WO2016124177A1

WO2016124177A1 - Verfahren und kit zur bestimmung des risikos einer entwicklung eines zervixkarzinoms oder einer seiner malignen vorstufen

Info

Publication number: WO2016124177A1
Application number: PCT/DE2016/100051
Authority: WO
Inventors: Matthias DÜRST; Alfred Hansel; Martina Schmitz
Original assignee: Oncgnostics Gmbh
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2016-08-11
Also published as: DE102015101555A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens. Dabei ist das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, vorgesehen, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.

Description

Verfahren und Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zer- vixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder seiner malignen Vorstufen sowie ein Kit, das zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder seiner malignen Vorstufen verwendet werden kann.

Gebärmutterhalskrebs, auch als Zervixkarzinom bezeichnet, gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen. Im Gegensatz zu vielen anderen Krebserkrankungen entsteht Gebärmutterhalskrebs meist als Folge einer Infektion mit sogenannten Hochrisiko-humanen-Papillomaviren (hr-HPV). Diese Viren werden sexuell über- tragen, so dass eine Infektion schon im jungen Alter auftreten kann. Damit sind von Gebärmutterhalskrebs und seinen Vorstufen sehr häufig auch schon Frauen unter 30 Jahre betroffen. Gebärmutterhalskrebs entwickelt sich langsam über Vorstufen, die als zervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN) bezeichnet werden. Diese werden unterteilt in:

CIN1 = leichte Dysplasie, geht von basal aus bis höchstens einem Drittel der Höhe des Epithels;

CIN2 = mittelgradige Dysplasie, bis zu zwei Drittel des Epithels; und

CIN3 = hochgradige Dysplasie, durchzieht fast das gesamte Epithel.

Während etwa 90% der CIN1 sich nach einer gewissen Zeit zurückbilden und die zugrunde liegende hr-HPV-lnfektion nicht mehr nachweisbar ist, entwickeln sich etwa 30% der CIN2 und zwischen 30 und 50% der CIN3 zu einem Zervixkarzinom. D. h. mit anderen Worten, nicht jede der Neoplasien CIN1 , CIN2 und CIN3 ist tatsächlich eine maligne, also bösartige Gewebeveränderung. Es ist daher wünschenswert, so früh wie möglich zwischen malignen Neoplasien und nicht-malignen Neoplasien zu unterscheiden. Molekularbiologische Testverfahren haben die Krebsvorsorge in vielen Bereichen wesentlich verbessert. Da bis auf wenige Ausnahmen alle Zervixkarzinome und deren Vorstufen hr-HPV-DNA enthalten, erscheint der Nachweis von HPV-DNA als ideales Verfahren für die Krebsvorsorge. In verschiedenen veröffentlichten Studien konnte gezeigt werden, dass HPV-DNA-Nachweistests für den Nachweis von CIN2+ eine Sensitivität größer 95 % und eine Spezifität größer 90 % aufweisen. Allerdings werden durch einen positiven HPV-Test sehr viele Frauen verunsichert, obwohl nur ein geringer Teil der infizierten Frauen eine maligne Dysplasie oder ein Karzinom aufweist oder entwickeln wird, während die meisten lediglich mit HPV infiziert sind, aber keine Krebsvorstufen aufweisen (Cuzick et al., 2006; Int J Cancer, 1 19: 1095- 1 101). Somit besteht ein Bedarf an einer verbesserten Diagnostik, um maligne Läsionen bzw. sich erst entwickelnde, maligne Läsionen gezielt nachzuweisen.

In vielen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Methylierungsmarker grundsätzlich für die molekulare Diagnostik im Bereich der Früherkennung des Zervixkarzinoms geeignet sind. Wang et al., Cancer Res. 2008, 68(7), S. 2489 ff., beschreiben die Identifikation neuer Methylierungsmarker bei Zervixkarzinom. Huang et al., Abstract #50, 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, CA, USA, April 12-16, 2008, ISSN 0197-016X beschreiben die Hypermethylie- rung von CIDEA und RXFP3 als potentielle epigenetische Marker für Eierstockkrebs. Dürst, Hansel, Steinbach beschreiben in EP 2 478 1 17 B1 die Nutzung des Nachweises einer DNA-Hypermethylierung der Promotor-/5'-Bereiche der beiden Marker ASTN1 und ZNF671 zur Früherkennung von Zervixkarzinomen. Hansel et al., PLo- Sone 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0091905 beschreiben die Nutzung einer DNA-Methylierungssignatur zum Nachweis von Zervixkarzinomen. Beschrieben wurden speziell die Marker DLX1 , ITGA4, RXFP3, SOX17, ZNF671 .

Alle diese und auch weitere Publikationen beschreiben allerdings die Erkennung von Zervixkarzinomen und deren Vorstufen. Es wäre jedoch wünschenswert, wenn be- reits vor der Ausbildung eines Zervixkarzinoms und/oder einer seiner malignen Vorstufen die beginnende Entstehung einer solchen Vorstufe, insbesondere einer beginnenden malignen zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN3), nachgewiesen werden könnte. Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren angegeben werden, das eine Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen ermöglicht, und zwar be- vor eine maligne Vorstufe, insbesondere CIN3, oder ein Zervixkarzinom bei dem Lebewesen entstanden ist.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 , 1 1 , 13 und 16 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein erstes Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Le- bewesens vorgesehen. Das erste Verfahren umfasst das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1 , DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Unterscheidung zwischen Lebewesen, die eine maligne Vorstufe des Zervixkarzinoms oder ein Zervixkarzinom ent- wickeln werden (sofern keine medizinische Behandlung durchgeführt wird), von den Lebewesen, die keine maligne Vorstufe des Zervixkarzinoms oder ein Zervixkarzinom entwickeln werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt diese Unterscheidung lange bevor sich eine Vorstufe des Zervixkarzinoms, sei sie maligne oder nicht, gebildet hat. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die Unterscheidung zwi- sehen malignen oder nicht-malignen Vorstufen des Zervixkarzinoms. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Erkennung einer inzidenten CIN3 mit malignem Potential geeignet. Eine inzidente CIN3 (in der Fachsprache als„incident CIN3" bezeichnet) ist eine CIN3 am Beginn ihrer Entwicklung oder unmittelbar vor dem Beginn ihrer Entwicklung. Wie oben erläutert, besteht bei einer CIN3 ein beson- ders hohes Risiko eines Fortschreitens zu einem Zervixkarzinom. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher insbesondere geeignet, das Risiko, dass eine Patientin eine maligne CIN3 entwickeln wird, zu bestimmen. Der Begriff „maligne Vorstufe" bezeichnet eine Vorstufe, die sich - sofern keine medizinische Behandlung vorgenommen wird - zu einem Zervixkarzinom entwickeln wird.

Die Ausdrücke„Neoplasie" und „Dysplasie" werden in der vorliegenden Erfindung synonym verwendet.

Der Begriff „humane und tierische Lebewesen" umfasst Menschen und Tiere, insbesondere weibliche Menschen und Tiere. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Bestimmung des Risikos bei Menschen bestimmt.

