RU2671557C1 - Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы - Google Patents
Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671557C1 RU2671557C1 RU2017124372A RU2017124372A RU2671557C1 RU 2671557 C1 RU2671557 C1 RU 2671557C1 RU 2017124372 A RU2017124372 A RU 2017124372A RU 2017124372 A RU2017124372 A RU 2017124372A RU 2671557 C1 RU2671557 C1 RU 2671557C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- risk
- reagents
- breast cancer
- seq
- Prior art date
Links
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 70
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 38
- 101000921361 Homo sapiens Elongation of very long chain fatty acids protein 5 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101000840582 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 101000796028 Homo sapiens Thioredoxin domain-containing protein 9 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100029180 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 102100031350 Thioredoxin domain-containing protein 9 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 102100032052 Elongation of very long chain fatty acids protein 5 Human genes 0.000 claims description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 102100040881 60S acidic ribosomal protein P0 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000673456 Homo sapiens 60S acidic ribosomal protein P0 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 claims description 8
- 101000913306 Homo sapiens F-box only protein 42 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000653679 Homo sapiens Translationally-controlled tumor protein Proteins 0.000 claims description 8
- 108010027310 Host Cell Factor C1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 claims description 7
- 102100026079 F-box only protein 42 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- -1 ITGBP6 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 2
- 102000018726 Host Cell Factor C1 Human genes 0.000 claims 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 7
- 102100030355 Host cell factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- ZBZXYUYUUDZCNB-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexa-1,3-dien-1-yl-N-phenyl-4-[4-(N-[4-[4-(N-[4-[4-(N-phenylanilino)phenyl]phenyl]anilino)phenyl]phenyl]anilino)phenyl]aniline Chemical compound C1=CCCC(N(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 ZBZXYUYUUDZCNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102100029887 Translationally-controlled tumor protein Human genes 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000680015 Homo sapiens Thioredoxin-related transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 102100022169 Thioredoxin-related transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- WVAKRQOMAINQPU-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-[5-(2,2-dimethylbutyl)-1h-imidazol-2-yl]ethyl]phenyl]pyridine Chemical compound N1C(CC(C)(C)CC)=CN=C1CCC1=CC=C(C=2N=CC=CC=2)C=C1 WVAKRQOMAINQPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJFILYACUCTLKB-UHFFFAOYSA-N 2-chloroguanidine Chemical compound NC(N)=NCl BJFILYACUCTLKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094765 70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032311 Aurora kinase A Human genes 0.000 description 1
- 102100037152 BAG family molecular chaperone regulator 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026540 Cathepsin L2 Human genes 0.000 description 1
- 101710169274 Cathepsin L2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010060385 Cyclin B1 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101150022456 ELOVL5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150094243 FBXO42 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032340 G2/mitotic-specific cyclin-B1 Human genes 0.000 description 1
- 108700031843 GRB7 Adaptor Proteins 0.000 description 1
- 101150052409 GRB7 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036534 Glutathione S-transferase Mu 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102100033107 Growth factor receptor-bound protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 101150001754 Gusb gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105330 HCFC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000798300 Homo sapiens Aurora kinase A Proteins 0.000 description 1
- 101000740062 Homo sapiens BAG family molecular chaperone regulator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001071694 Homo sapiens Glutathione S-transferase Mu 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000593405 Homo sapiens Myb-related protein B Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000631713 Homo sapiens Signal peptide, CUB and EGF-like domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150075789 Igfbp6 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 238000008149 MammaPrint Methods 0.000 description 1
- 108010076502 Matrix Metalloproteinase 11 Proteins 0.000 description 1
- 101100273740 Mus musculus Cd68 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034670 Myb-related protein B Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101150032199 Rplp0 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028932 Signal peptide, CUB and EGF-like domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000017303 Stromelysin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 1
- 101150111242 TPT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150096624 Txndc9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010339 medical test Methods 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности, к онкологии и молекулярной биологии. Предложены набор реагентов и планшет для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, включающие праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9. Предложенная группа изобретений обеспечивает получение новых диагностических маркеров РМЖ, позволяющих при сопоставимой достоверности и специфичности оценить риск развития рецидива после хирургического лечения. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 2 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска рецидива рака молочной железы после хирургического удаления опухоли.
Изобретение основано на оценке уровня экспрессии 3 генов, мРНК которых могут быть получены из образца опухолевой ткани пациента. При этом уровень экспрессии может быть измерен как известными способами, так и способом, описанным в настоящем изобретении.
Предшествующий уровень техники
Рак молочной железы (РМЖ) - это злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. В мире это наиболее частая форма рака среди женщин, поражающая в течение жизни от 1:13 до 1:9 женщин в возрасте от 13 до 90 лет. Это также второе по частоте после рака легких онкологическое заболевание в популяции в целом (считая и мужское население). Количество случаев рака молочной железы в развитых странах резко увеличилось после 1970-х годов. За этот феномен считают частично ответственным изменившийся стиль жизни населения развитых стран (в частности, то, что в семьях стало меньше детей и сроки грудного вскармливания сократились) [Мерабишвили В.М. (2011). Рак молочной железы: заболеваемость, смертность, выживаемость (популяционное исследование). Вопросы онкологии, 5, 609-615].
