RU2818527C1 - Реагент для обнаружения опухолей - Google Patents
Реагент для обнаружения опухолей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818527C1 RU2818527C1 RU2022131275A RU2022131275A RU2818527C1 RU 2818527 C1 RU2818527 C1 RU 2818527C1 RU 2022131275 A RU2022131275 A RU 2022131275A RU 2022131275 A RU2022131275 A RU 2022131275A RU 2818527 C1 RU2818527 C1 RU 2818527C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- positive
- negative
- bladder cancer
- control
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 102
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 113
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 96
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 60
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 60
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 53
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 282
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 282
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 282
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 27
- 208000020984 malignant renal pelvis neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 201000007444 renal pelvis carcinoma Diseases 0.000 claims description 23
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 19
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 claims description 18
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000005068 bladder tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 70
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 34
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 24
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 21
- 101150029107 MEIS1 gene Proteins 0.000 description 13
- 108700041619 Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1 Proteins 0.000 description 12
- 102000047831 Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1 Human genes 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 11
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 11
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 108010079362 Core Binding Factor Alpha 3 Subunit Proteins 0.000 description 7
- 102000012666 Core Binding Factor Alpha 3 Subunit Human genes 0.000 description 7
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101000616761 Homo sapiens Single-minded homolog 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100021825 Single-minded homolog 2 Human genes 0.000 description 5
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 102100026323 BarH-like 2 homeobox protein Human genes 0.000 description 4
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 description 4
- 102100030636 Homeobox protein OTX1 Human genes 0.000 description 4
- 101000766218 Homo sapiens BarH-like 2 homeobox protein Proteins 0.000 description 4
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 description 4
- 101000584392 Homo sapiens Homeobox protein OTX1 Proteins 0.000 description 4
- 101000652332 Homo sapiens Transcription factor SOX-1 Proteins 0.000 description 4
- 101000964613 Homo sapiens Zinc finger protein 154 Proteins 0.000 description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical group OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100030248 Transcription factor SOX-1 Human genes 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040784 Zinc finger protein 154 Human genes 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010021779 GATA5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 101100013973 Mus musculus Gata4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010061336 Pelvic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010072135 Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024649 Cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000026641 DNA hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 102100021147 DNA mismatch repair protein Msh6 Human genes 0.000 description 1
- 201000002994 Dyschromatosis symmetrica hereditaria Diseases 0.000 description 1
- 102100031785 Endothelial transcription factor GATA-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008412 GATA5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102100040896 Growth/differentiation factor 15 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 description 1
- 101000968658 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh6 Proteins 0.000 description 1
- 101001066265 Homo sapiens Endothelial transcription factor GATA-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000893549 Homo sapiens Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 description 1
- 101100237041 Homo sapiens MEIS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001108246 Homo sapiens Neuronal pentraxin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000665449 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000628562 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase STK11 Proteins 0.000 description 1
- 101000666775 Homo sapiens T-box transcription factor TBX3 Proteins 0.000 description 1
- 101000834948 Homo sapiens Tomoregulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000803403 Homo sapiens Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 101000976642 Homo sapiens Zinc finger protein ZIC 4 Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 102100021878 Neuronal pentraxin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036961 Nuclear mitotic apparatus protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- -1 PAX5A Proteins 0.000 description 1
- 102100035394 POU domain, class 4, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038188 RNA binding protein fox-1 homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100042260 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026715 Serine/threonine-protein kinase STK11 Human genes 0.000 description 1
- 108010029625 T-Box Domain Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038721 T-box transcription factor TBX2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038409 T-box transcription factor TBX3 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100026160 Tomoregulin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010063400 Transcription Factor Brn-3B Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 102100023493 Zinc finger protein ZIC 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000009557 abdominal ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 201000006330 glandular cystitis Diseases 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 108010036112 nuclear matrix protein 22 Proteins 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007779 soft material Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, содержащий праймер и зонд, а также применение данного реагента для обнаружения уротелиальной опухоли у пациента. Изобретения можно использовать для обнаружения и диагностирования опухолей. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 26 ил., 19 табл., 7 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее раскрытие принадлежит к области обнаружения генов, а точнее, настоящее раскрытие относится к реагенту и набору принадлежностей для обнаружения опухолей.
Уровень техники
С развитием социальной экономики возрастает число пациентов, страдающих от опухолей, и заболеваемость ими молодеет. Раннее, безболезненное, быстрое и точное обнаружение опухолей становится все более насущной необходимостью.
Существующие стандартные способы диагностики и последующего наблюдения опухолей в основном включают в себя визуализацию в лабораторных условиях, микроскопию в лабораторных условиях, биопсию тканей и эксфолиативную цитологию или цитологию экскрементов. Технологии визуализации в лабораторных условиях включают в себя в основном компьютерную томографию, ядерно-магнитно-резонансную визуализацию, трансабдоминальное УЗИ и т.д., и эти технологии часто имеют высокий уровень ложноположительных результатов при ранней диагностике рака. Микроскопия in vivo, являющаяся золотым стандартом для диагностики некоторых опухолей, была усовершенствована, и в ней в последние годы используют мягкие материалы, но она все еще является высоко инвазивной и причиняет много боли пациентам, которые могут страдать от боли, кровотечения и других проблем в течение нескольких дней после исследования. Кроме того, микроскопия in vivo обладает низкой специфичностью и чувствительностью для ранней диагностики некоторых опухолей. Биопсию тканей используют для детектирования тканей с подозрениями на заболевания и в основном для детектирования морфологии опухолей клеток и биомаркеров с высокой специфичностью и чувствительностью. Однако биопсия тканей несколько инвазивна для пациентов при отборе образцов и имеет такие недостатки, как длительное время предварительной обработки образцов и усложненные этапы. Эксфолиативная цитология или цитология экскрементов является неинвазивным испытанием и поэтому широко применяется для диагностики некоторых опухолей. Однако некоторые испытания эксфолиативной цитологии или цитологии экскрементов не могут исключать наличия опухолей низкой степени злокачественности и приводят к низкой чувствительности. Такие способы обнаружения, как белок-22 ядерного матрикса, опухолеассоциированные антигены, анализ Immuno Cyt и анализ Uro Vysion, не применяются в обычных клинических исследованиях из-за их низкой чувствительности и/или специфичности.
Эпигенетика является быстро развивающейся областью биологии рака и обладает большим потенциалом для клинических исследований и для исследований трансляционной медицины. Исследования показали, что биохимические пути, критичные для онкогенеза, частично регулируются эпигенетическими явлениями, такими как изменения метилирования ДНК в опухолевых клетках, аномальные модификации гистонов, опосредованный микроРНК сайленсинг различных целевых генов и реконструкция гамартоматозных нуклеосом. Аберрантное метилирование ДНК является наиболее широко изученным эпигенетическим изменением, связанным со всеми типами рака человека. Гиперметилирование, подавляющее такие транскрпипционные факторы, как RUNX3, GATA-4 и GATA-5, вызывает инактивацию их нижестоящих мишеней, вовлеченных в различные клеточные процессы. RUNX3 является важным элементом семейства транскрипционных факторов, и исследования обнаружили, что в клеточных линиях рака легкого и в образцах первичного рака легкого RUNX3 инактивируется аберрантным гиперметилированием ДНК. Аналогично, семейство GATA транскрипционных факторов связано с патогенезом желудочно-кишечных заболеваний, и наблюдается, что среди стимуляторов рака толстой и прямой кишки часто метилируются стимулирующие области генов GATA-4 и GATA-5. Стимуляторы некоторых генов при раке мочевого пузыря также сильно метилируются с частотой метилирования ДНК, составляющей 48-96%, включая такие гены, как A2BP1, NPTX2, POU4F2, HOXA9, MEIS1, GDF15, TMEFF2, VIM, STK11, MSH6, BRCA1, TBX2, TBX3, GATA2, ZIC4, PAX5A, MGMT и IGSF4[1].
В последние годы обнаружение метилирования специфического участка гена, связанного с опухолью, в образцах крови, мокроты, слюны, фекалий или мочи широко применялось для таких аспектов, как диагностика и ранняя диагностика рака, прогнозирование прогрессирования рака, прогнозирование рака, пост-лечебный мониторинг и прогнозирование реакции на противораковую терапию.
Раскрытие изобретения
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает использование нуклеотидной последовательности (здесь и далее, «нуклеотидной последовательности» или «фрагмента нуклеиновой кислоты»), которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, при приготовлении комплекта для обнаружения опухоли.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает применение реагента для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, для изготовления реагента или набора для обнаружения опухоли.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также обеспечивает праймер, который включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, или SEQ ID NO: 47, или их комплементарных последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые, соответственно, имеют, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из любой пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые имеют, соответственно, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из любой пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые имеют, соответственно, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает зонд, который включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48, или их комплементарных последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления зонд включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48, или их комплементарных последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления зонд включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 45.
В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд представляет собой изолированный праймер или зонд.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает применение вышеупомянутого праймера и/или зонда для изготовления реагента или набора для обнаружения опухоли.
В настоящем раскрытии термин «детектирование», «обнаружение» синонимичный термину «диагностика», включает в себя не только раннюю, но также промежуточную и позднюю диагностику опухолей, а также включает в себя скрининг опухоли, оценку риска, прогнозирование, идентификацию заболевания, диагностику стадий заболевания и выбор терапевтических мишеней.
В необязательном варианте осуществления на стадии заболевания диагностика возможна путем детектирования степени метилирования нуклеотидной последовательности в образце в соответствии с прогрессированием опухоли на различных стадиях или в различные периоды времени. Конкретную стадию опухоли в образце можно выявить путем сопоставления степени метилирования нуклеотидной последовательности, выделенной из образцов опухоли на различных стадиях, со степенью метилирования нуклеотидной последовательности одной или более нуклеиновых кислот, выделенных из образца без аномальной пролиферации клеток.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает реагент для обнаружения опухолей, который включает в себя реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.
Метилирование относится к добавлению метильной группы к цитозину. После обработки солью гидросульфита, или бисульфита, или гидразина цитозин преобразуется в урацил. Поскольку урацил аналогичен тимину, он распознается как тимин в ходе ПЦР-амплификации. Таким образом, в ПЦР-амплифицированной последовательности неметилированный цитозин преобразуется в тимин (C преобразуется в T), а метилированный цитозин (C) не преобразуется. MSP (план медицинских услуг) представляет собой повсеместно использованную технологию ПЦР для детектирования метилирования гена, в которой праймеры конструируют для обработанного метилированного фрагмента (т.е., не преобразованного C во фрагменте), а затем выполняют ПЦР-амплификацию. Если фрагмент амплифицируется, это указывает на то, что фрагмент метилирован, а если фрагмент не амплифицируется, это указывает на то, что фрагмент не метилирован.
В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения уровня метилирования используют для детектирования последовательности, модифицированной солью гидросульфита, или бисульфита, или гидразина нуклеотидной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления выявляют последовательность, модифицированную бисульфитом нуклеотидной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения уровня метилирования включает в себя праймеры и зонд для обнаружения уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления прямой праймер у указанных праймеров имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:
I. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 46; или
II. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в I.
В некоторых вариантах осуществления обратный праймер у указанных праймеров имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:
III. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 47; или
IV. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в III.
Праймеры используют для амплификации нуклеотидной последовательности. Из уровня техники хорошо известно, что успешное конструирование праймеров имеет решающее значение для ПЦР. По сравнению с обычным ПЦР, конструирование праймеров более важно для обнаружения уровня метилирования. Причина состоит в том, что метилсульфирование вызывает преобразование «C» в нити ДНК в «U», что приводит к снижению содержания GC и появлению длинных прилегающих «T» в последовательности после ПЦР. Можно легко вызвать обрыв нити ДНК, и таким образом, сложно подобрать стабильные праймеры с подходящими значениями Tm. С другой стороны, чтобы отличить сульфированные ДНК от несульфированных и не полностью обработанных ДНК, необходимо, чтобы праймеры имели достаточное количество «C», что повышает сложность подбора стабильных праймеров. Поэтому при детектировании уровня метилирования ДНК выбор фрагмента, амплифицируемого с помощью праймеров, в частности, выбор длины и положения амплифицируемого фрагмента, выбор праймеров и т.д. оказывает влияние на чувствительность и специфичность детектирования. С помощью экспериментов авторы изобретения обнаружили, что различные целевые амплифицируемые фрагменты и праймеры дают разные результаты детектирования. Много раз было обнаружено, что некоторые гены или нуклеотидные последовательности по-разному экспрессируются в опухолях и не опухолях, но предстоит еще долгий путь для преобразования этих генов в опухолевые маркеры и клинического применения опухолевых маркеров. Основная причина состоит в ограниченности реагентов для детектирования, что усложняет детектирование чувствительности и специфичности этих потенциальных опухолевых маркеров, чтобы они отвечали требованиям детектирования, или способ обнаружения сложен в эксплуатации и является дорогостоящим, и его сложно применять клинически в крупном масштабе.
