WO2018231085A1 - Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы - Google Patents

Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы Download PDF

Info

Publication number
WO2018231085A1
WO2018231085A1 PCT/RU2017/000407 RU2017000407W WO2018231085A1 WO 2018231085 A1 WO2018231085 A1 WO 2018231085A1 RU 2017000407 W RU2017000407 W RU 2017000407W WO 2018231085 A1 WO2018231085 A1 WO 2018231085A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
risk
primers
txndc9
elovl5
igfbp6
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000407
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Максим Юрьевич ШКУРНИКОВ
Владимир Владимирович ГАЛАТЕНКО
Алексей Владимирович ГАЛАТЕНКО
Тимур Рустэмович САМАТОВ
Александр Григорьевич ТОНЕВИЦКИЙ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Priority to PCT/RU2017/000407 priority Critical patent/WO2018231085A1/ru
Publication of WO2018231085A1 publication Critical patent/WO2018231085A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to medicine, in particular to oncology and molecular biology, and can be used to assess the risk of breast cancer recurrence after surgical removal of the tumor.
  • the invention is based on the assessment of the expression level of 3 genes, mRN of which can be obtained from a sample of a patient's tumor tissue. Moreover, the expression level can be measured both by known methods and by the method described in the present invention.
  • BC Breast cancer
  • BC is a malignant tumor of the glandular tissue of the breast.
  • this is the most common form of cancer among women, affecting during life from 1:13 to 1: 9 women aged 13 to 90 years. It is also the second most common cancer after lung cancer in the general population (including the male population).
  • the number of cases of breast cancer in developed countries has increased dramatically since the 1970s. For this phenomenon, the changed lifestyle of the population of developed countries is partially responsible (in particular, the fact that families have fewer children and the time of breastfeeding has decreased) [Merabishvili V. M. (2011). Breast cancer: incidence, mortality, survival (population study). Oncology issues, 5, 609-615].
  • a new step in the treatment of cancer is the so-called “individual treatment selection”. It is known that chemotherapy occupies an important place in the treatment regimen for breast cancer patients. Previously, patients with tumor types similar in cell structure underwent chemotherapy according to the same scheme. Detailed studies of breast cancer transcript revealed that each tumor has its own characteristics that are unique to it. That is, with similar clinical manifestations and cell structure, different tumors can manifest themselves in different ways, including responding differently to ongoing drug therapy. This is determined by the molecular genetic characteristics of the tumor, including the peculiarities of the expression of certain genes in tumor cells. U2017 / 000407
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • a probe is an oligonucleotide that hybridizes to a DNA / cDNA sequence between two flanking primers.
  • PCR-RV consists of two main stages: 1) hybridization of the test matrix with the probe; and 2) PCR catalyzed by TaqflHK polymerase, which has 5'-exonuclease activity, splitting the probe, which leads to the appearance and increase of a fluorescent signal.
  • reaction usually reaction lasts about 2 hours (40 cycles), in new generation devices - only 40 minutes. Analysis results become available immediately after completion of the reaction.
  • the patent application US 201 1/0145176 Al (RAM50) describes a method, a set of reagents and microarrays for diagnosing breast cancer and predicting the effectiveness of therapy based on measurements of expression levels of 50 marker genes.
  • the method and kit of reagents for predicting the development of breast cancer using six sets of marker genes are described in patent application US 2010/0035240 Al.
  • the method is based on the assessment of the level of expression of 135 genes by the method of quantitative polymerase chain reaction in real time in freshly frozen breast cancer samples. The method allows you to assess the overall ten-year survival, the likelihood of distant metastases and lymph nodes.
  • US 7,622,251 B2 discloses numerical molecular indicators to predict the likelihood of a successful response to an antiestrogen agent (tamoxifen) and chemotherapy for patients with breast cancer (ER +, LNN) without adjuvant therapy.
  • Oncotype DX Breast Cancer Assay diagnostic test used to assess the risk of breast cancer recurrence. Using this test, you can get additional information and decide on further treatment. The results of the study determine the aggressiveness of the tumor, and also assesses the risk of relapse and the need for chemotherapeutic treatment.
  • the objective of the proposed technical solution is the development of new diagnostic breast cancer markers that can reliably assess the risk of relapse after surgical treatment, as well as the development of a simple, sensitive, reliable method for assessing the risk of breast cancer relapse in clinical or outpatient medical institutions.
  • the claimed invention extends the arsenal of diagnostic tests by obtaining new diagnostic markers of breast cancer, allowing for comparable reliability and specificity to assess the risk of relapse after surgical treatment.
  • the problem is solved by the method of determining the risk of occurrence relapse of breast cancer in a patient, including measuring the expression level (quantification of representation) of marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 or a weighted sum of the expression levels of these marker genes in a patient’s tumor tissue sample with the risk of SR recurrence and subsequent assessment of the risk of cancer recurrence breast diseases by comparing the obtained coefficient with predetermined threshold values.
  • the present invention in its first aspect, relates to a method for determining the risk of breast cancer recurrence in humans, comprising measuring the expression level of marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 in a patient’s tumor tissue sample and then evaluating the risk of breast cancer recurrence by comparing the weighted sum expression levels of marker genes with predetermined threshold values.
  • marker genes can be measured by microarray analysis or PCR-RV. Single-stranded cDNAs synthesized on mRNAs isolated and purified from a patient’s tumor tissue sample are used to measure the expression of marker genes by PCR-RV.
  • direct and reverse gene-specific primers with the sequences SEQ ID NO: 1-3 and SEQ ID NO: 4-6, respectively, and probes with the sequences SEQ ID NO: 7-9 can be used for PCR. Normalization of PCR results can be carried out using pairs of gene-specific primers with sequences of SEQ ID NO: 10-19 and probes with sequences of SEQ ID NO:
  • the invention relates to a kit of reagents for evaluating the expression of marker genes during PCR, including at least 3 pairs of primers for genes with the sequences SEQ ID NO: 1-3 and SEQ ID NO: 4-6 - direct and reverse , respectively, and probes with sequences of SEQ ID NO: 7-9, specific for the marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, presented in lyophilized form or in aqueous solution.
  • the invention also relates to a tablet with a set of reagents for conducting
  • PCR reactions in determining the risk of a relapse of breast cancer in humans containing direct and reverse gene-specific oligonucleotide primers applied to the wells of the microplate with the sequences SEQ ID NO: 1-3 and SEQ ID NO: 4-6, respectively, in lyophilized form (direct and reverse) and fluorescent probes with the sequences of SEQ ID NO: 7-9.
  • primers at a concentration of 250 nMol can be used.
  • the fluorescent probe may contain a FAM dye with parameters excitation at a wavelength of 485 nm and emission at a wavelength of 520 nm, taken at a concentration of 250 nM.
  • the invention in another aspect, relates to a kit of reagents for determining the risk of a recurrence of breast cancer in humans, including reagents for the isolation and purification of RNA from a sample of tumor tissue; reagents for the synthesis of single-stranded cDNA on mRNA using oligonucleotide primers; reagents for evaluating gene expression; buffers for PCR, with a kit or plate used as reagents for assessing the expression of marker genes.
  • the invention also relates to a method for assessing the level of expression.
  • marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 obtained by PCR to determine the risk of recurrence of breast cancer in humans, characterized by the fact that threshold cycles for marker genes and normalization genes are measured, and non-normalized quantitative estimates of the representation of the marker genes Q (ELOVL5), Q (IGFBP6), Q (TXNDC9) and then normalized quantitative estimates of the representation Q casual orm (ELOVL5), Qnorm ⁇ IGFBP6), Q norm (TXNDC9) are calculated and derived from these estimates risk and relapse S R with the subsequent construction of a forecast of the risk of relapse R, carried out by comparing the risk coefficient S R with predetermined threshold values.
  • PCR is performed using primers and probes specific for marker genes, primers with the sequences SEQ ID NO: 1-3 and SEQ ID NO: 3-6, and probes with the sequences SEQ ID NO: 7-9, respectively as well as primers and probes specific for the FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 and TPT1 genes for normalizing PCR results, primers with sequences SEQ ID NO: 10-19 and probes with sequences SEQ ID NO: 20-24, respectively, coefficient SR is determined by the formula:
  • threshold values for constructing the risk of breast cancer relapse are two values (0.2 and -0.2), and when the SR value is greater than 0.2 - conclude that there is a high risk of relapse, with an SR value less than -0.2 - they conclude that there is a low risk of relapse, when an SR value is obtained In the range from -0.2 to 0.2
  • the invention relates to a method for evaluating the expression (quantification of representation) of marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 by microarray analysis to determine the risk of breast cancer recurrence in a patient, characterized in that based on microarray analysis of the tumor tissue, an irregular quantitative assessment of the representation of the marker genes Q (ELOVL5), Q (IGFBP6), Q ⁇ TXNDC9), then normalized quantitative estimates of the representation of the marker genes of the Q norm (ELOVL5) are calculated, Qn or m (IGFBP6), Q n0 rm (TXNDC9), on the basis of which the SR relapse risk value is determined, based on which the relapse risk forecast is built by comparing the obtained SR relapse risk value with predetermined threshold values.