Новым шагом в лечении онкологических заболеваний является так называемый «индивидуальный подбор лечения». Известно, что важное место в схеме лечения больных РМЖ занимает химиотерапия. Ранее пациентки со схожими по клеточному строению типами опухолей проходили химиотерапию по одной и той же схеме. Детальные исследования транскриптома РМЖ позволили установить, что каждая опухоль обладает собственными, присущими только ей характеристиками. То есть при схожих клинических проявлениях и клеточном строении разные опухоли могут проявлять себя различным образом, в том числе, по-разному реагировать на проводимую медикаментозную терапию. Это определяется молекулярно-генетическими особенностями опухоли, в том числе, особенностями экспрессии определенных генов в опухолевых клетках.
В настоящее время выделяют несколько молекулярно-генетических классов РМЖ. Данная классификация предполагает деление первичных опухолей и метастазов в зависимости от наличия и плотности на поверхности раковых клеток рецепторов к биологически активным веществам-регуляторам (гормонам). Иммуногистохимическое типирование позволяет выделить группу пациентов, которым показано лечение противоопухолевыми эндокринными препаратами (препаратами, блокирующими определенные рецепторы раковых клеток, что приводит к снижению их пролиферативного потенциала).
Проблемы метастазирования и рецидива рака молочной железы являются одними из сложнейших в плане прогнозирования в онкологической практике и требующими разработки комплексного подхода для раннего выявления риска появления метастаз.
Из уровня техники известны различные методы построения подобных прогнозов, в том числе основанных на оценке уровня экспрессии мРНК генов. В частности, при построении прогнозов известно использование метода, основанного на полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), который отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Aerts, J., Wynendaele, W., Paridaens, R., Christiaens, M.R., Van Den Bogaert, W., Van Oosterom, A. Т., & Vandekerckhove, F. (2001). A real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect breast carcinoma cells in peripheral blood. Annals of oncology official journal of the European Society for Medical Oncology ESMO (Vol. 12, pp. 39-46).]. Метод широко используют в мире, как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности: обычно проводят 96 реакций в одном опыте, а в последних моделях приборов - 384 реакции. В отличие от обычной полимеразной цепной реакции, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой Таq ДНК-полимеразой, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. Обычно реакция продолжается около 2 часов (40 циклов), в приборах нового поколения - всего 40 мин. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения реакции.
Существующие тест-системы позволяют уточнить диагноз, предсказать риск метастазирования и рецидива и эффективность разных видов терапии. Однако в работе Thomassen et al. (Thomassen M, Tan Q, Eiriksdottir F, Bak M, Cold S, Kruse ТА. Prediction of metastasis from low-malignant breast cancer by gene expression profiling. Int J Cancer. 2007 Mar 1; 120(5):1070-5) показано, что наборы генов в профилях практически не пересекаются. Кроме того, они применимы для анализа определенных разновидностей рака молочной железы (LNN, чувствительных к эстроген-рецептору (ER+)) или для прогнозирования развития заболевания у пациентов, принимающих адъювантную терапию.
Группа van't Veer et al. (van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AAM, Mao M, et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature [Internet]. Nature Publishing Group; 2002 Jan 31; 415(6871):530-6) использовала чип Rosetta с 60-мерными олигонуклеотидами и разработала 70-генный профиль, с помощью которого можно предсказывать образование метастаз в течение пяти лет у пациентов с РМЖ типа LNN (lymph node-negative) с большей точностью, чем с помощью классического клинико-патологического подхода. Предложенный генный профиль описан в патенте US 7514209 В2 (MammaPrint).
В заявке на патент US 2011/0145176 A1 (РАМ50) описан метод, набор реагентов и микрочипов для диагностики заболевания РМЖ и прогнозирования эффективности терапии на основании измерений уровней экспрессии 50 генов-маркеров.
Набор из праймеров к 14 генам и реагенты для определения их экспрессии методом ПЦР-РВ, а также алгоритм интерпретации экспрессии этих генов, предложены в патенте US 7695915 В2 для прогнозирования образования метастазов при люминальной форме РМЖ.
Метод и набор реагентов для прогнозирования развития заболевания РМЖ с помощью шести наборов генов-маркеров описаны в заявке на патент US 2010/0035240 A1. Метод основан на оценке уровня экспрессии 135 генов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени в свежезамороженных образцах РМЖ. Метод позволяет оценить общую десятилетнюю выживаемость, вероятность появления отдаленных метастазов и поражения лимфатических узлов.
В патенте US 7622251 В2 (Oncotype DX™) предложены численные молекулярные индикаторы для предсказания вероятности успешного отклика на антиэстрогенный агент (тамоксифен) и химиотерапию пациентов с заболеванием РМЖ (ER+, LNN) без адъювантной терапии.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату является диагностический тест Oncotype DX Breast Cancer Assay, применяемый для оценки риска возникновения рецидива рака молочной железы. С помощью данного теста можно получать дополнительную информацию и принимать решение о дальнейшем лечении. По результатам исследования определяется агрессивность опухоли, а также оценивается риск возникновения рецидива и необходимость химиотерапевтического лечения. Исследуя экспрессию 21-го гена (16 генов-маркеров - Ki-67, STK15, Survivin, Cyclin B1, MYBL2, Stromelysin 3, Cathepsin L2, ER, PR, Bcl-2, SCUBE2, GRB7, HER2, GSTM1, Cd68, BAG1, и 5 нормировочных генов - Beta-actin, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC), специалисты устанавливают вероятность рецидива в течение 10 лет. Сам показатель выражен числом от 0 до 100. При этом для проведения теста используются фрагменты опухолевой ткани, стабилизированные в формалине и зафиксированные в парафине. Дополнительная стадия подготовки пробы приводит к увеличению времени проведения теста и дополнительным затратам. Также к недостаткам можно отнести необходимость в осуществлении микродиссекции образца опухолевой ткани, что требует привлечения высококвалифицированных специалистов.
