将半甲基化位置复制后修复(post-replicative restoration)为全甲基化；反之，DNMT3A及DNMT3B则被认为主要负责甲基化新的位置，进行一种称为重新甲基化(de novomethylation)的步骤。
除了染色体缺失及基因突变之外，经由启动子的高度甲基化所造成肿瘤抑制基因的表征遗传静默现象(epigenetic silencing)，也常见于人类癌症中(Herman etal.2003N Engl J Med)。
现有技术US7820386B2揭示PAX1(Paired box protein-1)基因的高度甲基化与子宫颈癌、卵巢癌、肝癌的形成高度相关；另US8048634B2揭示ZNF582(zinc finger 582)基因的高度甲基化与子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌的形成高度相关。基因甲基化检测的学理虽发展已有相当时日，也为学术研究者广泛使用，然如欲应用于医疗检测等临床相关领域，则其准确度和灵敏度不可忽视，另检验试剂的方便度也受到重视。由于其高复杂性，检测基因甲基化目前于医疗上尚未普及，其部分原因除需大量研究来支持标定基因临床意义及相关验证外，如何提供方便快速的侦测方法也有相当的技术障碍。
为解决上述问题，提供一种高准确度和高灵敏度、同时具有方便性的子宫颈癌侦测方法，本发明提供适用于侦测子宫颈癌的检测方法和套组，具有多重(multiplex)放大基因的功能，也使相关目标基因的甲基化检测具产业可利用性，可应用于医疗领域，提早预防、治疗子宫颈癌。本发明的子宫颈癌侦测套组可更精确检验，设计以试剂盒的形式，达到更快更方便与更有效率，提供检验上使用的完善产品。
发明内容
为达成上述的发明目的，本发明提供一种子宫颈癌检测套组，用以检测检体中基因CpG序列甲基化或HPV16或HPV18的存在，也即先由检体萃取出其DNA，该DNA经过适当前处理或化学反应，即可使用该检测套组进行检测，该检测套组包括：
浓度范围在20nM-1250nM的目标基因甲基化的引子混合液，其至少包含有正向引子和反向引子，该目标基因甲基化是PAX1甲基化或ZNF582甲基化；
浓度范围在20nM-1250nM的HPV16和HPV18的引子混合液，其至少包含有正向引子和反向引子；
浓度范围在20nM-1250nM内部控制组基因的引子混合液，其至少包含有正向引子及反向引子；
聚合酶连锁反应主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及镁盐。
其中，该PAX1甲基化的引子，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少二者；该ZNF582甲基化的引子，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少二者；该HPV16的引子，选自SEQ ID NO:57-69所组成的群组中至少二者；该HPV18的引子，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少二者；上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
其中，该内部控制组基因的引子，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少二者，上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
其中，
该目标基因引子混合液、HPV16和HPV18的引子混合液包含可侦测PAX1、ZNF582、HPV16、HPV18的探针；
该内部控制组基因的引子混合液，包含可侦测内部控制基因扩增产物的探针；
该PAX1甲基化的探针，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少一者；该ZNF582甲基化的探针，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少一者；该HPV16的探针，选自SEQ IDNO:57-69所组成的群组中至少一者；该HPV18的探针，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少一者；该内部控制组基因的探针，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少一者；上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
其中，该至少有80％的序列相似性至少具有90％的序列相似性。
其中，该PAX1甲基化的引子，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少二者；该ZNF582甲基化的引子，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少二者；该HPV16的引子，选自SEQ ID NO:57-69所组成的群组中至少二者；该HPV18的引子，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少二者。
其中，该内部控制组基因的引子，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少二者。