  • the data are preprocessed using the RMA method together with the normalization set or using the fRMA method, and the SR coefficient is determined by the formula:
  • two threshold values are used as threshold values for constructing the risk of breast cancer recurrence, and when obtaining a value of S R greater than 0.2, they conclude that there is a high risk of relapse, with an SR value less than -0 2 - conclude that there is a low risk of relapse, when receiving an SR value In the range from -0.2 to 0.2
  • the invention relates to information carriers containing programs recorded thereon that implement methods for quantitatively assessing the representation of marker genes ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 by PCR-RV and microarray analysis.
  • FIG. 1 shows a diagram of the wells of a Tablet.
  • FIG. Figures 2 and 3 show the Kaplan-Meyer curves and the ROC curve, respectively, constructed from the 5th validation sample, and confirming the operability of the claimed method.
  • sequences of forward and reverse gene-specific primers sequences of SEQ ID NO: 1-3 and SEQ ID NO: 4-6
  • sequences of probes SEQ ID NO: 7-9
  • sequences of gene-specific primers to normalize PCR results SEQ ID NO: 10-10 19
  • probes SEQ ID NO: 20-24.
  • the invention provides new molecular genetic markers for predicting relapse-free survival after surgical removal of a primary tumor of the luminal form of breast cancer, based on the determination of
  • biopsy samples can be used, including material obtained by needle biopsy of a breast tumor.
  • Methods of isolating total RNA from mammalian tissue samples 5 are well known to specialists and, as a rule, include the following stages: grinding of tumor and normal tissue samples in liquid nitrogen, cell lysis, RNA isolation and purification, RNA quality control by electrophoresis in 1% agarose gel in the presence of a dye of ethidium bromide or in denaturing polyacrylamide gel, as well as spectrophotometric determination of the amount of 30 RNA. Homogenization of tissue pieces is carried out manually, grinding with a pestle in a ceramic mortar, or using mechanical homogenizers, for example, Omni Mixer or Micro-Dismembrator U from Sartorius (Germany).
  • RNA isolation methods employ strong chaotropic agents such as guanidinochloride and guanidinoisothiocyanate, protein soluble, and sequential phenol and chloroform extractions to denature and remove proteins [Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning. A laboratory Manual 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbor: CSHL Press].
  • the Trizol reagent method [GIBCO / Life Technologies] is also widely used.
  • inhibitors are used, such as an RNAsin inhibitor of placental or recombinant origin, or, for example, a vanadyl riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor.
  • RNA isolation is carried out using a number of commercially available kits (Clonogen, St. Russia; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (USA), etc.).
  • kit for example, QuickGene-810 (Life Science, Japan), eliminates the work with aggressive agents, accelerate and simplify the isolation of RNA.
  • this device uses an 80 ⁇ m porous membrane, which is 12.5 times thinner than the glass filter (1000 ⁇ m) commonly used in such devices, which makes it possible to reduce RNA degradation and increase its yield.
  • the reverse transcription reaction which synthesizes a single-stranded DNA chain on an RNA matrix, is carried out using commercially available reverse transcriptase preparations, such as Moloni mouse leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase, avian myeloblastosis virus (AMV), PowerScript (point mutation M-MLV-RT), C.
  • M-MLV Moloni mouse leukemia virus
  • AMV avian myeloblastosis virus
  • PowerScript point mutation M-MLV-RT
  • C. Therm Polymerase and others, with the help of which it is possible to obtain amplification products up to several thousand and even several tens of thousands of nucleotide pairs (kb).
  • Thermostable Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase can be used, which has reverse transcriptase activity in the presence of Mn ions.
  • primers for reverse transcription, various primers can be used, for example:
  • Oligo (T) -containing primers bind to the endogenous polyA-tail at the 3'-end of the mRNA. These primers are most often used to obtain full-size cDNA.
  • nucleotides A, C, or G are often added at the 3'-end to anchor the primer to the border of the transcript and poly-A tract;
  • Random hexanucleotide primers hybridize with RNA in numerous sites. When reverse transcription with these primers receive short cDNA. Random hexamers are used to overcome difficulties associated with the secondary structure of RNA, they are more effective in reverse transcription of 5'-regions of mRNA;
  • Hexamers or other short oligonucleotides (10-12 nucleotides) of random composition can also be used in combination with oligo-HG-containing primers;
  • primers and probes are carried out by a method well known to specialists in this field, for which they use the available programs, many of which are freely available on the Internet, for example, Genome Browser Gateway, BLAST, Primer3, etc.
  • PCR-RV The high specificity of PCR-RV is ensured by using a probe containing a fluorophore or fluorescent dye (in this case, FAM-6-carboxy-fluoroscein) at the 5'-end, and at the 3'-end - the so-called a damper (in this case, RTQ1).
  • a fluorophore or fluorescent dye in this case, FAM-6-carboxy-fluoroscein
  • RTQ1 a damper
  • C p 1,2, ..., 24
  • PCR efficiencies corresponding to the primers used are considered known: E (ELOVL5), E (IGFBP6), E (TXNDC9), £ (FBX042), £ (GUSB), £ (HCFC1), E (RPLP0) and £ (TPT1).
  • SEQ ID NO: 1 - 6, 10 - 19 these PCR efficiencies are equal to 1,
  • Q (IGFBP6), Q (TXNDC9) can be implemented using the transition to the logarithmic scale.
  • the normalization coefficients a and b are selected at the stage of system calibration in such a way that for each marker gene ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, the empirical mean value of Qnorm is zero, and the empirical standard deviation is unity. Values of the normalization coefficients may depend on the equipment used during PCR-RV and the collection of samples from which the empirical mean and standard deviation were calculated. Possible values of normalization coefficients are given in table. one. Table 1
  • the final forecast of the risk of relapse R is carried out: with a value of more than 0.2, a conclusion is made that the risk of relapse is high, with a value of less than -0.2, a conclusion is made that there is a low risk of relapse, with a value between - 0.2 and 0.2 the risk is uncertain.
  • both steps taken in the transition from unnormalized quantitative estimates of the representation of Q (ELOVL5), OXIGFBP6), Q (TXNDC9) to the value of the risk of relapse SR can be combined into one, which consists in calculating a linear combination of the logarithms of these values.
  • dividing into two steps allows, within the framework of the system under consideration, when changing the equipment used or even the method used to assess the quantitative representation of marker genes, only normalization parameters a g and b g are recalculated, while maintaining the values of the weight parameters wo and w (ELOVL5), w (IGFBP6) , w (TXNDC9).
  • the microchip When assessing the number of transcripts corresponding to marker genes using microarray analysis, the microchip is pre-processed first, together with a standard normalizing set of microchips. Pretreatment is carried out using the RMA method (Irizarry R.A. et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data // Biostatistics. 2003. T. 4 C. 249-264). In the case of Affymetrix Human Genome U133A Array microarrays, the GSE 17705 collection (Symmans WF et al. Genomic index of sensitivity to endocrine therapy for breast cancer // J. Clin. Oncol. 2010. T, 28, F> 7. C. 41 1 1-41 19.
  • Q (ELOVL5), 0 (IGFBP6), Q (TXNDC9) transcripts are taken as non-standardized estimates of the quantitative representation of transcripts, and the values obtained as a result of preprocessing associated with the corresponding marker genes are selected from microarray sample sets. Values are taken on a standard (non-logarithmic) scale.
  • Q (ELOVL5), 0 (IGFBP6), Q (TXNDC9) transcripts are taken as non-standardized estimates of the quantitative representation of transcripts, and the values obtained as a result of preprocessing associated with the corresponding marker genes are selected from microarray sample sets. Values are taken on a standard (non-logarithmic) scale.
  • transcripts used directly for generating the prognosis was based on the analysis of data on the genome-wide transcript of more than 400 patients for whom information was available on the occurrence and time of diagnosis of relapse (data sets GSE6532, GSE 12093, GSE 17705), as well as Own data of a genome-wide transcriptome analysis of more than 250 tissue samples affected by breast cancer.
  • the selection was based on the construction of a binary (two-class) classifier that distinguishes between patients who have been diagnosed with relapse and patients who have not been diagnosed with relapse.
  • the so-called “gray zone” was excluded from consideration: only patients in whom the relapse was diagnosed within the first five years after surgical treatment were included in the first class, and in the second patients, in whom the relapse-free period was not less than seven years.