Анализ патентной документации свидетельствует о том, что поиск эффективных решений, направленных на построение прогнозов общей и безрецидивной выживаемости с учетом индивидуальных молекулярно-генетических особенностей рака молочной железы, является крайне актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого технического решения является разработка новых диагностических маркеров РМЖ, позволяющих достоверно оценить риск развития рецидива после хирургического лечения, и наборов реагентов на их основе для оценки экспрессии генов-маркеров при проведении ПЦР. При этом проводить оценку риска рецидива РМЖ с помощью заявляемого набора реагентов можно с помощью известных из уровня техники методов, а также с помощью описанного ниже способа, являющегося, простым, чувствительным, надежным, применимым в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений.
Заявляемое изобретение расширяет арсенал диагностических тестов посредством получения новых диагностических маркеров РМЖ, позволяющих при сопоставимой достоверности и специфичности оценить риск развития рецидива после хирургического лечения.
Поставленная задача решается за счет создания набора реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, содержащего реагенты для оценки экспрессии генов-маркеров при проведении ПЦР, включающие праймеры - прямые и обратные, и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, представленные в лиофилизированном виде или водном растворе.
В одном из вариантов осуществления изобретения набор реагентов включает, по крайней мере, 3 пары праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6 - прямые и обратные, соответственно, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, специфичные по отношению к генам-маркерам ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9.
Набор реагентов может дополнительно содержать праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1, используемые для нормирования результатов ПЦР. В качестве таких праймеров и зондов могут быть использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 10-19 и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 20-24 соответственно.
Для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы набор реагентов, помимо реагентов для оценки экспрессии генов-маркеров при проведении ПЦР, может содержать реагенты для выделения и очистки РНК из образца опухолевой ткани; реагенты для синтеза одноцепочечной кДНК на мРНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; буферы для проведения ПЦР.
Изобретение также относится к планшету с набором реагентов для проведения ПЦР реакции при определении риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у человека, содержащему нанесенные на его лунки праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам - ELOVL5, ITGBP6, TXNDC9. В одном из вариантов осуществления изобретения на лунки планшета нанесены геноспецифические олигонуклеотидные праймеры прямые и обратные с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, соответственно, в лиофилизированном виде, и флуоресцентные зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9. Праймеры могут содержаться в концентрации 250 нМоль. Зонд может содержать краситель FAM с параметрами возбуждения на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм, взятый в концентрации 250 нМоль.
При определении риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у пациента с помощью заявляемых набора или планшета измеряют уровень экспрессии (количественной оценки представленности) генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 или взвешенной суммы уровней экспрессии указанных генов-маркеров в образце опухолевой ткани пациента с последующей оценкой риска рецидива путем сравнения уровней экспрессии генов-маркеров с предопределенными пороговыми значениями.
В качестве образцов опухолевой ткани пациента могут быть использованы свежезамороженные клетки ткани, или клетки биопсии, или зафиксированные в парафине клетки. Измерение экспрессии генов-маркеров осуществляется методом ПЦР-РВ. Для измерения методом ПЦР-РВ предпочтительно использовать одноцепочечные кДНК, синтезированные на выделенных и очищенных из образца опухолевой ткани пациента мРНК. Синтез кДНК может быть осуществлен с использованием олигонуклеотидных неспецифических праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов и с парами праймеров - прямыми и обратными, и зондами, специфичными по отношению к генам-маркерам, а также с парами праймеров и зондами, специфичными по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 для нормирования результатов ПЦР, с получением для каждого из генов-маркеров ненормированных оценок уровней их экспрессии Q(g), последующим их нормированием и получением значений Qnorm(g) для каждого гена-маркера, вычислением на основе Qnorm (g) риска рецидива SR. с использованием формулы:
где w(ELOVL5)=-0,72, w(IGFBP6)=-0,65, w(TXNDC9)=0,55, w0=0,39;
Qnorm(ELOVL5), Qnorm(IGFBP6), Qnorm(TXNDC9) - нормированные уровни экспрессии генов-маркеров (или нормированные количественные оценки представленности генов), В качестве пороговых значений предпочтительно использовать, по крайней мере, два значения, при получении SR выше верхнего порогового значения делают вывод о высоком риске рецидива, при получении SR. ниже нижнего порогового значения - делают вывод о низком риске рецидива, при получении SR. из интервала значений, находящихся между указанными пороговыми значениями - делают вывод о неопределенном риске.