В некоторых вариантах осуществления зонд имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:
V. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48; или
VI. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в V.
В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя реагент для обнаружения референсного гена.
В некоторых вариантах осуществления референсный ген представляет собой β-актин (ACTB).
В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения референсного гена представляет собой праймеры и зонд для референсного гена.
В некоторых вариантах осуществления реагент также включает в себя по меньшей мере один из следующих компонентов: соль гидросульфита, бисульфита или гидразина для модифицирования нуклеотидной последовательности; при этом, конечно, реагент может и не включать в себя соль гидросульфита, бисульфита или гидразина.
В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя один или более из следующих компонентов: ДНК-полимераза, дНТФ, ионы Mg2+ и буфер; и, необязательно, реагент включает в себя реакционную систему ПЦР, которая включает в себя ДНК-полимеразу, дНТФ, Mg2+ ионы и буфер и используется для амплификации модифицированной нуклеотидной последовательности.
В качестве образца для детектирования с использованием реагента для детектирования/диагностики по настоящему раскрытию может быть выбрано по меньшей мере одно из следующего: ткань, жидкость организма и экскремент.
Необязательно, ткань представляет собой ткань мочевого пузыря.
Необязательно, жидкость организма представляет собой по меньшей мере одно из следующего: кровь, сыворотка, плазма, внеклеточная жидкость, тканевая жидкость, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость и водянистая влага глаза.
Необязательно, экскремент представляет собой по меньшей мере одно из следующего: мокрота, моча, слюна и кал.
Необязательно, экскремент представляет собой мочу.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает набор, который включает в себя вышеупомянутый реагент для детектирования опухолей. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя инструкции. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя реагент для экстракции нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя прибор для отбора проб.
В некоторых вариантах осуществления ткань, детектируемую с помощью реагента для детектирования по настоящему раскрытию, выбирают из опухолевой ткани и нормальной ткани паракарциномы (или ткани доброкачественной опухоли).
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также обеспечивает способ для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности в образце, характеризующийся следующими этапами: (1) обработка детектируемого образца солью гидросульфита, бисульфита и гидразина для получения модифицированного детектируемого образца; (2) детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности, например, с использованием вышеупомянутого реагента или набора для детектирования метилирования нуклеотидной последовательности в детектируемом образце, который модифицирован на этапе (1). В необязательном варианте осуществления на этапе (2) для детектирования используют флуоресцентную количественную цепную реакцию полимеразы, специфичную для метилирования, в режиме реального времени.
В одном из вариантов осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ обнаружения опухоли, который включает в себя: детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности в детектируемом образце, необязательно путем вышеупомянутого способа детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности; и определение наличия или риска наличия у пациента опухоли в соответствии с отклонением, необязательно, в соответствии с разностью в уровнях метилирования, с выявленным уровнем метилирования, необязательно, путем вышеупомянутого способа детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, от соответствующего уровня метилирования в обычном контрольном образце. Термин «отклонение» в вышеупомянутых этапах относится к отклонению уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ обработки опухоли у пациента, который включает в себя: обнаружение опухоли у пациента, включая детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, в детектируемом образце, полученном у пациента, и обработку опухоли в случае, когда детектирование опухоли у пациента указывает на наличие или на риск наличия опухоли у обследуемого. Необязательно, уровень метилирования выявляют вышеупомянутым способом детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности. Необязательно, опухоль у пациента выявляют вышеупомянутым способом детектирования опухоли. Необязательно, лечение представляет собой применение хирургии, химиотерапии, лучевой терапии, химиолучевой терапии, иммунотерапии, онколитической вирусной терапии, любого другого вида способа лечения опухолей, использованного согласно уровню техники, или сочетание этих способов лечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ конструирования праймеров, который включает в себя этапы конструирования праймеров для нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает систему для конструирования праймеров, которая включает в себя:
1) входной компонент; 2) обрабатывающий компонент; и 3) выходной компонент. Необязательно, входной компонент выполнен с возможностью считывать нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4. Необязательно, обрабатывающий компонент загружается с программой для конструирования праймеров, исходя из информации, считываемой входным компонентом. Необязательно, выходной компонент сконфигурирован для вывода последовательностей праймеров, сконструированных с помощью обрабатывающего компонента.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает систему детектирования опухоли. Система включает в себя: (1) компонент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, или по меньшей мерена 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99%, или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 4, и (2) систему определения результата.
В некоторых вариантах осуществления компонент для детектирования уровня метилирования включает в себя вышеупомянутый реагент или набор для детектирования.
В некоторых вариантах осуществления компонент для определения результата выполнен с возможностью вывода данных о риске наличия опухоли и/или типа опухоли согласно уровню метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, который выявляют с помощью системы обнаружения.
В некоторых вариантах осуществления риск наличия опухоли определяют путем сопоставления уровня метилирования детектируемого образца с уровнем метилирования обычного образца, и определяют, что детектируемый образец имеет высокий риск наличия опухоли, если имеется значительная разница или крайне значительная разница между уровнем метилирования детектируемого образца и уровнем метилирования обычного образца.
В некоторых вариантах осуществления, если метилирование нуклеотидной последовательности является положительным, то это указывает на то, что донором детектируемого образца является пациент с опухолью или с высоким риском наличия опухоли. В необязательном варианте осуществления, положительный результат относится к тому, при котором результат детектирования для детектируемого образца сопоставляется с результатом детектирования для обычного образца, если имеется значительная разница или крайне значительная разница между результатом амплификации детектируемого образца и результатом амплификации обычного образца, и тогда донор детектируемого образца является положительным.
В некоторых вариантах осуществления критерии определения системы определения включают в себя следующий критерий: определяют, представляет ли собой образец опухоль или обычный образец, в соответствии со значением точки разделения.
В некоторых вариантах осуществления опухоль выбирают из уротелиальных опухолей. Необязательно, опухоль выбирают из рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака почечной лоханки и рака уретры. Необязательно, опухоль выбирают из рака мочевого пузыря.
Способ детектирования по данной заявке можно использовать до и после лечения опухоли или использовать в сочетании с лечением опухоли. После лечения способ обнаружения используют, например, для оценки успешности лечения, наблюдения за облегчением, обострением и/или прогрессированием (включая метастазы) опухолей после лечения.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1A-1F показаны, соответственно, кривые ROC детектирования фрагментов 1-6 нуклеиновой кислоты в 108 клинических образцах ткани (включая 66 образцов ткани рака мочевого пузыря и 42 образца ткани паракарциномы рака мочевого пузыря);
На Фиг. 2 показаны кривые ROC детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и MEIS1 в 97 образцах мочи (включая 45 образцов рака мочевого пузыря и 52 контрольных образцов);
На Фиг. 3 показаны статистические результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах образцов опухоли, включая 299 образцов мочи (включая 1 образец инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 16 образцов папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 105 образцов рака мочевого пузыря, 31 образцов рака простаты, 17 образцов рака почечной лоханки, 10 образцов рака мочеточников и 119 контрольных образцов) различных типов опухолей с фрагментом 4 нуклеиновой кислоты, причем на Фиг. 3A показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы «рак мочевого пузыря и рак мочеточников и рак почечной лоханки»; на Фиг. 3B показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака мочеточников; на Фиг. 3C показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака почечной лоханки; на Фиг. 3D показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака мочевого пузыря; на Фиг. 3E показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы «инвертированная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности и папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности»; и на Фиг. 3F показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака простаты;
На Фиг. 4 показаны кривые амплификации и кривые плавления различных комплектов праймера и зонда; и
На Фиг. 5 показаны кривые ROC детектирования CG441 в 193 образцах мочи.
Осуществление изобретения
Технические решения по настоящему раскрытию будут описаны ниже применительно к конкретным примерам, при этом конкретные примеры не предназначены для ограничения объема защиты настоящего раскрытия. Некоторые несущественные модификации и корректировки, сделанные другими, исходя из идеи настоящего раскрытия, по-прежнему попадают в объем защиты настоящего раскрытия.
В данной заявке термин «праймер» или «зонд» относится к олигонуклеотиду, который включает в себя область, комплементарную к последовательности по меньшей мере 6 прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле (например, в целевом фрагменте нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть последовательности праймера или зонда не комплементарна к амплифицированной последовательности. В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд включает в себя область, комплементарную к последовательности по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле. В случае, когда праймер или зонд включает в себя область, «комплементарную по меньшей мере к x прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле», праймер или зонд является по меньшей мере на 95% комплементарным по меньшей мере к x прилегающих или не смежным блок-нуклеотидам в целевой молекуле. В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% комплементарным к целевой молекуле.
В данной заявке «нормальный» образец относится к тому же типу образца, выделенному у лица, про которое известно, что у него нет рака или опухоли.
В данной заявке образцы для детектирования уровня метилирования включают в себя, но не ограничены следующим: ДНК, РНК, мРНК-содержащие образцы ДНК и РНК, а также гибриды ДНК-РНК. ДНК или РНК могут быть однонитевыми или двухнитевыми.
В данной заявке «пациент» является млекопитающим, таким как человек.
В данной заявке термин «уровень метилирования» синонимичен термину «степень метилирования» и обычно выражается как процентная доля метилированного цитозина, который рассчитывают по количеству метилированного цитозина, деленному на сумму количества метилированного цитозина и количества неметилированного цитозина. В настоящее время уровень метилирования, как правило, рассчитывают по количеству метилированных целевых генов, деленному на количества референсных генов, или в других работах из уровня техники рассчитывают по другим формулам.
В данной заявке термин «образец» синонимичен термину «проба».
Как использовано в данной заявке, термин «и/или» относится и покрывает любые и все возможные сочетания одного или более из связанных перечисленных объектов. При использовании в перечне двух или более объектов термин «и/или» означает, что любой один из перечисленных объектов можно использовать по отдельности, или можно использовать любое сочетание двух или более из перечисленных объектов. Например, если состав, сочетание, конструкция и т.д. описаны как включающие в себя (или содержащие) компоненты A, B, C и/или D, состав может включать в себя один A; включать в себя один B; включать в себя один C; включать в себя один D; включать в себя сочетание A и B; включать в себя сочетание A и C; включать в себя сочетание A и D; включать в себя сочетание B и C; включать в себя сочетание B и D; включать в себя сочетание C и D; включать в себя сочетание A, B, и C; включать в себя сочетание A, B, и D; включать в себя сочетание A, C, и D; включать в себя сочетание B, C, и D; или включать в себя сочетание A, B, C, и D.
Пример 1
Авторы изобретения отобрали сотни маркеров генов и фрагменты нуклеиновых кислот для исследования распределения метилированных сайтов генов.
Авторы изобретения отобрали шесть фрагментов нуклеиновых кислот; результаты отбора перечислены в настоящей работе.
Последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты 1-6 показаны, соответственно, как SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6.
Процесс эксперимента:
Клеточные линии UM-UC-3, J82, SW780, T24, RT4, 5637, SCaBER, UM-UC-3 и J82 были получены у National Infrastructure of Cell Line Resource (Китай), другие клеточные линии были закуплены у ATCC (American Type Culture Collection, Американская коллекция типовых культур). Все клеточные линии были реанимированы в рекомендованных средах. Все клеточные линии были отрицательными при детектировании микоплазмы и имели нормальную клеточную морфологию. После размножения клетки были собраны, упакованы в субпакет при плотности 5×106 клеток на пробирку и сохранены в криогенной холодильной машине при -80°C для экстракции ДНК.
1) Экстракция ДНК
ДНК экстрагировали из 17 клеточных линий рака мочевого пузыря с использованием наборов для выделения ДНК (QIAGEN DNA Mini Kit, #51306), закупленных у QIAGEN.
2) Модифицирование ДНК
ДНК модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH.
Модифицированные последовательности показаны в Таблице 1.
Таблица 1
| Исходный фрагмент | После модифицирования |
| Фрагмент 1 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 1) | SEQ ID NO: 25 |
| Фрагмент 2 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 2) | SEQ ID NO: 26 |
| Фрагмент 3 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 3) | SEQ ID NO: 27 |
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 4) | SEQ ID NO: 28 |
| Фрагмент 5 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 5) | SEQ ID NO: 29 |
| Фрагмент 6 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 6) | SEQ ID NO: 30 |
3) Амплификация и детектирование
Праймеры и зонды для определения того, метилированы ли фрагменты нуклеиновых кислот, показаны в Таблице 2.