其中，该聚合酶连锁反应主要混合液包含可辨识聚合酶连锁反应产物的荧光物质或可与DNA双股作用产生荧光进而被侦测的物质。
其中，该探针具有荧光标记，该荧光标记选自FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3所组成的群组。
其中，该检测套组可用于检测异常细胞增生。
其中，该异常细胞增生可用于癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
其中，该目标基因甲基化的引子与内部控制组基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
其中，其中HPV16和HPV18的引子与内部控制组基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
其中，该目标基因甲基化是PAX1甲基化和ZNF582甲基化。
其中，其中该聚合酶连锁反应的产物的鉴定方法可用荧光法、定序法、微数组、质谱仪分析、变性高效液相色谱、焦磷酸定序、或免疫分析法。
其中，该检体是子宫颈抹片、血液、尿液、腹水、子宫颈上皮细胞、手术后癌症组织的离体样本、HPV检验呈阳性的细胞样本。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种子宫颈癌检测套组，包含特定的引子、探针、以及内部控制组基因的引子，另包含可扩增核酸分子的主要混和液(master mix)，该主要混和液包含脱氧核苷三磷酸(dNTP，deoxynucleoside triphosphate)、DNA聚合酶(DNA polymerase)、和供聚合酶反应的镁离子，可有效地扩增核酸分子以便判别；该套组也可混和该特定的引子和内部控制组基因的引子，另二扩增反应于同一试管中进行，即多重聚合酶连锁反应，有利于快速获得检测结果。
附图说明
图1A为本发明实施例公开的受试母体1的受试者以单项癌化指标的检测结果的曲线图，其曲线下面积越大者，其癌症筛检准确度越高；
图1B为本发明实施例公开的受试母体2的受试者以单项癌化指标的检测结果的曲线图，其曲线下面积越大者，其癌症筛检准确度越高；
图1C为本发明实施例公开的受试母体1的受试者以二项癌化指标的检测结果的曲线图，其曲线下面积越大者，其癌症筛检准确度越高；
图1D为本发明实施例公开的受试母体1的受试者以二项癌化指标的检测结果的曲线图，其曲线下面积越大者，其癌症筛检准确度越高；
图2A为本发明实施例公开的以多种检测方法检测经子宫颈抹片筛检分类后的受试母体1的患者，于不同增生或癌化阶段的检测敏感性；y轴表示检出率，x轴表示不同增生或癌化阶段；NILM:上皮内恶性肿瘤阴性(negative intraepithelial malignancy)；
图2B为本发明实施例公开的以多种检测方法检测经子宫颈抹片筛检分类后的受试母体2的患者，于不同增生或癌化阶段的检测敏感性；y轴表示检出率，x轴表示不同增生或癌化阶段；NILM:上皮内恶性肿瘤阴性(negative intraepithelial malignancy)。
具体实施方式
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。本发明以下面的实施例予以示范阐明，但仅为例示而非限制，本发明不受下述实施例所限制。除非另有说明，本发明所用的材料皆市售易于取得，下列仅为示例可取得的管道。
本说明书用语癌、癌症、肿瘤、恶性肿瘤及其近似用语，指涉一疾病群组，包括异常细胞增生、低度细胞分化、低度细胞凋亡、具备血管新生能力、具备侵袭和扩散至身体其他器官的能力，上述疾病群组可用于判断癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测、肿瘤用药预测、或愈后效果检测。
本说明书用语样本、检体及其近似用语，指涉取自患者或可能患者的细胞、组织、组织切片、器官抹片、排遗、或排泄物，可为但不限于血液、血球细胞、子宫颈抹片、腹水、尿液、粪便、痰、口腔黏膜细胞、胃液、胆汁、子宫颈上皮细胞、或手术后的癌症组织等离体的检体、样本。
本说明书用语侦测、检测、筛选及其近似用语，指涉使用分子生物学的技术，辨别样本、检体中基因型的方法，可为但不限于核酸聚合酶连锁反应(Polymerase ChainReaction)、荧光法(fluorescence)、定序法(sequencing)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
本发明的癌症检测套组，用于检测该离体样本中的目标基因甲基化及病毒感染的状态，以作为各类癌症的检测指标。本发明所提供的癌症检测方法及其检测指标，可供检测研究人员于实验室中进行检测。
上述聚合酶连锁反应主要反应组合，可进一步包含可辨识聚合连锁反应产物的荧光物质，或与可与DNA双股键结产生荧光进而被侦测的荧光物质，上述荧光物质可为但不限于SYBER Green、或Syber Gold。
本发明的癌症检测套组，其中内部控制组基因可为但不限于Col2A、β-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-actin。
本发明的癌症检测套组，其中目标基因与内部控制组基因的探针具有荧光标记，此荧光标记可为但不限于FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。