При использовании для нормирования результатов ПЦР в качестве праймеров SEQ ID NO: 10-19 и зондов SEQ ID NO: 20-24, специфичных по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1, при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске возникновения рецидива, при значении SR меньше минус 0,2 - делают вывод о низком риске возникновения рецидива, при получении значения SR в интервале значений от минус 0,2 до 0,2 - считают риск неопределенным.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен пример последовательности прямых и обратных геноспецифических праймеров (последовательности SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6). На фиг. 2 представлен пример последовательности зондов (SEQ ID NO: 7-9). На фиг. 3 - последовательности геноспецифических праймеров для нормирования результатов ПЦР (SEQ ID NO: 10-19) и зондами (SEQ ID NO: 20-24). На фиг. 4 представлена схема лунок планшета. На фиг. 5 и 6 представлены кривые Каплана-Мейера и ROC-кривая, построенные по валидационной выборке, подтверждающие работоспособность заявленного метода.
Осуществление изобретения
В изобретении представлены новые молекулярно-генетические маркеры для прогноза безрецидивной выживаемости после хирургического удаления первичной опухоли люминальной формы рака молочной железы, основанного на определении количественных оценок представленности мРНК 3 генов: ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9. Это простой, надежный способ прогноза безрецидивной выживаемости на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Функционал экспрессии 3 генов позволяет с высокой степенью достоверности оценить риск развития рецидива в первые пять лет после хирургического удаления первичной опухоли люминальной формы РМЖ.
В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, в том числе материал, полученный при игольчатой биопсии опухоли молочной железы.
В одном из вариантов осуществления изобретения при использовании для измерения экспрессии генов-маркеров метода ПЦР-РВ, может быть использована следующая последовательность действий:
- получение образца опухолевой ткани;
- выделение и очистка мРНК из образца;
- синтез одноцепочечных кДНК на мРНК с использованием олигонуклеотидных неспецифических праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов;
- проведение ПЦР одноцепочечных кДНК с прямыми и обратными геноспецифическими праймерами и зондами, специфичными по отношению к исследуемым генам (генам-маркерам) - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, и с парами геноспецифических праймеров и зондами для нормирования результатов ПЦР, например, специфичными по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 с получением для каждого из перечисленных генов-маркеров их ненормированных количественных оценок представленности Q(g), последующим их нормированием и получением нормированных количественных оценок представленности Qnorm(g), вычислением риска рецидива (SR) по формуле (1), и при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске возникновения рецидива, при значении SR меньше - 0,2 - делают вывод и низком риске возникновения рецидива, при получении значения SR в интервале от - 0,2 до 0,2 - считают риск неопределенным.
Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков тканей проводят вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК используют различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с применением реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами используют ингибиторы, такие как игибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения, или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.
Быстрое и качественное выделение РНК проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например, QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.
Реакцию обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, проводят с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С. Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn2+.
Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:
1) Олиго(с1Т)-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК. Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;
2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных со вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;
3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоГГ-содержащими праймерами;
4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.
Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете, например, Genome Browser Gateway, BLAST, Primer3 и др.
Высокая специфичность ПЦР-РВ обеспечивается за счет использования зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (в данном случае, FAM-6-carboxy-fluoroscein), а на 3'-конце - т.н. гаситель (в данном случае - RTQ1). В процессе ПЦР их взаимодействие нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено использовать праймеры и зонды SEQ ID NO: 1-24 (фиг. 1, 2 и 3).
При оценке уровня мРНК генов на вход поступает соответствующий результатам одного ПЦР-исследования биологического образца набор значений пороговых циклов Ср (p=1,2,…,24), где значение порогового цикла Ср соответствует пробе (лунке Планшета) р, пробы 1-3 соответствуют гену ELOVL5, пробы 4-6 - гену IGFBP6, пробы 7-9 - гену TXNDC9, пробы 10-12 - гену FBXO42, пробы 13-15 - гену GUSB, пробы 16-18 - гену HCFC1, пробы 19-21 - гену RPLP0 и пробы 22-24 - гену ТРТ1. При этом известными считаются соответствующие используемым праймерам эффективности ПЦР: E(ELOVL5), E(IGFBP6), E(TXNDC9), E(FBXO42), E(GUSB), E(HCFC1), E(RPLP0) и E(TPT1). Для праймеров SEQ ID NO: 1-6, 10-19 эти значения эффективностей ПЦР равны соответственно 1,842, 1,914, 1,807, 1,885, 1,870, 1,904, 1,889 и 1,765.
Сначала по значениям пороговых циклов определяют количество соответствующих транскриптов в отдельности по каждой пробе, соответствующей одному из генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9. Для этого для каждой из проб p=1,2,3 вычисляют величину пропорциональную количеству мРНК ELOVL5 в исследуемом образце, по формуле
Аналогичным образом для каждой из проб p=4,5,6 вычисляют величину пропорциональную количеству мРНК IGFBP6 в исследуемом образце по формуле
а для каждой из проб p=7,8,9 вычисляют величину пропорциональную количеству мРНК TXNDC9 в исследуемом образце по формуле
В приведенных формулах нормировка основывается на подходе, связанном с усреднением, использующим среднее геометрическое [Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, A.M. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов ПЦР «в реальном времени» - Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, п. 8.4; J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, В. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, F. Speleman Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes // Genome Biol., 2002, 3 (7): RESEARCH0034]. При этом для нормировки проб, ассоциированных с каждым из генов-маркеров, используется поднабор нормировочных генов с количеством мРНК по порядку наиболее близким к среднему количеству мРНК соответствующего гена-маркера.
