CN111212921A

CN111212921A - 瘤变和癌的风险确定

Info

Publication number: CN111212921A
Application number: CN201780095278.3A
Authority: CN
Inventors: M·杜尔斯特; I·B·伦纳鲍姆; M·施米茨; A·汉塞尔
Original assignee: Oncognostix Ltd
Current assignee: Oncognostix Ltd; Oncgnostics GmbH
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2020-05-29
Also published as: JP2020537513A; JP2022116131A; ZA202001572B; WO2019063097A1; JP7116165B2; US20200216911A1; CA3075836A1; EP3688194A1; AU2017433280A1; KR20200058421A

Abstract

本发明涉及确定未表现出瘤变的组织病理学指征的组织，特别是肛门生殖器组织中发展瘤变的风险的方法。所述方法基于确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA序列的甲基化状态。

Description

瘤变和癌的风险确定

技术领域

本发明涉及一种确定患者组织中发展瘤变的风险的方法，所述组织未显示瘤变的任何组织病理学指征，即，未显示任何形态变化(异型增生)。特别地，所述方法包括确定获得自患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态，其中当样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的一个或多个区域甲基化时，患者组织中发展瘤变的风险增加。

背景技术

子宫颈的癌症(宫颈癌)是全球女性中第二大常见的恶性癌性疾病。其通常是在感染所谓的高危型人乳头瘤病毒(hr-HPV)的过程中通过初步阶段发展的，所述阶段称作宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。根据受累的严重程度，这些阶段分为三个级别：

CIN1＝轻度异型增生，从基底至最多上皮高度的三分之一；

CIN2＝中度异型增生，高达上皮高度的三分之二；以及

CIN3＝高度异型增生，几乎穿透整个上皮层。

与这些异型增生相关，它们有发展为宫颈癌的巨大风险。然而，虽然约90％的CIN1异型增生在一定时间内消失，并且潜在的hr-HPV感染不再可检测，但是如果不治疗，约30％的CIN2异型增生和30-50％的CIN3异型增生发展为宫颈癌。换句话说，并非每个CIN1、CIN2或CIN3异型增生都发展为恶性肿瘤，即，宫颈癌，但是许多的确如此(参见例如，Cuzick etal.,2006,Int J Cancer 119:1095-1101)。

检测宫颈癌及其初步阶段(CIN)的现有测试是基于细胞形态学方法(Pap测试)。但是，Pap测试极易出错，因为必须利用显微镜术在数以千计的其他不同细胞的背景下识别怀疑是癌性或参与异型增生的一些细胞。此外，细胞形态学的评估是非常主观的。由于这些缺点，Pap测试对于检测癌前阶段CIN2、CIN3和癌症的灵敏度为53％，并且特异性为96.3％(Cuzick et al.,2006,Int J Cancer 119:1095-1101)。

分子生物学测试已显著改善许多领域中的癌症护理。因为除了少数例外，所有宫颈癌及其前兆均包含hr-HPV DNA，检测HPV DNA看来是检测癌症的理想方法。各种已发表的研究显示用于检测CIN2的HPV DNA检测具有大于95％的灵敏度和大于90％的特异性。然而，HPV检测呈阳性会使许多妇女不必要地担心，因为仅一小部分受感染的妇女会继续发展癌症，并且大多数感染HPV的妇女没有癌症前兆/异型增生(Cuzick et al.,2006,Int JCancer 119:1095-1101)。

许多出版物已表明，甲基化标记一般适合宫颈癌早期检测领域中的分子诊断。例如，Wang et al.,2008,Cancer Res.68:2489描述了宫颈癌中新甲基化标记的鉴定。此外，Huang et al.,2008,Abstract#50,99th Annual Meeting of the American Associationfor Cancer Research,San Diego,CA,USA描述了CIDEA和RXFP3的超甲基化(hypermethylation)作为卵巢癌的潜在表观遗传标记。

EP专利2 478 117 B1描述了检测ASTN1和ZNF671基因的启动子/5’区的超甲基化用于检测CIN3和宫颈癌，并且Hansel et al.,2014,PLoS ONE9(3):e91905描述了DNA甲基化标记在高危型乳头瘤病毒DNA阳性妇女的分诊中的用途，所述甲基化标记是DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17和ZNF671。

有许多诊断方法可用于确定观察到的瘤变发展为癌的可能性或者观察到的瘤变是否实际是恶性癌症。尽管如此，本领域中仍需要确定在组织中尚无瘤变的组织病理学指征的患者中发展瘤变和/或癌的风险的方法。下文描述的本发明满足这个需求。

发明内容

本发明基于，至少部分基于发明人的发现，获得自患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中的一个或多个相关的基因组DNA序列的甲基化状态可以预测患者的组织是否会发展瘤变，特别是具有发展为癌的巨大潜力的高级别瘤变，在组织未显示瘤变的组织病理学或细胞形态学指征的情况下，例如，在获得样品时。

本发明涉及一种确定患者组织中发展瘤变的风险的方法，所述组织未表现出瘤变的组织病理学指征，所述方法包括确定获得自所述患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。在一实施方案中，当在生物样品中一个或多个区域甲基化时，患者组织中发展瘤变的风险增加。在一实施方案中，优选确定与基因ZNF671相关的基因组DNA区域的甲基化状态。在某些实施方案中，风险增加可以是这样的，其中在获得用来确定甲基化状态的生物样品之后的3-6个月内、或7-12个月内、或13-24个月内或24-36个月内将在组织中发展具有发展为癌的显著潜力的中度或严重形式的瘤变，即HSIL/CIN3。