  • Validation of the final set of transcripts and the classifier corresponding to this set was carried out on a validation sample, the samples of which were not used either in the selection of transcripts or when setting the classifier: training and validation samples did not intersect not only in patients, but also in clinics in which the biomaterial was collected, and in the laboratories that conducted research on this biomaterial.
  • the example shows the implementation of a method for assessing the risk of breast cancer recurrence in a patient Inna U. based on PCR-RV.
  • RNA solution was kept on ice;
  • test tubes containing 2 ⁇ g of isolated RNA were prepared and added to each water deionized to a final volume of 12 ⁇ l;
  • reaction mixtures for PCR-RV were prepared in accordance with the scheme presented in table. 6 (the calculation for PCR-RV in one of the 384-well plates is given, the composition of the mixtures is similar).
  • the example shows the implementation of a method for assessing the risk of breast cancer recurrence. Interpretation step of normalized quantitative estimates of Q n0 nn- gene expression. Cases with high and low risk of relapse are presented.
  • the example shows the implementation of a method for assessing the risk of recurrence of breast cancer in a patient Daria P. based on a microarray analysis
  • the values associated with the ELOVL5, IGFBP6, and TXNDC9 genes were 1942.9, 149.0, and 223.1, respectively.
  • the analysis was carried out on an Affymetrix microchip
  • Validation of the reliability of the described methodology was carried out on our own data collection, to which PCR-RV analysis was applied, as well as on the microarray data set GSE3494 (Miller LD et al. An expression signature for p53 status in human breast cancer predicts mutation status, transcriptional effects, and patient survival // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. T. 102, N ° 38. C. 13550-13555), which were not used either when choosing marker genes used or when setting the classifier. Validation confirmed the high reliability of the method.
  • the Kaplan-Meyer curves and the ROC curve corresponding to microchip validation (201 samples, including 33 samples corresponding to the occurrence of relapse within five years, and 128 samples corresponding to relapse-free survival for at least 7 years) are shown in FIG. 5.
  • the relapse rates estimated for this sample in patients with a low, uncertain, and high risk of relapse were 0.094 (9.4%), 0.160 (16.0%), and 0.412 (41.2%), respectively. Proportion of patients in class with the uncertain risk was only 0.155 (15.5%).
  • the values of sensitivity and specificity were 0.756 (75.6%) and 0.602 (60.2%), respectively, in the case of combining uncertain risk with high, and 0.636 (63.6%) and 0.766 (76.6%), respectively, in case of combining uncertain low risk. With the exclusion of samples with uncertain risk from consideration, the sensitivity and specificity were 0.724 (72.4%) and 0.720 (72.0%), respectively.
  • the experimental data show that the application of the claimed method allows with high sensitivity and specificity to assess the risk of relapse after surgical treatment using new diagnostic breast cancer markers, and also to develop a simple, sensitive, reliable method for predicting relapse-free survival on their basis.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска рецидива рака молочной железы после хирургического удаления опухоли. Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у пациента основан на исследовании количественной оценки представленности мРНК генов-маркеров - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 - в образце опухолевой ткани пациента с получением значения риска рецидива S R , вычисляемого на основе количественных оценок представленности перечисленных генов (взвешенной суммы уровней экспрессии генов-маркеров), и последующим построением прогноза риска рецидива онкологических заболеваний молочной железы путем сравнения полученного коэффициента с предопределенными пороговыми значениями.

Description

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ РЕЦИДИВА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска рецидива рака молочной железы после хирургического удаления опухоли.
Изобретение основано на оценке уровня экспрессии 3 генов, мРН которых могут быть получены из образца опухолевой ткани пациента. При этом уровень экспрессии может быть измерен как известными способами, так и способом, описанным в настоящем изобретении.
Предшествующий уровень техники
Рак молочной железы (РМЖ) - это злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. В мире это наиболее частая форма рака среди женщин, поражающая в течение жизни от 1:13 до 1:9 женщин в возрасте от 13 до 90 лет. Это также второе по частоте после рака лёгких онкологическое заболевание в популяции в целом (считая и мужское население). Количество случаев рака молочной железы в развитых странах резко увеличилось после 1970-х годов. За этот феномен считают частично ответственным изменившийся стиль жизни населения развитых стран (в частности то, что в семьях стало меньше детей и сроки грудного вскармливания сократились) [Мерабишвили В. М. (2011). Рак молочной железы: заболеваемость, смертность, выживаемость (популяционное исследование). Вопросы онкологии, 5, 609-615].
Новым шагом в лечении онкологических заболеваний является так называемый «индивидуальный подбор лечения». Известно, что важное место в схеме лечения больных РМЖ занимает химиотерапия. Ранее пациентки со схожими по клеточному строению типами опухолей проходили химиотерапию по одной и той же схеме. Детальные исследования транскриптома РМЖ позволили установить, что каждая опухоль обладает собственными, присущими только ей характеристиками. То есть при схожих клинических проявлениях и клеточном строении разные опухоли могут проявлять себя различным образом, в том числе, по-разному реагировать на проводимую медикаментозную терапию. Это определяется молекулярно- генетическими особенностями опухоли, в том числе, особенностями экспрессии определённых генов в опухолевых клетках. U2017/000407
В настоящее время выделяют несколько молекулярно-генетических классов РМЖ. Данная классификация предполагает деление первичных опухолей и метастазов в зависимости от наличия и плотности на поверхности раковых клеток рецепторов к биологически активным веществам-регуляторам (гормонам). Иммуногистохимическое типирование позволяет выделить группу пациентов, которым показано лечение противоопухолевыми эндокринными препаратами (препаратами, блокирующими определенные рецепторы раковых клеток, что приводит к снижению их пролиферативного потенциала).
Проблемы метастазирования и рецидива рака молочной железы являются одними из сложнейших в плане прогнозирования в онкологической практике и требующими разработки комплексного подхода для раннего выявления риска появления метастаз.
Из уровня техники известны различные методы построения подобных прогнозов, в том числе основанных на оценке уровня экспрессии мРНК генов. В частности, при построении прогнозов известно использование метода, основанного на полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), который отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Aerts, J., Wynendaele, W., Paridaens, R., Christiaens, M. R., Van Den Bogaert, W., Van Oosterom, А. Т., & Vandekerckhove, F. (2001). A real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect breast carcinoma cells in peripheral blood. Annals of oncology official journal of the European Society for Medical Oncology ESMO (Vol. 12, pp. 39-46).]. Метод широко используют в мире, как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности: обычно проводят 96 реакций в одном опыте, а в последних моделях приборов - 384 реакции. В отличие от обычной полимеразной цепной реакции, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой TaqflHK- полимеразой, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. Обычно реакция продолжается около 2 часов (40 циклов), в приборах нового поколения - всего 40 мин. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения реакции.
Существующие тест-системы позволяют уточнить диагноз, предсказать риск метастазирования и рецидива и эффективность разных видов терапии. Однако в работе Thomassen et al. (Thomassen M, Tan Q, Eiriksdottir F, Bak M, Cold S, Kruse ТА. Prediction of metastasis from low-malignant breast cancer by gene expression profiling. Int J Cancer. 2007 Mar 1; 120(5): 1070-5) показано, что наборы генов в профилях практически не пересекаются. Кроме того, они применимы для анализа определённых разновидностей рака молочной железы (LNN, чувствительных к эстроген-рецептору (ER+)) или для прогнозирования развития заболевания у пациентов, принимающих адъювантную терапию.
Группа van't Veer et al. (van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart A AM, Mao M, et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature [Internet]. Nature Publishing Group; 2002 Jan 31;415(6871 ): 530-6) использовала чип Rosetta с 60-мерными олигонуклеотидами и разработала 70-генный профиль, с помощью которого можно предсказывать образование метастаз в течение пяти лет у пациентов с РМЖ типа LNN (lymph node-negative) с большей точностью, чем с помощью классического клинико-патологического подхода. Предложенный генный профиль описан в патенте US 7514209 В2 (MammaPrint).
В заявке на патент US 201 1/0145176 Al (РАМ50) описан метод, набор реагентов и микрочипов для диагностики заболевания РМЖ и прогнозирования эффективности терапии на основании измерений уровней экспрессии 50 генов- маркеров.
Набор из праймеров к 14 генам и реагенты для определения их экспрессии методом ПЦР-РВ, а также алгоритм интерпретации экспрессии этих генов, предложены в патенте US 7695915 В2 для прогнозирования образования метастазов при люминальной форме РМЖ.
Метод и набор реагентов для прогнозирования развития заболевания РМЖ с помощью шести наборов генов-маркеров описаны в заявке на патент US 2010/0035240 Al . Метод основан на оценке уровня экспрессии 135 генов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени в свежезамороженных образцах РМЖ. Метод позволяет оценить общую десятилетнюю выживаемость, вероятность появления отдаленных метастазов и поражения лимфатических узлов.
