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Hintergrund
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Analyse von methylierten Nukleinsäuren und
insbesondere die Analyse des Methylierungsstatus einer Nukleinsäure-Probe
innerhalb eines komplexen Methylierungsmusters.
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Es
ist bekannt, dass sich pathogene Zustände durch ein modifiziertes
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms zeigen. 5-Methylcytosin
ist die am häufigsten
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen und
sie spielt eine Rolle bei der Regulierung der Transkription, beim
Imprinting und bei der Tumorgenese. Es hat sich gezeigt, dass abweichende
Methylierungsmuster mit einer großen Auswahl von Krankheitszuständen in
Zusammenhang stehen. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin-Stellen in einer spezifischen
Probe ist deshalb von erheblichem Interesse, nicht nur für die Forschung
sondern insbesondere für
die molekulare Diagnose verschiedener Krankheiten. Die Befähigung einen
Gewebetyp, entweder erkrankt oder gesund, basierend auf seinen Methylierungsmustern
zu charakterisieren, macht es erforderlich, dass Techniken zur Analyse
von Komplexen von CpG-Positionen entwickelt werden.
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Obwohl
ein gesundes Gewebe häufig
von einem Krebsgewebe mittels Co-Methylierungsanalyse unterschieden
werden kann, wäre
darüber
hinaus ein ausgereifteres Verfahren der Tumor-Methylierungsanalyse
wertvoll. Beispielsweise bestehen Tumorgewebe-Proben häufig sowohl
aus Tumor- wie auch aus angrenzendem Gewebe. Dort, wo es erforderlich ist,
dass die Klassifizierung des Tumorgewebetyps durchgeführt wird,
muss die Analyse des Methylierungszustands multipler CpG-Stellen,
sowohl für
methylierte als auch für
unmethylierte Varianten jeder CpG-Position durchgeführt werden.
Allerdings wäre die
Analyse unter Anwendung konventioneller MSP-Techniken zeitaufwending
und nicht praktikabel. Eine andere Anwendung für die Analyse des Methylierungszustands
multipler CpG-Stellen ist die Überwachung
von Krankheitsprogression. Wenn ein Krankheitszustand mittels des
abweichenden Methylierungszustands von CpG-reichen Inseln identifiziert wird,
dann muss die Analyse auf CpG-Positionen innerhalb einer Gewebe-
oder Zellprobe ausgerichtet werden, welche sowohl methylierte als
auch unmethylierte Kopien der gleichen CpG-Position enthalten kann.
Auch die Untersuchung einer solchen Probe unter Verwendungen von
Techniken wie Bisulfit-Sequenzierung
und MSP-Analyse ist wiederum zeitaufwendig und nicht praktikabel.
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Die
kovalente Bindung einer Methylgruppe an die C5-Position der Nukleotid-Base Cytosin
tritt insbesondere häufig
in CpG-Dinukleotiden von regulatorischen Genregionen auf. Die Häufigkeit
des Auftretens eines jeden speziellen Dinukleotids in einer vorgegebenen
DNA-Sequenz ist 1/16 oder ~6 %. Beim Menschen ist jedoch die gemessene
durchschnittliche Häufigkeit
des CpG-Dinukleotids sehr gering – ungefähr 1/70. Trotzdem existieren
zusammenhängende
Genomregionen mit einer Länge
von 300 by bis 3000 bp, in welchen das Auftreten von CpG-Dinukleotiden
wesentlich größer ist
als normal. Diese CpG-reichen Regionen werden im Stand der Technik
als CpG-"Inseln" bezeichnet und machen
ungefähr
1 % des Genoms aus. Solche CpG-Inseln
sind erstmalig in der 5'-Region
von Genen beobachtet worden und mehr als 60 % der menschlichen Promotoren
liegen in solchen CpG-Inseln oder überlappen mit diesen.
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Das
am häufigsten
angewendete Verfahren zur Untersuchung von DNA oder anderen Nukleinsäure-Proben
auf die Anwesenheit von 5-Methylcytosin basiert auf der spezifischen
Reaktion von Bisulfit mit Cytosin. Die Bisulfit-Reaktion überführt selektiv Cytosin – aber nicht
5-Methylcytosin
-in Uracil, welches in seinem Basenpaarungsverhalten mit Thymin korrespondiert.