在本发明的上下文中,确定甲基化状态涵盖确定与ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2基因相关的基因组DNA序列或者这类序列的一部分的甲基化状态，包括基因内的编码和非编码序列。还涵盖位于基因转录起始位点5’的序列，即控制基因表达的启动子/增强子序列，以及位于编码DNA区3’的非编码序列。在一实施方案中，可以确定ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2的基因组DNA的一个或多个编码外显子序列或其一部分的甲基化状态。在一实施方案中，可以确定ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2的基因组DNA的一个或多个非编码内含子序列或其一部分的甲基化状态。在一实施方案中，可以确定ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2的启动子区或启动子区的一部分的甲基化状态。在一优选实施方案中，与待确定甲基化状态的指定基因相关的基因组DNA的一个或多个区域包含CpG岛。在一实施方案中，与待确定甲基化状态的指定基因相关的基因组DNA包含指定基因序列上游和/或下游(5’和/或3’)约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40千碱基内的那些基因组DNA序列。

在一实施方案中，甲基化状态可以与对照样品的甲基化状态进行比较。对照样品可以是获得自组织的样品，其中已知与ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的(各个)基因组序列中的至少1个、2个、3个或全部未甲基化，或者可以是反映已知甲基化值或甲基化状态的标准。对照样品还可以是获得自不同患者的生物样品，其中已确定该患者中的组织未发展瘤变，例如，在获得来自不同患者的样品之后3年或更晚时间内未发展瘤变。

在一实施方案中，瘤变可以是上皮内瘤变。优选地，瘤变可以是肛门生殖器瘤变，更优选宫颈瘤变或子宫瘤变。在一实施方案中，宫颈瘤变可以是HSIL/CIN3宫颈瘤变或宫颈癌。在一优选实施方案中，本发明的方法涉及确定在例如肛门生殖器组织(如在宫颈组织或直肠组织)中发展高度上皮内病变或CIN3瘤变的风险。

在一实施方案中，获得自患者的生物样品可以包含组织的细胞。在一实施方案中，生物样品可以是宫颈涂片或直肠涂片，例如，Pap涂片，其包含宫颈的细胞或直肠的细胞。在一实施方案中，生物样品可以是血液、痰、支气管吸出物、尿、粪便、胆汁、胃肠道分泌物或淋巴液。

在一实施方案中，组织可以是宫颈、阴道、尿道、肛门生殖器、直肠、喉、口、鼻、胃、皮肤、肝、胰腺或肌肉组织。在一实施方案中，生物样品可以直接获得自待确定发展瘤变的风险的组织。

在一实施方案中，可以通过阴道镜确定组织的组织病理学状态。

在本发明的一实施方案中，获得自患者的生物样品可以用来确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态，以及确定组织的组织病理学状态。在另一实施方案中，用来确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态的获得自患者的生物样品可以是与用来确定组织的组织病理学状态的生物样品不同的获得自患者的生物样品。不同的生物样品可以以相同或相似的方式获得和/或可以具有相同或相似的性质，例如，两个样品可以都是宫颈组织的涂片。而且，不同的生物样品可以以不同的方式获得和/或可以具有不同的性质，例如，一个样品可以是宫颈组织的涂片，而另一个是宫颈组织的活检。

在一实施方案中，用来确定甲基化状态的获得自患者的生物样品可以在已确定组织的组织病理学状态之后获得。在一实施方案中，用来确定甲基化状态的获得自患者的生物样品可以在已确定组织的组织病理学状态之前获得。

在一实施方案中，患者可以感染有乳头瘤病毒或者可以未感染乳头瘤病毒。

在一实施方案中，可以通过甲基化-特异性PCR(MSP)确定甲基化状态，优选地，其中MSP是定量MSP(QMSP)，优选地，其中QMSP是基于荧光探针的使用。在一实施方案中，可以通过纳米孔测序确定甲基化状态。

在本发明的一实施方案中，在已确定组织发展瘤变的风险增加之后，所述方法进一步包括确定组织的组织病理学状态。进一步确定可以例如在确定发展瘤变的风险增加之后3个月、6个月、9个月或12个月内进行。例如，组织的组织病理学状态的进一步确定可以在确定风险增加之后通过组织病理学筛选获得自患者的组织样品进行。组织样品可以例如在确定瘤变的风险增加之后3个月、6个月、9个月或12个月内获得。

在另一实施方案中，在已确定组织发展瘤变的风险增加之后，所述方法可以进一步包括给予患者药物以防止组织中发展瘤变或癌。可以向发展瘤变的风险增加的患者给药本领域已知的适合预防瘤变的任何这类药物。在一实施方案中，药物是抗炎剂，优选非甾体抗炎剂，或者药物是甲基化抑制剂，如氮胞苷(azacytidine)或地西他滨(decitabine)。在一实施方案中，其中组织是肛门生殖器组织，例如，宫颈组织或直肠组织，可以通过为患者针对乳头瘤病毒(例如，人乳头瘤病毒)接种疫苗来治疗发展瘤变的风险增加的患者。在一实施方案中，疫苗接种针对的乳头瘤病毒优选可以是已知引起或有助于引起癌症的病毒株，如HPV毒株16和18。

本发明还涉及一种选择在组织中未表现出瘤变的组织病理学指征的患者进行组织中瘤变的更频繁筛查的方法，其包括选择这样的患者，其中在获得自所述患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域是甲基化的。在一实施方案中，更频繁的筛查可以是对相同组织的基于组织化学的筛查。优选地，更频繁的筛查可以每3-12个月进行，优选每6个月进行，更优选每3个月进行。