В патенте US 7622251 В2 (Oncotype DX™) предложены численные молекулярные индикаторы для предсказания вероятности успешного отклика на антиэстрогенный агент (тамоксифен) и химиотерапию пациентов с заболеванием РМЖ (ER+, LNN) без адъювантной терапии.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату является диагностический тест Oncotype DX Breast Cancer Assay, применяемый для оценки риска возникновения рецидива рака молочной железы. С помощью данного теста можно получать дополнительную информацию и принимать решение о дальнейшем лечении. По результатам исследования определяется агрессивность опухоли, а также оценивается риск возникновения рецидива и необходимость химиотерапевтического лечения. Исследуя экспрессию 21-го гена (16 генов-маркеров - Ki-67, STK15, Survivin, Cyclin Bl, MYBL2, Stromelysin 3, Cathepsin L2, ER, PR, Bcl-2, SCUBE2, GRB7, HER2, GSTM1, Cd68, BAG1, и 5 нормировочных генов - Beta-actin, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC), специалисты устанавливают вероятность рецидива в течение 10 лет. Сам показатель выражен числом от 0 до 100. При этом для проведения теста используются фрагменты опухолевой ткани, стабилизированные в формалине и зафиксированные в парафине. Дополнительная стадия подготовки пробы приводит к увеличению времени проведения теста и дополнительным затратам. Также к недостаткам можно отнести необходимость в осуществлении микродиссекции образца опухолевой ткани, что требует привлечения высококвалифицированных специалистов.
Анализ патентной документации свидетельствует о том, что поиск эффективных решений, направленных на построение прогнозов общей и безрецидивной выживаемости с учетом индивидуальных молекулярно-генетических особенностей рака молочной железы, является крайне актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого технического решения является разработка новых диагностических маркеров РМЖ, позволяющих достоверно оценить риск развития рецидива после хирургического лечения, а также разработка на их основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа оценки риска рецидива РМЖ.
Заявляемое изобретение расширяет арсенал диагностических тестов посредством получения новых диагностических маркеров РМЖ, позволяющих при сопоставимой достоверности и специфичности оценить риск развития рецидива после хирургического лечения.
Поставленная задача решается способом определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у пациента, включающий измерение уровня экспрессии (количественной оценки представленности) генов- маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 или взвешенной суммы уровней экспрессии указанных генов-маркеров в образце опухолевой ткани пациента с получением риска рецидива SR и последующей оценкой риска рецидива онкологических заболеваний молочной железы путем сравнения полученного коэффициента с предопределенными пороговыми значениями.
Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к способу определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у человека, включающему измерение уровня экспрессии генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 в образце опухолевой ткани пациента и последующей оценкой риска рецидива онкологических заболеваний молочной железы путем сравнения взвешенной суммы уровней экспрессии генов-маркеров с предопределенными пороговыми значениями.
Измерение экспрессии генов-маркеров может быть проведено методом микрочипового анализа или ПЦР-РВ. Для измерения экспрессии генов-маркеров методом ПЦР-РВ используют одноцепочечные кДНК, синтезированные на выделенных и очищенных из образца опухолевой ткани пациента мРНК.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения при использовании для измерения экспрессии генов-маркеров метода ПЦР-РВ, может быть использована следущая последовательность действий:
- получение образца опухолевой ткани;
- выделение и очистку мРНК из образца;
синтез одноцепочечных кДНК на мРНК с использованием олигонуклеотидных неспецифических праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов;
- проведение ПЦР одноцепочечных кДНК с прямыми и обратными геноспецифическими праймерами и зондами, специфичными по отношению к исследуемым генам (генам-маркерам) - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, и с парами геноспецифических праймеров и зондами для нормирования результатов ПЦР, например, специфичными по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 с получением для каждого из перечисленных генов-маркеров их ненормированных количественных оценок представленности Q(g), последующим их нормированием и получением нормированных количественных оценок T RU2017/000407 представленности Qn0rmig), вычислением риска рецидива (SR) по формуле
SR= w0 + w(ELOVL5) Qnorm[ELOVL5) + w(IGFBP6) Q„orm(IGFBP6) + w(JXNDC9)
Q„orm(TXNDC9),
где n>(ELOVL5) = - 0,72, w(IGFBP6) = - 0,65, w(TXNDC9) = 0,55, w0 = 0,39; Qimrm (ELOVL5), Qmrm (IGFBP6), Qnorm (TXNDC9) - нормированные количественные оценки представленности генов, и оценкой уровня риска путем сравнения коэффициента риска рецидива с предустановленными порогами:
при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске возникновения рецидива, при значении SR меньше -0,2 - делают вывод и низком риске возникновения рецидива, при получении значения SR В интервале от -0,2 до 0,2
- считают риск неопределенным.
В одном из вариантов осуществления изобретения для проведения ПЦР можно использовать прямые и обратные геноспецифические праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1 -3 и SEQ ID NO: 4-6 соответственно, и зондами с последовательностями SEQ ID NO: 7-9. Нормирование результатов ПЦР можно осуществлять с использованием пар геноспецифических праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 10-19 и зондами с последовательностями SEQ ID
NO: 20-24.
В другом аспекте изобретение относится к набору реагентов для оценки экспрессии генов-маркеров при проведении ПЦР, включающему, по крайней мере, 3 пары праймеров к генам с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6 - прямые и обратные, соответственно, и зондами с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, специфичными по отношению к генам-маркерам ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, представленных в лиофилизированном виде или водном растворе.
Изобретение также относится к планшету с набором реагентов для проведения
ПЦР реакции при определении риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у человека, содержащему нанесенные на лунки микропланшета геноспецифические олигонуклеотидные праймеры прямые и обратные с последовательностями SEQ ID NO: 1 -3 и SEQ ID NO: 4-6 соответственно, в лиофилизированном виде (прямой и обратный) и флуоресцентные зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9.
В одном из вариантов осуществления изобретения можно использовать праймеры в концентрации 250 нМоль.
Флуоресцентный зонд может содержать краситель FAM с параметрами возбуждения на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм, взятый в концентрации 250 нМ.
В другом аспекте изобретение относится к набору реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у человека, включающем реагенты для выделения и очистки РНК из образца опухолевой ткани; реагенты для синтеза одноцепочечной кДНК на мРНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; реагенты для оценки экспрессии генов; буферы для проведения ПЦР, при этом в качестве реагентов для оценки экспрессии генов-маркеров используют набор или планшет.
Изобретение также относится к способу оценки уровня экспрессии
(количественной оценки представленности) генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, полученной при проведении ПЦР для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у человека, характеризующемуся тем, что измеряют пороговые циклы для генов-маркеров и нормировочных генов, по ним получают ненормированные количественные оценки представленности генов-маркеров Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q(TXNDC9) и затем вычисляют нормированные количественные оценки представленности Q„orm(ELOVL5), Qnorm{IGFBP6), Qnorm(TXNDC9), и получения на основе этих оценок риска рецидива SR с последующим построением прогноза риска рецидива R, осуществляемым путем сравнения коэффициента риска SR с предопределенными пороговыми значениями. При этом ПЦР проводят с использованием праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам - маркерам, праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 3-6, и зондов с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, соответственно, а также праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 для нормирования результатов ПЦР, праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 10-19 и зондов с последовательностями SEQ ID NO: 20-24, соответственно, коэффициент SR определяют по формуле:
SR= WO + w(ELOVL5) QmrmiEWVLS) + w(IGFBP6) Qmrm(IGFBP6) + w(TXNDC9)
Qnorm(TXNDC9),
где w(ELOVL5) = - 0,72, w(IGFBP6) = - 0,65, w(TXNDC9) = 0,55, w0 = 0,39; Qnurm (ELOVL5), g„„rm(IGFBP6), £>no„n(TXNDC9) - нормированные количественные оценки представленности генов-маркеров,
где качестве пороговых значений для построения риска рецидива РМЖ используют два значения (0,2 и -0,2), и при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске рецидива, при значении SR меньше -0,2 - делают вывод и низком риске рецидива, при получении значения SR В интервале от -0,2 до 0,2
- считают риск неопределенным.