Повторно используя усреднение, основывающееся на среднем геометрическом, в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера ELOVL5 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
Аналогично в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера IGFBP6 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера TXNDC9 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
Для уменьшения вычислительных погрешностей вычисления и Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q(TXNDC9) могут осуществляться с использованием перехода в логарифмическую шкалу.
После того, как в рамках исследования образца биологического материала вычислены значения ненормированных количественных оценок представленности Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q(TXNDC9), прогнозирование риска рецидива осуществляется применением линейного классификатора. На первом шаге осуществляется переход в логарифмическую шкалу и линейная нормировка: вычисляются нормированные количественные оценки представленности
Нормировочные коэффициенты а и b выбираются на стадии калибровки системы таким образом, что для каждого гена-маркера ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 эмпирическое среднее величины Qnorm равно нулю, а эмпирическое среднеквадратическое отклонение - единице. Значения нормировочных коэффициентов могут зависеть от оборудования, используемого при проведении ПЦР-РВ, и коллекции образцов, по которой вычислялись эмпирические среднее и среднеквадратичное отклонения. Возможные значения нормировочных коэффициентов приведены в табл. 1.
Далее осуществляют вычисление значения риска рецидива РМЖ SR:
Значения весовых параметров w0, w(ELOVL5), w(IGFBP6), w(TXNDC9) приведены в табл. 2.
По значению SR осуществляют окончательное построение прогноза риска рецидива R: при значении больше 0,2 делают вывод о высоком риске рецидива, при значении меньше -0,2 делают вывод о низком риске рецидива, при значении между -0,2 и 0,2 считают риск неопределенным.
Формально, оба шага, осуществляемых при переходе от ненормированных количественных оценок представленности Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q(TXNDC9) к значению риска рецидива SR, могут быть объединены в один, заключающийся в вычислении линейной комбинации логарифмов этих величин. Однако разбиение на два шага позволяет в рамках рассматриваемой системы при изменении используемого оборудования или даже используемого метода оценки количественной представленности генов-маркеров осуществлять пересчет только нормировочных параметров ag и bg, сохраняя значения весовых параметров w0 и w(ELOVL5), w(IGFBP6), w(TXNDC9).
Следует отметить, что отбор транскриптов, используемых непосредственно для формирования прогноза, осуществлялся на основе анализа данных о полногеномном транскриптоме более чем 400 пациентов, для которых имелась информация о возникновении и времени диагностирования рецидива (наборы данных GSE6532, GSE12093, GSE17705), а также собственных данных полногеномного транскриптомного анализа более чем 250 образцов тканей, пораженных РМЖ. В основе отбора лежало построение бинарного (двухклассового) классификатора, различающего пациентов, у которых был диагностирован рецидив, и пациентов, у которых рецидив диагностирован не был. При этом при построении обучающей выборки из рассмотрения была исключена так называемая «серая зона»: в первый класс были включены лишь пациенты, у которых рецидив был диагностирован в течение первых пяти лет после оперативного лечения, а во второй пациенты, у которых продолжительность безрецидивного периода составляла не менее семи лет.
При фиксированном наборе транскриптов для автоматизированного построения классификатора, использующего в точности этот набор транскриптов, применялся метод опорных векторов (SVM Supprot Vector Machine, см. С. Cortes, V. Vapnik Support-vector networks // Machine Learning, Vol. 20 (1995), 273-297) с линейным ядром и различными штрафами за ошибки разного рода.
Формирование итогового набора транскриптов осуществлялось автоматизированно с использованием полного перебора пар транскриптов и последующего достроения наиболее информативных пар до троек; достроение проводилось с использованием так называемого «жадного подхода», включающего добавление одного транскрипта к паре и последующей покомпонентной оптимизации (Galatenko V.V. и др. Highly informative marker sets consisting of genes with low individual degree of differential expression // Sci. Rep. 2015. T. 5. C. 14967; Галатенко В.В. и др. О построении медицинских тест-систем с использованием жадного алгоритма и метода опорных векторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 156. №11. С. 654-60).
Валидация итогового набора транскриптов и соответствующего этому набору классификатора осуществлялась на валидационной выборке, образцы которой не использовались ни при отборе транскриптов, ни при настройке классификатора: обучающие и валидационная выборки не пересекались не только по пациентам, но и по клиникам, в которых осуществлялся забор биоматериала, и по лабораториям, в которых проводились исследования этого биоматериала.
Осуществление изобретения
Изобретение поясняется следующими примерами осуществления.
Пример 1.