本发明涉及一种确定未表现出瘤变的组织病理学指征的组织中发展瘤变的风险的方法，其包括(i)确定患者组织的组织病理学状态；以及(ii)在步骤(i)之前或之后确定获得自相同患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。在一实施方案中，当组织的组织病理学状态表明没有瘤变时，并且当生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的一个或多个区域甲基化时，患者组织中发展瘤变的风险增加。

具体实施方式

虽然下文详细描述本发明，但是应当理解本发明并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

在下文中会描述本发明的要素。这些要素用具体实施方案列出，然而，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。各种以前描述的实例和优选实施方案不应当理解为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选的元素的实施方案。此外，除非上下文另有说明，本申请中所有描述的元素的任何排列和组合应当认为通过本申请的说明书公开。

优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.

Eds.,(1995)Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland所述定义。

除非另有说明，本发明的实施会采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，其在所述领域的文献中解释(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,4th Edition,M.R.Green,J.Sambrook et al.eds.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor2012)。

在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及其变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，虽然在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的陈述仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，每个单独的值如其在本文中单独陈述地加入本说明书。

除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并不对本发明的范围构成限制。本说明书中任何语言都不应解释为表示任何未声明的元素对实施本发明是必要的。

在本说明书的整个正文中引用几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中任何内容均不解释为承认本发明无法享有在先申请的优先权。

本发明允许鉴定在组织中发展瘤变的风险增加的患者，特别是发展高级别瘤变的风险增加的患者，所述组织未表现出瘤变的任何组织病理学指征。这类患者的鉴定是由于这样的事实，在未表现出瘤变的指征但其中在获得自患者的生物样品中与ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2基因中的一个或多个相关的基因组DNA序列甲基化的组织中，在组织中存在显著增加的发展瘤变的风险，例如，HSIL/CIN3。一旦鉴定出在组织中发展瘤变的风险增加的患者，可以利用标准组织病理学方法更频繁地监测这类患者组织中瘤变的出现以增加早期发现的可能性和/或可以治疗以预防组织中瘤变的发展。

与根据本发明确定甲基化状态的基因组DNA序列相关的基因包括以下：

ASTN1(Astrotactin 1；GenBank登录号NM_0043.1，NM_207108，包含在NC_000001.9中)，其是一种粘附蛋白，在神经细胞的迁移中起重要作用；

BRINP2(骨形态发生蛋白/视黄酸诱导的神经特异性蛋白(Bone morphogeneticprotein/retinoic acid inducible neural-specific protein)；GenBank登录号NM_021165.3，包含在NC_000001.11中)；

ZNF671(GenBank登录号NM_024883，包含在NC_000019.9中)，其是具有典型锌指基序的转录因子；

ZNF154(GenBank登录号NP_001078853.1，包含在NC_000019.10中)，其是具有典型锌指基序的蛋白；

ZNF776(GenBank登录号NP_775903.3，包含在NC_000019.10中)，其是具有典型锌指基序的蛋白；

DLX1(distal-less homeobox 1；GenBank登录号NM_178120，NM_001038493，包含在NC_000002.11中)，其是转录因子，并且可以影响细胞分化；

DLX2(distal-less homeobox gene 2a；GenBank登录号NP_004396.1，包含在NC_000002.12中)，假定其在发育中发挥作用；以及

METAP1D(GenBank登录号NM_001322279.1，NM_199227.2，NM_001322278.1，NR_136276.1，NR_136273.1，包含在NC_000002.12中)，甲硫氨酰氨肽酶(methionylaminopeptidase)1D型。

在本发明的某些实施方案中，其中个体是非人个体，与确定甲基化状态的序列相关的基因是各个非人个体中的各个同源基因。在涉及非人个体的实施方案中，基因组DNA是与各个基因的人序列和/或其任何部分具有最强同源性/相同性的非人染色体中的那些区域。

在一实施方案中，与待确定甲基化状态的指定基因相关的基因组DNA的一个或多个区域包含至少一个指定基因序列的上游和/或下游(5’和/或3’)约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40千碱基内的那些基因组DNA序列。在本发明的一实施方案中，与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA序列的一个或多个区域包括人1号染色体的一部分(从大约核苷酸177,132,585至大约核苷酸177,152,584)，人2号染色体的一部分(从大约核苷酸172,943,500至大约核苷酸172,974,289)，和/或人19号染色体的一部分(从核苷酸58,217,499至大约核苷酸58,262,501)，以及这类序列的部分或片段(见图1、2A、2B和3)。本文引用的核苷酸编号(位置)来自2009年2月的Human Genome Assembly(GRCh37/hg19)。

优选地，上述序列的一部分包含CG-富集区和/或包含在较大序列内的CpG岛。因此，在一实施方案中，与指定基因相关的基因组DNA的一个或多个区域是上述染色体序列的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分包含CG-富集区和/或CpG岛。在某些实施方案中，与ASTN1和/或BRINP2相关的基因组序列的部分包括人染色体1号的大约核苷酸177,140,121至大约核苷酸177,140,323的区域，与METAP1D、DLX1和/或DLX2相关的基因组序列的部分包括人染色体2号的大约核苷酸172,945,912至大约核苷酸172,946,212的区域，并且与ZNF154、ZNF671和/或ZNF776相关的基因组序列的部分包括人染色体19号的大约核苷酸58,238,586至大约核苷酸58,239,028的区域，以及这类区域的部分或片段。