本发明的癌症检测套组，用于侦测的癌症包括生殖器官癌(genital cancer)、头颈癌(head and neck cancer)、头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cellcarcinoma)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、肛门癌(anal cancer)。
上述生殖器官癌，可为但不限于阴茎癌、阴道癌、外阴肿瘤(Vulvar cancer)、子宫颈癌。
上述生殖器官癌，为子宫颈癌。
实施例1侦测受试检体目标基因甲基化的方法
子宫颈抹片检体，抽取其细胞全DNA，再经过重亚硫酸盐(bisulfite)转换，
并以表1揭示可用于扩增含有PAX1、ZNF582甲基化区域、以及内部控制组的引子及探针组，来进行检测。
本发明所使用的核甘酸引子及探针，可为低专一性序列引子或探针(degenerateprimer or probe)，以因应基因多型性(genetic polymorphism)所产生的序列变化，可扩增可能产生多型性的序列，故本案所使用的核甘酸引子及探针可为上述低专一性序列引子或探针所替换，所述的低专一性具有至少80％的序列相似性(homology)，或至少具有90％的序列相似性。
表1 扩增目标基因PAX1、ZNF582甲基化区域，以及扩增内部控制组基因的引子及探针组
侦测基因型的核酸扩增反应条件如下：
(i)将上述检体细胞的DNA于95℃活化聚合酶10分钟；
(ii)前步骤的产物于95℃变性DNA模板10秒形成单股DNA模板，接着于60℃令引子和探针黏着(annealing)单股DNA模板并且聚合(polymerization)40秒；及
(iii)进行上述步骤(ii)的变性、黏着、聚合的循环30至50次。
以上述PCR扩增产物判断该目标基因是否高度甲基化，进一步判断目标基因来源细胞是否为癌细胞。
实施例2侦测受试检体的高风险人类乳突病毒(hr-HPV)的方法
子宫颈抹片检体，抽取其细胞全DNA，并以表2揭示可用于扩增含有HPV16、HPV18、以及内部控制组的引子及探针组，来进行检测。
表2 扩增HPV16、HPV18，以及扩增内部控制组基因的引子及探针组
侦测基因型的核酸扩增反应条件如下：
(i)将上述检体细胞的DNA于95℃活化聚合酶10分钟；
(ii)前步骤的产物于95℃变性DNA模板10秒形成单股DNA模板，接着于60℃令引子和探针黏着(annealing)单股DNA模板并且聚合(polymerization)40秒；及
(iii)进行上述步骤(ii)的变性、黏着、聚合的循环30至50次。
以上述PCR扩增产物判断该检体细胞是否感染HPV，进一步综合该检体细胞的PAX1、ZNF582的基因高度甲基化侦测结果，判断目标基因来源细胞是否为癌细胞。
实施例3子宫颈抹片筛检分类后的侦测
本实施例于台湾、中国医院招募欲进行子宫颈癌筛检或确诊妇女，募得参与受试者区分为受试母体1共499人(n1＝499)，以及受试母体2共449人(n2＝449)。受试者取其子宫颈抹片检体萃取全DNA，依据实施例2提供的方法侦测是否感染HPV16/18；再取上述萃取的DNA500ng，进行重亚硫酸盐转换(bisulfite conversion)后，依据实施例1提供的方法侦测PAX1基因或ZNF582基因甲基化；并依据上述检测结果判断受试者是否罹患子宫颈癌：
a.上述侦测结果显示检体具有目标基因PAX1高度甲基化、感染HPV16、或感染HPV18三特征其中之一为阳性(positive)，则判断受试者罹患子宫颈癌；或
b.上述侦测结果显示检体具有目标基因ZNF582高度甲基化、感染HPV16、或感染HPV18三特征其中之一为阳性，则判断受试者罹患子宫颈癌。
子宫颈抹片检查(Pap test或Pap smear)是以细胞学的方法，进行子宫颈细胞抹片染色的子宫颈癌诊断方法，可用以判断细胞是否异常增生或癌化，以及判断细胞癌化的阶段。
子宫颈抹片检查的结果，其组织学的分类可区分为低度增生的CIN1(Cervicalintraepithelial neoplasia 1)、中度增生的CIN2、高度增生的CIN3；CIN1所对应的细胞学特征称之为低度鳞状上皮内病变(Low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)，而CIN2所对应的细胞学特征称之为高度鳞状上皮内病变(High grade squamousintraepithelial lesion，HSIL)；若难以判断其细胞学特征，则称之为难以判断的非典型鳞状细胞(Atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)，或是难以判断的非典型鳞状腺细胞(atypical glandular cells of undeterminedsignificance)。
上述受试者母体1和母体2检测结果揭示于表3及图1A-D。
表3
AUC:曲线下面积(area under curve)；SN:敏感性(sensitivity)；SP:特异性(specificity)；m:甲基化(methylation)
表3揭示若采用上述段落0029所述的判断方法，其结果皆具有高度准确度，即本发明提供的检测方法可正确地检测受试者是否罹患子宫颈癌，且检测结果为伪阴性的机率极低；图1A-D则是依据表3绘制成的曲线图。