В другом аспекте изобретение относится к способу оценки экспресии (количественной оценки представленности) генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 методом микрочипового анализа для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы у пациента, характеризующийся тем, что на основе микрочипового анализа опухолевой ткани получают ненормированную количественную оценку представленности генов- маркеров Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q{TXNDC9), затем вычисляют нормированные количественные оценки представленности генов маркеров Qnorm(ELOVL5), Qnorm{IGFBP6), Qn0rm(TXNDC9), на основе которых определяют значение риска рецидива SR, ПО которому строят прогноз риска рецидива путем сравнения полученного значения риска рецидива SR С предопределенными пороговыми значениями. При этом при использовании микрочипового анализа осуществляется предобработка полученных данных с использованием метода RMA совместно с нормировочным набором или с использованием метода fRMA, а коэффициент SR определяют по формуле:
SR= wo + w(ELOVL5) Qnorm{ELOVL5) + w{IGFBP6) Qnom(lGFBP6) + w(TXNDC9)
Qmm{TXNDC9),
где w(ELOVL5) = - 0,72, w(IGFBP6) = - 0,65, w(TXNDC9) = 0,55, w0 = 0,39; Qmm (ELOVL5), g„orm(IGFBP6), g„orm(TXNDC9) - нормированные количественные оценки представленности генов-маркеров,
при этом в качестве пороговых значений для построения риска рецидива РМЖ используют два значения (0,2 и -0,2), и при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске рецидива, при значении SR меньше -0,2 - делают вывод и низком риске рецидива, при получении значения SR В интервале от -0,2 до 0,2
- считают риск неопределенным.
В другом аспекте изобретение относится к носителям информации, содержащим записанные на них программы, реализующие способы количественной оценки представленности генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 методом ПЦР- РВ и методом микрочипового анализа. Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена схема лунок Планшета. На фиг. 2 и 3 представлены кривые Каплана-Мейера и ROC-кривая, соответственно, построенные по 5 валидационной выборке, и подтверждающие работоспособность заявленного метода.
Кроме того, в изобретении представлены последовательности прямых и обратных геноспецифических праймеров (последовательности SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6), последовательности зондов (SEQ ID NO: 7-9), последовательности геноспецифических праймеров для нормирования результатов ПЦР (SEQ ID NO: 10- 10 19) и зондов (SEQ ID NO: 20-24).
Осуществление изобретения
В изобретении представлены новые молекулярно-генетические маркеры для прогноза безрецидивной выживаемости после хирургического удаления первичной опухоли люминальной формы рака молочной железы, основанного на определении
15 количественных оценок представленности мРНК 3 генов: ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9.
Это простой, надежный способ прогноза безрецидивной выживаемости на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Функционал экспрессии 3 генов позволяет с высокой степенью достоверности оценить риск развития рецидива в первые пять лет после хирургического удаления первичной 0 опухоли люминальной формы РМЖ.
В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, в том числе материал, полученный при игольчатой биопсии опухоли молочной железы.
Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих 5 хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%- ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества 30 РНК. Гомогенизацию кусочков тканей проводят вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК используют различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с применением реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами используют ингибиторы, такие как игибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения, или, например, ванадил- рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.
Быстрое и качественное выделение РНК проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например, QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.
Реакцию обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, проводят с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), C.Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Мп .
Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:
1) Олиго^Т)-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА- хвостом на З'-конце мРНК. Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(дТ)-последовательности часто добавляют на З'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта; 2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных со вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;
3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоГГ- содержащими праймерами;
4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.
Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете, например, Genome Browser Gateway, BLAST, Primer3 и др.
Высокая специфичность ПЦР-РВ обеспечивается за счет использования зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (в данном случае, FAM-6-carboxy-fluoroscein), а на 3 '-конце - т.н. гаситель (в данном случае - RTQ1). В процессе ПЦР их взаимодействие нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено использовать праймеры и зонды SEQ ID NO: 1 - 24 (фиг. 1, 2 и 3).
При оценке уровня мРНК генов на вход поступает соответствующий результатам одного ПЦР-исследования биологического образца набор значений пороговых циклов Ср (р=1,2,...,24), где значение порогового цикла Ср соответствует пробе (лунке Планшета) р, пробы 1-3 соответствуют гену ELOVL5, пробы 4-6 - гену IGFBP6, пробы 7-9 - гену TXNDC9, пробы 10-12 - гену FBX042, пробы 13-15 - гену GUSB, пробы 16-18 - гену HCFC1, пробы 19-21 - гену RPLP0 и пробы 22-24 - гену ТРТ1. При этом известными считаются соответствующие используемым праймерам эффективности ПЦР: E(ELOVL5), E(IGFBP6), E(TXNDC9), £(FBX042), £(GUSB), £(HCFC1), E(RPLP0) и £(ТРТ1). Для праймеров SEQ ID NO: 1 - 6, 10 - 19 эти значения эффективностей ПЦР равны соответственно 1,842, 1,914, 1,807, 1,885, 1,870, 1 ,904, 1,889 и 1,765.
Сначала по значениям пороговых циклов определяют количество соответствующих транкриптов в отдельности по каждой пробе, соответствующей одному из генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9. Для этого для каждой из проб р=1,2,3 вычисляют величину N , пропорциональную количеству мРНК ELOVL5 в исследуемом образце, по формуле
Figure imgf000013_0001
Аналогичным образом для каждой из проб /?=4,5,6 вычисляют величину N , пропорциональную количеству мРНК IGFBP6 в исследуемом образце по формуле
N. =
Figure imgf000013_0002
а для каждой из проб /?=7,8,9 вычисляют величину N , пропорциональную количеству мРНК TXNDC9 в исследуемом образце по формуле
Figure imgf000013_0003
В приведенных формулах нормировка основывается на подходе, связанном с усреднением, использующим среднее геометрическое [Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, A.M. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов ПЦР «в реальном времени» — Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, п.8.4; J. Vandesompele, К. De Preter, F. Pattyn, В. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, F. Speleman Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes II Genome Biol., 2002, 3 (7): RESEARCH0034] . При этом для нормировки проб, ассоциированных с каждым из генов-маркеров, используется поднабор нормировочных генов с количеством мРНК по порядку наиболее близким к среднему количеству мРНК соответствующего гена-маркера.
Повторно используя усреднение, основывающееся на среднем геометрическом, в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера ELOVL5 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
Figure imgf000014_0001
Аналогично в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера IGFBP6 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
Figure imgf000014_0004
в качестве ненормированной количественной оценки представленности гена-маркера TXNDC9 в образце биологического материала, берут среднее геометрическое по всем пробам, соответствующим этому гену:
Figure imgf000014_0003
Для уменьшения вычислительных погрешностей вычисления Л^ и Q(ELOVL5),
Q(IGFBP6), Q(TXNDC9) могут осуществляться с использованием перехода в логарифмическую шкалу.
После того, как в рамках исследования образца биологического материала вычислены значения ненормированных количественных оценок представленности Q(ELOVLS), Q{IGFBP6), Q{TXNDC9\ прогнозирование риска рецидива осуществляется применением линейного классификатора. На первом шаге осуществляется переход в логарифмическую шкалу и линейная нормировка: вычисляются нормированные количественные оценки представленности
Figure imgf000014_0002
Нормировочные коэффициенты а и b выбираются на стадии калибровки системы таким образом, что для каждого гена-маркера ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 эмпирическое среднее величины Qnorm равно нулю, а эмпирическое среднеквадратическое отклонение - единице. Значения нормировочных коэффициентов могут зависеть от оборудования, используемого при проведении ПЦР- РВ, и коллекции образцов, по которой вычислялись эмпирические среднее и среднеквадратичное отклонения. Возможные значения нормировочных коэффициентов приведены в табл. 1. Таблица 1
Значения нормировочных коэффициентов
Figure imgf000015_0003
Далее осуществляют вычисление значения риска рецидива РМЖ SR:
Figure imgf000015_0001
Значения весовых параметров wo,
Figure imgf000015_0002
приведены в табл. 2.
Таблица 2.
Figure imgf000015_0004
По значению SR осуществляют окончательное построение прогноза риска рецидива R: при значении больше 0,2 делают вывод о высоком риске рецидива, при значении меньше -0,2 делают вывод о низком риске рецидива, при значении между - 0,2 и 0,2 считают риск неопределенным.
Формально, оба шага, осуществляемых при переходе от ненормированных количественных оценок представленности Q(ELOVL5), OXIGFBP6), Q(TXNDC9) к значению риска рецидива SR, могут быть объединены в один, заключающийся в вычислении линейной комбинации логарифмов этих величин. Однако разбиение на два шага позволяет в рамках рассматриваемой системы при изменении используемого оборудования или даже используемого метода оценки количественной представленности генов-маркеров осуществлять пересчет только нормировочных параметров ag и bg, сохраняя значения весовых параметров wo и w{ELOVL5), w(IGFBP6), w(TXNDC9). Это актуально, в частности, при оценке количественной представленности генов-маркеров с помощью микрочипового анализа. В этом случае изменяется только способ вычисления нормированной количественной оценки представленности Qnorm(ELOVL5), Qnorm (IGFBP6), Q„orm (TXNDC9), а переход от этих оценок к риска рецидива SR И последующее построение прогноза риска R осуществляются в точности способом, описанным выше.