В примере представлена реализация способа оценки риска возникновения рецидива рака молочной у пациентки Инны У. на основе ПЦР-РВ. Выделение РНК:
а) брали образец биопсии опухолевой ткани молочной железы, законсервированный Реагентом для стабилизации мРНК;
б) анализируемый фрагмент биопсии опухолевой ткани молочной железы извлекали пинцетом из Реагента для стабилизации мРНК в предварительно подготовленную охлажденную фарфоровую ступку. Повторно охлаждали ступку и пестик жидким азотом до состояния, когда азот уже почти не испаряется;
в) осуществляли механическое дробление/перетирание образца в ступке;
г) добавляли в ступку 700 мкл Буфера А и 20 мл жидкого азота. Перетирали до получения однородной розоватой пудры. По завершению давали возможность ступке нагреться до комнатной температуры, а образцу растаять;
д) переносили все содержимое ступки в чистую пробирку на 1,5 мл и доводили объем гомогената до 1 мл, добавив 300 мкл Буфера А.
е) проводили стадию дополнительной гомогенизации. Для этого переносили 500 мкл гомогената на колонку QIAAshredder (Qiagen) или аналогичную. Центрифугировали 2 минуты при скорости >10000 об/мин. Раствор, прошедший через колонку, аккуратно отбирали в чистую пробирку. Повторяли процедуру для оставшегося образца. Объединяли гомогенизированные фракции;
ж) добавляли к образцу 200 мкл хлороформа и тщательно перемешивали на вортексе 15 сек. Инкубировали при комнатной температуре 2-3 мин;
и) центрифугировали при 4°С в течение 15 минут при 12000 об/мин;
к) переносили водную фазу (верхняя, неокрашенная) в чистую пробирку на 1.5-2 мл и определяли ее объем;
л) добавляли 1,5 объема от перенесенной водной фазы 100% этанола. Хорошо перемешивали с помощью пипетки;
м) переносили 500 мкл образца, включая осадок, если он выпал, на колонку RNeasy mini spin или аналогичную. Центрифугировали 15 сек при скорости >10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
н) повторяли предыдущий шаг для оставшегося раствора (с использованием той же самой колонки);
п) наносили на колонку 350 мкл Буфера В и центрифугировали 15 сек при скорости >10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
р) обрабатывали DNaseI. Переносили 80 мкл приготовленного раствора DNaseI на колонку RNeasy mini spin или аналогичную и инкубировали 15 мин при 20-30°С;
с) повторяли пункт п);
т) наносили на колонку 500 мкл Буфера Б, центрифугировали 15 сек при скорости >10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
у) добавляли 500 мкл Буфера Б на колонку и центрифугировали 2 мин при скорости >10000 об/мин;
ф) осторожно переносили колонку в чистую пробирку на 1,5 мл и центрифугировали еще 1 мин., чтобы полностью удалить остатки Буфера В;
х) переносили колонку в чистую пробирку на 1,5 мл для элюции образца. Аккуратно наносили 40 мкл воды деионизованной непосредственно на мембрану колонки. Центрифугировали 1 мин. при скорости >10000 об/мин;
ц) собирали элюированный раствор и снова наносили его на мембрану той же колонки RNeasy mini spin или аналогичную. Центрифугировали 1 мин при скорости >10000 об/мин;
ш) собранный элюированный раствор перемешивали, осаждали коротким центрифугированием и разделяли на 2 аликвоты. Держали полученный раствор РНК на льду;
щ) измеряли концентрацию выделенной тотальной РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop или аналога;
э) Оценивали целостность выделенной тотальной РНК с помощью аппаратно-программной платформы Agilent 210 Bioanalyzer или аналога.
Проведение обратной транскрипции (ОТ):
а) пробирки с Буфером для проведения ОТ, смесью праймеров для проведения ОТ и водой деионизированной размораживали при комнатной температуре. Пробирку с Транскриптазой обратной помещали в лед;
б) приготавливали две пробирки, содержащие по 2 мкг выделенной РНК, и добавляли в каждую воды деионизированной до конечного объема 12 мкл;
в) инкубировали 5 мин. при 65°С. Переносили в лед;
г) смешивали 11 мкл Буфера для проведения ОТ, 1 мкл смеси праймеров для проведения ОТ, 1 мкл транскриптазы обратной. Перемешивали и добавляли по 13 мкл к 2 мкг РНК;
д) проводили синтез кДНК в программируемом автоматическом термоциклере по программе, представленной в табл.3
е) смешивали в одной пробирке полученные две пробы кДНК. Держали на льду. Проведение ПЦР-РВ
а) готовили разбавленные в 10 раз растворы кДНК исследуемого образца, Образца РНК клеток мозга контрольного и образца универсальной человеческой РНК контрольного. В табл.4 приведен расчет компонентов реакционной смеси для нанесения на Планшет с нанесенными реагентами.
б) реакционные смеси для проведения ПЦР-РВ готовили в соответствии со схемой, представленной в табл.5 (приведен расчет для проведения ПЦР-РВ в одном из 384-луночных планшетов, состав смесей аналогичен).
1)Контроль без примесей ДНК и РНК отрицательный
2)Образец РНК клеток мозга контрольный
3)Образец универсальной человеческой РНК контрольный
4)Буфер для проведения ПЦР-РВ (БАВР.943129.020)
5)Полимераза для проведения ПЦР-РВ (БАВР.943129.022)
6)Вода деионизированная (БАВР.943129.021)
в) добавляли по 12 мкл реакционной смеси в соответствующие лунки Планшета (схема лунок планшета на фиг. 4);
г) заклеивали заполненный планшет пленкой прозрачной для использования планшета. Встряхивали планшет на вортексе. Коротко центрифугировали планшет в центрифуге для осаждения капель со стенок и пленки на дно пробирок;
д) планшет ставили в амплификатор для ПЦР-РВ на 384 лунки. Рекомендуемая программа для амплификации представлена в табл.6
После проведения ПЦР-РВ биопсии пациентки Инны У. получены значения пороговых циклов, приведенные в табл.7.