Nach der DNA-Behandlung
mittels der Bisulfit-Reaktion kann 5- Methylcytosin mittels molekularbiologischer
Standardverfahren als einziges verbliebenes Cytosin – beispielsweise
durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung – nachgewiesen
werden, wohingegen 5-Methylcytosin in einer unbehandelten DNA-Probe
nicht von Cytosin mittels seines Hybridisierungsverhaltens unterschieden
werden kann.
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Eine
behandelte DNA-Probe kann unter Verwendung von Verfahren, die auf
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren, einschließlich PCR
in Kombination mit Bisulfit-Behandlung
der DNA, um unmethylierte Cytosine in Uracil zu überführen, analysiert werden. Allerdings
macht die reduzierte Sequenzkomplexität von Bisulfit-behandelter
DNA die Nukleinsäure-Analyse
unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken wie
PCR und Hybridisierungsanalyse schwieriger. Typische Probleme bei
der PCR schließen
erhöhte
Kreuzhybridisierungslevel, Mispriming, falsch-positive Ergebnisse für die Methylierung
und Schwierigkeiten bei der Identifizierung hypermethylierter Allele
in kleinen Proben ein.
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Um
die Nachteile bei der Verwendung von PCR und Bisulfit-Behandlung
zur Detektion methylierter Nukleinsäuren zu überwinden, beschrieben Herman
et al. (US-Pat. Nr.
5786146 )
die Verwendung von methylierungsempfindlichen Primern und ein Verfahren
zur Detektion eines methylierten CpG in einer Nukleinsäure – methylierungsspezifische
PCR ("MSP"). Herman et al.
beschreiben die Verwendung von Oligonukleotid-Primerpaaren, die
spezifisch für methylierte,
im Gegensatz zu unmethylierten Allelen in Nukleinsäuren sind,
zur Amplifikation von DNA-Proben, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit
eines Amplifikats dadurch anzeigt, dass der Methylierungsstatus
einer Gruppe von CpG-Positionen innerhalb einer CpG-Insel der Probe – das heißt ob irgendeine
CpG-Position innerhalb einer Gruppe von Positionen, die durch die
Forward- und Reverse-Primer abgedeckt wird, methyliert ist.
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Das
Verfahren wird von Herman et al. als nur zur Detektion einer unmethylierten
im Gegensatz zu einer methylierten Position innerhalb CpG-reicher Regionen
geeignet beschrieben. Das Verfahren ist weniger zugänglich für die Analyse
komplexer Methylierungsmuster oder die Quantifizierung des Methylierungsgrads
an einer spezifischen CpG-Position in
einer Probe. Gemäß der Beschreibung
erlaubt das Verfahren nur eine semi-quantitative Bewertung des Methylierungsgrads
und ist deshalb nicht für
eine detaillierte Analyse von hypermethylierter DNA innerhalb von
Promotor-Regionen geeignet. Die Verwendung von MSP hat sich als
insbesondere zur Detektion hypermethylierter regulatorischen Genregionen geeignet
erwiesen. Jedoch ist das Verfahren, wie von Herman et al. beschrieben,
nur zur Detektion von hypermethylierten im Vergleich zu nicht-methylierten Positionen
innerhalb von CpG-reichen Regionen geeignet. Dieses Verfahren ist
weniger zugänglich
für die
Analyse komplexer Methylierungsmuster oder die Quantifizierung des
Methylierungsgrads an einer spezifischen CpG-Position in einer Probe.
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Im
Besonderen wurde bei gegenwärtigen Verfahren
der CpG-Methylierungsanalyse, einschließlich Bisulfit-Behandlung, gefolgt
von Nukleinsäureamplifikation
unter Verwendung methylierungsspezifischer PCR (MSP) und methylierungsspezifischer
Primer, nicht die Verwendung multipler Primerspezies, zur Quantifizierung
des Methylierungsgrads in einer Probe, gezeigt. Wie in Laird et
al. (US-Pat. Nr.