При оценке количества транскриптов, соответствующих генам-маркерам, с помощью микрочипового анализа, сначала осуществляется предобработка микрочипа, совместная со стандартным нормирующим набором микрочипов. Предобработка осуществляется с использованием метода RMA (Irizarry R.A. и др. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data // Biostatistics. 2003. T. 4 C. 249-264). В случае применения микрочипов Affymetrix Human Genome U133A Array в качестве стандартного нормирующего набора микрочипов может использоваться коллекция GSE 17705 (Symmans W.F. et al. Genomic index of sensitivity to endocrine therapy for breast cancer // J. Clin. Oncol. 2010. T, 28, Ж>7. C. 41 1 1-41 19. Использование стандартного нормирующего набора необходимо для приведения результатов предобработки разных микрочипов в единую шкалу. Альтернативой использования стандартного нормирующего набора микрочипов является использование для предобработки метода fRMA (McCall M.N., Bolstad В.М., Irizarry R.A. Frozen robust multiarray analysis (fRMA) // Biostatistics. 2010. T. 1 1, N° 2. C. 242-253.).
После предобработки в качестве ненормированных оценок количественной представленности транскриптов Q(ELOVL5), 0(IGFBP6), Q{TXNDC9) берут полученные в результате предобработки значения, ассоциированные с соответствующими генам-маркерам наборами проб микрочипа. Значения берутся в стандартной (нелогарифмической) шкале. Далее осуществляется переход к нормированным количественным оценкам представленности генов-маркеров Q„orm{ELOVL5), £U-m(IGFBP6), Q„ORM{TXNDC9). Схема этого перехода аналогична описанной выше, отличие заключается в используемых для нормировки коэффициентах:
Figure imgf000016_0001
Значения нормировочных коэффициентов, соответствующие микрочиповой технологии Affymetrix Human Genome U133A Array и нормировочному набору GSE 17705, приведены в табл. 3.
Таблица 3 Значения нормировочных коэффициентов для микрочиповой технологии
Affymetrix Human Genome U133A Array и коллекции GSE 17705 как нормирующего набора
Figure imgf000017_0001
Следует отметить, что отбор транскриптов, используемых непосредственно для формирования прогноза, осуществлялся на основе анализа данных о полногеномном транскриптоме более чем 400 пациентов, для которых имелась информация о возникновении и времени диагностирования рецидива (наборы данных GSE6532, GSE 12093, GSE 17705), а также собственных данных полногеномного транскриптомного анализа более чем 250 образцов тканей, пораженных РМЖ. В основе отбора лежало построение бинарного (двухклассового) классификатора, различающего пациентов, у которых был диагностирован рецидив, и пациентов, у которых рецидив диагностирован не был. При этом при построении обучающей выборки из рассмотрения была исключена так называемая «серая зона»: в первый класс были включены лишь пациенты, у которых рецидив был диагностирован в течение первых пяти лет после оперативного лечения, а во второй пациенты, у которых продолжительность безрецидивного периода составляла не менее семи лет.
При фиксированном наборе транскриптов для автоматизированного построения классификатора, использующего в точности этот набор транскриптов, применялся метод опорных векторов (SVM Supprot Vector Machine, см. С. Cortes, V. Vapnik Support-vector networks // Machine Learning, Vol. 20 (1995), 273-297) с линейным ядром и различными штрафами за ошибки разного рода. Формирование итогового набора транскриптов осуществлялось автоматизированно с использованием полного перебора пар транскиптов и последующего достроения наиболее информативных пар до троек; достроение проводилось с использованием так называемого «жадного подхода», включающего добавление одного транскрипта к паре и последующей покомпонентной оптимизации (Galatenko V. V. и др. Highly informative marker sets consisting of genes with low individual degree of differential expression // Sci. Rep. 2015. T. 5. C. 14967; Галатенко В. В. и др. О построении медицинских тест-систем с использованием жадного алгоритма и метода опорных векторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 156. jVb П. С. 654-60).
Валидация итогового набора транскриптов и соответствующего этому набору классификатора осуществлялась на валидационной выборке, образцы которой не использовались ни при отборе транскриптов, ни при настройке классификатора: обучающие и валидационная выборки не пересекались не только по пациентам, но и по клиникам, в которых осуществлялся забор биоматериала, и по лабораториям, в которых проводились исследования этого биоматериала.
Осуществление изобретения
Изобретение поясняется следующими примерами осуществления.
Пример 1.
В примере представлена реализация способа оценки риска возникновения рецидива рака молочной у пациентки Инны У. на основе ПЦР-РВ.
Выделение РНК:
а) брали образец биопсии опухолевой ткани молочной железы, законсервированный Реагентом для стабилизации мРНК;
б) анализируемый фрагмент биопсии опухолевой ткани молочной железы извлекали пинцетом из Реагента для стабилизации мРНК в предварительно подготовленную охлаждённую фарфоровую ступку. Повторно охлаждали ступку и пестик жидким азотом до состояния, когда азот уже почти не испаряется;
в) осуществляли механическое дробление/перетирание образца в ступке;
г) добавляли в ступку 700 мкл Буфера А и 20 мл жидкого азота. Перетирали до получения однородной розоватой пудры. По завершению давали возможность ступке нагреться до комнатной температуры, а образцу растаять;
д) переносили всё содержимое ступки в чистую пробирку на 1 ,5 мл и доводили объём гомогената до 1 мл, добавив 300 мкл Буфера А. е) проводили стадию дополнительной гомогенизации. Для этого переносили 500 мкл гомогената на колонку QIAAshredder (Qiagen) или аналогичную. Центрифугировали 2 минуты при скорости > 10000 об/мин. Раствор, прошедший через колонку, аккуратно отбирали в чистую пробирку. Повторяли процедуру для остав- шегося образца. Объединяли гомогенизированные фракции;
ж) добавляли к образцу 200 мкл хлороформа и тщательно перемешивали на вортексе 15 сек. Инкубировали при комнатной температуре 2-3 мин;
и) центрифугировали при 4°С в течение 15 минут при 12000 об/мин;
к) переносили водную фазу (верхняя, неокрашенная) в чистую пробирку на 1.5- 2 мл и определяли её объём;
л) добавляли 1,5 объема от перенесенной водной фазы 100% этанола. Хорошо перемешивали с помощью пипетки;
м) переносили 500 мкл образца, включая осадок, если он выпал, на колонку RNeasy mini spin или аналогичную. Центрифугировали 15 сек при скорости > 10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
н) повторяли предыдущий шаг для оставшегося раствора (с использованием той же самой колонки);
п) наносили на колонку 350 мкл Буфера В и центрифугировали 15 сек при скорости > 10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
р) обрабатывали DNasel. Переносили 80 мкл приготовленного раствора DNasel на колонку RNeasy mini spin или аналогичную и инкубировали 15 мин при 20-30°С; с) повторяли пункт п);
т) наносили на колонку 500 мкл Буфера Б, центрифугировали 15 сек при скорости > 10000 об/мин. Удаляли раствор, прошедший через колонку;
у) добавляли 500 мкл Буфера Б на колонку и центрифугировали 2 мин при скорости > 10000 об/мин;
ф) осторожно переносили колонку в чистую пробирку на 1,5 мл и центрифугировали ещё 1 мин., чтобы полностью удалить остатки Буфера В;
х) переносили колонку в чистую пробирку на 1,5 мл для элюции образца. Аккуратно наносили 40 мкл воды деионизованной непосредственно на мембрану колонки. Центрифугировали 1 мин. при скорости > 10000 об/мин;
ц) собирали элюированный раствор и снова наносили его на мембрану той же колонки RNeasy mini spin или аналогичную. Центрифугировали 1 мин при скорости > 10000 об/мин; ш) собранный элюированный раствор перемешивали, осаждали коротким центрифугированием и разделяли на 2 аликвоты. Держали полученный раствор РНК на льду;
щ) измеряли концентрацию выделенной тотальной РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop или аналога;
э) Оценивали целостность выделенной тотальной РНК с помощью аппаратно- программной платформы Agilent 210 Bioanalyzer или аналога.
Проведение обратной транскрипции (ОТ):
а) пробирки с Буфером для проведения ОТ, смесью праймеров для проведения ОТ и водой деионизированной размораживали при комнатной температуре. Пробирку с Транскриптазой обратной помещали в лёд;
б) приготавливали две пробирки, содержащие по 2 мкг выделенной РНК, и добавляли в каждую воды деионизированной до конечного объема 12 мкл;
в) инкубировали 5 мин. при 65°С. Переносили в лёд;
г) смешивали 1 1 мкл Буфера для проведения ОТ, 1 мкл смеси праймеров для проведения ОТ, 1 мкл транскриптазы обратной. Перемешивали и добавляли по 13 мкл к 2 мкг РНК;
д) проводили синтез кДНК в программируемом автоматическом термоциклере по программе, представленной в табл. 4
Таблица 4
Программа синтеза кДНК
Figure imgf000020_0001
е) смешивали в одной пробирке полученные две пробы кДНК. Держали на льду.