Таблица 2 Последовательности праймеров и зондов для фрагментов нуклеиновых кислот
| Фрагмент нуклеиновой кислоты | Праймер и зонд последовательности |
| ACTB (референсный ген) |
F: TTTTGGATTGTGAATTTGTG (SEQ ID NO: 49) R: AAACCTACTCCTCCCTTAAA (SEQ ID NO: 50) P: TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT (SEQ ID NO: 51) |
| Фрагмент 1 нуклеиновой кислоты |
F: CGAGAGGTTATATAAGTTTACG (SEQ ID NO: 7) R: AATTTCCTAACAAATAATTTCCG (SEQ ID NO: 8) P: CGCCCGAAAACGTATAAATTACTCC (SEQ ID NO: 9) |
| Фрагмент 2 нуклеиновой кислоты |
F: TTTAAGGATTAATAATAGAGCG (SEQ ID NO: 10) R: GAACCGCGTAATTAAAAC (SEQ ID NO: 11) P: CTAACTCTCGCCGTACCGAATC (SEQ ID NO: 12) |
| Фрагмент 3 нуклеиновой кислоты |
F: GGACGGAGATATAAGGAT (SEQ ID NO: 13) R: ATAAACGAACACCAAAATC (SEQ ID NO: 14) P: CGCAACCCCATAAAACCCAA (SEQ ID NO: 15) |
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты |
F: GTAGTCGAGAAGTATTCG (SEQ ID NO: 16) R: GATAAACGTACACTTAACG (SEQ ID NO: 17) P: ATCCTTCCAACGACAATAACG (SEQ ID NO: 18) |
| Фрагмент 5 нуклеиновой кислоты |
F: TTCGTTTATTTATGGATTACG (SEQ ID NO: 19) R: CGTAAATCGACTCCTTATAC (SEQ ID NO: 20) P: AACAACGACGACCGAACGAT (SEQ ID NO: 21) |
| Фрагмент 6 нуклеиновой кислоты |
F: GAAAATAATGTCGAATTTCGT (SEQ ID NO: 22) R: AAAATCGAAAATCCCACG (SEQ ID NO: 23) P: CTCGAACAAACGTCTCCTTAAC (SEQ ID NO: 24) |
Реакционная система показана в Таблице 3.
Таблица 3
| Компонент реакции | Добавленное количество (мкл) |
| iTaq Universal SYBR супермикс зеленый (Green supermix) (2×) | 10 |
| Праймеры (F+R, 12,5 мкМ) | 0,2 |
| Вода без нуклеазы | 8,8 |
| Матричная ДНК | 1 |
| Общий объем | 20 |
Протокол амплификации показан в Таблице 4.
Таблица 4
| Этап | Температура и время | Число циклов |
| Предварительная денатурация | 95 °C в течение 10 мин | 1 |
| Усиление | 95° C в течение 30 с | 45 |
| 55° C в течение 30 с | ||
| 72° C в течение 30 с, накопление флуоресценции |
||
| Кривая плавления | 95° C в течение 5 с | 1 |
| 65° C в течение 60 с, непрерывное накопление флуоресценции, до достижения 97 °C |
||
| Охлаждение | 40 °C в течение 3 с | 1 |
После завершения детектирования количество копий количественной системы каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждой клеточной линии было количественно рассчитано с использованием стандартной кривой, а степень метилирования каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря была рассчитана по формуле «количество копий фрагмента нуклеиновой кислоты ÷ количество копий референсного гена ACTB × 100».
Были выявлены уровни метилирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря. Результаты детектирования показаны в Таблице 5.
Таблица 5 Результаты детектирования уровней метилирования фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря
| Клеточная линия | Фрагмент 1 НК | Фрагмент 2 НК | Фрагмент 3 НК | Фрагмент 4 НК | Фрагмент 5 НК | Фрагмент 6 НК |
| BFTC-905 | 14% | 34% | 56% | 58% | 73% | 55% |
| CAL-29 | 57% | 59% | 81% | 51% | 39% | 50% |
| SCABER | 10% | 8% | 3% | 90% | 83% | 95% |
| VM-CUB-1 | 88% | 87% | 87% | 87% | 56% | 97% |
| RT-112 | 78% | 71% | 83% | 76% | 66% | 84% |
| SW780 | 44% | 51% | 62% | 72% | 75% | 80% |
| DSH1 | 89% | 85% | 78% | 92% | 54% | 95% |
| RT4 | 90% | 83% | 86% | 74% | 80% | 92% |
| SW1710 | 86% | 67% | 81% | 70% | 58% | 77% |
| 639-V | 35% | 62% | 91% | 85% | 76% | 95% |
| UM-UC-3 | 92% | 83% | 85% | 89% | 88% | 84% |
| LB831-BLC | 78% | 81% | 89% | 82% | 71% | 72% |
| KU-19-19 | 56% | 68% | 84% | 60% | 63% | 34% |
| 647-V | 13% | 50% | 83% | 83% | 60% | 85% |
| 5637 | 1% | 5% | 36% | 84% | 86% | 98% |
| J82 | 79% | 80% | 76% | 74% | 35% | 80% |
| T-24 | 62% | 83% | 87% | 76% | 55% | 83% |
Из Таблицы 5 видно, что в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря, 6 фрагментов нуклеиновых кислот метилированы до различной степени, среди которых фрагменты нуклеиновых кислот 3, 4, и 6 метилированы в большем количестве клеточных линий по сравнению с другими фрагментами.
Пример 2
Была выявлена чувствительность и специфичность каждого фрагмента нуклеиновой кислоты по Примеру 1 к 108 клиническим образцам ткани (включая 66 образцов ткани рака мочевого пузыря и 42 образцов ткани параканциномы рака мочевого пузыря паракарцинома).
Процесс эксперимента:
1) Экстракция ДНК
ДНК экстрагировали из каждого образца среза ткани с использованием набора принадлежностей для экстракции ДНК (HiPure FFPE DNA Kit, D3126-03), закупленного у компании Magen.
2) Модифицирование ДНК, амплификация и детектирование, причем праймеры и зонды для фрагментов были теми же, что и в Примере 1.
3) Способ расчета
После завершения детектирования количество копий количественной системы каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждой клеточной линии было рассчитано с использованием стандартной кривой, а степень метилирования каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждом образце ткани была рассчитана по формуле «количество копий фрагмента нуклеиновой кислоты ÷ количество копий референсного гена ACTB × 100». Наконец, был выбран порог в качестве критерия, чтобы отличить группу рака от контрольной группы. Если преобразованное соотношение больше заданного порога, то метилирование определяют как положительное, а если преобразованное соотношение больше или равно заданного порога, то метилирование определяют как отрицательное. Согласно критерию, статистические результаты детектирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в 108 клинических образцах ткани показаны в Таблице 6, а кривые ROC показаны на Фиг. 1A-1F.
Таблица 6 Результаты детектирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в клинических образцах ткани
| Фрагмент | Чувствительность | Специфичность | AUC (P<0,001) |
| Фрагмент 1 нуклеиновой кислоты | 65,2 | 80,5 | 0,783 |
| Фрагмент 2 нуклеиновой кислоты | 77,3 | 83,3 | 0,854 |
| Фрагмент 3 нуклеиновой кислоты | 81,8 | 90,5 | 0,915 |
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | 84,8 | 92,2 | 0,925 |
| Фрагмент 5 нуклеиновой кислоты | 63,6 | 91,1 | 0,773 |
| Фрагмент 6 нуклеиновой кислоты | 78,8 | 92,9 | 0,896 |
Результаты показывают, что различные фрагменты имеют различия в чувствительности и специфичности к образцам ткани. Среди них чувствительность и специфичность фрагментов нуклеиновой кислоты 3 и 4 выше, чем у других фрагментов.
Пример 3
Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию сопоставили с маркерами MEIS1, NKX6-2, OTX1, SIM2, SOX1, BARHL2, ZNF154 и RUNX3 метилирования гена рака мочевого пузыря, о которых часто сообщалось в документах.
Было взято 20 образцов ткани мочевого пузыря с внедренным парафином, включая 10 образцов рака мочевого пузыря и 10 контрольных образцов гландулярного цистита.
Процесс эксперимента:
1) Экстракция ДНК
ДНК экстрагировали из каждого среза ткани с использованием набора для экстракции ДНК (набор для экстракции ДНК HiPure FFPE HiPure FFPE DNA Kit, D3126-03), закупленного у компании Magen.
2) Модифицирование ДНК
ДНК модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH.
3) Амплификация и детектирование
Реакционная система и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 1.
Последовательности праймеров показаны в Таблице 7.
Таблица 7
| Наименование | Последовательность |
| ACTB (референсный ген) | Прямой праймер: TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT (SEQ ID NO: 52) Обратный праймер: AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO: 53) |
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты |
Прямой праймер: GCGTTCGGAGTTGTTTAGC (SEQ ID NO: 54) Обратный праймер: CACCGACGCCACAAACG (SEQ ID NO: 55) |
| MEIS1 | Прямой праймер: GTTCGGGATAAGATTTCGGGG (SEQ ID NO: 56) Обратный праймер: TAATTAAAACTACGCAACCCGACT (SEQ ID NO: 57) |
| NKX6-2 | Прямой праймер: AGAAGAAGTATTCGCGTTCGAT (SEQ ID NO: 58) Обратный праймер: GATCATACCCAACGAATAAACG (SEQ ID NO: 59) |
| OTX1 | Прямой праймер: GTTAGTAGTAGTAGAGCGGGAGC (SEQ ID NO: 60) Обратный праймер: GACGTAAATTAACCACTACTTTCG (SEQ ID NO: 61) |
| SIM2 | Прямой праймер: GTAGGCGTAGAGGGGATAATTCG (SEQ ID NO: 62) Обратный праймер: ACCCCGCGCTAAATCTACAAC (SEQ ID NO: 63) |
| SOX1 | Прямой праймер: TAATTAGGATCGGGTTAAACGGT (SEQ ID NO: 64) Обратный праймер: AAACGCTTACTAATCTCCGAAT (SEQ ID NO: 65) |
| BARHL2 | Прямой праймер: CGTTAGTAGTCGGATTATAAGCGAAC (SEQ ID NO: 66) Обратный праймер: AAAAATTACGAAACAAACACGACCG (SEQ ID NO: 67) |
| ZNF154 | Прямой праймер: GTTAGGTTTGGGATAGGGATCG (SEQ ID NO: 68) Обратный праймер: CGCTACCATCAAACTCTACG (SEQ ID NO: 69) |
| RUNX3 | Прямой праймер: GAGGTTTAGTACGCGTTCG (SEQ ID NO: 70) Обратный праймер: CCCGCCTCCTAAATCTATCG (SEQ ID NO: 71) |
4) Способ расчета был таким же, как и в Примере 2.
Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и маркеры в 20 образцах ткани показаны в Таблице 8, а результаты статистического анализа показаны в Таблице 9.