在确定基因组DNA序列的这些区域或其部分的甲基化状态中，可以确定包含于这些序列内的单个(例如，分离的)胞嘧啶的甲基化状态，以及包含于这些序列内的CG-富集区和CpG岛中的胞嘧啶的甲基化状态。在一优选实施方案中，通过测量包含于这类基因组序列内的一个或多个CpG岛中的胞嘧啶的甲基化状态确定与指定基因相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。在一实施方案中，与待确定甲基化状态的与一个或多个指定基因相关的基因组DNA序列的区域包含图1至3中任一个示出的CpG岛中的至少一个或其一部分。

如本文所用，术语“部分”、“片段”和“部件”可互换使用，是指一部分，特别是指较大的核苷酸序列或氨基酸序列的一部分。还涵盖于这些术语内的是包含较大分子的多个不连续部分的分子，例如，包含不同核苷酸序列(如染色体序列)的一个或多个不连续部分的核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列的一部分的长度可以是约10、20、30、40、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或约10,000个核苷酸或更多。在另一实施方案中，1号、2号或19号染色体的染色体序列的一部分包含至少一个CpG岛或CpG岛的一部分。本发明涵盖的示例性CpG岛在图1至3中鉴定，并且任选地包括CpG岛的上游和/或下游长达1000个核苷酸的序列。

根据本发明确定发展瘤变的风险的组织可以是患者的任何组织。示例性组织包括但不限于宫颈、阴道、尿道、肛门生殖器、直肠、阴茎、喉、口、鼻、胃、肠、皮肤、肝、胰腺、肺、神经/神经元和肌肉组织。在一优选实施方案中，组织是肛门生殖器组织，例如，宫颈、阴道或直肠组织。

虽然术语“瘤变(neoplasia)”和“异型增生(dysplasia)”具有不同含义，但是这些术语在本文中可互换使用，因为它们均指组织和/或组织的细胞中的形态学或组织学变化。瘤变是指肿瘤或癌组织的发生。异型增生是指细胞和组织的形态学特征和/或功能的变化，如未成熟细胞数量的增加和细胞之间的变异性更大。异型增生不一定表明细胞已经癌变，而是表明潜在的变化可能易患癌症。

根据受累的严重程度可以将异型增生分为不同水平，例如，(i)轻度异型增生，变化从基底层延伸至组织上皮层高度的最大三分之一；(ii)中度异型增生，变化延伸至上皮高度的三分之二；以及(iii)高度异型增生，其中几乎在组织的整个上皮层内都发现变化。轻度异型增生还可以称作低度上皮内病变(LSIL)，而中度或重度异型增生还可以称作高度上皮内病变(HSIL)。

与宫颈组织相关，异型增生可以称作宫颈上皮内瘤变(CIN)，根据受累的严重程度可以将其分为不同水平：CIN1＝轻度异型增生；CIN2＝中度异型增生；以及CIN3＝高度异型增生。CIN1还可以称作低度上皮内病变(LSIL)，而CIN2/CIN3还可以称作高度上皮内病变(HSIL)。

在本发明的上下文中，LSIL与CIN1可互换使用，而HSIL与CIN2和/或CIN3可互换使用。

可以利用本领域已知的用于确定组织或组织内细胞的组织病理学或细胞形态学状态的任何适当方法确定组织是否表现出瘤变的任何指征，如在显微镜下或阴道镜下。例如，可以通过利用例如福尔马林以及苏木精和伊红的组合固定和染色组织样品来加工获得自患者的组织样品，用于在显微镜下观察。苏木精用来将核染为蓝色，而伊红将细胞质和胞外结缔组织基质染为粉色。用于组织切片着色的其他化合物包括番红(safranin)、油红O(Oil Red O)、Congo红、银盐和人工染料。抗体也可以用来染色细胞的特定蛋白、脂质和碳水化合物，例如抗p16或Ki67的抗体。这些相同方法可以用于分析来自确定发展瘤变的风险增加的患者的组织。

术语“对象”、“个体”、“生物体”或“患者”可互换使用，并且涉及脊椎动物，优选哺乳动物。例如，本发明的上下文中的哺乳动物是人，非人灵长类，驯养动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验室动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈养动物如动物园的动物。术语“动物”还包括人。优选地，术语“对象”、“个体”、“生物体”或“患者”是指雄性或雌性哺乳动物，特别是男性和女性。个体可以是任何年龄，但是，优选个体是成年。在一实施方案中，个体是30岁或更年轻。在另一实施方案中，个体超过30岁。在一实施方案中，个体是女性，优选12-30岁的女性。在一实施方案中，个体现在或曾经性活跃。在某些实施方案中，个体可以感染有乳头瘤病毒或者可以未感染乳头瘤病毒。

术语“体内”涉及个体中的环境。

如本文所用，“生物样品”包括获得自患者的任何生物样品。这类生物样品的实例包括血液、细胞涂片、痰、支气管吸出物、尿、粪便、胆汁、胃肠道分泌物、淋巴液、骨髓、器官吸出物和组织活检，包括打孔活检。任选地，生物样品可以获得自患者的粘膜。优选包含细胞的涂片。生物样品优选可以包含来自待确定发展瘤变的风险增加的组织的细胞。优选地，生物样品包含DNA，例如，基因组DNA，从而可以确定DNA或其部分的甲基化状态。生物样品可以是获得自待确定发展瘤变的风险的组织的生物样品。