6331393
B1 ) offenbart, ist das Verfahren von Herman et al. eine
qualitative und keine quantitative Technik. Die Verwendung zweier
getrennter, unterschiedlicher PCR-Reaktionen bei der MSP (methyliert
und unmethyliert) ergibt Schwierigkeiten bei der Durchführung eines
kinetischen Vergleichs zwischen den Reaktionen. Weiterhin kann die
Verwendung von gepaarten Primern bei der MSP, welche häufig eine DNA-Sequenz
abdecken, die mehr als ein CpG-Dinukleotid enthält, nur eine von multiplen
möglichen Sequenzvarianten
darstellen. Aus diesem Grund wird das Verfahren von Herman et al.
als nicht-quantitativ beschrieben, da es auf dem Auftreten oder Nicht-Auftreten
eines PCR-Produkts in der vollständig
methylierten, im Gegensatz zur unmethylierten Reaktion, basiert.
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Deshalb
wird offensichtlich, dass MSP keine vielseitige Technik für die Analyse
komplexer Methylierungsmuster ist. Zur Untersuchung des Methylierungsstatus
einer Sequenz, die sowohl methylierte als auch unmethylierte Cytosin-Positionen
enthalten kann, muss eine große
Anzahl von Primern, welche jede mögliche Kombination von methylierten
und nicht-methylierten CpG-Positionen abdecken, designed und getestet
werden. Das ist wirtschaftlich nicht praktikabel, zeitaufwendig,
teuer und arbeitsintensiv. Diese Problem würden auch dort noch offensichtlicher
werden, wo das Verfahren im Rahmen großer Durchsatzmengen eingesetzt
wird, wo die Aufrechterhaltung der Datenqualität schwer zu steuern sein kann
und falsches Annealing von Primern auch zu einer nicht korrekten
Interpretation der Daten führen kann.
Ein weiterer Nachteil des Verfahrens, wie es von Herman et al. beschrieben
wurde, ist, dass obwohl das Verfahren die Detektion methylierter
Sequenzen in einer Probe ermöglicht,
es nicht die Quantifizierung oder absolute Messung der in einer Probe
vorliegenden Menge an methylierten Sequenzen gestattet.
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Deshalb
ist ein verbessertes Verfahren zur Bewertung des CpG-Methylierungsstatus
erforderlich um, neben anderen Gründen, ein verlässliches, quantitatives
Mittel bereitzustellen, das die Analyse des Methylierungsgrads an
einer spezifischen CpG-Position gestattet und die simultane Analyse des
Methylierungsstatus aller CpG-Dinukleotide
in einer Probe erlaubt, wodurch die Untersuchung der komplexen epigenomischen
Signifikanz multipler CpG-Stellen in Bezug auf phenotypische Variation vorangetrieben
werden kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
stellt ein Mittel zur Analyse komplexer Methylierungsmuster in biologischen
Proben durch die Verwendung multipler Paare methylierungsspezifischer
Primer bereit. Nachdem unmethylierte Cytosin-Basen in einer Nukleinsäure-Probe
durch die Bereitstellung eines Umsetzungs-Agens, das methylierte
Cytosine nicht verändert,
in Uracil-Basen überführt wurden,
werden ausgewählte
Segmente der umgesetzten Nukleinsäure-Probe in einer Polymerasereaktion, bei
der mindestens zwei Oligonukleotid-Primerpaare eingesetzt werden,
derart amplifiziert, dass die gebildeten Amplifikate unterscheidbar
detektierbar und quantifizierbar sind. Ein Primerpaar bindet bevorzugt
an eine behandelte Nukleinsäuren,
die in der Sequenz, an die der Primer hybridisiert, ursprünglich methyliert war.
Ein anderes Primerpaar bindet bevorzugt an behandelte Nukleinsäure, die
in der Sequenz, an die der Primer hybridisiert, ursprünglich unmethyliert war.
Ein drittes Oligonukleotid-Primerpaar kann verwendet werden, um
eine Sequenz zu amplifizieren, die als Referenz-Sequenz fungiert.
Der Methylierungsgrad in mindestens einem der ausgewählten Segmente
der Nukleinsäure-Probe
wird basierend auf den relativen Unterschieden in den Amplifikaten bestimmt,
die durch jedes der Oligonukleotid-Primerpaare gebildet wurden.