Осуществление вычисления в логарифмической шкале и учет значений
эффективностей ПЦР E(ELOVL5)=1,842, E(IGFBP6)=1,914, E(TXNDC9)=1,807, E(FBXO42)=1,885, E(GUSB)=1,870, E(HCFC1)=1,904, E(RPLP0)=1,889 и E(TPT1)=1,765, приводят к значениям
Следует отметить, что значение Q(ELOVL5) приведено исключительно для полноты изложения, так как на следующем шаге (при вычислении Qnorm(ELOVL5)) используется значение именно log2 Q(ELOVL5), а не самой Q(ELOVL5).
Аналогичные вычисления дают
Далее вычисляются нормированные количественные оценки представленности генов-маркеров (см. Таблицу 1):
Qnorm(ELOVL5)=(log2 Q(ELOVL5)-(-1,351)) / 0,934 ≈ -0,163;
Qnorm(IGFBP6)=(log2 Q(IGFBP6)-(-0,876)) / 0,752 ≈ -1,014;
Qnorm(TXNDC9)=(log2 Q(TXNDC9)-(-0,417)) / 0,629 ≈ 0,800.
По нормированным количественным оценкам представленности генов-маркеров вычисляется коэффициент риска рецидива Sr (см. Таблицу 2):
Так как полученное значение SR больше чем 0,2, сделан вывод о высоком риске рецидива РМЖ.
Пример 2.
В примере представлена реализация способа оценки риска возникновения рецидива рака молочной. Этап интерпретации нормированных количественных оценок экспрессии генов Qnorm. Представлены случаи с высоким и низким риском рецидива.
Вычисление ненормированных количественных оценок представленности генов по значениям пороговых циклов, полученных при ПЦР-РВ анализе образца.
Оценка риска возникновения рецидива по нормированным количественным оценкам представленности генов Qnorm.
2.1. После проведения ПЦР-РВ образца биопсии пациентки Екатерины А. и вычисления нормированных количественных оценок представленности генов получены следующие результаты: Qnorm(ELOVL5) = 0,418; Qnorm(IGFBP6) = 1,096; Qnorm(TXNDC) = -0,602. В этом случае значение коэффициента риска рецидива SR составило (см. Таблицу 2)
Так как полученное значение SR меньше чем -0,2, делается вывод о низком риске возникновении рецидива.
2.2. После проведения ПЦР-РВ образца биопсии пациентки Александры П. и вычисления нормированных количественных оценок представленности генов получены следующие результаты: Qnorm(ELOVL5) = -0,545; Qnorm(IGFBP6) = 0,199; Qnorm(TXNDC) = 0,438. В этом случае значение коэффициента риска рецидива SR составило (см. Таблицу 2)
Так как полученное значение SR больше чем 0,2, сделан вывод о высоком риске возникновении рецидива РМЖ.
Валидация достоверности методики
Валидация достоверности описанной методики проведена на собственной коллекции данных, к которым применялся ПЦР-РВ анализ, а также на наборе GSE3494 микрочиповых данных (Miller L.D. et al. An expression signature for p53 status in human breast cancer predicts mutation status, transcriptional effects, and patient survival // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. T. 102, №38. C. 13550-13555), не использовавшихся ни при выборе используемых генов-маркеров, ни при настройке классификатора. Валидация подтвердила высокую достоверность методики.
Так, кривые Каплана-Мейера и ROC-кривая, соответствующие микрочиповой валидации (201 образец, включая 33 образца, соответствующих возникновению рецидива в течение пяти лет, и 128 образцов, соответствующих безрецидивной выживаемости не менее 7 лет), приведены на Фиг. 5.
Оцененные по этой выборке частоты возникновения рецидивов у пациентов с низким, неопределенным и высоким риском развития рецидива составили соответственно 0,094 (9,4%), 0,160 (16,0%) и 0,412 (41,2%). Доля пациентов в классе с неопределенным риском составила всего 0,155 (15,5%). Значения чувствительности и специфичности составили соответственно 0,756 (75,6%) и 0,602 (60,2%) в случае объединения неопределенного риска с высоким, и соответственно 0,636 (63,6%) и 0,766 (76,6%) в случае объединения неопределенного риска с низким. При исключении из рассмотрения образцов с неопределенным риском чувствительность и специфичность составили соответственно 0,724 (72,4%) и 0,720 (72,0%).
Таким образом, экспериментальные данные показывают, что применение заявленного способа позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью оценить риск развития рецидива после хирургического лечения с помощью новых диагностических маркеров РМЖ, а также разработать на их основе простой, чувствительный, надежный способ прогноза безрецидивной выживаемости.
Claims (10)
1. Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, характеризующийся тем, что он включает, по меньшей мере, реагенты для измерения уровня экспрессии генов-маркеров, в качестве которых использованы праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9.
2. Набор по п. 1, характеризующийся тем, что реагенты представлены в лиофилизированном виде или в виде водного раствора.