Таблица 8 Результаты детектирования уровней метилирования 9 генов в образцах ткани мочевого пузыря
| Образец № | Тип образца | MEIS1 | NKX6-2 | OTX1 | SIM2 | SOX1 | BARHL2 | Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | ZNF154 | RUNX3 |
| BA01 | рак мочевого пузыря | 54,1% | 0,0% | 3,7% | 39,8% | 0,0% | 0,0% | 21,6% | 0,0% | 0,0% |
| BA02 | рак мочевого пузыря | 133,0% | 0,0% | 0,9% | 68,5% | 9,7% | 1,3% | 1,7% | 0,0% | 11,0% |
| BA03 | рак мочевого пузыря | 87,5% | 0,0% | 50,6% | 2,6% | 19,4% | 34,8% | 46,8% | 75,8% | 23,0% |
| BA04 | рак мочевого пузыря | 8,6% | 36,4% | 46,5% | 48,6% | 66,7% | 36,7% | 46,1% | 79,9% | 37,8% |
| BA05 | рак мочевого пузыря | 98,6% | 0,0% | 0,6% | 28,8% | 6,0% | 0,0% | 0,0% | 7,7% | 8,1% |
| BA06 | рак мочевого пузыря | 52,5% | 21,5% | 53,2% | 60,4% | 8,1% | 20,3% | 45,7% | 87,9% | 3,2% |
| BA07 | рак мочевого пузыря | 0,0% | 17,7% | 119,5% | 57,5% | 25,8% | 70,8% | 12,7% | 161,5% | 23,4% |
| BA08 | рак мочевого пузыря | 53,8% | 57,7% | 48,5% | 64,7% | 14,1% | 54,8% | 29,0% | 94,0% | 43,4% |
| BA09 | рак мочевого пузыря | 54,1% | 21,1% | 47,5% | 28,4% | 8,9% | 23,8% | 43,6% | 55,9% | 55,9% |
| BA10 | рак мочевого пузыря | 74,1% | 2,3% | 63,9% | 59,0% | 52,8% | 67,1% | 42,8% | 76,8% | 85,8% |
| BB01 | Контрольный | 3,4% | 0,0% | 1,2% | 26,4% | 11,4% | 0,0% | 1,4% | 11,5% | 42,3% |
| BB02 | Контрольный | 5,3% | 2,4% | 1,1% | 11,1% | 6,7% | 8,9% | 0,7% | 7,0% | 54,3% |
| BB03 | Контрольный | 0,4% | 0,0% | 2,2% | 7,3% | 3,7% | 0,6% | 0,0% | 3,9% | 37,7% |
| BB04 | Контрольный | 0,9% | 0,0% | 7,1% | 2,1% | 12,8% | 0,0% | 0,0% | 23,3% | 19,6% |
| BB05 | Контрольный | 0,7% | 0,0% | 0,6% | 4,7% | 10,0% | 0,9% | 1,2% | 18,0% | 14,2% |
| BB06 | Контрольный | 3,2% | 1,4% | 2,0% | 11,3% | 5,1% | 0,9% | 1,0% | 9,8% | 43,2% |
| BB07 | Контрольный | 5,3% | 0,0% | 4,4% | 1,8% | 9,9% | 0,0% | 1,0% | 6,8% | 17,2% |
| BB08 | Контрольный | 2,1% | 0,0% | 33,7% | 18,7% | 3,9% | 0,0% | 0,0% | 8,2% | 15,9% |
| BB09 | Контрольный | 0,9% | 0,0% | 1,4% | 3,1% | 0,0% | 0,0% | 0,0% | 15,4% | 1,2% |
| BB10 | Контрольный | 3,5% | 0,0% | 0,9% | 25,9% | 40,3% | 24,0% | 7,8% | 3,8% | 124,0% |
В Таблице процент метилирования = количественная концентрация целевого гена / количественная концентрация референсного гена × 100%.
Таблица 9 Статистические результаты
| MEIS1 | NKX6-2 | OTX1 | SIM2 | SOX1 | BARHL2 | Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | ZNF154 | RUNX3 | |
| Чувствительность | 90,0% | 60,0% | 70,0% | 90,0% | 50,0% | 70,0% | 90,0% | 70,0% | 20,0% |
| Специфичность | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% | 90,0% |
Результаты показывают, что MEIS1, SIM2 и фрагмент 4 нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию могут позволить хорошо различать образцы ткани рака, взятые у пациентов с раком мочевого пузыря, и образцы ткани мочевого пузыря, взятые у людей без рака мочевого пузыря, и их чувствительность и специфичность к образцам ткани рака мочевого пузыря у тех и других составляет 90%.
Пример 4
Информация об образцах: 97 образцов мочи, включая 45 образцов рака мочевого пузыря и 52 контрольных образцов.
В настоящем примере экстракция и преобразование ДНК были такими же, как и в Примере 3.
Последовательности праймеров и зондов показаны в Таблице 10.
Таблица 10
| Наименование | Последовательность |
| ACTB (референсный ген) |
Прямой праймер: TTTTGGATTGTGAATTTGTG (SEQ ID NO: 49) Обратный праймер: AAACCTACTCCTCCCTTAAA (SEQ ID NO: 50) Зонд: TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT (SEQ ID NO: 51) |
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | Прямой праймер: GCGTTCGGAGTTGTTTAGCG (SEQ ID NO: 72) Обратный праймер: CACCGACGCCACAAACGA (SEQ ID NO: 73) Зонд: CTATTACCGCCGCCGCCGTCG (SEQ ID NO: 74) |
| MEIS1 | Прямой праймер: GTTCGGGATAAGATTTCGGGG (SEQ ID NO: 75) Обратный праймер: TAATTAAAACTACGCAACCCGACT (SEQ ID NO: 76) Зонд: CGAGAGGGGTCGGGCGAGTTAG (SEQ ID NO: 77) |
Система амплификации по настоящему примеру показана в Таблице 11.
Таблица 11
| Компонент реакции | Добавленное количество (мкл) |
| 5× буфер | 4 |
| Ионы магния (25 мМ) | 4 |
| дНТФ (10 мМ) | 0,8 |
| Прямой праймер F (25 мкМ) | 0,4 |
| Обратный праймер R (25 мкМ) | 0,4 |
| Зонд P (10 мкМ) | 0,4 |
| Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
| H2O | 7,6 |
| Матричная ДНК | 2 |
| Общий объем | 20 |
Протокол амплификации по настоящему примеру показан в Таблице 12.
Таблица 12
| Этап | Температура и время | Число циклов |
| Предварительная денатурация | 95 °C в течение 5 мин | 1 |
| Усиление | 95 °C в течение 20 с | 45 |
| 65 °C в течение 20 с | ||
| 62 °C в течение 40 с | ||
| Охлаждение | 40 °C в течение 3 мин | 1 |
В 97 образцах мочи, если величина Ct детектирования уровня метилирования составляет больше, чем величина точки разделения, то метилирование определяют как отрицательное, а в противном случае метилирование определяют как положительное. Значение точки разделения для детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляет 34,65, а значение точки разделения для детектирования MEIS1 составляет 33,82. Результаты детектирования показаны в Таблице 13.
Таблица 13 Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и MEIS1 в 97 образцах мочи
| Образец № | Тип образца | Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | MEIS1 | ||
| Значение Ct | Результат выявления | Значение Ct | Результат выявления | ||
| UF001 | Контрольный | 35,21 | отрицательный | 34,82 | отрицательный |
| UF002 | Контрольный | 35,59 | отрицательный | 35,67 | отрицательный |
| UF003 | Контрольный | 45 | отрицательный | 36,27 | отрицательный |
| UF004 | Контрольный | 45 | отрицательный | 38,84 | отрицательный |
| UF005 | Контрольный | 37,64 | отрицательный | 36,16 | отрицательный |
| UF006 | Контрольный | 35,74 | отрицательный | 33,77 | положительный |
| UF007 | Контрольный | 35,29 | отрицательный | 36,04 | отрицательный |
| UF008 | Контрольный | 35,78 | отрицательный | 35,24 | отрицательный |
| UF009 | Контрольный | 38,69 | отрицательный | 33,45 | положительный |
| UF010 | Контрольный | 36,29 | отрицательный | 35,19 | отрицательный |
| UF011 | Контрольный | 45 | отрицательный | 37,9 | отрицательный |
| UF012 | Контрольный | 45 | отрицательный | 38,24 | отрицательный |
| UF013 | Контрольный | 35,66 | отрицательный | 34,53 | отрицательный |
| UF014 | Контрольный | 36,01 | отрицательный | 33,99 | отрицательный |
| UF015 | Контрольный | 45 | отрицательный | 37,7 | отрицательный |
| UF016 | Контрольный | 35,51 | отрицательный | 43 | отрицательный |
| UF017 | Контрольный | 38,13 | отрицательный | 37,21 | отрицательный |
| UF018 | Контрольный | 36,81 | отрицательный | 36,47 | отрицательный |
| UF019 | Контрольный | 35,47 | отрицательный | 38,45 | отрицательный |
| UF020 | Контрольный | 38,94 | отрицательный | 36,76 | отрицательный |
| UA009 | Контрольный | 37,26 | отрицательный | 34,56 | отрицательный |
| UA011 | Контрольный | 35,81 | отрицательный | 35,53 | отрицательный |
| UA013 | Контрольный | 39,42 | отрицательный | 38,74 | отрицательный |
| UA018 | Контрольный | 37,11 | отрицательный | 35,1 | отрицательный |
| UA022 | Контрольный | 37 | отрицательный | 35,63 | отрицательный |
| UA023 | Контрольный | 34,74 | отрицательный | 36,69 | отрицательный |
| UA027 | Контрольный | 45 | отрицательный | 35,29 | отрицательный |
| UA028 | Контрольный | 36,54 | отрицательный | 33,88 | отрицательный |
| UA029 | Контрольный | 38,01 | отрицательный | 34,08 | отрицательный |
| UA030 | Контрольный | 37,43 | отрицательный | 35,35 | отрицательный |
| UA032 | Контрольный | 37,35 | отрицательный | 35,88 | отрицательный |
| UA037 | Контрольный | 45 | отрицательный | 36,94 | отрицательный |
| UA040 | Контрольный | 39,99 | отрицательный | 35,97 | отрицательный |
| UA042 | Контрольный | 36,98 | отрицательный | 35,32 | отрицательный |
| UA046 | Контрольный | 45 | отрицательный | 34,91 | отрицательный |
| UA049 | Контрольный | 36,78 | отрицательный | 34,18 | отрицательный |
| UE001 | Контрольный | 36,62 | отрицательный | 34,69 | отрицательный |
| UE002 | Контрольный | 40,11 | отрицательный | 33,89 | отрицательный |
| UE003 | Контрольный | 38,04 | отрицательный | 32,22 | положительный |
| UE004 | Контрольный | 35,21 | отрицательный | 32,48 | положительный |
| UE005 | Контрольный | 35,85 | отрицательный | 33,81 | положительный |
| UE006 | Контрольный | 34,83 | отрицательный | 35,28 | отрицательный |
| UE008 | Контрольный | 34,7 | отрицательный | 33,87 | отрицательный |
| UE009 | Контрольный | 45 | отрицательный | 35,98 | отрицательный |
| UE010 | Контрольный | 36,34 | отрицательный | 35 | отрицательный |
| UE013 | Контрольный | 45 | отрицательный | 35,5 | отрицательный |
| UE014 | Контрольный | 36,1 | отрицательный | 32,03 | положительный |
| UE016 | Контрольный | 37,54 | отрицательный | 34,6 | отрицательный |
| UE017 | Контрольный | 37,84 | отрицательный | 31,55 | положительный |
| UE018 | Контрольный | 38,09 | отрицательный | 33,71 | положительный |
| UE019 | Контрольный | 39,16 | отрицательный | 35,08 | отрицательный |
| UE020 | Контрольный | 36,56 | отрицательный | 36,16 | отрицательный |
| UC107 | рак мочевого пузыря | 26,19 | положительный | 30,05 | положительный |
| UC108 | рак мочевого пузыря | 27,43 | положительный | 31,65 | положительный |
| UD043 | рак мочевого пузыря | 34,26 | положительный | 38,77 | отрицательный |
| UD044 | рак мочевого пузыря | 28,51 | положительный | 31,87 | положительный |
| UD046 | рак мочевого пузыря | 31,21 | положительный | 33,72 | положительный |
| UD047 | рак мочевого пузыря | 28,08 | положительный | 32 | положительный |
| UD049 | рак мочевого пузыря | 34,4 | положительный | 35,46 | отрицательный |
| UD051 | рак мочевого пузыря | 27,47 | положительный | 31,34 | положительный |
| UD054 | рак мочевого пузыря | 28,2 | положительный | 31,28 | положительный |
| UD056 | рак мочевого пузыря | 27,87 | положительный | 31,01 | положительный |
| UD057 | рак мочевого пузыря | 26,69 | положительный | 30,22 | положительный |
| UD059 | рак мочевого пузыря | 31,27 | положительный | 33,76 | положительный |
| UD060 | рак мочевого пузыря | 28,24 | положительный | 37,69 | отрицательный |
| UD063 | рак мочевого пузыря | 28,89 | положительный | 33,08 | положительный |
| UD065 | рак мочевого пузыря | 30,45 | положительный | 33,72 | положительный |
| UD068 | рак мочевого пузыря | 31,03 | положительный | 33,82 | отрицательный |
| UD070 | рак мочевого пузыря | 30,46 | положительный | 33,93 | отрицательный |
| UD072 | рак мочевого пузыря | 34,65 | отрицательный | 34,76 | отрицательный |
| UD076 | рак мочевого пузыря | 27,43 | положительный | 31,16 | положительный |
| UD084 | рак мочевого пузыря | 31,18 | положительный | 38,69 | отрицательный |
| UD089 | рак мочевого пузыря | 35,94 | отрицательный | 31,28 | положительный |
| UA001 | рак мочевого пузыря | 39,38 | отрицательный | 37,19 | отрицательный |
| UA002 | рак мочевого пузыря | 34,58 | положительный | 33,91 | отрицательный |
| UA003 | рак мочевого пузыря | 30,83 | положительный | 29,99 | положительный |
| UA004 | рак мочевого пузыря | 27,54 | положительный | 30,54 | положительный |
| UA063 | рак мочевого пузыря | 27,48 | положительный | 29,67 | положительный |
| UA066 | рак мочевого пузыря | 27,38 | положительный | 30,61 | положительный |
| UA067 | рак мочевого пузыря | 33,04 | положительный | 35,16 | отрицательный |
| UA068 | рак мочевого пузыря | 31,82 | положительный | 33,7 | положительный |
| UA069 | рак мочевого пузыря | 34,33 | положительный | 38,53 | отрицательный |
| UA070 | рак мочевого пузыря | 29,89 | положительный | 32,33 | положительный |
| UA071 | рак мочевого пузыря | 25,65 | положительный | 28,54 | положительный |
| UA072 | рак мочевого пузыря | 36,09 | отрицательный | 27,93 | положительный |
| UC018 | рак мочевого пузыря | 30,49 | положительный | 34,31 | отрицательный |
| UC035 | рак мочевого пузыря | 25,15 | положительный | 27,93 | положительный |
| UC045 | рак мочевого пузыря | 34,14 | положительный | 38,61 | отрицательный |
| UC062 | рак мочевого пузыря | 34,52 | положительный | 31,73 | положительный |
| UC068 | рак мочевого пузыря | 33,77 | положительный | 33,31 | положительный |
| UC070 | рак мочевого пузыря | 26,54 | положительный | 29,28 | положительный |
| UC080 | рак мочевого пузыря | 26,07 | положительный | 30,74 | положительный |
| UC082 | рак мочевого пузыря | 38,23 | отрицательный | 37,59 | отрицательный |
| UC083 | рак мочевого пузыря | 32,52 | положительный | 33,67 | положительный |
| UC087 | рак мочевого пузыря | 29,51 | положительный | 32,2 | положительный |
| UC092 | рак мочевого пузыря | 29,64 | положительный | 31,9 | положительный |
| UC095 | рак мочевого пузыря | 26,63 | положительный | 31,88 | положительный |
Результаты статистического анализа вышеуказанных результатов детектирования показаны в Таблице 14, а кривые ROC показаны на фиг. 2.