可以获得生物样品的患者组织包括但不限于宫颈、阴道、尿道、肛门生殖器、直肠、阴茎、喉、口、鼻、胃、肠、皮肤、肝、胰腺、肺和肌肉。在一实施方案中，生物样品直接获得自特定组织/器官，例如，获自患者的宫颈(子宫颈)。在一实施方案中，生物样品获得自患者的直肠。从患者和/或从适当组织获得生物样品的任何合适方法可以结合本发明使用。

“有风险”或“风险增加”表示个体，即患者，其鉴定为与一般群体相比，有比正常更高的机会发展疾病，特别是瘤变或癌症。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品的1-3个月内发展瘤变。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品的3-6个月内发展瘤变。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品的7-12个月内发展瘤变。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品的13-24个月内发展瘤变。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品的24-36个月内发展瘤变。在一实施方案中，风险增加表示在获得样品之后36个月，例如42、48、52、60个月或更晚，发展瘤变。

根据本发明，可以以某种方式加工样品中存在的基因组DNA，以便确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中的一个或多个相关的基因组DNA序列的甲基化状态。例如，可以利用技术人员已知的任何方法从生物样品提取基因组DNA并确定DNA的特定区域的甲基化状态，例如，用酚/氯仿或通过商业试剂盒提取，然后利用亚硫酸氢钠法或通过商业试剂盒(如EZ-DNA Methylation-GoldTM试剂盒，ZymoResearch,Irvine,California)确定甲基化。在另一实施方案中，无需从样品分离DNA的准备步骤即可确定甲基化状态。

术语“甲基化状态”一般是指基因组DNA或其区域是否包含甲基化的核苷酸残基，特别是甲基化的胞嘧啶残基，即5-甲基胞嘧啶。在一实施方案中，待确定其甲基化状态的基因组DNA区域是富含鸟嘌呤残基和胞嘧啶残基的区域，特别是富含CG-二核苷酸，即所述区域包含一个或多个CpG岛。如下文讨论的，可以通过已知方法确定甲基化状态。甲基化通常发生在基因的启动子区中，因此，检测相关基因的甲基化状态的方法通常集中在这些区域。然而，基因也可以在除启动子区以外的区域中甲基化，因为GC-富集区如包含CpG岛的那些区域可以位于基因的其他区域中。基因的这类其他区域的甲基化状态的检测也涵盖在本发明内。

在本发明的方法中，确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA中的优选CG-富集区如CpG岛的甲基化状态。如分子生物学中公知的，认为术语“甲基化”与术语“超甲基化”同义。其是指DNA的阳性甲基化状态，即在DNA中存在5-甲基胞嘧啶，优选在CpG岛或富含GC核苷酸的其他区域内存在5-甲基胞嘧啶。

如上文讨论的，待确定其甲基化状态的基因组DNA区域可以位于指定基因之一的外显子、内含子或5’启动子/增强子区中。如本文所用，术语“甲基化”至少表示DNA序列包含5-甲基胞嘧啶核苷酸。在一实施方案中，通过测试的DNA序列(确定其甲基化状态)中5-甲基胞嘧啶核苷酸的存在确定发展瘤变的风险增加。在一实施方案中，通过测试的DNA序列中5-甲基胞嘧啶(甲基化)量的增加确定发展瘤变的风险增加。可以通过比较生物样品中甲基化的量与对照样品中确定的甲基化的量，确定甲基化量的增加。在一实施方案中，当甲基化的增加比对照样品中确定的甲基化量高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％或更多时，确定发展瘤变的风险增加。在一实施方案中，当甲基化的增加比对照样品中确定的甲基化量高至少1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x或更多时，确定发展瘤变的风险增加。在一实施方案中，通过生物样品中的甲基化水平是否超过预定阈值水平确定甲基化水平的增加。对照样品可以是已知甲基化或未甲基化的基因/序列，或者可以是获得自患者的生物样品中测试的相同序列，但是所述相同序列获得自另一患者，其中确定在获得另一患者的样品之后的指定时间段内，另一患者中的所述组织不发展瘤变。在某些实施方案中，指定时间段可以是至少24个月、30个月、36个月或48个月或更长。

在一实施方案中，利用纳米孔测序确定DNA的甲基化状态，其解释了单个DNA分子通过纳米级蛋白孔时观察到的离子流变化。此外，纳米孔测序不仅能够区分DNA链的核苷酸，而且还能区分单碱基修饰，如5’-甲基化的胞嘧啶。鉴于这些能力，可以同时进行序列相同性和胞嘧啶甲基化的分析，参见，例如，Euskirchen et al.,2017,Acta Neuropathol,epub prior to publication,DOI 10.1007/S00401-017-1743-5。

还可以在通过亚硫酸氢盐方法先修饰未甲基化胞嘧啶残基之后，通过所谓的甲基化特异性PCR反应(MSP)利用合适的引物对确定DNA的甲基化状态。在亚硫酸氢盐方法中，利用亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶残基(5-甲基胞嘧啶)受到保护免于这种转化。因为尿嘧啶具有不同于胞嘧啶的配对特性，即它像胸腺嘧啶那样与腺苷配对，基于尿嘧啶结合胸腺嘧啶而胞嘧啶不结合胸腺嘧啶的事实，可以利用特别设计的引物检测转化。MSP是本领域已知的检测DNA甲基化的成熟技术。