Die erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise bei Frauen angewendet, die hr-HPV-positiv getestet worden sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, insbesondere bei hr-HPV-positiv getesteten Frauen diejenigen frühzeitig zu erkennen, die CIN3 und in Folge Zervixkarzinome entwickeln. Die Probe ist daher zweckmäßigerweise eine hr-HPV-positiv getestete Probe oder einer hr-HPV-positiv getesteten Frau entnommen.

Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass die Methylierung von mindestens zwei Genen oder von allen drei Genen der ersten Gruppe bestimmt wird. Erfin- dungsgemäß besteht ein Risiko eines Fortschreitens zu einem Zervixkarzinom, wenn nur eines der drei Gene der ersten Gruppe methyliert ist. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass ein Risiko besteht, wenn in der Probe zumindest zwei der Gene der ersten Gruppe methyliert sind oder wenn in der Probe zumindest drei der Gene der ersten Gruppe methyliert sind.

Die Begriffe„methyliert" oder„Methylierung" bedeuten, dass bei einer Probe der Me- thylierungsstatus bestimmt wird und sich dieser im Vergleich zu einer Probe ohne maligne CIN, also einer unauffälligen Probe, unterscheidet. Der Methylierungsstatus kann mittels bekannter Verfahren, beispielsweise mittels methyl-spezifischer PCR, aber auch mittels Sequenziertechniken oder Verdau mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen, bestimmt werden.

Die Gene der ersten Gruppe und zweiten Gruppe werden im Folgenden auch als „Marker" oder„Markergene" bezeichnet.

Im Sinne des erfindungsgemäßen ersten Verfahrens besteht das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann. Eine solche Probe ist eine positive Probe. Ist die Probe keine positive Probe, so ist sie eine negative Probe.

Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylie- rung bestimmt wird, ohne dass es eines vorbereitenden Schrittes einer DNA-Isolation aus der Probe bedarf. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe und/oder zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe mittels methylierungsspezifischer PCR bestimmt wird. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylierung mittels Zweischritt-PCR im Echtzeit-Format bestimmt wird.

Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass die Methylierung mehrerer oder aller Gene, deren Methylierung bestimmt werden soll, unter gleichen Verfahrensbedin- gungen bestimmt wird. Die Bestimmung der Methylierung der Gene kann gleichzeitig vorgenommen werden. Der Ort der Bestimmung kann sich jedoch für jedes Gen unterscheiden. Es kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass Gene der ersten und/oder der zweiten Gruppe und/oder Kontrollgene zwar in unterschiedlichen Probegefäßen, aber unter den gleichen experimentellen Bedingungen der Zweischritt-PCR unterzogen werden. Bevorzugt wird die Methylierung der Gene der ersten Gruppe und, falls deren Methylierung verfahrensgemäß bestimmt werden soll, der zweiten Gruppe in unterschiedlichen Probegefäßen unter den gleichen experimentellen Bedingungen, beispielsweise der Zweischritt-PCR, vorgenommen. Ist die Bestimmung eines oder mehrerer Kontrollgene vorgesehen, so wird das Vorhan- densein aller Kontrollgene sowie die Methylierung aller Gene der ersten Gruppe und, falls deren Methylierung verfahrensgemäß bestimmt werden soll, der zweiten Gruppe in unterschiedlichen Probegefäßen unter den gleichen experimentellen Bedingungen, beispielsweise der Zweischritt-PCR, bestimmt. Das kann gleichzeitig geschehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner umfassen das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4 (a4-lntegrin), RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide re- ceptor 3) und SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) besteht, methyliert sind. Dabei besteht das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen, wenn

(i) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann; und

(ii) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt. Die Bestimmung, ob zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe methyliert ist, ist dann besonders zweckmäßig, wenn nicht ganz klar festgestellt werden kann, ob zumindest ein Gen der ersten Gruppe methyliert ist. Die Bestimmung, ob zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe methyliert ist, kann aber auch dann durchgeführt werden, wenn feststeht, dass zumindest eines der Gene der ersten Gruppe methyl- iert ist.

Weiterhin kann es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, ein oder mehrere Kontrollgene zu nutzen. Kontrollgene sind Gene, die in der Probe enthalten sind, aber nicht zu der ersten Gruppe und zweiten Gruppe gehören. Die Kontrollgene können genutzt werden, um die Qualität der eingesetzten Probe zu kontrollieren. Beispiele solcher Kontrollgene sind das Gen ACHE (Acetylcholin-Esterase; Accession Number NM_000665, Version Number NM_000665.4, Datenbank NCBI (RefSeq Gene, NC_000007.14)) und das Gen IDS (lduronat-2-Sulfatase; NM_001 166550, Version Number NM_001 166550.3, Datenbank NCBI (RefSeq Gene, NC_000023.1 1)). Jedes der Kontrollgene weist eine Markerregion auf, die es ermöglicht, das Gen in der Probe nachzuweisen - sofern es in der Probe enthalten ist. Es kann vorgesehen sein, dass eine Probe nur dann zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms verwendet wird, wenn das oder die Kontrollgene in der Probe nachgewiesen werden. Nur in diesem Fall wird die Probe als diagnostisch auswertbar angesehen.

Der Nachweis einer Markerregion im Bereich des Gens ACHE ist unabhängig vom Methylierungsstatus des Bereichs, setzt aber die vorherige Behandlung der Probe mit Bisulfit voraus. Die Behandlung der Probe mittels Bisulfit ist nachstehend als Bisulfit-Methode beschrieben. Dabei ist eine Probe nur dann diagnostisch auswertbar, wenn das Gen ACHE über seine Markerregion durch die PCR nachgewiesen ist.