3. Набор по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам-маркерам, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, соответственно.
4. Набор по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1, используемые для нормирования результатов ПЦР.
5. Набор по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам FBXO42, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 10-19 и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 20-24, соответственно.
6. Набор по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит один или несколько реагентов, выбранных из группы: реагенты для выделения и очистки РНК из образца опухолевой ткани; реагенты для синтеза одноцепочечной кДНК на мРНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; буферы для проведения ПЦР.
7. Планшет для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, включающий нанесенные на лунки реагенты из набора по п. 1 в лиофилизированном виде - праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам - ELOVL5, ITGBP6, TXNDC9.
8. Планшет по п. 7, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам-маркерам, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, соответственно.
9. Планшет по п. 7, характеризующийся тем, что праймеры содержатся в концентрации 250 нМоль.
10. Планшет по п. 7, характеризующийся тем, что зонд содержит краситель FAM с параметрами возбуждения на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм, взятый в концентрации 250 нМоль.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017124372A RU2671557C1 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017124372A RU2671557C1 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015157146A Division RU2626603C2 (ru) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2671557C1 true RU2671557C1 (ru) | 2018-11-02 |
Family
ID=64103534
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017124372A RU2671557C1 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2671557C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2818527C1 (ru) * | 2020-04-30 | 2024-05-02 | Криэйтив Байосайенсиз (Гуанчжоу) Ко., Лтд. | Реагент для обнаружения опухолей |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101195825A (zh) * | 2007-12-10 | 2008-06-11 | 上海华冠生物芯片有限公司 | 用于乳腺癌预后的基因及其应用 |
RU2012146343A (ru) * | 2010-03-31 | 2014-05-10 | Сайвидон Дайагностикс Гмбх | Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении |
-
2017
- 2017-07-10 RU RU2017124372A patent/RU2671557C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101195825A (zh) * | 2007-12-10 | 2008-06-11 | 上海华冠生物芯片有限公司 | 用于乳腺癌预后的基因及其应用 |
RU2012146343A (ru) * | 2010-03-31 | 2014-05-10 | Сайвидон Дайагностикс Гмбх | Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CRONIN M. et al. Analytical Validation of the Oncotype DX Genomic Diagnostic Test for Recurrence Prognosis and Therapeutic Response Prediction in Node-Negative, Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer. Clin Chem. 2007 Jun; 53(6): 1084-1091. * |
CRONIN M. et al. Analytical Validation of the Oncotype DX Genomic Diagnostic Test for Recurrence Prognosis and Therapeutic Response Prediction in Node-Negative, Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer. Clin Chem. 2007 Jun; 53(6): 1084-1091. Integrated Solutions — Real-Time PCR Applications. Critical Factors for Successful Real-Time PCR. QIAGEN. 2006; стр.1-48 [Найдено 21.06.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://jornades.uab.cat/workshopmrama/sites/jornades.uab.cat.workshopmrama/files/Critical_factors_successful_real_time_PCR.pdf. * |
Integrated Solutions — Real-Time PCR Applications. Critical Factors for Successful Real-Time PCR. QIAGEN. 2006; стр.1-48 [Найдено 21.06.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://jornades.uab.cat/workshopmrama/sites/jornades.uab.cat.workshopmrama/files/Critical_factors_successful_real_time_PCR.pdf. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2818527C1 (ru) * | 2020-04-30 | 2024-05-02 | Криэйтив Байосайенсиз (Гуанчжоу) Ко., Лтд. | Реагент для обнаружения опухолей |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6246845B2 (ja) | 遺伝子発現を用いた前立腺癌の予後を定量化する方法 | |
RU2654587C2 (ru) | Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении | |
KR101562644B1 (ko) | 직장결장암용 예후 예측 | |
JP6666852B2 (ja) | 前立腺がん再発の予後に関する遺伝子発現パネル | |
WO2018097678A1 (ko) | 유방암 환자의 예후 예측 방법 | |
US20110165566A1 (en) | Methods of optimizing treatment of breast cancer | |
EP2342354B1 (en) | Molecular classifier for evaluating the risk of metastasic relapse in breast cancer | |
WO2009026128A2 (en) | Gene expression markers of recurrence risk in cancer patients after chemotherapy | |
US20160222461A1 (en) | Methods and kits for diagnosing the prognosis of cancer patients | |
KR102376220B1 (ko) | 전립선암에서 후기 임상적 종점을 평가하기 위한 알고리즘 및 방법 | |
AU2017268510B2 (en) | Method for using gene expression to determine prognosis of prostate cancer | |
US7615353B1 (en) | Tivozanib response prediction | |
US11840733B2 (en) | Method for predicting prognosis of breast cancer patient | |
RU2671557C1 (ru) | Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы | |
RU2626603C2 (ru) | Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы | |
RU2545998C2 (ru) | Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления | |
WO2018231085A1 (ru) | Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы | |
US20190010558A1 (en) | Method for determining the risk of recurrence of an estrogen receptor-positive and her2-negative primary mammary carcinoma under an endocrine therapy | |
EP1772521A1 (en) | Methods for the prognosis of cancer patients | |
Andres | A genomic approach for assessing clinical outcome of breast cancer |