Die Erfindung schließt
auch Primer und ein Kit ein.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Diagramm, das ein Verfahren der MSP-Amplifikationgemäß dem Stand der Technik zeigt.
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2 ist
ein Flussdiagramm eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung.
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Beschreibung
veranschaulichender Ausführungsbeispiele
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Eine
erfindungsgemäße Ausführungsform stellt
ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren, einschließlich der
Analyse von CpG-reichen Inseln, bereit. Multiple Spezies von Primeroligonukleoti den
werden verwendet um eine Nukleinsäure-Probe zu amplifizieren.
Die relativen Mengen der Amplifikate werden detektiert, wodurch eine
detaillierte, spezifischere und quantifizierbare Analyse des Methylierungsstatus
einer Nukleinsäure-Probe
innerhalb eines komplexen Methylierungsmusters ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß bedeutet ein
komplexes Methylierungsmuster den Methylierungsgrad an einer CpG-Position
oder mehreren CpG-Positionen, wobei der Methylierungsgrad mittels
der relativen Menge von methylierten zu nicht-methylierten Nukleinsäuren in
der Probe bestimmt wird.
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1 zeigt
ein Verfahren der MSP-Amplifikation gemäß dem Stand der Technik – eine typische MSP
Polymerase-gestützte Amplifikation
einer CpG-reichen Sequenz unter Verwendung methylierungsspezifischer
Primer an vier repräsentativen
Bisulfit-behandelten DNA-Strängen
(A-D) ("MSP Amplifikation"). In dem in Herman
et al. (US-Pat. Nr.
5786146 )
offenbarten Verfahren, sind die Primer komplementär zur Bisulfit-umgesetzten
Target-Sequenz, die ein CG-Dinukleotid einschließt, d. h., dass die Primer
an Positionen hybridisieren, die in der Original-Nukleinsäure-Probe methyliert waren.
Amplifikat-Nukleinsäuren werden
dann detektiert, wodurch die Anwesenheit einer methylierten Nukleinsäure in der
Probe angezeigt wird. Alternativ können die Primer ein 'TG'- oder 'CA'-Dinukleotid an Stelle
des 'CG'-Dinukleotids umfassen,
wodurch eine unmethylierte Version der Target-Nukleinsäure amplifiziert und deren
Detektion ermöglicht
wird. In einer weiteren Veranschaulichung des Standes der Technik kann
die Verwendung von zwei Primerspezies in einer Reaktion kombiniert
werden, welche zur Analyse heterogener Proben geeignet ist.
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In 1 können die
methylierungsspezifischen Forward-Primer 1a, 1b, 1c und 1d beziehungsweise
die Reverse-Primer 1a', 1b', 1c' und 1d' an den Bisulfit-behandelten DNA-Strängen A-D,
an den Bisulfit-behandelten DNA-Strang 3a anlagern, wenn
die korrespondierenden genomischen Subjekt-CpG-Sequenzen methyliert
waren. Die Bisulfit-behandelten DNA-Stränge können amplifiziert werden, wenn
sich sowohl die Forward- als auch die Reverse-Primer anlagern, wie es bei Strang A
gezeigt ist. Dunkle kreisförmige
Markierungen (2) an den DNA-Strängen 3a, 3c,
und 3d repräsentieren methylierte,
mit Bisulfit umgesetzte CpG-Positionen, wohingegen weiße kreisförmige Positionen
(4) unmethylierte mit Bisulfit umgesetzte Positionen repräsentieren.