Zum Nachweis des Kontrollgens IDS kann eine Markerregion des Gens verwendet werden, die in dessen Promotorbereich liegt. IDS liegt auf dem X-Chromosom. Bei Frauen ist auf einem der X-Chromosomen das Gen IDS durch eine Hypermethylie- rung der Markerregion inaktiviert. Daher zeigt ein Nachweis dieser Markerregion an, dass eine Probe aus einem weiblichen Individuum stammt. Weiterhin zeigt ein Nachweis der IDS-Markerregion an, dass die DNA-Methylierung in der verwendeten Probe während Entnahme, Transport und Lagerung erhalten geblieben ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich zu der Methylierung von Genen der ersten Gruppe und, falls deren Methylierung verfahrensgemäß bestimmt werden soll, der zweiten Gruppe das Kontrollgen ACHE per Echtzeit-Polymerase- Kettenreaktion nachgewiesen. Dabei kann es hilfreich sein, den bei der Auswertung für das Kontrollgen ACHE ermittelten Amplifikationswert jeweils von den für die Gene der ersten und, falls deren Bestimmung verfahrensgemäß vorgesehen ist, der zweiten Gruppe erhaltenen Amplifikationswerten zu subtrahieren. Liegt der ermittelte Differenzwert für ein Gen der ersten oder zweiten Gruppe unterhalb eines Schwellen- wertes, gilt die Methylierung dieses Genes als nachgewiesen, anderenfalls als nicht nachgewiesen. Dieser Schwellenwert kann beispielsweise je nach Ausführungsform der Erfindung zwischen 8 und 10 variieren. Der Amplifikationswert ist der Wert, bei dem das Vorhandensein des Ausgangsmaterials sichtbar wird. Dieser Wert wird in der Fachsprache auch als„Threshold Cycle" oder Ct-Wert bezeichnet. Wird der Methylierungsstatus der Gene durch Echtzeit- Polymerase-Kettenreaktion nachgewiesen, gibt der Ct-Wert oder Amplifikationswert ein Maß für die Menge an Ausgangs-DNA der jeweiligen Markerregion an. Je mehr Desoxyribonucleinsäure einer Markerregion vor der PCR in der Probenlösung vorlag, desto mehr Kopien entstehen in den Polymerisierungszyklen. Die Anzahl der Zyklen, bei der die Fluoreszenz, welche ein Maß für die Menge der amplifizierten DNA ist, einen festgesetzten Schwellenwert übersteigt, ist dann der Ct-Wert oder Amplifikati- onswert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Prognose, ob die Patientin, der die Probe entnommen worden ist, ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, entwickelt, sofern sie sich keiner Behandlung unterzieht. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher vorteilhafterweise mit einer Probe durchgeführt, die einer Patientin entnommen wurde, bei der zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder vorher kein Zervixkarzinomen und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, festgestellt worden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher mit einer Probe durchgeführt, die einer Patientin entnommen wurde, die weder zum Zeitpunkt der Probenentnahme noch zu einem früheren Zeitpunkt ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein prognostisches Verfahren zur Bestimmung, ob eine Patientin ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe, insbesondere maligne CIN3, davon entwickeln könnte.

Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit der frühzeitigen Diagnose von Gewebeveränderungen des Gebärmutterhalses, die das Potenzial zur Entwicklung einer malignen zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN3) haben, durch den Nachweis von hypermethylierten DNA-Regionen. Solche CIN3 haben eine hohe Wahrscheinlichkeit, zu einem Karzinom fortzuschreiten, gelten daher als Krebsvorstufen, die behandelt werden müssen. Ihr frühzeitiger zuverlässiger Nachweis ist von besonders hohem Interesse, da Patientinnen mit Potenzial zur Entwicklung einer solchen hoch- gradigen Dysplasie bereits vor deren Ausbildung erkannt, entsprechend diagnostisch überwacht und schließlich auch rechtzeitig gezielt behandelt werden können. Dies ist von besonderem Interesse, da solche CIN3 bereits bei Frauen mit Kinderwunsch auftreten. Nach einer operativen Behandlung einer hochgradigen Dysplasie haben Frauen ein stark erhöhtes Risiko zur Früh- und Fehlgeburtlichkeit, wobei das Risiko umso höher ist, je tiefgreifender der operative Eingriff war. Die (frühzeitige) Entfernung von möglichst kleinen malignen Gewebeveränderungen minimiert damit das Risiko der erhöhten Früh- und Fehlgeburtlichkeit. Weiterhin hilft die Unterscheidung zwischen malignen und nicht malignen Dysplasien, Operationen bei Frauen mit nicht malignen Dysplasien zu vermeiden und damit, bei diesen das Risiko einer aus einer solchen Operation folgenden erhöhten Früh- und Fehlgeburtlichkeit zu minimieren.

Damit unterscheidet sich die vorliegende Erfindung erheblich vom Stand der Technik, aus dem zwar die Erkennung von Zervixkarzinomen und deren Vorstufen bekannt ist. Im Stand der Technik ist aber nicht beschrieben, dass Neoplasien mit malignem Potential, die sehr häufig zu einem Karzinom führen, bereits vor ihrer histopathologi- schen Erkennung durch den Nachweis von DNA-Methylierungsmarkern erkannt und von nicht-malignen Neoplasien diskriminiert werden können. Dies wurde in den der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchungen erstmals gezeigt.

In den erfindungsgemäßen Verfahren wird speziell die Hypermethylierung von DNA- Regionen im Promotorbereich und/oder im 5'-Bereich der Gene ASTN1 (Astrotactin 1 ), und/oder DLX1 (distal-less homeobox 1 , Transkriptionsfaktor), und/oder ZNF671 (Zinkfinger-Protein 671 ; Transkriptionsfaktor) untersucht. Die dieser Erfindung zu- gründe liegenden Untersuchungen haben gezeigt, dass eine DNA-Methylierung in Guanin-/Cytosin-reichen Bereichen, sogenannten CpG-lnseln, im Promotorbereich und/oder im 5'-Bereich wenigstens eines dieser drei Gene oder zwei dieser drei Gene oder aller drei Gene bereits frühzeitig in der Entstehung von hochgradigen malignen Dysplasien (CIN3) nachgewiesen werden kann. Ihr Nachweis kann damit für die frühzeitige Erkennung von sich entwickelnder maligner CIN3, also einer inzidenten malignen CIN3, diagnostisch genutzt werden.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass es unter Verwendung einer ersten Probe, die dem Lebewesen zu einem ersten Zeitpunkt entnommen wurde, und einer zweiten Probe, die dem Lebewesen zu einem zweiten Zeitpunkt entnommen wurde, durchgeführt wird, wobei der zweite Zeitpunkt zumindest 10 Tage nach dem ersten Zeitpunkt liegt und wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und,

(b) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der ersten und zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass es die Schritte umfasst:

(a1) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind;

(a2) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind;

(b1) wenn in der zweiten Probe (i) eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder

(ii) wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt,

Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und

(b2) wenn in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn (i) in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt; und (ii) in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt. Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen vorgesehen. Das Kit ist insbesondere für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt. Das Kit umfasst Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylie- rungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1 , DLX1 und ZNF671 besteht, in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelte Proben-DNA binden. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4, RXFP3 und SOX17 besteht, in der Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelte Proben-DNA aus der Probe binden. Das Kit kann zusätzlich Primer oder Primerpaare zum Nachweis des oder der Kontrollgene umfassen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den nachfolgend näher beschriebenen Erkenntnissen der Erfinder hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen dem Methylierungsstatus bestimmter DNA-Abschnitte und der Entwicklung von hochgradigen Dysplasien CIN3, die das Potenzial zur Progression zu einem Zervixkarzinom (ma- lignes Potentail) haben. In solchen hochgradigen Dysplasien CIN3 und in Karzinomen werden im Vergleich zum entsprechenden Normalgewebe die Cytosin/Guanin- reichen CpG-lnseln im Upstream-, Promotor- und in promotornahen Exonbereichen von bestimmten Genen häufig methyliert. Diese Methylierung von DNA-Regionen geschieht nicht willkürlich, sondern ist von den jeweiligen Tumor-Entitäten und Tu- mor-Typen abhängig (Esteller, 2007, Hum. Mol. Genet., 16: R50-R59).