在本发明的上下文中，用于检测甲基化状态的PCR扩增引物的设计取决于序列在与待确定甲基化状态的基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中的一个或多个相关的基因组DNA序列内的位置。例如，如果在引物结合位点内某些胞嘧啶甲基化，则这类序列的甲基化特异性引物可以设计为仅结合至亚硫酸氢盐修饰的样品DNA。如果这些区域在亚硫酸氢盐处理之前未甲基化，则引物不结合，并且不形成PCR反应产物。因此，在本发明的上下文中，PCR反应的存在表示特定基因的特定DNA区域甲基化，因此，患者组织中发展瘤变的风险增加。

特别优选实时PCR方法(QMSP)，其不仅允许对甲基化进行定性检测，而且还允许对甲基化的DNA区域进行定量。这种MSP可以在基于荧光的实时方法中进行，其中通过荧光染料(例如，

-Green I或II(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)或者EVA-

(Biotium,Inc.,Fremont,CA))的掺入检测甲基化特异性产物的形成。这些方法能够在未甲基化DNA的大背景下检测甲基化DNA的区域，并且是特别适合筛查组织样品的高通量方法(Shames et al.,2007,Cancer Lett,251:187-198)。

或者，在PCR完成之后还可以通过杂交方法检测通过MSP产生的PCR产物，例如，利用固定有所得PCR产物结合的探针的条带或阵列，因此可以检测。其他技术，包括使用甲基化敏感的DNA限制酶区分甲基化和未甲基化的DNA，或者用亚硫酸氢盐化学处理的DNA的高通量测序用于检测甲基化的DNA。

另一优选方法是基于“MethyLight”技术的QMSP方法，其中将荧光探针用于待检测甲基化的DNA的各个区域。在一优选实例中，探针在5’-端带有荧光染料标记，并且在3’-端带有淬灭剂，探针结合至两条特异性扩增引物之间的PCR反应产物(参见，例如，Eads etal.,2000,Nucleic Acids Research 28:e32)。一旦探针结合至靶序列之后通过DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性分解，释放荧光染料，并且测量的荧光反映形成的产物量。可以通过利用几种寡核苷酸和探针对这种方法中研究的样品相应地减少进行的反应数量(Shameset al.,2007,Cancer Lett 251:187-198)。合适的荧光染料和淬灭剂是本领域已知的，例如，荧光团FAM^TM、HEX^TM、NED^TM、ROX^TM、Texas

等，以及淬灭剂TAMRA^TM或Black Hole

例如，可在ATDBio Ltd.,Southhampton,UK或LGC Biosearch Technologies,Steinach,Germany获得。

在一特别优选的实施方案中，甲基化状态的确定可以作为多重实验进行。这样的多重实验允许分析样品中基因组DNA的几个区域的甲基化状态，已知这与单一测定中发展瘤变的风险增加相关。多重方法提供几个优点，因为可以通过每个样品一个或两个反应确定待测试的DNA区域集的甲基化状态。这样节省大量时间、样品材料和材料成本。在某些多重实验中，可以确定多达5个基因的甲基化状态。此外，每个基因使用另一个特异性寡核苷酸，即“探针”。探针在一端带有荧光染料，并且设计为在探针特异性地结合至形成的PCR反应产物之前不会检测到荧光信号。不同探针会携带不同荧光基团，因此可以同时检测每个荧光信号。还可以通过“微阵列”技术进行这类方法。

根据本发明可以使用本领域已知的用于确定甲基化状态的其他方法，例如，基于通过荧光直接确定特定产物量的方法。例如，本文中还可以使用分子信标技术。分子信标是连接至报告荧光团和淬灭剂的寡核苷酸。探针5’端的核苷酸与3’端的核苷酸互补以形成分子信标的二级结构特征。在这种状态下，其称作发夹或环结构，由于荧光团与淬灭剂的接近，检测不到荧光。由于环结构与PCR期间产生的互补DNA序列的结合，荧光团和淬灭剂之间的距离增加，因此可以观察到荧光。

另一合适的技术包括“蝎子(scorpion)”技术。蝎子探针是复杂的寡核苷酸，其在一个(单蝎)或两个分子(双蝎)中组合实时PCR探针和PCR引物的特性。与分子信标相似，它们包含具有自身互补区的特征性二级结构，其末端用报告荧光团和淬灭剂修饰。此外，这些探针可以用作PCR引物。在PCR循环期间，因为结合增加淬灭剂和报告荧光团之间的距离，所以可以通过环结构连接至互补DNA序列观察到报告荧光。对于不同探针结合的检测，不同探针可以具有不同报告荧光团。

此外，可以共扩增阳性和/或阴性对照DNA，例如，DNA的未甲基化的对照区域，并且用于PCR反应的对照和/或甲基化的存在和/或不存在的对照。

此外，已知基因组DNA区域的甲基化通常与邻近这些(甲基化)DNA的区域的基因的转录阻断有关，使得甲基化基因的编码蛋白不表达。因此，在一实施方案中，可以通过确定ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2基因中的一个或多个编码的RNA和/或蛋白的浓度完成基因组DNA的一个或多个指定区域的甲基化状态的间接确定。可以通过本领域已知的任何适当方法进行其检测，例如，(对于RNA)Northern印记分析、RT-PCR等，以及(对于蛋白)基于抗体的方法或基于确定表达蛋白的生物活性的方法。

作为说明性实例，本发明的方法包括以下步骤：(a)根据标准方法从获得自患者的生物样品分离DNA，例如，包含待确定发展瘤变的风险的组织细胞的涂片，例如，利用QiaAmpDNA-Mini试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)；(b)根据亚硫酸氢盐方法化学转化分离的DNA，例如，通过商业试剂盒如EZ-DNA Methylation-Gold^TM试剂盒,Zymo Research,Irvine,California)，其通过用亚硫酸氢钠处理随后碱水解将DNA样品中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)通过DNA的甲基化形式的特异性PCR引物扩增相关DNA；以及(d)检测PCR产物的存在，这表明获得的样品中的DNA被甲基化。