Таблица 14
| Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты | MEIS1 | |
| Точка разделения | 34,65 | 33,82 |
| Чувствительность | 91,1 | 71,1 |
| Специфичность | 100,0 | 84,6 |
| AUC | 0,956 | 0,790 |
Результаты показывают, что при детектировании уровней метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в образцах мочи для выявления рака мочевого пузыря специфичность детектирования имеет высокое значение, составляющее 100%, а чувствительность составляет 91,1%. При детектировании уровней метилирования гена MEIS1 в образцах мочи для выявления рака мочевого пузыря специфичность детектирования составляет лишь 84,6%, а чувствительность составляет лишь 71,1%.
Пример 5
Информация об образцах: 299 образцов мочи, включая 1 образец инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 16 образцов папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 105 образцов рака мочевого пузыря, 31 образцов рака простаты, 17 образцов рака почечной лоханки, 10 образцов рака мочеточников и 119 контрольных образцов.
В настоящем раскрытии экстракция и преобразование ДНК, последовательности праймеров и зондов для фрагмента 4 нуклеиновой кислоты, система амплификации и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 4.
Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах образцов опухоли показаны в Таблице 15.
Таблица 15 Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах опухолей в образцах мочи
| Тип образца | Значение Ct фрагмента 4 нуклеиновой кислоты | Результат выявления фрагмента 4 нуклеиновой кислоты | |
| UA126 | инвертированная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 37,89 | отрицательный |
| UD007 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 45 | отрицательный |
| UD035 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 39,18 | отрицательный |
| UD055 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 36,92 | отрицательный |
| UD058 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 36,77 | отрицательный |
| UD061 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 31,52 | положительный |
| UD091 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 40,48 | отрицательный |
| UD106 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 33,11 | положительный |
| UD123 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 37,45 | отрицательный |
| UD159 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 34,93 | положительный |
| UD160 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 35,19 | положительный |
| UD181 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 38,92 | отрицательный |
| UD230 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 37,64 | отрицательный |
| UD232 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 45 | отрицательный |
| UD319 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 38,82 | отрицательный |
| UG043 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 36,51 | отрицательный |
| UC071 | папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности | 28,56 | положительный |
| UA010 | Контрольный | 37,29 | отрицательный |
| UA012 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA014 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA015 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA016 | Контрольный | 36,49 | отрицательный |
| UA017 | Контрольный | 37,42 | отрицательный |
| UA020 | Контрольный | 36,91 | отрицательный |
| UA021 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA024 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA025 | Контрольный | 36,85 | отрицательный |
| UA026 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA031 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA033 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA034 | Контрольный | 35,75 | положительный |
| UA035 | Контрольный | 38,62 | отрицательный |
| UA036 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA039 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA041 | Контрольный | 34,56 | положительный |
| UA043 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA044 | Контрольный | 37,17 | отрицательный |
| UA045 | Контрольный | 37,63 | отрицательный |
| UA047 | Контрольный | 33,25 | положительный |
| UA048 | Контрольный | 37,92 | отрицательный |
| UA050 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA051 | Контрольный | 37,24 | отрицательный |
| UA052 | Контрольный | 38,46 | отрицательный |
| UA108 | Контрольный | 36,84 | отрицательный |
| UA109 | Контрольный | 40,73 | отрицательный |
| UA114 | Контрольный | 37,47 | отрицательный |
| UA117 | Контрольный | 38,63 | отрицательный |
| UA118 | Контрольный | 39,81 | отрицательный |
| UA128 | Контрольный | 42,86 | отрицательный |
| UC001 | Контрольный | 34,94 | положительный |
| UC002 | Контрольный | 36,77 | отрицательный |
| UC005 | Контрольный | 37,97 | отрицательный |
| UC006 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC007 | Контрольный | 37,7 | отрицательный |
| UC009 | Контрольный | 38,15 | отрицательный |
| UC011 | Контрольный | 38,43 | отрицательный |
| UC012 | Контрольный | 38,92 | отрицательный |
| UC013 | Контрольный | 37,17 | отрицательный |
| UC017 | Контрольный | 37,49 | отрицательный |
| UC019 | Контрольный | 37,67 | отрицательный |
| UC020 | Контрольный | 37,79 | отрицательный |
| UC022 | Контрольный | 37,67 | отрицательный |
| UC023 | Контрольный | 38,4 | отрицательный |
| UC024 | Контрольный | 39,64 | отрицательный |
| UC026 | Контрольный | 37,81 | отрицательный |
| UC027 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC030 | Контрольный | 37,23 | отрицательный |
| UC031 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC032 | Контрольный | 36,74 | отрицательный |
| UC033 | Контрольный | 38,47 | отрицательный |
| UC039 | Контрольный | 37,73 | отрицательный |
| UC040 | Контрольный | 38,62 | отрицательный |
| UC041 | Контрольный | 37,8 | отрицательный |
| UC044 | Контрольный | 38,03 | отрицательный |
| UC046 | Контрольный | 34,15 | положительный |
| UC047 | Контрольный | 37,57 | отрицательный |
| UC048 | Контрольный | 36,51 | отрицательный |
| UC051 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC052 | Контрольный | 37,56 | отрицательный |
| UC055 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC056 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC059 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC060 | Контрольный | 39,64 | отрицательный |
| UC061 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UC063 | Контрольный | 37,51 | отрицательный |
| UC064 | Контрольный | 38,07 | отрицательный |
| UC081 | Контрольный | 36,53 | отрицательный |
| UC097 | Контрольный | 37,37 | отрицательный |
| UC098 | Контрольный | 37,81 | отрицательный |
| UD008 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD040 | Контрольный | 39,98 | отрицательный |
| UD041 | Контрольный | 35,93 | положительный |
| UD045 | Контрольный | 37,53 | отрицательный |
| UD050 | Контрольный | 38,19 | отрицательный |
| UD071 | Контрольный | 38,29 | отрицательный |
| UD073 | Контрольный | 37,69 | отрицательный |
| UD108 | Контрольный | 37,99 | отрицательный |
| UD124 | Контрольный | 39,18 | отрицательный |
| UD126 | Контрольный | 37,49 | отрицательный |
| UD200 | Контрольный | 42,77 | отрицательный |
| UD236 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD238 | Контрольный | 37,68 | отрицательный |
| UD242 | Контрольный | 37,06 | отрицательный |
| UD259 | Контрольный | 34,49 | положительный |
| UD263 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD265 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD266 | Контрольный | 38,52 | отрицательный |
| UD269 | Контрольный | 37,42 | отрицательный |
| UD270 | Контрольный | 36,66 | отрицательный |
| UD274 | Контрольный | 38,54 | отрицательный |
| UD276 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD277 | Контрольный | 38,73 | отрицательный |
| UD281 | Контрольный | 39,23 | отрицательный |
| UD301 | Контрольный | 38,06 | отрицательный |
| UD304 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD306 | Контрольный | 36,66 | отрицательный |
| UD316 | Контрольный | 38,57 | отрицательный |
| UD318 | Контрольный | 36,85 | отрицательный |
| UD323 | Контрольный | 39,11 | отрицательный |
| UD325 | Контрольный | 38,66 | отрицательный |
| UD326 | Контрольный | 38,6 | отрицательный |
| UD328 | Контрольный | 40,71 | отрицательный |
| UD331 | Контрольный | 37,89 | отрицательный |
| UD336 | Контрольный | 32,95 | положительный |
| UG004 | Контрольный | 37,95 | отрицательный |
| UG009 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UG021 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UG036 | Контрольный | 38,4 | отрицательный |
| UG039 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UG066 | Контрольный | 38,08 | отрицательный |
| UG093 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UD164 | Контрольный | 36,5 | отрицательный |
| UG035 | Контрольный | 38,61 | отрицательный |
| UD346 | Контрольный | 37,55 | отрицательный |
| UD357 | Контрольный | 37,33 | отрицательный |
| UD364 | Контрольный | 45 | отрицательный |
| UA002-2 | рак мочевого пузыря | 35,86 | положительный |
| UA006 | рак мочевого пузыря | 33,2 | положительный |
| UA008 | рак мочевого пузыря | 29,04 | положительный |
| UA053 | рак мочевого пузыря | 30,97 | положительный |
| UA055 | рак мочевого пузыря | 29,19 | положительный |
| UA056 | рак мочевого пузыря | 28,83 | положительный |
| UA057 | рак мочевого пузыря | 37,26 | отрицательный |
| UA060 | рак мочевого пузыря | 32,61 | положительный |
| UA061 | рак мочевого пузыря | 37,8 | отрицательный |
| UA062 | рак мочевого пузыря | 29,53 | положительный |
| UA073 | рак мочевого пузыря | 29,92 | положительный |
| UA074 | рак мочевого пузыря | 34,94 | положительный |
| UA077 | рак мочевого пузыря | 32,69 | положительный |
| UA078 | рак мочевого пузыря | 29,86 | положительный |
| UA079 | рак мочевого пузыря | 35,04 | положительный |
| UA090 | рак мочевого пузыря | 36,6 | отрицательный |
| UA091 | рак мочевого пузыря | 29,57 | положительный |
| UA092 | рак мочевого пузыря | 30,71 | положительный |
| UA094 | рак мочевого пузыря | 31,85 | положительный |
| UA097 | рак мочевого пузыря | 29,41 | положительный |
| UA100 | рак мочевого пузыря | 36,99 | отрицательный |
| UA104 | рак мочевого пузыря | 37,5 | отрицательный |
| UA111 | рак мочевого пузыря | 31,03 | положительный |
| UA115 | рак мочевого пузыря | 34,47 | положительный |
| UA116 | рак мочевого пузыря | 31,71 | положительный |
| UA119 | рак мочевого пузыря | 33,26 | положительный |
| UA121 | рак мочевого пузыря | 31,05 | положительный |
| UA122 | рак мочевого пузыря | 30,28 | положительный |
| UA124 | рак мочевого пузыря | 29,37 | положительный |
| UA134 | рак мочевого пузыря | 29,32 | положительный |
| UA135 | рак мочевого пузыря | 36,85 | отрицательный |
| UA137 | рак мочевого пузыря | 31,16 | положительный |
| UA138 | рак мочевого пузыря | 30,48 | положительный |
| UA139 | рак мочевого пузыря | 28,75 | положительный |
| UA141 | рак мочевого пузыря | 28,14 | положительный |
| UA147 | рак мочевого пузыря | 45 | отрицательный |
| UA149 | рак мочевого пузыря | 29,24 | положительный |
| UA154 | рак мочевого пузыря | 31,17 | положительный |
| UB001 | рак мочевого пузыря | 31,57 | положительный |
| UB003 | рак мочевого пузыря | 29,23 | положительный |
| UB005 | рак мочевого пузыря | 28,74 | положительный |
| UB006 | рак мочевого пузыря | 31,12 | положительный |
| UB008 | рак мочевого пузыря | 32,25 | положительный |
| UC096 | рак мочевого пузыря | 36,11 | положительный |
| UC101 | рак мочевого пузыря | 30,2 | положительный |
| UD003 | рак мочевого пузыря | 35,16 | положительный |
| UD004 | рак мочевого пузыря | 29,16 | положительный |
| UD009 | рак мочевого пузыря | 29,79 | положительный |
| UD011 | рак мочевого пузыря | 28,87 | положительный |