Im Rahmen der Erfindung wurden Abstrichproben von Frauen untersucht, die bereits vor der Erkennung einer histopathologisch bestätigten hochgradigen Dysplasie CIN3 mindestens einmal an einer Untersuchung mit Entnahme einer Abstrichprobe sowie einer Gewebeprobe teilgenommen haben. Die hier aufgeführte Analyse zeigt erstmals, dass die Methylierung bestimmter Bereiche der Gene ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 einen wertvollen Marker zur frühzeitigen Diagnose von Patientinnen mit beginnenden malignen Dysplasien, insbesondere hochgradigen malignen Dysplasien CIN3, in einer Probe darstellt. Die vorliegende Erfindung stellt daher ver- besserte Methoden zum Nachweis einer inzidenten malignen CIN3 in einer Probe (z.B. Zellabstrich des Gebärmuttermundes, Zervikalspülung) bereit.

Obwohl die Bestimmung des Methylierungsstatus der drei vorgenannten Genregionen, wie von den Erfindern gezeigt, schon höchst aussagekräftig ist, kann es zur Ab- Sicherung der Diagnose in medizinischen Ausnahmefällen hilfreich sein, auch den Methylierungsstatus einer oder mehrerer weiterer Genregionen wie ITGA4 (a4- Integrin) und/oder RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und/oder SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) zu ermitteln.

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Nachweis des Methylierungsstatus von ASTN1 , DLX1 und ZNF671. Der Nachweis kann ein direkter oder ein indirekter Nachweis sein. Vorzugsweise wird nachgewiesen, ob die Promotorbereiche der Gene ASTN1 , DLX1 und ZNF671 hypermethyliert sind. Da Methylierung meist an Pro- motorregionen von Genen stattfindet, konzentrieren sich Methoden zum Nachweis der Methylierung der relevanten Gene meist auf diese Regionen. Allerdings können Gene auch in anderen als der Promotorregion methyliert sein, da die GC-reichen CpG-lnseln sich nicht nur dort befinden. Der Nachweis einer Methylierung in solchen weiteren Bereichen der genannten Gene kann auch von diagnostischem Nutzen sein und ist damit auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Zum Nachweis des Methylierungsstatus der Gene ASTN1 , DLX1 und ZNF671 wird untersucht, ob bestimmte Cytosine zu 5-Methylcytosin modifiziert, also methyliert sind oder nicht. In DNA aus einer Probe von einer Frau ohne hr-HPV-lnfektion oder von einer Frau mit einer hr-HPV-lnfektion ohne nachweisbare klinische Veränderungen ist die Methylierung in den entsprechenden Positionen der DNA selten bis gar nicht nachweisbar. Bei Frauen mit maligner Dysplasie oder Karzinom ist die Wahrscheinlichkeit für eine Methylierung an den gewählten Cytosinresten dagegen hoch. Die Untersuchungen, welche dieser Erfindung zugrunde liegen, haben überraschend gezeigt, dass bei Frauen, die eine hochgradige Dysplasie mit malignem Potential entwickeln, die Methylierung der Genabschnitte ASTN1 , DLX1 und ZNF671 zeitlich bereits deutlich vor der histopathologischen Entdeckung dieser Dysplasie nachweisbar ist. Damit ist gezeigt, dass die Methylierung dieser DNA-Regionen ein frühes Er- eignis in der Ausbildung von hochgradigen Dysplasien und folglich wahrscheinlich auch von Karzinomen darstellt. Somit ist das hier aufgezeigte Verfahren dazu geeignet, frühzeitig in der Krebsfrüherkennung diejenigen Patientinnen zu erkennen, die sehr genau auf Gewebeveränderungen untersucht werden müssen, um durch frühzeitige gezielte Eingriffe die negativen Folgen zu minimieren. Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere ein Verfahren zur Erkennung von inzidenter CIN3 mit Potenzial zur Progression zu einem Zervixkarzinom durch die Bestimmung des Methylierungsstatus bestimmter Genregionen im Bereich von ASTN1 (Astrotactin 1 ), DLX1 (distal-less homeobox 1 , Transkriptionsfaktor) und ZNF671 (Zinkfinger-Protein 671 , Transkriptionsfaktor), wobei eine nachweisbare Me- thylierung wenigstens einer dieser Genregionen ein Hinweis auf die Entstehung einer hochgradigen Dysplasie CIN3 ist. Im Verlauf der Untersuchungen, die dieser Erfindung zugrunde liegen, wurde auch der Methylierungsstatus der Genregionen ITGA4 (a4-lntegrin), RXFP3 (re- laxin/insulin-like family peptide receptor 3) und SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass optional bei uneindeutigen Befunden zusätzlich noch der Methylierungsstatus dieser Gene untersucht werden kann.

ASTN1 (Astrotactin 1 ; accession number NM_004319.1 , NM_207108 enthalten in NC_000001 .9) ist ein Adhäsionsprotein, das eine wichtige Rolle bei der Migration von neuronalen Zellen spielt. DLX1 (distal-less homeoboxl ; accession numbers NM_178120, NM_001038493, enthalten in NC_000002.1 1) ist ein Transkriptionsfak- tor und beeinflusst Zelldifferenzierung. ZNF671 (accession number NM_ 024883, enthalten in NC_000019.9) ist ein Transkriptionsfaktor mit einem typischen Zinkfinger-Motiv. ITGA4 (α-4-lntegrin; accession number NM_000885, enthalten in NC_000002.10) gehört zur Familie der α-lntegrine, welche zusammen mit jeweils einem ß-lntegrin als integrale Membranproteine auftreten. Sie dienen als Rezeptoren für Fibronectin und spielen somit eine wesentliche Rolle bei der Zelladhäsion. RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3; accession number NM_016568, enthalten in NC_000005.8) dient als G-Protein-gekoppelter Rezeptor für Relaxin 3. SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17; accession number NM_022454, enthalten in NC_000008.1 1) ist ein Transkriptionsfaktor, der bei Embryogenese und Zelldiffe- renzierung eine Rolle spielt. Die vorstehend angegebenen Accession Numbers beziehen sich auf die Datenbank GenBank.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck„Probe" umfasst jegliche Körperproben, in denen DNA-Methylierung nachgewiesen werden kann. Beispiele solcher Körperproben sind Blut, Abstriche, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, gastro- intestinale Sekrete, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Organpunktate und Biopsien. Insbesondere sind Abstriche und Biopsien vorteilhaft, wenn inzidente CIN mit malignem Potential erkannt werden sollen. Der Fachmann kennt geeignete Verfahren und Hilfsmittel zur Probenentnahme. Der Fachmann kennt auch Verfahren und Reagenzien zur DNA-Isolierung aus der Probe, z. B. Extraktion mit Phenol/Chloroform oder mittels kommerzieller Kits.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck„Methylierungsstatus" be- zieht sich auf die Hypermethylierung der genomischen DNA im Bereich der Primer- Bindungsstellen der betreffenden Genregionen, vorzugsweise in GC-reichen CpG- Inseln im 5'- und Promotorbereich der bezeichneten Gene.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Methylierung von CG-reichen Regionen im Bereich der Gene ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 bestimmt. Der hier verwendete Begriff„Methylierung" ist synonym mit dem in der Molekularbiologie gängigen Begriff „Hypermethylierung". Er bezeichnet die vom Normalzustand abweichende Methylierung innerhalb eines allgemein an Guanin und Cytosin und besonders an CG-Dinukleotiden reichen DNA-Abschnittes, einer sogenannten CpG-lnsel. Vorzugsweise handelt es sich bei der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Probe um einen Gebärmutterhalsabstrich, der sehr zuverlässige Ergebnisse liefert.