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Im
oberen Beispiel repräsentiert
Strang A den Fall, bei dem alle genomischen Subjekt-CpG-Positionen
co-methyliert waren
und sowohl Forward- als auch Reverse-Primer sind dadurch in der Lage, sich an
der korrespondierenden behandelten Nukleinsäure anzulagern und diese zu
amplifizieren. Bei Strang B war keine der genomischen Subjekt-CpG-Positionen
methyliert und deshalb lagert sich keiner der Primer an die korrespondierende
behandelte Nukleinsäure-Sequenz
an und die Sequenz wird nicht amplifiziert. Bei Strang C sind die
drei genomischen Subjekt-CpG-Positionen,
die durch die Forward- und Reverse-Primer abgedeckt werden, nicht
co-methyliert (nur eine der Positionen ist methyliert) und deshalb lagern
sich die Primer im Anschuss an die Bisulfit-Behandlung der DNA nicht
an. Bei Strang D waren die die durch den Reverse-Primer abgedeckten
Positionen methylierte CpG-Sequenzen in der genomischen Subjekt-DNA
und der Reverse-Primer lagert sich deshalb an die korrespondierende
Bisulfit-behandelte Sequenz an. Es gibt jedoch keine exponentielle Amplifikation
der korrespondierenden Bisulfit-behandelten DNA-Sequenz weil die mit dem Forward-Primer
abgedeckten genomischen Subjekt-CpG-Positionen nicht methyliert
waren und der Forward-Primer sich nicht anlagert. Wie in Laird et
al. im US-Pat. Nr.
6331393
B1 offenbart, ist das Verfahren von Herman et al. nicht
quantitativ, weil die in Herman et al. verwendeten gepaarten Primer
nur eine von mul tiplen möglichen
Sequenzvarianten repräsentieren
können und
es auf dem Vorhandensein eines PCR-Produkts in der vollständig methylierten
gegenüber
der vollständig
unmethylierten Reaktion basiert.
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Im
Stand der Technik wird deshalb offensichtlich, dass MSP weder eine
ausreichend vielseitige noch eine praktikable Technik für die Analyse komplexer
Methylierungsmuster ist. Zur Untersuchung des Methylierungsstatus
einer Sequenz mittels MSP, welche sowohl methylierte als auch nicht-methylierte
Cytosin-Positionen enthalten kann, muss eine große Anzahl von Primern, welche
jede mögliche
Kombination von methylierten und nicht-methylierten CpG-Positionen abdecken,
designed und getestet werden. Das ist wirtschaftlich nicht praktikabel,
zeitaufwendig, arbeitsintensiv und teuer und wirtschaftlich nicht
realisierbar. Diese Probleme würden
dort noch offensichtlicher werden, wo das Verfahren im Rahmen großer Durchsatzmengen
eingesetzt wird, wo die Aufrechterhaltung der Datenqualität schwer
zu steuern sein kann und falsches Annealing von Primern zu einer
nicht korrekten Interpretation der Daten führen kann. Ein weiterer Nachteil
des Verfahrens, wie es von Herman et al. beschrieben wurde, ist,
dass obwohl das Verfahren die Detektion methylierter Sequenzen in
einer Probe ermöglicht,
es nicht die Quantifizierung oder absolute Messung der in einer
Probe vorliegenden Menge an methylierten Sequenzen gestattet.
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Im
Gegensatz zum Stand der Technik stellt die gegenwärtige Erfindung
ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren, einschließlich der
Analyse CpG-reicher Inseln bereit. In einem ersten Ausführungsbeispiel
stellt das Verfahren ein Mittel zur Analyse des Methylierungsgrads
einer einzelnen CpG-Position bereit. Dieses wäre dort anwendbar, wo eine
Probe heterogenen Ursprungs ist – zum Beispiel dort, wo multiple
Proben einer Kategorie gepoolt werden, wobei das beschriebene Verfahren
ein Mittel zur Bestimmung des durchschnittlichen Auf tretens von
Methylierung in dem Probensatz bereitstellen würde. Ein zweites Ausführungsbeispiel des
Verfahrens stellt ein Mittel zur Analyse multipler CpG-Positionen
in einer Probe bereit, so dass die relativen Mengen an Methylierung
an jeder Position mittels Kalibrierung mit einer Referenz-Sequenz
abgeleitet wird.
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In
dem ersten Ausführungsbeispiel
werden in einer genomischen DNA-Probe Cytosin-Basen, die in der
5-Position unmethyliert
sind, durch die Behandlung mit einem Agens, z. B. Bisulfit, in Uracil oder
eine andere Base überführt, die
sich in Bezug auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet.