若针对抹片结果为ASCUS、AGC、或LSIL的受试者，其检测结果揭示于表4。
表4
CI:信赖区间(confidence interval)
表4结果揭示，若采用检测方法为PAXm、HPV16、或HPV18三者之一为阳性作为判断子宫颈癌的依据，则具有最准确的检出率，二母体分别为85.41％(95％信赖区间为75.73-95.08)、80.12％(95％信赖区间为74.99-85.25)，皆高于其他检测方法。因此，对于抹片检验结果分类为ASCUS、AGC、或LSIL的受试者，本发明提供的检测方法仍然具有高度的敏感性和精确度，可广泛应用于子宫颈癌检测。
另，本实施例所检测的受试母体1、受试母体2的受试者，经子宫颈抹片筛检和细胞学特征分类后，可区分为多类型的子宫颈细胞，其结果揭示于表5。
表5
AC:腺癌(adenocarcinoma)；CIS:原位癌(carcinoma in situ)
依据表5分类结果，可判断受试母体1、受试母体2皆含有不同癌化阶段的患者或可能的患者，可依其组织学特征区分严重度，分别为低度增生的CIN1、中度增生的CIN2、重度增生的CIN3、癌化等阶段。而表5所分类的各类受试者，以本说明书段落0043所提供的子宫颈癌检测其是否为子宫颈癌阳性或阴性，该检测结果揭示于图2A(受试母体1)和图2B(受试母体2)。
结果显示，本发明提供的检测方法无论针对受试母体1(图2A)或受试母体2(图2B)，均可于检测癌细胞和高度细胞增生的CIN3时，具有高敏感性(80％以上)；意即，若受试者具有癌细胞或极可能癌化的高度增生的细胞，则该检测方法可以高敏感性检测出受试者罹患癌症或可能将罹患癌症，而非无法检出。相对地，结果也显示，本发明提供的检测方法无论针对受试母体1(图2A)或受试母体2(图2B)，均可于检测低度细胞增生的CIN1-2、或正常细胞时，具有高特异性；意即，若受试者不具有癌细胞或极可能癌化的高度增生的细胞，仅具有正常细胞或低度增生而较不可能癌化的细胞，则该检测方法可以高特异性检测出受试者不具有癌症，而非错误地将的视为癌症患者。
实施例4筛检出感染高风险HPV后的侦测
如上述，高风险HPV(hr-HPV)为造成子宫颈癌的原因之一，约90％的子宫颈癌患者感染hr-HPV，故hr-HPV是筛检子宫颈癌的重要指针，通常以分子生物学方法检测感染hr-HPV与否并辨别其基因型。
本说明书所述受试母体1、受试母体2的受试者，经hr-HPV筛检后，各有105、301名受试者感染hr-HPV(n1(HPV)＝105，n2(HPV)＝301)，上述筛检后受试者均以本说明书段落0043提供的检测方法，检测是否罹患子宫颈癌，该检测结果揭示于表6、表7。
表6
表7
表6、表7结果显示，若综合PAX1甲基化、和HPV16、HPV18感染的检测结果，其胜算比(odds ratio)皆高于PAX1单独侦测、PAX1和ZNF582侦测、PAX1侦测和抹片检查等筛检方法，意即本发明所提供的方法较目前通常的方法，可得较高的敏感性及特异性，可正确地检测出是否罹患子宫颈癌，且较不容易误诊。
综本说明书实施例所揭示的内容，本发明提供一种具有高敏感性和高特异性的检测子宫颈癌的方法，且可达成高胜算比和高筛检的准确率，不易产生伪阳性或伪阴性的误判，有利于判断受试者是否为癌症患者或潜在癌症患者，使患者得以及早进行治疗，延长存活期；也可依据该方法制成一检测套组，包含特定的引子、探针、以及内部控制组基因的引子，另包含可扩增核酸分子的主要混和液(master mix)，该主要混和液包含脱氧核苷三磷酸(dNTP，deoxynucleoside triphosphate)、DNA聚合酶(DNA polymerase)、和供聚合酶反应的镁离子，可有效地扩增核酸分子以便判别；该套组也可混和该特定的引子和内部控制组基因的引子，另二扩增反应于同一试管中进行，即多重聚合酶连锁反应，有利于快速获得检测结果。
上列详细说明针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (16)

1.一种子宫颈癌检测套组，其特征在于，用以检测检体中基因CpG序列甲基化或HPV16或HPV18的存在，先由检体萃取出其DNA，所述DNA经过前处理或化学反应，即可使用所述检测套组进行检测，所述检测套组包括：
浓度范围在20nM-1250nM的目标基因甲基化的引子混合液，其至少包含有正向引子和反向引子，所述目标基因甲基化是PAX1甲基化或ZNF582甲基化；
浓度范围在20nM-1250nM的HPV16和HPV18的引子混合液，其至少包含有正向引子和反向引子；
浓度范围在20nM-1250nM内部控制组基因的引子混合液，其至少包含有正向引子及反向引子；
聚合酶连锁反应主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及镁盐。
2.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述PAX1甲基化的引子，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少二者；所述ZNF582甲基化的引子，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少二者；所述HPV16的引子，选自SEQ ID NO:57-69所组成的群组中至少二者；所述HPV18的引子，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少二者；上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