Vorzugsweise wird die Methylierung von DNA nach einer vorangegangenen chemi- sehen Modifikation von nicht-methylierten Cytosinen durch die Bisulfit-Methode mittels einer sogenannten methylierungsspezifischen PCR (MSP) unter Verwendung geeigneter Primerpaare nachgewiesen. Bei der Bisulfit-Methode werden unmethylier- te Cytosine in Uracil umgewandelt, methylierte Cytosine (5-Methylcytosin) sind vor dieser Umwandlung geschützt. Uracil weist andere Paarungseigenschaften als Cyto- sin auf, d.h., es verhält sich wie Thymin. Die MSP ist eine etablierte Technik zum Nachweis von DNA-Methylierung. Die MSP beruht auf Primern und eventuell Sonden, die eine Unterscheidung zwischen methylierter und unmethylierter DNA erlauben, d. h., die Ausbildung eines Amplifikationsproduktes zeigt eine Methylierung an, entspricht somit einem positiven Befund. Das Design der Primer für die Detektion des Methylierungsstatus hängt von der Lokalisierung und Sequenz der Methylierungsbereiche von ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 sowie von den Methylierungsbereichen von ITGA4 und/oder RXFP3 und/oder SOX17 ab, falls optional auch der Methylierungsstatus dieser Gene bestimmt werden soll.

Die in dieser Erfindung verwendbaren methylierungsspezifischen Primer für ASTN1 , DLX1 und ZNF671 binden während des Testverfahrens nur dann an die chemisch mit Bisulfit modifizierte Proben-DNA, wenn diese an bestimmten Cytosinen innerhalb der Primerbindestellen methyliert war. Waren diese Bereiche vor Bisulfit-Behandlung nicht methyliert, binden auch die Primer nicht, und es entsteht kein Reaktionsprodukt. So weist die Anwesenheit eines Reaktionsproduktes auf eine Methylierung des DNA-Bereiches des jeweiligen Gens und damit auf das mögliche Vorliegen eines Ri- sikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen, insbesondere einer inzidenten CIN3, hin.

Der Nachweis der methylierten Genregionen erfolgt vorzugsweise in einem Real-time PCR-Verfahren (QMSP), das nicht nur eine qualitative Erfassung der Methylierung, sondern auch eine Quantifizierung der methylierten DNA-Abschnitte erlaubt. Diese QMSP kann in einem fluoreszenzbasierten Realtime-Verfahren durchgeführt werden, bei dem die Entstehung des methylierungsspezifischen Produktes durch den Einbau eines fluoreszenten Farbstoffes, z. B. SYBR-Green oder EVA-Green, verfolgt wird. Mit beiden Verfahren, MSP und QMSP, kann die Methylierung von Markergenen in einem hohen Hintergrund von nicht-methylierter DNA nachgewiesen werden (Sha- mes et al., 2007, Cancer Lett. 251 : 187-98). PCR-basierte Methoden können auch in Hochdurchsatz-Verfahren angewendet werden und sind daher auch für den diagnostischen Nachweis im Rahmen der Krebsfrüherkennung besonders geeignet.

Alternativ kann die Entstehung der PCR-Produkte der MSP auch nach Abschluss der PCR durch ein Hybridisierungsverfahren, z. B. durch Streifen oder Arrays mit fixierten Sonden, an denen entstandene PCR-Produkte binden, nachgewiesen werden. Weiterhin können bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens positive und/oder negative Kontrollgene, z.B., ein unmethyliertes oder ein methyliertes Kontrollgen co-amplifziert werden. Dem Fachmann sind weitere Techniken, wie z. B. der Einsatz von methylierungssen- sitiven DNA-Restriktionsenzymen zur Unterscheidung zwischen methylierter und nicht-methylierter DNA mit anschließender PCR, oder die Hochdurchsatz- Sequenzierung von chemisch mit Bisulfit behandelter DNA zum Nachweis vormals methylierter DNA-Abschnitte, bekannt, um methylierte DNA-Regionen nachzuweisen. Auch diese und weitere Nachweistechniken für die methylierten DNA-Regionen umfasst die Erfindung.

Es ist bekannt, dass die Methylierung von Genen oft mit einer Transkriptionsblockade und dadurch einer fehlenden Translation in Zusammenhang steht. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch die indirekte Bestimmung des Methylierungs- status durch Bestimmung der Konzentration der entsprechenden RNA bzw. des Proteins. Deren Nachweis kann durch übliche Verfahren erfolgen, z. B. (für RNA) über Northern-Blot-Analyse, RT-PCR etc. und (für Proteine) Antikörper-basierte Verfahren oder Verfahren, die auf der Bestimmung einer biologischen Aktivität des Proteins ba- sieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auf den folgenden Schritten beruhen: (i) Vom Zellabstrich der zu testenden Person wird DNA nach einem Standard- Verfahren isoliert, z. B. QiaAmp DNA-Mini Kit, nach Vorschrift des Herstellers (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Alternativ kann eine Abstrichprobe mit einem lysierenden Medium, wie z. B. STM (QIAGEN) versetzt und direkt auf die Anwesenheit von hr-HPV-DNA, siehe nachfolgend (ii), untersucht oder in der chemischen Behandlung durch Bisulfit, siehe nachfolgend (iv), eingesetzt werden, ohne den vorherigen Schritt der Aufreinigung der Proben-DNA.

(ii) Vorzugsweise wird in einem zweiten Schritt untersucht, ob die zu analysierende Probe hr-HPV-DNA enthält. Dieser Nachweis erfolgt mit einem bereits etab- Herten Verfahren wie z.B. dem GP5+/6+-PCR EIA-Verfahren (Jacobs et al., 1995, J Clin Microbiol 33:901 -905) oder einem kommerziellen Verfahren, wie z. B. Hybrid Capture II (QIAGEN). Sämtliche hr-HPV-Typen (HPV16, 18, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82) sollten erfasst werden. Durch den Nachweis eines house-keeping Gens, z.B. ß-Globin, ACHE oder ß-

Actin, wird sichergestellt, dass in der Probe eine ausreichende Menge an DNA von ausreichender Qualität vorliegt, die auch amplifizierbar ist.

(iii) Bei einer HPV-negativen Probe ist die Entstehung einer malignen Dysplasie nahezu 100 % ausgeschlossen (Cuzick et al., 2006; Int. J. Cancer. 1 19:1095-

1 101). Diese Proben müssen daher nicht weiter untersucht werden. Die Differenzierung zwischen Frauen mit einem hr-HPV-positiven Befund entweder mit oder ohne maligne CIN erfolgt dann über die Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene von ASTN1 , DLX1 und ZNF671 ; der Nach- weis des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene ITGA4, RXFP3 und

SOX17 kann bei der Diagnose unterstützen.