Eine Nukleinsäure
oder mehrere Nukleinsäuren
der behandelten Probe werden in einer Amplifikationsreaktion mittels
zweier oder mehrerer Primeroligonukleotid-Paare für jede zu
analysierende CpG-Position
amplifiziert. Ein Primerpaar hybridisiert bevorzugt, wenn die CpG-Position
vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, und ein anderes Primerpaar
hybridisiert bevorzugt, wenn die CpG-Position vor der Bisulfit-Behandlung unmethyliert
war. Die durch jedes Primerpaar gebildeten Amplifikate werden detektiert
und gemessen, wodurch die Bestimmung des Methylierungsgrads an jeder
analysierten CpG-Position mittels des Vergleichs der Mengen der entsprechenden
Amplifikate ermöglicht
wird.
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Die
folgende Beschreibung betrifft ein Ausführungsbeispiel der Erfindung,
das mittels des Flussdiagramms in 2 veranschaulicht
wird, ist jedoch nicht auf dieses begrenzt. Erfindungsgemäß wird eine
Probe einer Nukleinsäure,
zum Beispiel DNA, zuerst aus Gewebe oder zellulären Quellen extrahiert (110),
welche beispielsweise Gewebeproben, Zell-Linien, histologische Schnitte,
Körperflüssigkeiten
oder in Paraffin eingebettetes Gewebe einschließen können. Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf
Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und deren Polymere, entweder
in einzel- oder doppelsträngiger
Form. Der Begriff umfasst Nukleinsäuren, welche bekannte Nukle otid-Analoga
oder modifizierte Rückgrat-Reste
oder Bindungen, ob synthetisch, natürlich vorkommend oder nicht-natürlich vorkommend,
enthalten, welche die gleichen Bindungseigenschaften besitzen wie
die Referenz-Nukleinsäuren und
welche in zu den Refernz-Nukleotiden analoger Weise metabolisiert
werden. Beispiele solcher Analoga schließen ein, ohne Begrenzung, Phosphorthioate,
Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale-Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide,
Peptid-Nukleinsäuren (PNAs).
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Zum
Zweck der Veranschaulichung wird in der Darstellung des erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels
in 2 auf DNA Bezug genommen. Die Extraktion kann
mit Mitteln geschehen, die einem Durchschnittsfachmann gängig sind,
einschließlich beispielsweise
der Verwendung von detergenten Lysaten, Ultraschall und Verwirbeln
mit Glasperlen.
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Die
Extraktion von DNA zur weiteren Analyse kann in einem winzigen Volumen, üblicherweise
in einer Ölschicht,
stattfinden, welche den Kontakt mit der Umwelt verhindert und Verluste
an DNA gering hält, um
auch mit kleinen Ausgangsmengen ein reproduzierbares Ergebnis bereitzustellen.
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In
Schritt (115), hier als "Vorbehandlung" bezeichnet, wird die genomische DNA-Probe
derart mit einem Umsetzungs-Agens behandelt, dass Cytosin-Basen,
die an der 5'-Position
unmethyliert sind, in Uracil, Thymidin oder eine andere Base überführt werden,
die sich im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin
unterscheidet. Beispiele von Umsetzungs-Agenzien sind Sulfit- und
Disulfit-Lösungen.
Ein bevorzugtes Agens ist Natriumbisulfit (NaHSO3),
welches mit der 5,6-Doppelbindung von Cytosin reagiert, was mit
einer wesentlich langsameren Geschwindigkeit verläuft als
die Reaktion mit methylierter Cytosin-Base. Cytosin reagiert mit
dem Bisulfit-Ion, wodurch ein sulfoniertes Cytosin als Reaktionszwischenprodukt entsteht,
welches zur Deaminierung neigt, was zu einem sulfonierten Uracil
führt. Die
Sulfonatgruppe kann unter alkalischen Bedingungen entfernt werden,
wodurch es zur Bildung von Uracil kommt.
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Weil
Uracil durch Polymerase als Thymin erkannt wird, enthält das aus
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) resultierende Produkt Cytosin
nur an der Position, an der 5-Methylcytosin in der ursprünglichen
Templat-DNA auftritt. Die Umsetzung einer genomischen Sequenz mittels
Bisulfit-Behandlung resultiert gewöhnlich in der Erzeugung einer
Cytosin-armen Nukleinsäure.