| UD014 | рак мочевого пузыря | 32,92 | положительный |
| UD015 | рак мочевого пузыря | 34,54 | положительный |
| UD016 | рак мочевого пузыря | 30,08 | положительный |
| UD018 | рак мочевого пузыря | 32,11 | положительный |
| UD028 | рак мочевого пузыря | 34,16 | положительный |
| UD030 | рак мочевого пузыря | 28,73 | положительный |
| UD038 | рак мочевого пузыря | 29,54 | положительный |
| UD039 | рак мочевого пузыря | 36,31 | отрицательный |
| UD078 | рак мочевого пузыря | 33,22 | положительный |
| UD080 | рак мочевого пузыря | 28,36 | положительный |
| UD095 | рак мочевого пузыря | 31,15 | положительный |
| UD099 | рак мочевого пузыря | 35,08 | положительный |
| UD109 | рак мочевого пузыря | 30,96 | положительный |
| UD110 | рак мочевого пузыря | 36,1 | положительный |
| UD111 | рак мочевого пузыря | 32,91 | положительный |
| UD134 | рак мочевого пузыря | 33,59 | положительный |
| UD135 | рак мочевого пузыря | 33,21 | положительный |
| UD136 | рак мочевого пузыря | 28,59 | положительный |
| UD137 | рак мочевого пузыря | 35,82 | положительный |
| UD141 | рак мочевого пузыря | 34,57 | положительный |
| UD142 | рак мочевого пузыря | 34,63 | положительный |
| UD145 | рак мочевого пузыря | 29,86 | положительный |
| UD150 | рак мочевого пузыря | 34,84 | положительный |
| UD161 | рак мочевого пузыря | 30,01 | положительный |
| UD162 | рак мочевого пузыря | 35,01 | положительный |
| UD174 | рак мочевого пузыря | 34,83 | положительный |
| UD175 | рак мочевого пузыря | 32,68 | положительный |
| UD205 | рак мочевого пузыря | 30,64 | положительный |
| UD210 | рак мочевого пузыря | 34,01 | положительный |
| UD220 | рак мочевого пузыря | 29,11 | положительный |
| UD221 | рак мочевого пузыря | 29,06 | положительный |
| UD225 | рак мочевого пузыря | 37,17 | отрицательный |
| UD237 | рак мочевого пузыря | 33,03 | положительный |
| UD243 | рак мочевого пузыря | 36,29 | положительный |
| UD244 | рак мочевого пузыря | 30,27 | положительный |
| UD257 | рак мочевого пузыря | 29,87 | положительный |
| UD268 | рак мочевого пузыря | 29,51 | положительный |
| UD293 | рак мочевого пузыря | 32,53 | положительный |
| UD298 | рак мочевого пузыря | 30,48 | положительный |
| UD303 | рак мочевого пузыря | 32,98 | положительный |
| UD308 | рак мочевого пузыря | 34,96 | положительный |
| UD312 | рак мочевого пузыря | 35,02 | положительный |
| UD314 | рак мочевого пузыря | 31,95 | положительный |
| UD330 | рак мочевого пузыря | 30,06 | положительный |
| UD349 | рак мочевого пузыря | 32,5 | положительный |
| UD355 | рак мочевого пузыря | 30,59 | положительный |
| UD361 | рак мочевого пузыря | 33,99 | положительный |
| UD366 | рак мочевого пузыря | 31,61 | положительный |
| UD367 | рак мочевого пузыря | 31,71 | положительный |
| UG003 | рак мочевого пузыря | 32,28 | положительный |
| UG025 | рак мочевого пузыря | 35,58 | положительный |
| UG046 | рак мочевого пузыря | 34,94 | положительный |
| UG053 | рак мочевого пузыря | 33,5 | положительный |
| UG059 | рак мочевого пузыря | 30,67 | положительный |
| UG064 | рак мочевого пузыря | 32,83 | положительный |
| UG080 | рак мочевого пузыря | 32 | положительный |
| UA088 | рак простаты | 35,19 | положительный |
| UA089 | рак простаты | 34,53 | положительный |
| UA093 | рак простаты | 36,14 | положительный |
| UA105 | рак простаты | 36,46 | отрицательный |
| UD064 | рак простаты | 34,91 | положительный |
| UD102 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UD127 | рак простаты | 36,5 | отрицательный |
| UD138 | рак простаты | 37,08 | отрицательный |
| UD151 | рак простаты | 36,07 | положительный |
| UD154 | рак простаты | 36,95 | отрицательный |
| UD165 | рак простаты | 37,88 | отрицательный |
| UD179 | рак простаты | 35,7 | положительный |
| UD206 | рак простаты | 39,03 | отрицательный |
| UD233 | рак простаты | 35,56 | положительный |
| UD240 | рак простаты | 34,29 | положительный |
| UD254 | рак простаты | 37,11 | отрицательный |
| UD255 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UD294 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UD310 | рак простаты | 37,97 | отрицательный |
| UD338 | рак простаты | 37,18 | отрицательный |
| UD341 | рак простаты | 38,13 | отрицательный |
| UD351 | рак простаты | 38,71 | отрицательный |
| UG007 | рак простаты | 34,69 | положительный |
| UG011 | рак простаты | 37,87 | отрицательный |
| UG037 | рак простаты | 38,11 | отрицательный |
| UG038 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UG044 | рак простаты | 33,04 | положительный |
| UG054 | рак простаты | 36,13 | положительный |
| UG061 | рак простаты | 36,66 | отрицательный |
| UA110 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UD292 | рак простаты | 45 | отрицательный |
| UA080 | рак почечной лоханки | 30,98 | положительный |
| UA085 | рак почечной лоханки | 34,92 | положительный |
| UA086 | рак почечной лоханки | 35,11 | положительный |
| UA106 | рак почечной лоханки | 33,1 | положительный |
| UA142 | рак почечной лоханки | 37,85 | отрицательный |
| UD013 | рак почечной лоханки | 35,76 | положительный |
| UD023 | рак почечной лоханки | 30,23 | положительный |
| UD042 | рак почечной лоханки | 33,77 | положительный |
| UD062 | рак почечной лоханки | 35,71 | положительный |
| UD067 | рак почечной лоханки | 38,29 | отрицательный |
| UD079 | рак почечной лоханки | 31,58 | положительный |
| UD113 | рак почечной лоханки | 28,25 | положительный |
| UD125 | рак почечной лоханки | 30,63 | положительный |
| UD251 | рак почечной лоханки | 31,07 | положительный |
| UD290 | рак почечной лоханки | 36,56 | отрицательный |
| UD291 | рак почечной лоханки | 31,54 | положительный |
| UD053 | рак почечной лоханки | 31 | положительный |
| UD167 | рак мочеточников | 29,78 | положительный |
| UD094 | рак мочеточников | 33,57 | положительный |
| UD156 | рак мочеточников | 36,74 | отрицательный |
| UD176 | рак мочеточников | 29,94 | положительный |
| UD177 | рак мочеточников | 31,76 | положительный |
| UD246 | рак мочеточников | 31,02 | положительный |
| UD253 | рак мочеточников | 34,98 | положительный |
| UD350 | рак мочеточников | 31,66 | положительный |
| UG078 | рак мочеточников | 34,14 | положительный |
| UG085 | рак мочеточников | 30,01 | положительный |
При детектировании, если значение Ct детектирования ACTB составляет менее 32, это указывает на то, что образец отвечает требованиям или его эксплуатация проводится надлежащим образом. Если значение Ct детектирования уровня метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляет менее 36,3, это указывает на то, что результат детектирования является положительным, а в противном случае результат детектирования является отрицательным.
Результаты статистического анализа вышеуказанных результатов детектирования показаны в Таблице 16, а кривые ROC показаны на фиг. 3.
Таблица 16
| Группа анализа | Индикатор | Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты |
| Сопоставление контрольной группы и группы рака мочевого пузыря и рака мочеточников и рака почечной лоханки | Специфичность | 93,3% |
| Чувствительность | 90,9% | |
| AUC | 0,962 (P<0,001) | |
| Сопоставление контрольной группы и группы рака мочеточников | Специфичность | 92,4% |
| Чувствительность | 90,0% | |
| AUC | 0,979 (P<0,001) | |
| Сопоставление контрольной группы и группы рака почечной лоханки | Специфичность | 92,4% |
| Чувствительность | 82,4% | |
| AUC | 0,927 (P<0,001) | |
| Сопоставление контрольной группы и рак мочевого пузыря группа | Специфичность | 93,3% |
| Чувствительность | 90,4% | |
| AUC | 0,966 (P<0,001) | |
| Сопоставление контрольной группы и группы инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности и папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности | Специфичность | 92,4 |
| Чувствительность | 83,6 | |
| AUC | 0,923 (P<0,001) | |
| Сопоставление контрольной группы и группы рака простаты | Специфичность | 80,7 |
| Чувствительность | 58,1 | |
| AUC | 0,671 (P=0,006) |
Как видно из результатов, приведенных в вышеуказанных Таблицах, фрагмент 4 нуклеиновой кислоты обладает высокой чувствительностью и специфичностью для детектирования различных типов опухолей в образцах мочи.
Пример 6
Праймеры и зонды также оказывают большое влияние на выявление эффектов маркеров опухоли. В ходе исследования авторы изобретения сконструировали несколько пар праймеров и их соответствующих зондов для отбора зондов и праймеров, которые могут повысить чувствительность и специфичность детектирования как можно больше, для обеспечения практического применения реагента для детектирования по настоящему раскрытию для клинического детектирования. Некоторые праймеры и зонды (6 комплектов) показаны в Таблице 17, а результаты детектирования показаны в Таблице 18. Все праймеры и зонды были сконструированы авторами изобретения с использованием метилированной последовательности фрагмента 4 нуклеиновой кислоты, которая была получена путем преобразования с помощью сульфита ы качестве матрицы. Они были синтезированы компанией Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Таблица 17. Праймеры и зонды
| Наименова-ние | Последова-тельность № | Последовательность |
| CG443-F | SEQ ID №: 31 | AGGTTCGTTTACGAGGTTTTC |
| CG443-R | SEQ ID №: 32 | CCTACGCCAACTACTCCG |
| CG443-P | SEQ ID №: 33 | CGAACGCTCCCGCTCCAAA |
| CG447-F | SEQ ID №: 34 | TGCGTTAAGTGTACGTTTATC |
| CG447-R | SEQ ID №: 35 | CGTAAAACAACTACAACTCGCG |
| CG447-P | SEQ ID №: 36 | TTCTCCTCCTACGCCTACTACCTA |
| CG190-F | SEQ ID №: 37 | GCGTTGCGTAGGTAGTAGGC |
| CG190-R | SEQ ID №: 38 | GAACCTCGAAAAAATAATACCGTT |
| CG190-P | SEQ ID №: 39 | AGGAGAACGAGGCGCGCGA |
| CG437-F | SEQ ID №: 40 | GCGTTCGGAGTTGTTTAGCG |
| CG437-R | SEQ ID №: 41 | CACCGACGCCACAAACGA |
| CG437-P | SEQ ID №: 42 | CTATTACCGCCGCCGCCGTCG |
| CG441-F | SEQ ID №: 43 | GCGGTCGTTGTATCGTTATC |
| CG441-R | SEQ ID №: 44 | GAATACTTCTCGACTACCCG |
| CG441-P | SEQ ID №: 45 | TAACGACCCCCGCAACAAACCG |
| CG446-F | SEQ ID №: 46 | CGTTGTATCGTTATCGGTGAGC |
| CG446-R | SEQ ID №: 47 | GCGCACTTAAAAATCCGCG |
| CG446-P | SEQ ID №: 48 | CTTCTCGACTACCCGCAACAACAATAACG |
| A1-F | SEQ ID №: 78 | TTGGATTGTGAATTTGTGTTTGT |
| A1-R | SEQ ID №: 79 | CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA |
| A1-P | SEQ ID №: 51 | TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT |
| A2-F | SEQ ID №: 80 | GATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT |
| A2-R | SEQ ID №: 81 | CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA |
| A2-P | SEQ ID №: 51 | TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT |
| A3-F | SEQ ID №: 82 | GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT |
| A3-R | SEQ ID №: 83 | CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA |
| A3-P | SEQ ID №: 51 | TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT |
Скрининг комплектов праймеров и зондов выполняли с использованием 5637 клеточной линии (положительной) рака мочевого пузыря и клеточной линии (отрицательной) SK-N-BE. С помощью детектирования микоплазмы и анализа клеточной морфологии определили, что клетки были нормальными. Клетки были размножены и собраны, а ДНК экстрагировали с использованием набора для экстракции ДНК (QIAGEN DNA Mini Kit, #51306), закупленного у QIAGEN. Экстрагированную ДНК количественно определяли с использованием УФ-спектрофотометра, а затем модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH. ДНК разбавляли буфером 1×TE до 6000 копий/мкл. Были получены соответственно положительная референсная P0 (100% положительная ДНК, т.е., степень метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляла 100%), и отрицательная референсная N0 (100% отрицательная ДНК, т.е., степень метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты была равна 0). P1 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:9, P2 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:99, а P3 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:999.