(iv) Dazu wird die DNA der hr-HPV-positiven Proben oder Material aus einem Abstrich in STM-Medium nach der Bisulfit-Methode, z. B. mittels eines kommerzi- eilen Kits (z. B. EpiTect Fast, QIAGEN), chemisch konvertiert. Dabei werden durch Behandlung mit Natrium-Bisulfit und nachfolgende alkalische Hydrolyse alle nicht methylierten Cytosine der DNA-Probe in Uracile umgewandelt.

(v) Die vormals methylierte DNA wird mittels spezifischer Primer für die methylierte Form der jeweiligen Genomabschnitte durch PCR amplifiziert und analysiert.

(vi) Zum Nachweis der Methylierung des Gens ASTN1 in einer methylierungsspezi- fischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Name Primersequenz

ASTN1 -f CGTAAGCGTTGTTAGCGTAGC

ASTN1 -rev CGCGAAATCGAAACGAAAACG Zum Nachweis der Methylierung des Gens DLX1 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Zum Nachweis der Methylierung des Gens ZNF671 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Das erfindungsgemäße Verfahren beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser Primer für den Nachweis der Methylierung der Gene ASTN1 , DLX1 und/oder ZNF671 . Die Nutzung von Primern mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der bezeichneten Genregionen dienen können, werden durch diese Erfindung ebenfalls erfasst.

(vii) Zum Nachweis der Methylierung der Genabschnitte ASTN1 , DLX1 und/oder ZNF671 durch MethyLight-Analyse können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Primern eine oder mehrere der folgenden fluoreszierenden Son- den eingesetzt werden:

Die Sonden können, je nach Applikation, mit entsprechenden fluoreszenten Farbstoffen gekoppelt sein. Die Erfindung beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser speziellen Sonden für den Nachweis der Methylierung der Genregionen ASTN 1 , DLX1 und/oder ZNF671 . Sie umfasst auch Sonden mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der beiden Gene dienen können.

Eine Quantifizierung der Methylierung der Markergene ist nicht zwingend. Entscheidend ist, dass, z.B. durch MSP oder QMSP, mindestens eine Zelle mit methylierten Markergen(en) in einem Hintergrund von 1000 Zellen ohne methylierte(s) Marker- gen(e) nachgewiesen werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Methylierung einer oder mehrerer der Gene ITGA4, RXFP3 und/oder SOX17 überprüft. Zum Nachweis der Methylierung des Gens ITGA4 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Zum Nachweis der Methylierung des Gens RXFP3 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Zum Nachweis der Methylierung des Gens SOX17 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

SOX17-f GGGATACGGTTTAAGAGTCGTTC

SOX17-rev ACGATACTCCACTACTACGCCG Zum Nachweis der Methylierung der Gene ITGA4, RXFP3 und/oder SOX17 durch MethyLight-Analyse können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Primern eine oder mehrere der folgenden fluoreszierenden Sonden eingesetzt werden:

Die Sonden können, je nach Applikation, mit entsprechenden fluoreszenten Farbstoffen gekoppelt sein. Die Erfindung beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser speziellen Sonden für den Nachweis der Methylierung der Gene ITGA4, RXFP3 und SOX17. Sie umfasst auch Sonden mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der beiden Gene dienen können.

Zum Nachweis des Gens ACHE können die folgenden Primer eingesetzt werden:

Zum Nachweis des Gens IDS können die folgenden Primer eingesetzt werden:

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein solches Kit umfasst genspezifische Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus der Genregionen von ASTN1 (Astrotactin 1 ), DLX1 (distal-less homeoboxl ) und ZNF671 (Zinkfingerprotein, Transkriptionsfaktor), vorzugsweise die vorstehend näher definierten Primer bzw. Primerpaare. In einer weiteren Ausführungsform kann das Kit zusätzlich genspezifische Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus von ITGA4 (a4-lntegrin) und/oder RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und/oder SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17), vorzugsweise die vorste- hend näher definierten Primer bzw. Primerpaare, enthalten.

Das Kit kann zusätzlich zu den Primerpaaren für die jeweiligen Genregionen fluores- zent markierte Sonden enthalten, falls eine Detektion der Marker mit dem MethyL- ight-Verfahren erfolgen soll.

Das Kit kann in getrennten Behältern zusätzlich folgende Reagenzien und Bestandteile enthalten:

(a) Enzyme zur Amplifikation von DNA

(b) einen oder mehrere Puffer

Von den einzelnen Kitkomponenten können einzelne oder mehrere Vertreter vorliegen.

Werden die Reaktionsprodukte im Anschluss an die Amplifikation durch Endpunkt- PCR nachgewiesen, kann das Kit zusätzlich zu den obigen Bestandteilen

(a) Arrays oder Teststreifen mit fixierten Detektionssonden zum Nachweis der Reaktionsprodukte

(b) einen oder mehrere Puffer

enthalten. Mit der vorliegenden Erfindung ist es somit möglich, frühzeitig zu erkennen, ob ein Lebewesen ein Zervixkarzinom oder eine seiner malignen Vorstufen, insbesondere eine maligne inzidente CIN3, entwickelt. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens kann bestimmt werden, ob eine maligne Vorstufe entsteht oder vorliegt. Damit können Frauen mit hr-HPV-lnfektion identifiziert werden, die eine hochgradige Dysplasie CIN3 mit malignem Potenzial bzw. ein Karzinom entwickeln werden. Kennzeichnend ist ferner, dass die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erzielten Ergebnisse nicht einer subjektiven Bewertung unterliegen, wodurch z.B. die falsch-negativen bzw. falsch-positiven Ergebnisse eines mikroskopischen Verfahrens wie des Pap- Tests vermieden werden können. Somit liefert die vorliegende Erfindung einen wichtigen Beitrag zur modernen Diagnostik im Bereich Gebärmutterhalskrebs.

Mittels einer Kombination der Bestimmung des Methylierungsstatus von ASTN1 , DLX1 und ZNF671 kann eine Erkennung einer inzidenten CIN3 erreicht werden, die über die Einzelbestimmung anderer Gene hinausgeht.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein zweites Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens vorgesehen. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Bestimmen in der Probe, ob die Gene ASTN1 , DLX1 , ZNF671 , ITGA4, RXFP3 und SOX17 methyliert sind;

(ii) Zuordnen eines Faktors zu jedem Gen, wobei der Faktor gleich Null ist, wenn das Gen nicht methyliert ist, und der Faktor größer Null ist, wenn das Gen methyliert ist; und (iii) Berechnen der Summe der Faktoren aller Gene, deren Methylierung bestimmt wurde, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn die Summe der Faktoren einen Grenzwert erreicht oder übersteigt. Das zweite Verfahren gleicht dem ersten Verfahren, außer dass der Methylierungsstatus aller sechs Gene bestimmt wird und der Einfluss der sechs Gene auf das Risiko mittels Faktoren gewichtet wird. Das zweite Verfahren sieht damit die Bestimmung des Methylierungsstatus aller Gene der ersten Gruppe und aller Gene der zweiten Gruppe vor. Die obigen Ausführungen zum ersten Verfahren gelten damit auch für das zweite Verfahren mit der Maßgabe, dass die Methylierung aller Gene der ersten Gruppe und die Methylierung aller Gene der zweiten Gruppe bestimmt wird. Mit dem zweiten Verfahren werden die Unsicherheiten vermieden, die sich ergeben, wenn die Methylierung von Genen der ersten Gruppe nicht eindeutig nachgewiesen werden kann. Die in Schritt (i) genannten Gene werden im Folgenden auch als„Marker" oder „Markergene" bezeichnet.