3.如权利要求2所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述内部控制组基因的引子，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少二者，上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
4.如权利要求3所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，
该目标基因引子混合液、HPV16和HPV18的引子混合液包含可侦测PAX1、ZNF582、HPV16、HPV18的探针；
所述内部控制组基因的引子混合液，包含可侦测内部控制基因扩增产物的探针；
所述PAX1甲基化的探针，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少一者；所述ZNF582甲基化的探针，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少一者；所述HPV16的探针，选自SEQID NO:57-69所组成的群组中至少一者；所述HPV18的探针，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少一者；所述内部控制组基因的探针，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少一者；上述引子的核苷酸序列，可为所示的核苷酸序列或与其至少有80％的序列相似性、或至少连续十个核苷酸相同的序列、或其互补序列。
5.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，该至少有80％的序列相似性至少具有90％的序列相似性。
6.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述PAX1甲基化的引子，选自SEQ ID NO:1-25所组成的群组中至少二者；所述ZNF582甲基化的引子，选自SEQ ID NO:26-40所组成的群组至少二者；所述HPV16的引子，选自SEQ ID NO:57-69所组成的群组中至少二者；所述HPV18的引子，选自SEQ ID NO:70-82所组成的群组中至少二者。
7.如权利要求6所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述内部控制组基因的引子，选自SEQ ID NO:41-56所组成的群组中至少二者。
8.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述聚合酶连锁反应主要混合液包含可辨识聚合酶连锁反应产物的荧光物质或可与DNA双股作用产生荧光进而被侦测的物质。
9.如权利要求5所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，该探针具有荧光标记，所述荧光标记选自FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3所组成的群组。
10.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，该检测套组可用于检测异常细胞增生。
11.如权利要求10所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述异常细胞增生可用于癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
12.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述目标基因甲基化的引子与内部控制组基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
13.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，其中HPV16和HPV18的引子与内部控制组基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
14.如权利要求1或2所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述目标基因甲基化是PAX1甲基化和ZNF582甲基化。
15.如权利要求1或2所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，其中所述聚合酶连锁反应的产物的鉴定方法可用荧光法、定序法、微数组、质谱仪分析、变性高效液相色谱、焦磷酸定序、或免疫分析法。
16.如权利要求1所述的子宫颈癌检测套组，其特征在于，所述检体是子宫颈抹片、血液、尿液、腹水、子宫颈上皮细胞、手术后癌症组织的离体样本、HPV检验呈阳性的细胞样本。
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