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In
dem am stärksten
bevorzugten Ausführungsbeispiel
des Verfahrens wird die Bisulfit-Behandlung gemäß der Agarose-Matrix durchgeführt, wie
von A. Olek, J. Oswald und J. Walter, "A modified and improved method for bisulphite
based cytosine methylation analysis." Nucleic Acids Res., 15. Dez. 1996,
24(24):5064–6,
beschrieben. In diesem Verfahren werden Zellen oder isolierte chromosomale DNA
vor der Bisulfit-Behandlung in eine Agarose-Gelmatrix eingeschlossen. Durch den
Einschluss der zu analysierenden Nukleinsäuren in eine feste Matrix ist
der Verlust an DNA begrenzt und die Empfindlichkeit des Verfahrens
wird dadurch erhöht.
Weiterhin ist beobachtet worden, dass das Agarose-Bead-Verfahren
der Bisulfit-Behandlung
eine höhere Umsetzungsgeschwindigkeit
hat als andere Verfahren.
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Die
verschiedenen Reaktionsschritte der Bisulfit-Reaktion sind Gleichgewichtsreaktionen,
bei welchen die Gleichgewichte der zwei wichtigen Reaktionsschritte,
die Sulfonierung des Cytosins und die anschließende Deaminierung, sich bei
unterschiedlichen Temperaturen auf der richtigen (sulfoniert und
deaminiert) Seite befinden. Deshalb ist es vorteilhaft, die Bisulfit-Reaktion
unter zyklischen Bedingungen mit wechselnden Temperaturen durchzuführen. Ein
bevorzugtes Ausführungsbeispiel
des Verfahrens umfasst eine Änderung
von ungefähr
4 °C (10 min)
auf 50 °C
(20 min). Alle anderen Temperaturen und Reaktionszeiten bei bestimmten
Temperaturen sollten jedoch in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeschlossen
sein. Zum Beispiel ist es unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft
gewesen, wenn wesentlich kürzere
Reaktionszeiten eingestellt wurden. Es ist auch zweckmäßig einen
Schritt einzufügen,
bei welchem die zu untersuchende DNA zwischen einem Deaminierungsschritt
(bei hoher Temperatur, ≥50 °C.) und einem
nachfolgenden wiederholten Sulfonierungsschritt bei sehr hohen Temperaturen
wieder denaturiert wird. Für
DNA mit hohem Molekulargewicht sind die Denaturierungstemperaturen üblicherweise >90 °C, sie können aber auch niedriger sein.
Bei einigen Variationen des Verfahrens sind die zu untersuchenden
DNA-Fragmente sehr kurz. In anderen Fällen kann die Komplementarität zwischen
Strängen
zurückgehen.
In einem zyklischen Protokoll kann die Denaturierungstemperatur im
ersten Zyklus höher
als 90 °C
sein, jedoch kann sie bei späteren
Zyklen auf niedrigere Werte reguliert werden.
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Die
DNA-Extraktion kann, wie in Olek et al. beschrieben, in einem winzigen
Volumen, zum Beispiel 1 μl,
aber auch mit kleineren oder größeren Volumina,
unter einer Ölschicht
durchgeführt
werden. Nachdem die DNA-Probe denaturiert wurde, wird dann die erforderliche
Bisulfit-Konzentration
durch die Addition eines größeren Volumens
einer Bisulfit-Lösung
(zum Beispiel 4 μl)
hinzugefügt,
was etwas mehr ist als zur ordnungsgemäßen Behandlung erforderlich
ist, so dass die erforderliche Endkonzentration und der pH sich
automatisch unter dem Öl
einstellen. Anschließend
wird die Bisulfit-Behandlung nach einem der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.
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Gemäß einem
erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel
wird die vorbehandelte Nukleinsäure dann
als Basis für
eine CpG-Stellen-Analyse verwendet, die auf einer Amplifikationsreaktion,
wie einer Polymerase, basiert. "Amplifikationsreaktion" bezieht sich auf
jede chemische, ein schließlich
enzymatische, Reaktion, die zu erhöhten Kopien einer Templat-Nukleinsäure-Sequenz
führt,
wie zum Beispiel PCR, ist jedoch nicht darauf begrenzt. In diesem
Zusammenhang können
thermostabile Polymerasen jeglichen Ursprungs verwendet werden.