当利用甲基化特异性PCR或QMSP方案确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中的一个或多个相关的基因组DNA区域的甲基化时，可以使用以下示例性甲基化特异性扩增引物，任选地用示例性探针oligo检测潜在的扩增产物：

但是，本发明的方法不限于这些引物用于检测基因组DNA区域的甲基化状态。扩增/检测与这些基因相关的基因组DNA的其他区域的其他引物可以用于检测这些基因的甲基化状态。在一实施方案中，与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域甲基化状态的定量不是强制性的，也不一定是关键的；但是，期望可以在DNA的相同区域未甲基化的1000个细胞的背景中检测到至少一个具有甲基化区域的细胞。

通过下文的图和实施例详细描述本发明，其仅用于说明目的而不是表示限制。由于描述和实例，技术人员容易得到同样包括在本发明内的其他实施方案。

附图说明

图1是位于1号染色体上的与基因ASTN1和BRINP2相关的基因组DNA的图示。

图2A和2B位于2号染色体上的与基因METAP1D、DLX1和DLX2相关的基因组DNA的图示。

图3是位于19号染色体上的与基因ZNF671、ZNF154和ZNF776相关的基因组DNA的图示。

图4示出在患者中于某个时间点获得的宫颈涂片细胞中甲基化标记的检出率(百分比)，所述患者在所述时间点在她们的宫颈组织中未表现出瘤变的组织病理学/细胞形态学指征，但是后来诊断为组织中有HSIL/CIN3的组织病理学发现。

实施例

本文使用的技术和方法在本文中描述或以本身已知的方式进行,并且如例如Green,Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th Edition(2012)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.中所述。除非特别说明，包括使用试剂盒和试剂在内的所有方法均根据制造商的信息进行。

宫颈涂片获得自女性，并且确定以下各个标记基因的每个附近的基因组DNA区域(标记区域)的甲基化状态：19号染色体上的ZNF671/ZNF154/ZNF776(称作“ZNF671”)、1号染色体上的ASTN1/BRINP2(称作“ASTN1”)和2号染色体上的DLX1/METAP1D/DLX2(称作“DLX1”)。在对患者宫颈组织的HSIL/CIN3的组织病理学诊断之前的时间点采集宫颈涂片。换句话说，对于采集宫颈涂片的30位女性中的每位，至少一个宫颈涂片是在后来确定存在严重异型增生(HSIL/CIN3)之前采集的，并且所述至少一个涂片用来确定标记基因的甲基化状态。因此，在获得自患者的包含宫颈组织细胞的生物样品中确定标记DNA区的甲基化状态，所述患者的宫颈组织那时未表现出任何瘤变的组织病理学指征，并且后来所述患者在后来获得的宫颈组织样品的基础上诊断为患有宫颈的高度异型增生(HSIL/CIN3)。

从涂片材料获得细胞团，并且在测试之前储存在-80℃下。用标准DNA分离程序从这些细胞团分离DNA。作为三个标记区域特异性的对照，还在552名未显示瘤变的组织病理学指征(细胞学结果Pap I)的女性的宫颈涂片样品(基于液体的细胞学样品)中确定它们的甲基化状态。

然后将分离的DNA用于所有未甲基化胞嘧啶残基的化学转化，利用亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵，随后根据标准方法纯化DNA。这种化学转化是区分甲基化和未甲基化DNA序列的前提，因此是检测所感兴趣的基因组区域中未甲基化DNA背景中的甲基化DNA的前提。这是极为重要的，因为分析的生物样品通常包含细胞物质的混合物，并且所述方法的目的是检测源自组织的潜在癌前和癌细胞子集的少量甲基化DNA分子。

设计用于分析PCR的寡核苷酸引物以从标记基因扩增所感兴趣的DNA区域，之前已表明所述标记基因在癌前和癌性宫颈组织细胞中是甲基化的。在这个实施例中，下述引物仅允许在所感兴趣的DNA区域甲基化时产生扩增产物。以下PCR引物用于分析PCR：

观察到30例患者中有9例(30％)、12例(40％)和15例(50％)在HSIL/CIN3组织病理学诊断之前采集的样品中分别从三个标记区域产生PCR产物。这些结果的图形表示见图4。总的来说，对于30例患者中的19例(63.3％)，在至少一个样品中确定三个标记中的至少一个是甲基化的。在这19例患者中的14例中，至少两个标记是甲基化的，并且在这14例患者中的7例中，全部三个标记是甲基化的。

此外，在后来采集的另一样品显示HSIL/CIN3组织病理学之前3-31、3-75和3-30个月采集的样品中分别确定三个标记区域是甲基化的。相比之下，相同的三个标记区域分别仅在552例来自有Pap I细胞学发现的女性的对照样品中的20例(3.6％)、61例(11.1％)和5例(0.9％)中可检测。

表1示出采集宫颈涂片的时间(这时未检测到异型增生/瘤变的迹象，但是标记基因之一是甲基化的)和从患者采集的另一样品表现出HSIL/CIN3异型增生的时间之间的时间间隔。