Кривые плавления праймера были получены в соответствии с системой и протоколом амплификации по Примеру 1, и в дальнейшем результаты амплификации комплектов праймера и зонда были получены в соответствии с системой обнаружения и протоколом амплификации по Примеру 4. Кривые амплификации и кривые плавления комплектов праймера и зонда показаны на Фиг. 4.
Данные результатов детектирования комплектов праймера и зонда в различных эталонах показана в Таблице 18.
Таблица 18. Значения Ct при детектировании комплектов праймеров и зондов в различных референсных генах
| Выявление ДНК |
CG190 | CG437 | CG441 | CG443 | CG446 | CG447 | A1 (внутренний эталон) |
A2 (внутренний эталон) |
A3 (внутренний эталон) |
| P0 (LOD 100%) | 24,973 | 25,809 | 24,934 | 25,090 | 25,238 | 25,355 | 24,582 | 24,363 | 24,371 |
| P1 (LOD 10%) | 28,340 | 29,020 | 28,035 | 28,285 | 28,637 | 28,949 | 24,691 | 24,270 | 24,715 |
| P2 (LOD 1%) | 31,520 | 32,309 | 31,090 | 31,145 | 32,637 | 31,902 | 24,504 | 24,285 | 24,559 |
| P3 (LOD 0,1%) | 35,293 | 33,738 | 35,012 | 34,949 | 34,738 | 34,824 | 24,449 | 24,230 | 24,566 |
| N0 (отрицат.) | 37,176 | 34,520 | Усиление отсутст. | 35,754 | 40,895 | Усиление отсутст. | 24,793 | 24,449 | 24,840 |
Значение точки разделения для определения результата равно 38, и если значение Ct меньше или равно 38, это указывает на то, что результат детектирования является положительным, а если значение Ct больше 38, это указывает на то, что результат детектирования является отрицательным.
Как показано в Таблице 18, все 6 сочетания зондов и праймеров могут позволить выявить 5637 положительных клеточных линий рака мочевого пузыря при ограничении детектирования (LOD), составляющем 0,1%, и лишь комплекты праймеров и зондов CG441, CG446 и CG447 не вызывают неспецифичной амплификации в отрицательной клеточной линии SK-N-BE или неправильного определения клеточной линии как положительной. Для практического применения в клинических исследованиях авторы изобретения сконструировали и выбрали три комплекта последовательностей праймеров и зондов для обнаружения референсного гена ACTB, где детектирование и оценка результатов референсных генов показывают, что результаты детектирования систем обнаружения A1, A2 и A3 праймеров и зондов согласуются.
На Фиг. 4 показано, что кривые плавления систем обнаружения CG190, CG437 и CG443 имеют два пика, причем позиции пиков плавления в результатах детектирования референсных генов P0, P1, и P2 согласуются, позиции пиков плавления некоторых систем обнаружения в результатах детектирования референсных генов P3 и N0 сильно отличаются от позиций в результате детектирования P0, значения Ct of количественно определенных кривые амплификации указывают на то, что системы обнаружения не могут позволить хорошо отличить отрицательный референсный ген от референсного гена P3, и предел детектирования не может достигнуть одной тысячной. Кривая плавления системы обнаружения CG446 также имеет два пика, позиция пика плавления CG446 в результате детектирования N0 сильно отличается от позиции в результате детектирования P0, значение Ct количественно определенной кривой амплификация CG446 указывает на то, что система обнаружения может позволить хорошо различать отрицательный референс от референса P3, а предел детектирования может достигать одной тысячной. Кривые плавления систем обнаружения CG441 и CG447 имеют один пик, кривая амплификация и пик плавления отсутствуют в результате детектирования N0, значения Ct количественно определенных кривых амплификации CG441 и CG447 указывают на то, что системы обнаружения могут позволить хорошо различать отрицательный референс от референса P3, а предел детектирования достигает одной тысячной. Интенсивность флуоресцентного сигнала CG447 на стадии платформы значительно ниже, чем интенсивность флуоресцентного сигнала CG441 и CG446.
Пример 7
Комплект праймера и зонда CG441 был выявлен в 193 образцах мочи (включая 89 образцы рака мочевого пузыря и 104 контрастных образцов), а система амплификации и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 4. Результаты детектирования показаны в Таблице 19.
Таблица 19. Результаты детектирования комплекта праймеров и зондов CG441 в 193 образцах мочи
| Образец № | Тип образца | ACTB (референсный ген) | CG441 | Результат выявления |
| UA141 | рак мочевого пузыря | 25,77 | 28,79 | положительный |
| UD080 | рак мочевого пузыря | 27,98 | 28,55 | положительный |
| UD136 | рак мочевого пузыря | 28,61 | 28,55 | положительный |
| UD030 | рак мочевого пузыря | 28,62 | 28,97 | положительный |
| UB005 | рак мочевого пузыря | 28,09 | 29,01 | положительный |
| UA139 | рак мочевого пузыря | 27,84 | 29,53 | положительный |
| UA056 | рак мочевого пузыря | 27,94 | 30,66 | положительный |
| UD011 | рак мочевого пузыря | 27,88 | 28,89 | положительный |
| UA008 | рак мочевого пузыря | 28,02 | 31,41 | положительный |
| UD221 | рак мочевого пузыря | 27,97 | 29,18 | положительный |
| UD220 | рак мочевого пузыря | 28,07 | 29,25 | положительный |
| UD004 | рак мочевого пузыря | 28,18 | 29,54 | положительный |
| UA055 | рак мочевого пузыря | 28,58 | 31,55 | положительный |
| UB003 | рак мочевого пузыря | 28,53 | 29,88 | положительный |
| UA149 | рак мочевого пузыря | 27,98 | 29,49 | положительный |
| UA134 | рак мочевого пузыря | 28,73 | 32,23 | положительный |
| UA124 | рак мочевого пузыря | 27,25 | 32,72 | положительный |
| UA097 | рак мочевого пузыря | 28,43 | 30,24 | положительный |
| UD268 | рак мочевого пузыря | 28,16 | 29,72 | положительный |
| UA062 | рак мочевого пузыря | 27,8 | 30,46 | положительный |
| UD038 | рак мочевого пузыря | 28,16 | 30,23 | положительный |
| UA091 | рак мочевого пузыря | 29,07 | 33,89 | положительный |
| UD009 | рак мочевого пузыря | 28,09 | 30,74 | положительный |
| UD145 | рак мочевого пузыря | 28,26 | 29,84 | положительный |
| UA078 | рак мочевого пузыря | 27,87 | 31,69 | положительный |
| UD257 | рак мочевого пузыря | 28,27 | 30,65 | положительный |
| UA073 | рак мочевого пузыря | 28,04 | 31,23 | положительный |
| UD161 | рак мочевого пузыря | 28,58 | 30,16 | положительный |
| UD016 | рак мочевого пузыря | 29,27 | 30,28 | положительный |
| UC101 | рак мочевого пузыря | 28,5 | 30,95 | положительный |
| UD244 | рак мочевого пузыря | 27,84 | 30,99 | положительный |
| UA122 | рак мочевого пузыря | 28,31 | 31,12 | положительный |
| UD298 | рак мочевого пузыря | 28,52 | 30,43 | положительный |
| UA138 | рак мочевого пузыря | 28,26 | 31,49 | положительный |
| UD205 | рак мочевого пузыря | 28,63 | 31,62 | положительный |
| UA092 | рак мочевого пузыря | 28,84 | 31,46 | положительный |
| UD109 | рак мочевого пузыря | 28,69 | 31,26 | положительный |
| UA053 | рак мочевого пузыря | 27,98 | 32,22 | положительный |
| UA111 | рак мочевого пузыря | 28,61 | 31,82 | положительный |
| UA121 | рак мочевого пузыря | 28,76 | 31,62 | положительный |
| UB006 | рак мочевого пузыря | 28,5 | 31,92 | положительный |
| UD095 | рак мочевого пузыря | 28,02 | 31,17 | положительный |
| UA137 | рак мочевого пузыря | 31,55 | 31,86 | положительный |
| UA154 | рак мочевого пузыря | 28,33 | 33,49 | положительный |
| UB001 | рак мочевого пузыря | 28,79 | 31,74 | положительный |
| UA116 | рак мочевого пузыря | 28,36 | 32,16 | положительный |
| UA094 | рак мочевого пузыря | 30,78 | 33,13 | положительный |
| UD018 | рак мочевого пузыря | 30,32 | 33,01 | положительный |
| UB008 | рак мочевого пузыря | 28,58 | 32,81 | положительный |
| UD293 | рак мочевого пузыря | 28,53 | 32,7 | положительный |
| UA060 | рак мочевого пузыря | 28,7 | 36,1 | положительный |
| UD175 | рак мочевого пузыря | 28,82 | 33,06 | положительный |
| UA077 | рак мочевого пузыря | 28,14 | 33,82 | положительный |
| UD111 | рак мочевого пузыря | 32,89 | 33,47 | положительный |
| UD014 | рак мочевого пузыря | 28,35 | 32,94 | положительный |
| UD336 | контрольный | 29,06 | 39,21 | отрицательный |
| UD303 | рак мочевого пузыря | 28,76 | 36,95 | положительный |
| UD237 | рак мочевого пузыря | 30,92 | 34,63 | положительный |
| UA006 | рак мочевого пузыря | 28,13 | 40,73 | отрицательный |
| UD135 | рак мочевого пузыря | 28,59 | 33,82 | положительный |
| UD078 | рак мочевого пузыря | 28,63 | 33,74 | положительный |
| UA047 | контрольный | 28,44 | 33,44 | положительный |
| UA119 | рак мочевого пузыря | 28,85 | 34,58 | положительный |
| UD134 | рак мочевого пузыря | 28,85 | 34,18 | положительный |
| UD210 | рак мочевого пузыря | 34,47 | положительный | |
| UC046 | контрольный | 28,98 | 35,98 | положительный |
| UD028 | рак мочевого пузыря | 28,32 | 34,14 | положительный |
| UA115 | рак мочевого пузыря | 30,82 | 35,14 | положительный |
| UD259 | контрольный | 28,64 | 37,1 | положительный |
| UD015 | рак мочевого пузыря | 28,21 | 36,08 | положительный |
| UA041 | контрольный | 28,9 | 38,6 | отрицательный |
| UD141 | рак мочевого пузыря | 29,8 | 34,97 | положительный |
| UD142 | рак мочевого пузыря | 29,92 | 35,47 | положительный |
| UD174 | рак мочевого пузыря | 29,03 | 36,32 | положительный |
| UD150 | рак мочевого пузыря | 29,44 | 36,45 | положительный |
| UA074 | рак мочевого пузыря | 32,62 | 36,47 | положительный |
| UC001 | контрольный | 28,89 | 36,78 | положительный |
| UD308 | рак мочевого пузыря | 28,52 | 35,41 | положительный |
| UA079 | рак мочевого пузыря | 29,33 | 40,29 | отрицательный |
| UD099 | рак мочевого пузыря | 28,14 | 36,62 | положительный |
| UD003 | рак мочевого пузыря | 28,46 | 40,21 | отрицательный |
| UA034 | контрольный | 28,95 | 39,11 | отрицательный |
| UD137 | рак мочевого пузыря | 30,71 | 39,03 | отрицательный |
| UA002-2 | рак мочевого пузыря | 29,72 | 37,66 | положительный |
| UD041 | контрольный | 28,7 | 38,65 | отрицательный |
| UD110 | рак мочевого пузыря | 28,6 | 37,43 | положительный |
| UC096 | рак мочевого пузыря | 30,93 | 44 | отрицательный |
| UD243 | рак мочевого пузыря | 31,46 | 36,57 | положительный |
| UD039 | рак мочевого пузыря | 28,43 | 39,76 | отрицательный |
| UA016 | контрольный | 28,94 | 43 | отрицательный |
| UD164 | контрольный | 28,73 | 40,47 | отрицательный |
| UC048 | контрольный | 28,21 | 44 | отрицательный |
| UC081 | контрольный | 27,9 | 40,39 | отрицательный |
| UA090 | рак мочевого пузыря | 28,71 | 40,83 | отрицательный |
| UD270 | контрольный | 29,85 | 37,27 | положительный |
| UD306 | контрольный | 28,91 | 44 | отрицательный |
| UC032 | контрольный | 28,93 | 38,9 | отрицательный |
| UC002 | контрольный | 28,58 | 37,82 | положительный |
| UA108 | контрольный | 28,66 | 38,81 | отрицательный |
| UD318 | контрольный | 29,83 | 39,14 | отрицательный |
| UA025 | контрольный | 28,91 | 43 | отрицательный |