Die Faktoren können damit die Bestimmung des Risikos weiter verbessern. Der Fak- tor eines Genes ist 0, wenn eine Methylierung des Gens in einer Probe nicht vorliegt. Der Faktor ist größer 0, wenn eine Methylierung des Gens in der Probe vorliegt. Die Probe gilt dann als positiv, wenn die Summe der Faktoren einen Grenzwert erreicht oder übersteigt. Liegt die Summe der Faktoren unter dem Grenzwert, so ist die Probe negativ. Die Summe der Faktoren ergibt sich durch Addition der sechs Faktoren, die für jedes der sechs Gene ermittelt wurden.

Der Faktor für ein Gen, das methyliert ist, sollte kleiner oder gleich 1 sein. Zumindest ein methyliertes Gen sollte einen höheren Faktor als ein anderes methyliertes Gen aufweisen. Vorzugsweise weist das methylierte Gen ZNF671 den höchsten Faktor auf. Den niedrigsten Faktor weist vorzugsweise das methylierte Gen DLX1 auf. Die Faktoren für ASTN1 , ITGA4, RXFP3 und SOX17 sind vorzugsweise größer als der Faktor für DLX1 und kleiner als der Faktor für ZNF671. Beispielsweise können den Genen folgende Faktoren zugewiesen werden, wenn das jeweilige Gen methyliert ist: ASTN1 = 0,2; DLX1 = 0, 1 ; ZNF671 = 0,5; ITGA4 = 0,2; RXFP3 = 0,2; SOX17 = 0,2. Der Grenzwert kann beispielsweise 0,5 betragen. Eine Probe kann dann als positiv gelten, wenn die Summe der Faktoren größer oder gleich 0,5 ist.

Es kann vorgesehen sein, dass zumindest ein Kontrollgen in der Probe nachgewiesen wird, um zu beurteilen, ob die Probe zur Bestimmung des Risikos einer Entwick- lung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen geeignet ist. Kontrollgene sind Gene, die in der Probe enthalten sind, aber nicht zu den in Schritt (i) aufgeführten Genen gehören. Die Kontrollgene können genutzt werden, um die Qualität der eingesetzten Probe zu kontrollieren. Beispiele solcher Kontrollgene sind das Gen ACHE (Acetylcholin-Esterase) und das Gen IDS (lduronat-2-Sulfatase). Jedes der Kontrollgene weist eine Markerregion auf, die es ermöglicht, das Gen in der Probe nachzuweisen - sofern es in der Probe enthalten ist. Es kann vorgesehen sein, dass eine Probe nur dann zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms verwendet wird, wenn das oder die Kontrollgene in der Probe nachge- wiesen werden. Nur in diesem Fall wird die Probe als diagnostisch auswertbar angesehen.

Zum Nachweis des Kontrollgens IDS kann eine Markerregion des Gens verwendet werden, die in dessen Promotorbereich liegt. IDS liegt auf dem X-Chromosom. Bei Frauen ist auf einem der X-Chromosomen das Gen IDS durch eine Hypermethylie- rung der Markerregion inaktiviert. Daher zeigt ein Nachweis dieser Markerregion an, dass eine Probe aus einem weiblichen Individuum stammt.

Das Kontrollgen ACHE kann per Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion nachgewiesen werden. Dabei kann es hilfreich sein, den bei der Auswertung für das Kontrollgen ACHE ermittelten Amplifikationswert jeweils von den Amplifikationswerten, die für die in Schritt (i) genannten Gene erhalten werden, zu subtrahieren. Liegt der ermittelte Differenzwert für ein Gen unterhalb eines Schwellenwertes, gilt die Methylierung dieses Genes als nachgewiesen, anderenfalls als nicht nachgewiesen. Dieser Schwellenwert kann beispielsweise je nach Ausführungsform der Erfindung zwischen 8 und 10 variieren. Vorzugsweise wird die Methylierung aller in Schritt (i) genannten Gene unter den gleichen Versuchsbedingungen bestimmt. Unter diesen Versuchsbedingungen können, sofern vorgesehen, auch eines oder mehrere, bevorzugt alle Kontrollgene nachgewiesen werden. Es kann vorgesehen sein, dass die Methylierung der in Schritt (i) genannten Gene gleichzeitig bestimmt wird. Auch das oder die Kontrollge- ne können gleichzeitig mit den in Schritt (i) genannten Genen bestimmt werden. Der Ort der Bestimmung kann sich jedoch für jedes Gen unterscheiden. Mit anderen Worten, die in Schritt (i) genannten Gene und, falls vorgesehen, die Kontrollgene können zwar in unterschiedlichen Probegefäßen, aber unter den gleichen experimentellen Bedingungen der Zweischritt-PCR gleichzeitig unterzogen werden. Ein Kit, das insbesondere zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zer- vixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen mittels des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, umfasst Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus der Gene ASTN1 , DLX1 , ZNF671 , ITGA4, RXFP3 und SOX17 in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA binden. Das Kit kann zusätzlich Primer oder Primerpaare zum Nachweis des oder der Kontrollgene umfassen. Das Kit kann zusätzlich zu den Pri- merpaaren für die jeweiligen Genregionen fluoreszent markierte Sonden enthalten, falls eine Detektion der Marker mit dem MethyLight-Verfahren erfolgen soll.

(a) Enzyme zur Amplifikation von DNA

(b) einen oder mehrere Puffer

Von den einzelnen Kitkomponenten können einzelne oder mehrere Vertreter vorliegen. Werden die Reaktionsprodukte im Anschluss an die Amplifikation durch Endpunkt- PCR nachgewiesen, kann das Kit zusätzlich zu den obigen Bestandteilen

(b) einen oder mehrere Puffer

enthalten.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels näher erläutert.