表1

时间间隔	ASTN1	DLX1	ZNF671
				3-6个月	2/9(22.2％)	4/12(33.3％)	7/15(46.7％)
7-12个月	3/9(33.3％)	4/12(33.3％)	2/15(13.3％)
				13-24个月	2/9(22.2％)	2/12(16.7％)	2/15(13.3％)
>24个月	2/9(22.2％)	2/15(16.7％)	4/15(26.7％)

表2示出获得测试的涂片之后以月计在测试的30个患者中发展HSIL/CIN3异型增生的百分比，即通过确定每个标记基因的甲基化状态实现HSIL/CIN3异型增生的早期检测的患者的百分比。

表2

以月计的时间	ASTN1	DLX1	ZNF671
				3-6	6.7％	13.3％	23.3％
7-12	10.0％	13.3％	6.7％
				13-24	6.7％	6.7％	6.7％
>24	6.7％	6.7％	13.3％
				没有早期检测	70.0％	60.0％	50.0％

总而言之，这些结果证实确定获得自患者的样品中与标记基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中至少一个相关的基因组DNA序列的甲基化状态为早期确定发生高度宫颈病变(HSIL/CIN3)的风险增加提供了有用工具，所述高度宫颈病变(HSIL/CIN3)具有发展为癌症的巨大潜力。从这些结果可以清楚地看出这三个基因的甲基化状态允许及时评估发展高度上皮内病变的风险，特别是CIN3。与这些标记基因相关的基因组DNA序列在来自细胞学检查正常(Pap I)的患者的样品中很少甲基化的事实强调了基于与标记基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态的测试的高诊断价值。

序列表

<110> 昂科格诺斯蒂克斯有限公司

<120> 瘤变和癌的风险确定

<130> 992-1 PCT

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 1

cggaggacgt agtatttatt cgc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 2

ctacgtcccc gatcgaaacg 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 3

cgtgggcgcg gacagttgtc gggagcg 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 4

cgtaagcgtt gttagcgtag c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 5

cgcgaaatcg aaacgaaaac g 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 6

gtaattcgtt tgtttcgtaa gttgttcg 28

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

tatcgggatt cgcgtttgta c 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

cgaccgaact aaaactcaac tcg 23

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

cgtaaacgtt agctgttctg gaaaccg 27

Claims

1.一种确定患者组织中发展瘤变的风险的方法，所述组织未表现出瘤变的组织病理学指征，所述方法包括确定获得自所述患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。

2.权利要求1的方法，其中当所述生物样品中一个或多个区域甲基化时，所述患者组织中发展瘤变的风险增加。

3.权利要求1或2的方法，其包括确定与基因ZNF671相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中确定基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2中的一个或多个的启动子区的甲基化状态。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中将所述甲基化状态与对照样品的甲基化状态进行比较。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述瘤变是上皮内瘤变。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述瘤变是肛门生殖器瘤变，优选宫颈瘤变或子宫瘤变。

8.权利要求7的方法，其中所述宫颈瘤变是HSIL/CIN3宫颈瘤变或宫颈癌。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述生物样品包含所述组织的细胞。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述生物样品是宫颈涂片或直肠涂片。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述生物样品是血液、痰、支气管吸出物、尿、粪便、胆汁、胃肠道分泌物或淋巴液。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述组织是宫颈、阴道、尿道、肛门生殖器、直肠、喉、口、鼻、胃、皮肤、肝、胰腺或肌肉组织。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物样品直接获得自所述组织。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中通过阴道镜确定所述组织的组织病理学状态。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中将获得自所述患者的生物样品用来确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态，以及确定所述组织的组织病理学状态。

16.权利要求1-14中任一项的方法，其中用来确定与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态的获得自所述患者的生物样品是与用来确定所述组织的组织病理学状态的生物样品不同的获得自所述患者的生物样品。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中用来确定甲基化状态的获得自所述患者的生物样品是在确定所述组织的组织病理学状态之后获得的。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述患者感染有乳头瘤病毒。

19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述患者未感染乳头瘤病毒。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中通过纳米孔测序确定甲基化状态。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中通过甲基化特异性PCR(MSP)确定甲基化状态，优选其中所述MSP是定量MSP(QMSP)。

22.权利要求21的方法，其中所述QMSP是基于荧光探针的使用。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中在已确定所述组织发展瘤变的风险增加之后，所述方法进一步包括确定所述组织的组织病理学状态。

24.权利要求23的方法，其中所述进一步确定发生在确定发展瘤变的风险增加的3个月、6个月、9个月或12个月内。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中在已确定所述组织发生瘤变的风险增加之后，所述方法进一步包括给予所述患者药物以防止组织中发展瘤变。

26.一种选择在组织中未表现出瘤变的组织病理学指征的患者进行组织中瘤变的更频繁筛查的方法，其包括选择这样的患者，其中在获得自所述患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域是甲基化的。

27.权利要求26的方法，其中所述更频繁筛查是基于组织病理学的筛查。

28.权利要求26或27的方法，其中所述更频繁筛查是每12个月，优选每6个月，更优选每3个月。

29.一种确定未表现出瘤变的组织病理学指征的组织中发展瘤变的风险的方法，其包括

(i)确定患者组织的组织病理学状态；以及

(ii)在步骤(i)之前或之后确定获得自所述患者的生物样品中与基因ZNF671、ZNF154、ZNF776、ASTN1、BRINP2、DLX1、METAP1D和/或DLX2相关的基因组DNA的一个或多个区域的甲基化状态。

30.权利要求29的方法，其中当所述组织的组织病理学状态表明没有瘤变时，并且当所述生物样品中一个或多个区域甲基化时，所述患者组织中发展瘤变的风险增加。