| UA135 | рак мочевого пузыря | 28,79 | 39,61 | отрицательный |
| UA020 | контрольный | 28,82 | 43 | отрицательный |
| UA100 | рак мочевого пузыря | 28,14 | 44 | отрицательный |
| UD242 | контрольный | 29,58 | 44 | отрицательный |
| UA044 | контрольный | 29,17 | 44 | отрицательный |
| UC013 | контрольный | 28,33 | 44 | отрицательный |
| UD225 | рак мочевого пузыря | 30,63 | 39,58 | отрицательный |
| UC030 | контрольный | 29,2 | 44 | отрицательный |
| UA051 | контрольный | 28,72 | 39,49 | отрицательный |
| UA057 | рак мочевого пузыря | 30,11 | 44 | отрицательный |
| UA010 | контрольный | 28,93 | 39,99 | отрицательный |
| UD357 | контрольный | 27,73 | 44 | отрицательный |
| UC097 | контрольный | 28,88 | 44 | отрицательный |
| UD269 | контрольный | 30,34 | 40,72 | отрицательный |
| UA017 | контрольный | 29,56 | 44 | отрицательный |
| UA114 | контрольный | 28,04 | 43 | отрицательный |
| UD126 | контрольный | 28,81 | 38,62 | отрицательный |
| UC017 | контрольный | 28,92 | 44 | отрицательный |
| UA104 | рак мочевого пузыря | 28,79 | 44 | отрицательный |
| UC063 | контрольный | 28,27 | 44 | отрицательный |
| UD045 | контрольный | 28,29 | 44 | отрицательный |
| UD346 | контрольный | 29,17 | 44 | отрицательный |
| UC052 | контрольный | 28,07 | 44 | отрицательный |
| UC047 | контрольный | 29,03 | 44 | отрицательный |
| UA045 | контрольный | 28,45 | 44 | отрицательный |
| UC022 | контрольный | 28,93 | 38,73 | отрицательный |
| UC019 | контрольный | 28,94 | 39,08 | отрицательный |
| UD238 | контрольный | 28,2 | 39,73 | отрицательный |
| UD073 | контрольный | 28,31 | 40,61 | отрицательный |
| UC007 | контрольный | 28,61 | 44 | отрицательный |
| UC039 | контрольный | 28,04 | 41,53 | отрицательный |
| UC020 | контрольный | 28,66 | 44 | отрицательный |
| UC041 | контрольный | 28,16 | 44 | отрицательный |
| UA061 | рак мочевого пузыря | 28,57 | 39,92 | отрицательный |
| UC026 | контрольный | 29,23 | 39,74 | отрицательный |
| UC098 | контрольный | 28,68 | 43 | отрицательный |
| UA048 | контрольный | 29,52 | 44 | отрицательный |
| UC005 | контрольный | 29,43 | 40,93 | отрицательный |
| UD108 | контрольный | 28,36 | 44 | отрицательный |
| UC044 | контрольный | 28,83 | 39,09 | отрицательный |
| UC064 | контрольный | 28,87 | 39,75 | отрицательный |
| UC009 | контрольный | 28 | 44 | отрицательный |
| UD050 | контрольный | 28,79 | 44 | отрицательный |
| UD071 | контрольный | 29,67 | 44 | отрицательный |
| UC023 | контрольный | 29,51 | 44 | отрицательный |
| UC011 | контрольный | 28,65 | 44 | отрицательный |
| UA052 | контрольный | 29,08 | 39,13 | отрицательный |
| UC033 | контрольный | 28,84 | 44 | отрицательный |
| UD266 | контрольный | 29,92 | 39,91 | отрицательный |
| UD274 | контрольный | 28,81 | 44 | отрицательный |
| UC040 | контрольный | 29,21 | 40,05 | отрицательный |
| UA035 | контрольный | 31,25 | 44 | отрицательный |
| UA117 | контрольный | 29,24 | 44 | отрицательный |
| UD277 | контрольный | 28,64 | 44 | отрицательный |
| UC012 | контрольный | 28,89 | 44 | отрицательный |
| UD124 | контрольный | 30,65 | 39,12 | отрицательный |
| UD281 | контрольный | 28,62 | 44 | отрицательный |
| UC024 | контрольный | 29,61 | 44 | отрицательный |
| UC060 | контрольный | 31,53 | 44 | отрицательный |
| UA118 | контрольный | 33,15 | 44 | отрицательный |
| UD040 | контрольный | 28,75 | 44 | отрицательный |
| UA109 | контрольный | 31,61 | 44 | отрицательный |
| UD200 | контрольный | 32,69 | 44 | отрицательный |
| UA128 | контрольный | 31,09 | 44 | отрицательный |
| UA147 | рак мочевого пузыря | 30,53 | 44 | отрицательный |
| UA021 | контрольный | 28,93 | 39,63 | отрицательный |
| UD364 | контрольный | 30,84 | 39,72 | отрицательный |
| UC061 | контрольный | 31,94 | 40,68 | отрицательный |
| UA050 | контрольный | 28,88 | 43 | отрицательный |
| UC059 | контрольный | 30,63 | 43 | отрицательный |
| UD263 | контрольный | 30,59 | 43 | отрицательный |
| UD008 | контрольный | 30,29 | 44 | отрицательный |
| UC056 | контрольный | 32,65 | 44 | отрицательный |
| UC055 | контрольный | 28,32 | 44 | отрицательный |
| UC027 | контрольный | 32,18 | 44 | отрицательный |
| UD265 | контрольный | 30,04 | 44 | отрицательный |
| UD236 | контрольный | 28,35 | 44 | отрицательный |
| UA015 | контрольный | 29,47 | 44 | отрицательный |
| UG093 | контрольный | 29,74 | 44 | отрицательный |
| UA014 | контрольный | 31,76 | 44 | отрицательный |
| UA012 | контрольный | 31,47 | 44 | отрицательный |
| UA024 | контрольный | 32,56 | 44 | отрицательный |
| UA036 | контрольный | 30,78 | 44 | отрицательный |
| UA043 | контрольный | 30,74 | 44 | отрицательный |
| UA033 | контрольный | 29,55 | 44 | отрицательный |
| UA031 | контрольный | 29,48 | 44 | отрицательный |
| UA026 | контрольный | 28,84 | 44 | отрицательный |
| UA039 | контрольный | 33 | 44 | отрицательный |
| UC006 | контрольный | 31,89 | 44 | отрицательный |
| UC031 | контрольный | 30,49 | 44 | отрицательный |
| UC051 | контрольный | 31,51 | 44 | отрицательный |
| UD276 | контрольный | 32,49 | 44 | отрицательный |
Значение точки разделения для определения результата задано равным 38,6, и если значение Ct меньше или равно 38,6, то детектирование определяют как положительное, а если значение Ct больше 38,5, то результат детектирования определяют как отрицательный. Полученная специфичность детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты к образцам рака мочевого пузыря в 193 образцах мочи составляет 93,3%, чувствительность составляет 84,3%, а площадь под кривой ROC равна 0,931 (P<0,001). Кривая ROC показана на Фиг. 5.
Список литературы:
1. Mbeutcha, A., Lucca, I., Mathieu, R., Lotan, Y. & Shariat, S. F. Current Status of Urinary Biomarkers for Detection and Surveillance of Bladder Cancer. Urologic Clinics of North America 43, 47–62 (2016).
Claims (17)
1. Реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, характеризующийся тем, что содержит: праймер, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, или SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, или SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, или SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46,или SEQ ID NO: 47 или их комплементарные последовательности; и
зонд, содержащий нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 48 или их комплементарные последовательности.
2. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
3. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
4. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
5. Реагент по п. 1, в котором зонд содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 48 или их комплементарные последовательности.
6. Реагент по п. 1, в котором зонд содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 45.
7. Реагент по п. 1, в котором указанный праймер представляет собой пару праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, а
указанный зонд содержит нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID NO: 45.
8. Применение реагента по любому из пп. 1-7 для обнаружения уротелиальной опухоли у пациента.
9. Применение по п. 8, в котором исследуют по меньшей мере один образец, выбранный из группы, состоящей из ткани, жидкости организма и экскремента.
10. Применение по п. 9, в котором образец представляет собой ткань мочевого пузыря.
11. Применение по п. 9, в котором образец представляет собой по меньшей мере один образец, выбранный из группы, состоящей из мокроты, мочи, слюны и кала.
12. Применение по п. 11, в котором образец представляет собой мочу.
13. Применение по п. 8, в котором обнаружение включает в себя: детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в детектируемом образце, полученном у обследуемого; и
обозначение наличия или риска наличия у пациента уротелиальной опухоли в соответствии с отклонением уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в образце от уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в образце, взятом у субъекта, который не имеет уротелиальной опухоли.
14. Применение по п. 8, в котором уротелиальная опухоль представляет собой по меньшей мере одну опухоль, выбранную из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака почечной лоханки и рака уретры.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010361690.9 | 2020-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818527C1 true RU2818527C1 (ru) | 2024-05-02 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671557C1 (ru) * | 2017-07-10 | 2018-11-02 | Александр Григорьевич Тоневицкий | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
| CN110872631A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-10 | 广州市基准医疗有限责任公司 | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 |
| CN110964823A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒和检测方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671557C1 (ru) * | 2017-07-10 | 2018-11-02 | Александр Григорьевич Тоневицкий | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
| CN110964823A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒和检测方法 |
| CN110872631A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-10 | 广州市基准医疗有限责任公司 | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108350504B (zh) | 膀胱癌的诊断方法 | |
| EP3083993B1 (en) | Gene methylation based colorectal cancer diagnosis | |
| CN109112216B (zh) | 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 | |
| JP2015517321A (ja) | 定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ法−ｃＭｅｔｈＤＮＡ、試薬、及びその使用 | |
| WO2021004215A1 (zh) | 一种多基因联合检测试剂 | |
| CN110964809B (zh) | Hoxa7甲基化检测试剂 | |
| CN111676287A (zh) | 一种基因标志物组合及其应用 | |
| CN115896281B (zh) | 甲基化生物标记物、试剂盒及用途 | |
| JP6269491B2 (ja) | 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
| EP4144859A1 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| CN111363811B (zh) | 基于foxd3基因的肺癌诊断剂及试剂盒 | |
| WO2019223516A1 (zh) | 肿瘤标志物、甲基化检测试剂、试剂盒及其应用 | |
| CN111662980A (zh) | 一种肺癌检测试剂及试剂盒 | |
| CN110964813B (zh) | Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途 | |
| JP5602355B2 (ja) | 癌患者の外科的手術後の治療選択方法及び予後診断 | |
| US20210189461A1 (en) | Tumor marker, methylation detection reagent, kit and use thereof | |
| RU2818527C1 (ru) | Реагент для обнаружения опухолей | |
| CN116121387A (zh) | 一种用于结直肠癌检测的组合标志物及其应用 | |
| US20080032292A1 (en) | Methods for the Detection of Ovarian Cancer | |
| EP4083232A1 (en) | Combination of dna methylation biomarkers, and detection method therefor and kit thereof | |
| US11542559B2 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
| CN111363812B (zh) | 基于dmrta2基因的肺癌诊断剂及试剂盒 | |
| CN111647657A (zh) | 一种肺癌检测试剂及试剂盒 | |
| EP3821038A1 (en) | Urine dna methylation markers for bladder cancer | |
| CN111363817B (zh) | 基于hoxd12基因的肺癌诊断剂及试剂盒 |