Проведение ПЦР-РВ
а) готовили разбавленные в 10 раз растворы кДНК исследуемого образца,
Образца РНК клеток мозга контрольного и образца универсальной человеческой РНК контрольного. В табл. 5 приведён расчёт компонентов реакционной смеси для нанесения на Планшет с нанесенными реагентами. Таблица 5
Расчет компонентов реакционной смеси
Figure imgf000021_0001
б) реакционные смеси для проведения ПЦР-РВ готовили в соответствии со схемой, представленной в табл. 6 (приведён расчёт для проведения ПЦР-РВ в одном из 384-луночных планшетов, состав смесей аналогичен).
Таблица 6
Реакционные смеси из расчёта на один Планшет
Figure imgf000021_0002
» Контроль без примесей ДНК и РНК отрицательный
2> Образец РНК клеток мозга контрольный
3> Образец универсальной человеческой РНК контрольный
«Буфер для проведения ПЦР-РВ (БАВР.943129.020)
«Полимераза для проведения ПЦР- РВ (БАВР.943129.022)
«Вода деионизированая (БАВР.943129.021) в) добавляли по 12 мкл реакционной смеси в соответствующие лунки Планшета (схема лунок планшета на фиг. 4);
г) заклеивали заполненный планшет пленкой прозрачной для использования планшета. Встряхивали планшет на вортексе. Коротко центрифугировали планшет в центрифуге для осаждения капель со стенок и плёнки на дно пробирок;
д) планшет ставили в амплификатор для ПЦР-РВ на 384 лунки. Рекомендуемая программа для амплификации представлена в табл. 7
Таблица 7
Рекомендуемая программа для амплификации
Figure imgf000022_0001
После проведения ПЦР-РВ биопсии пациентки Инны У. получены значения пороговых циклов, приведенные в Таблице 8.
Таблица 8.
Значения пороговых циклов, полученные после проведения ПЦР-РВ биопсии пациентки Инны У.
Figure imgf000022_0002
Осуществление вычисления в логарифмической шкале и учет значений эффективностей ПЦР E(ELOVL5)=l,842, E(IGFBP6)=1,914, £(TXNDC9)= 1,807, E(FBX042)=1,885, E(GUSB)= 1,870, E(HCFC1)= 1,904, E(RPLP0)=1,889 и E(TPT1)=1,765, приводят к значениям
Figure imgf000023_0008
и, аналогично,
Figure imgf000023_0007
Соответственно,
Figure imgf000023_0006
приведено
Figure imgf000023_0005
исключительно для полноты изложения, так как на следующем шаге (при вычислении
) используется значение именно
Figure imgf000023_0004
Figure imgf000023_0003
Аналогичные вычисления дают
Figure imgf000023_0001
Далее вычисляются нормированные количественные оценки представленности генов- маркеров (см. Таблицу 1):
Figure imgf000023_0002
По нормированным количественным оценкам представленности генов-маркеров вычисляется коэффициент риска рецидива SR (см. Таблицу 2):
SR = w0 + w(ELOVL5)Qmrm (ELOVL5) +w(JGFBP6)Q„om (IGFBP6) + w(TXNDC9)Q„orm (TXNDC9) *
« 0,392 - 0, 724 · (-0, 163) - 0,654 · (-1,014) + 0,549 - 0,800 « 1,613.
Так как полученное значение SR больше, чем 0,2, сделан вывод о высоком риске рецидива РМЖ.
Пример 2.
В примере представлена реализация способа оценки риска возникновения рецидива рака молочной. Этап интерпретации нормированных количественных оценок экспрессии генов Qn0nn- Представлены случаи с высоким и низким риском рецидива.
Вычисление ненормированных количественных оценок представленности генов по значениям пороговых циклов, полученных при ПЦР-РВ анализе образца.
Оценка риска возникновения рецидива по нормированным количественным оценкам представленности генов Q„orm.
2.1. После проведения ПЦР-РВ образца биопсии пациентки Екатерины А. и вычисления нормированных количественных оценок представленности генов получены следующие результаты: Qnorm(ELOVh5) = 0,418; O^„OROT(IGFBP6) = 1 ,096; SJOWXTXNDC) = -0,602. В этом случае значение коэффициента риска рецидива SR составило (см. Таблицу 2)
SR = w0 + w(ELOVL5)Q„orm (ELOVL5) +w(IGFBP6)Q„om(IGFBP6) + w(TXNDC9)Qnom (TXNDC9) =
= 0, 392 - 0, 724 · 0, 418 - 0, 654 · 1, 096 + 0, 549 · (-0, 602) * -0, 958.
Так как полученное значение SR меньше, чем -0,2, делается вывод о низком риске возникновении рецидива.
2.2. После проведения ПЦР-РВ образца биопсии пациентки Александры П. и вычисления нормированных количественных оценок представленности генов получены следующие результаты: O.„ORM(ELOVL5) = - 0,545; Q„orm(lGFBP6) = 0, 199; {?«o/-m(TXNDC) = 0,438. В этом случае значение коэффициента риска рецидива SR составило (см. Таблицу 2)
SK = w0 + w{ELOVLS)Qnorm (ELOVL5) +w(IGFBP6)Q„om (IGFBP6) + w(TXNDC9)Q„orm (TXNDC9) =
= 0, 392 + 0, 724 · 0, 545 - 0, 654 · 0, 199 + 0, 549 · 0, 438 * 0, 897.
Так как полученное значение SR больше, чем 0,2, сделан вьшод о высоком риске возникновении рецидива РМЖ. Пример 3.
В примере представлена реализация способа оценки риска возникновения рецидива рака молочной у пациентки Дарьи П. на основе микрочипового анализа
После проведения микрочипового анализа биопсии пациентки Дарьи П. значения, ассоциированные с генами ELOVL5, IGFBP6 и TXNDC9, составили соответственно 1942,9, 149,0 и 223,1. Анализ проводился на микрочипе Affymetrix
Human Genome U133A Array, в качестве нормирующего набора при предобработке использовалась коллекций GSE 17705, в качестве наборов проб, соответствующих генам маркерам, 208788_at, 203851_at и 211758_x_at соответственно.
Нормированные количественные оценки представленности генов-маркеров (см.
Таблицу 3) составили
QNOM (ELOVL5) = (log2 1942, 9 -10, 427) / 0, 763 * 0,651;
Qnorn, (IGFBP6) = (log2 149, 0 - 7, 379) / 0, 640 * -0, 250;
QNORM (TXNDC9) = (log2 223,1 -8,316) / 0,581 * -0,885.
Соответственно, коэффициент риска рецидива SR (см. Таблицу 2) составил:
SR = w, + w(ELOVLS}Q^ (ELOVLS) +wUGFBP6)Q^ (IGFBP6) + ^TXNDC9)Qlim(TXNDC9) *
* 0, 392 - 0, 724 · 0, 651 - 0, 654 · (-0, 250) + 0, 549 · (-0, 885) * -0, 402.
Так как полученное значение SR меньше, чем -0,2, сделан вывод о низком риске рецидива РМЖ.
Валидация достоверности методики
Валидация достоверности описанной методики проведена на собственной коллекции данных, к которым применялся ПЦР-РВ анализ, а также на наборе GSE3494 микрочиповых данных (Miller L.D. et al. An expression signature for p53 status in human breast cancer predicts mutation status, transcriptional effects, and patient survival // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. T. 102, N° 38. C. 13550-13555), не использовавшихся ни при выборе используемых генов-маркеров, ни при настройке классификатора. Валидация подтвердила высокую достоверность методики.
Так, кривые Каплана-Мейера и ROC-кривая, соответствующие микрочиповой валидации (201 образец, включая 33 образца, соответствующих возникновению рецидива в течение пяти лет, и 128 образцов, соответствующих безрецидивной выживаемости не менее 7 лет), приведены на Фиг. 5.
Оцененные по этой выборке частоты возникновения рецидивов у пациентов с низким, неопределенным и высоким риском развития рецидива составили соответственно 0,094 (9,4%), 0,160 (16,0%) и 0,412 (41,2%). Доля пациентов в классе с неопределенным риском составила всего 0,155 (15,5%). Значения чувствительности и специфичности составили соответственно 0,756 (75,6%) и 0,602 (60,2%) в случае объединения неопределенного риска с высоким, и соответственно 0,636 (63,6%) и 0,766 (76,6%) в случае объединения неопределенного риска с низким. При исключении из рассмотрения образцов с неопределенным риском чувствительность и специфичность составили соответственно 0,724 (72,4%) и 0,720 (72,0%).