Beispiel: Frühzeitige Bestimmung der DNA-Methylierung in Abstrichen

Untersucht wurden Abstriche von 31 Frauen, die im Rahmen von kolposkopischen Untersuchungen genommen wurden. Von jeder Frau wurden Abstriche an mindestens zwei unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten genommen. Zusätzlich wurden an den jeweiligen Untersuchungszeitpunkten teilweise Gewebeproben genom- men. Zum jeweils letzten Untersuchungszeitpunkt wurde bei den Frauen histopatho- logisch eine hochgradige Dysplasie CIN3 diagnostiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und den Tabellen 2A und 2B dargestellt. Tabelle 1 zeigt, wie häufig die Genregionen ASTN1 , DLX1 und ZNF671 zu einem ersten Zeitpunkt methyliert vorlagen (Zeile„vorher"). In der Zeile„gleichzeitig" ist angeben, wie häufig die Genregionen ASTN1 , DLX1 und ZNF671 , die zum ersten Zeitpunkt nicht methyliert vorlagen, zum zweiten Zeitpunkt, bei dem eine CIN3 histologisch nachgewiesen wurde, methyliert vorlagen. In der Zeile„nicht" ist angeben, wie häufig die Genregionen ASTN1 , DLX1 und ZNF671 , die zum ersten Zeitpunkt nicht methyliert vorlagen, auch zum zweiten Zeitpunkt, bei dem eine CIN3 histologisch nachgewiesen wurde, nicht methyliert vorlagen.

Eine frühere Methylierung wenigstens eines der Gene trat bei 84 % der Patientinnen auf. Durch die Kombination der drei Gene kann somit eine frühere Diagnose einer sich entwickelnden CIN3 erreicht werden. Dies zeigt die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Außerdem konnte eine starke Korrelation nachgewiesen werden zwischen einem po- sitiven Methylierungsbefund und einem malignen Potential einer histopathologisch bestätigten CIN3.

Tabelle 1 :

Methylierungsstatus von konsekutiv gesammelten Abstrichproben von Frauen mit histopathologischer Enddiagnose CIN3. Insgesamt wurden die Abstrichproben von 31 Patientinnen untersucht, wobei von jeder einzelnen Patientin mindestens zwei Proben vorlagen. Eine Probe gilt als positiv, wenn in wenigstens einer der drei Genregionen in der Analyse eine Methylierung nachgewiesen werden kann.

Erkennung im ASTN1 DLX1 ZNF671 Anzahl PatienRelativer Anteil

Vergleich zu His- tinnen, die für der Patientintopathologie mindestens nen, die für

CIN3 einen der drei mindestens

Marker positiv einen der drei ist Marker positiv ist

vorher 10 19 14 26 83,9 % gleichzeitig 7 8 7 4 12,9 % nicht 13 3 9 1 3,2 %

In den Tabellen 2A und 2B ist gezeigt, wie viel früher eine Diagnose aufgrund des Methylierungsstatus der drei Genregionen ASTN1 , DLX1 oder ZNF671 gestellt wer- den konnte, und zwar bei den 26 Patientinnen, bei denen eine der Genregionen ASTN1 , DLX1 und ZNF671 zu einem ersten Zeitpunkt methyliert vorlag (vgl. die Zeile „vorher" in Tabelle 1 ). Bei über 46 % der Patientinnen war eine Methylierung einer der drei Genregionen bereits von größer 1 Jahr bis 6 Jahre, bei fast 31 % der Patientinnen eine Methylierung einer der drei Genregionen 6 bis 12 Monate vor der histopa- thologischen Diagnose von CIN3 möglich. Dies belegt, dass aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Nachweis einer Methylierung zumindest einer der drei genannten Genregionen eine frühzeitige Erkennung von inzidentem CIN3 mit malignem Potential und damit eine bessere Strategie für eine schonende Behandlung von Gewebeveränderungen am Gebärmutterhals erfolgen kann.

Tabelle 2A:

Zeitliche Verteilung der Diagnosen: Wie frühzeitig vor einer CIN3-Diagnose wurde eine Methylierung eines der drei Marker ASTN1 , DLX1 , und ZNF671 nachgewiesen?

Tabelle 2B

Zeitliche Verteilung der Diagnosen aus Tabelle 2A, aufgeschlüsselt nach Monaten bzw. Jahren

Monate/Jahre Anzahl früher erkannt Anteil an allen 26 früher erkannten Pavor erster His- (insgesamt 26) tientinnen todiagnose

CIN3

1 Monat 1 6 (d. h. bei 23, 1 % der früher Erkannten

2 Monate 1 wurde eine inzidente CIN3 in einem

3 Monate 1 Zeitraum kleiner 6 Monate früher er¬

5 Monate 3 kannt)

6 Monate 1 8 (d. h. bei 30,8 % der früher Erkannten

7 Monate 2 wurde eine inzidente CIN3 6 bis 12

9 Monate 1 Monate früher erkannt)

10 Monate 2

12 Monate 2

18 Monate 4 12 (d. h. bei 46,1 % d. früher Erkannten

2 Jahre 2 wurde eine inzidente CIN3 mehr als 12

3 Jahre 1 Monate früher erkannt)

4 Jahre 1

5 Jahre 1

6 Jahre 3

Claims

Patentansprüche

1 . Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzi- noms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens, umfassend das

Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1 , DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzi- noms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4 (a4-lntegrin), RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und SOX17 (SRY-(sex- determining region Y)-box 17) besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn

(ii) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine hr-HPV-positiv getestete Probe ist.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe einem humanen oder tierischen Lebewesen entnommen wurde, das kein Zervixkarzinom oder eine seiner malignen Vorstufen aufweist. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Gebärmuttermund- und/oder Gebärmutterhalsabstrich ist.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung einer ersten Probe, die dem Lebewesen zu einem ersten Zeitpunkt entnommen wurde, und einer zweiten Probe, die dem Lebewesen zu einem zweiten Zeitpunkt entnommen wurde, durchgeführt wird, wobei der zweite Zeitpunkt zumindest 10 Tage nach dem ersten Zeitpunkt liegt und wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:

(b1) wenn in der zweiten Probe

(i) eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder

(b2) wenn in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn

(i) in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt; und

(ii) in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausge- schlössen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung ohne vorherige DNA-Isolation bestimmt wird.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung zumindest eines Genes der ersten Gruppe oder der zweiten Gruppe mittels methylierungsspezifischer PCR bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung mittels Zweischritt-PCR im Echtzeit-Format bestimmt wird.

1 1. Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen, umfassend Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungs- status zumindest eines der Gene, die aus einer ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1 , DLX1 und ZNF671 besteht, in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA binden.

12. Kit nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4, RXFP3 und SOX17 besteht, in der Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA aus der Probe binden.

13. Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens, umfassend die Schritte (i) Bestimmen in der Probe, ob die Gene ASTN1 , DLX1 , ZNF671 , ITGA4, RXFP3 und SOX17 methyliert sind;

Zuordnen eines Faktor zu jedem Gen, wobei der Faktor gleich Null ist, wenn das Gen nicht methyliert ist, und der Faktor größer Null ist, wenn das Gen methyliert ist; und

Berechnen der Summe der Faktoren aller Gene, deren Methylierung bestimmt wurde, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn die Summe der Faktoren einen Grenzwert erreicht oder übersteigt.

Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Kontrollgen in der Probe nachgewiesen wird, um zu beurteilen, ob die Probe für die zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen geeignet ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung der Gene unter den gleichen Versuchsbedingungen bestimmt wird.

16. Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen, umfassend Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungs- status der Gene ASTN1 , DLX1 , ZNF671 , ITGA4, RXFP3 und SOX17 in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der

Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA binden.