Таким образом, экспериментальные данные показывают, что применение заявленного способа позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью оценить риск развития рецидива после хирургического лечения с помощью новых диагностических маркеров РМЖ, а также разработать на их основе простой, чувствительный, надежный способ прогноза безрецидивной выживаемости.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, включающий измерение уровня экспрессии генов- маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 в образце опухолевой ткани пациента и последующей оценкой риска рецидива онкологических заболеваний молочной железы путем сравнения уровней экспрессии генов-маркеров с предопределенными пороговыми значениями.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве пороговых значений используют, по крайней мере, два значения, при получении уровня экспрессии выше верхнего порогового значения делают вывод о высоком риске рецидива, при получении уровня экспрессии ниже нижнего порогового значения - делают вывод о низком риске рецидива, при получении уровня экспрессии из интервала значений, находящихся между указанными пороговыми значениями - делают вывод о неопределенном риске.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве образцов опухолевой ткани пациента используют свежезамороженные клетки ткани, или клетки биопсии, или зафиксированные в парафине клетки.
4. Способ по п.1 , характеризующийся тем, что измерение экспрессии генов- маркеров осуществляют методом микрочипового анализа.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что измерение экспрессии генов- маркеров осуществляют методом ПЦР-РВ, при этом для измерения используют одноцепочечные кДНК, синтезированные на вьщеленных и очищенных из образца опухолевой ткани пациента мРНК.
6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что синтез кДНК осуществляют с использованием олигонуклеотидных неспецифических праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов и с парами праймеров - прямыми и обратными, и зондами, специфичными по отношению к генам-маркерам, а также с парами праймеров и зондами, специфичными по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 для нормирования результатов ПЦР, с получением для каждого из генов- маркеров ненормированных оценок уровней их экспрессии Q(g), последующим их нормированием и получением значений Qnorm(g) для каждого гена-маркера, вычислением на основе Qnorm (g) риска рецидива SR.
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам-маркерам, используют праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, соответственно; в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 для нормирования результатов ПЦР, используют праймеры с последовательностями
SEQ ID NO: 10-19 и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 20-24, соответственно, при этом оценку риска рецидива (SR) проводят с использованием формулы: SR= W0 + w(ELOVL5) Qnorm(ELOVL5) + w(IGFBP6) Qnorm(IGFBP6) + w(TXNDC9) Qnorm(TXNDC9),
где w(ELOVL5) = - 0,72, w(IGFBP6) = - 0,65, w(TXNDC9) = 0,55, wO - 0,39;
Qnorm(ELOVL5), Qnorm(IGFBP6), Qnorm(TXNDC9) - нормированные уровни экспрессии генов-маркеров,
при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске возникновения рецидива, при значении SR меньше минус 0,2 - делают вывод о низком риске возникновения рецидива, при получении значения SR В интервале значений от минус 0,2 до 0,2 - считают риск неопределенным.
8. Способ по п.5, характеризующийся тем, что синтез кДНК для измерения экспрессии генов-маркеров осуществляют с помощью набора реагентов, включающего, по крайней мере, праймеры - прямые и обратные, и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, представленных в лиофилизированном виде или водном растворе, или нанесенных на лунки планшета.
9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что праймеры в лунках планшета содержатся в концентрации 250 нМоль.
10. Способ по п.8, характеризующийся тем, что зонд в лунках планшета содержит краситель FAM с параметрами возбуждения на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм, взятый в концентрации 250 нМоль.
1 1. Способ по п.4, характеризующийся тем, что измерение уровней экспрессии генов-маркеров ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9 методом микрочипового анализа проводят посредством получения ненормированных оценок уровней экспрессии генов-маркеров Q(ELOVL5), Q(IGFBP6), Q(TXNDC9), затем вычисляют нормированные оценки уровней генов маркеров Qnorm(ELOVL5), Qnorm(IGFBP6), Qnorm(TXNDC9),
оценку риска рецидива (SR) проводят с использованием формулы:
SR= w0 + w(ELOVL5) Qnorm(ELOVL5) + w(IGFBP6) Qnorm(IGFBP6) + w(TXNDC9) Qnorm(TXNDC9),
где w(ELOVL5) = - 0,72, w(IGFBP6) = - 0,65, w(TXNDC9) = 0,55, wO = 0,39; Qnorm(ELOVL5), Qnorm(IGFBP6), Qnorm(TXNDC9) - нормированные уровни экспрессии генов-маркеров,
при получении значения SR больше 0,2 - делают вывод о высоком риске возникновения рецидива, при значении SR меньше минус 0,2 - делают вывод о низком риске возникновения рецидива, при получении значения SR в интервале значений от минус 0,2 до 0,2 - считают риск неопределенным.
12. Способ по п.П, характеризующийся тем, что для получения ненормированных оценок уровней экспрессии генов-маркеров осуществляют предобработку полученных данных с использованием метода RMA совместно с нормировочным набором или с использованием метода fRMA.
13. Набор реагентов для измерения уровня экспрессии генов-маркеров методом ПЦР при определении риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, характеризующийся тем, что он включает, по крайней мере, праймеры - прямые и обратные, и зонды, специфичные по отношению к генам- маркерам - ELOVL5, IGFBP6, TXNDC9, представленных в лиофилизированном виде или водном растворе.
14. Набор по п.13, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к исследуемым генам, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9 соответственно.
15. Набор по п.13, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит праймеры и зонды, специфичные по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1 для нормирования результатов ПЦР.
16. Набор по п.15, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам FBX042, GUSB, HCFC1, RPLP0 и ТРТ1, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 10-19 и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 20-24 соответственно.
17. Планшет с набором реагентов для проведения ПЦР реакции при определении риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы, содержащий нанесенные на лунки праймеры - прямые и обратные, и зонды, специфичные по отношению к генам-маркерам - ELOVL5, ITGBP6, TXNDC9, в лиофилизированном виде.
18. Планшет по п.17, характеризующийся тем, что в качестве праймеров и зондов, специфичных по отношению к генам-маркерам, использованы праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-3 и SEQ ID NO: 4-6, и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, соответственно.
19. Планшет по п.17, характеризующийся тем, что праймеры содержатся в концентрации 250 нМоль.
20. Планшет по п.17, характеризующийся тем, что зонд содержит краситель FAM с параметрами возбуждения на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм, взятый в концентрации 250 нМоль.
PCT/RU2017/000407 2017-06-13 2017-06-13 Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы WO2018231085A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000407 WO2018231085A1 (ru) 2017-06-13 2017-06-13 Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000407 WO2018231085A1 (ru) 2017-06-13 2017-06-13 Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018231085A1 true WO2018231085A1 (ru) 2018-12-20

Family

ID=64660586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000407 WO2018231085A1 (ru) 2017-06-13 2017-06-13 Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018231085A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140314786A1 (en) * 2011-05-06 2014-10-23 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Human invasion signature for prognosis of metastatic risk

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140314786A1 (en) * 2011-05-06 2014-10-23 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Human invasion signature for prognosis of metastatic risk

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALATENKO V. V. ET AL.: "Highly informative marker sets consisting of genes with low individual degree of differential expression", SCIENTIFIC REPORT S, vol. 5, 2015, pages 1 - 8, XP055558120 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11098372B2 (en) Gene expression panel for prognosis of prostate cancer recurrence
JP6246845B2 (ja) 遺伝子発現を用いた前立腺癌の予後を定量化する方法
RU2654587C2 (ru) Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении
CA2776751C (en) Methods to predict clinical outcome of cancer
KR101562644B1 (ko) 직장결장암용 예후 예측
WO2018097678A1 (ko) 유방암 환자의 예후 예측 방법
KR20140105836A (ko) 다유전자 바이오마커의 확인
US20110165566A1 (en) Methods of optimizing treatment of breast cancer
EP2191020A2 (en) Gene expression markers of recurrence risk in cancer patients after chemotherapy
EP2163649A1 (en) Molecular classifier for evaluating the risk of metastasic relapse in breast cancer
US20160222461A1 (en) Methods and kits for diagnosing the prognosis of cancer patients
JP7239477B2 (ja) 前立腺がんにおける後期臨床エンドポイントを評価するためのアルゴリズムおよび方法
US7615353B1 (en) Tivozanib response prediction
WO2013079188A1 (en) Methods for the diagnosis, the determination of the grade of a solid tumor and the prognosis of a subject suffering from cancer
RU2671557C1 (ru) Набор реагентов для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы
RU2626603C2 (ru) Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы
WO2018231085A1 (ru) Способ определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы
US20190010558A1 (en) Method for determining the risk of recurrence of an estrogen receptor-positive and her2-negative primary mammary carcinoma under an endocrine therapy

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17913180

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17913180

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1