Der verwendete Polymerase-Typ ist nicht wesentlich und er kann auch
in Abhängigkeit
der vorliegenden Puffer-Bedingungen variiert werden. Diese Lösung enthält eine solche
Polymerase und alle Nukleotide und die erforderlichen Oligonukleotid-Primer.
Nach der Zugabe dieser Lösung
kann daher eine Amplifikation direkt im gleichen Reaktionsbehälter stattfinden.
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Die
Amplifikation kann unter Verwendung von zwei oder mehr Oligonukleotid-Primerpaaren durchgeführt werden,
wobei zwei Primerpaare bei der Analyse einer jeden CpG-Position benutzt
werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens
werden zwei Primerpaare (125, 130) bei der Amplifikation
jeder Target-Sequenz verwendet, wobei die Target-Sequenz mindestens
eine zu analysierende CpG-Position umfasst. Ein Primerpaar lagert
sich spezifisch an die Target-Sequenz an, die vor der Bisulfit-Behandlung
unmethyliert war und das andere Primerpaar lagert sich, in dem Fall,
dass die Sequenz vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, an dieselbe
Target-Sequenz an.
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Gemäß einem
erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel
besteht jedes Paar Amplifikationsprimer aus einem ersten (Forward)
und einem zweiten (Reverse) Primer, wie es in vielen Amplifikationsverfahren,
wie bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR),
Standard ist. Es ist erforderlich, dass jedes der Primerpaare aus
wenigstens einem methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid
besteht. Methylierungsspezifischer Primer bezieht sich auf ein Primeroligonukleotid
für die
Verwendung bei der Amplifikation einer methylierungsdiskriminierenden
Bisulfit-behandelten Nukleinsäure
(oder gleichartig umgesetzter Nukleinsäure), wobei der Primer wenigstens
ein CpG- oder CpA-Dinukleotid in seiner Sequenz enthält. Wie
beispielsweise im US-Patent
Nr.
5786146 von Herman
et al. beschrieben, bestehen MSP-Primer aus einem Oligonukleotid,
das spezifisch für
das Annealing an eine Nukleotidsequenz ist, die wenigstens ein Bisulfit-behandeltes
CpG-Dinukleotid enthält.
Gemäß diesem
Ausführungsbeispiel des
Verfahrens umfasst deshalb das Primerpaar, das bevorzugt an die
Target-Nukleinsäure
hybridisiert, die vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, ein CpG-Dinukleotid
an der zu untersuchenden CpG-Position, und das Primerpaar, das bevorzugt
an die Target-Nukleinsäure
hybridisiert, die vor der Bisulfit-Behandlung unmethyliert war,
umfasst ein TpG- oder CpA-Dinukleotid an der CpG-Position. Methylierungsspezifische
Primer enthalten allgemein relativ wenige Cytosine, da Cytosine
durch die Bisulfit-Reaktion umgesetzt werden. Wenn die Primer jedoch spezifisch
für methylierte
Cytosin-Dinukleotide sind, werden die Cytosin-Positionen in den Primer-Oligonukleotiden
konserviert. Deshalb enthält
die Sequenz der Primer wenigstens ein CpG-, TpG-, oder CpA-Dinukleotid.
MSP-Primer enthalten üblicherweise
relativ wenige Cytosine, da Cytosine durch die Bisulfit-Reaktion
umgesetzt werden. Wenn die Primer jedoch spezifisch für methylierte
Cytosin-Dinukleotide sind, werden Cytosin-Positionen in den Primer-Oligonukleotiden
konserviert.
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Das
Design methylierungsspezifischer Primer kann unter Verwendung von
Software, wie "Primo
MSP 3.4.", durchgeführt werden.
Es ist bevorzugt, dass das Design von methylierungsspezifischen
Primern gemäß der folgenden
Richtlinien durchgeführt
wird:
- • Primer
sollten wenigstens eine CpG-Stelle in ihrer Sequenz besitzen und
die CpG-Stelle sollte sich bevorzugt am äußersten 3'-Ende ihrer Sequenz befinden, um methylierte
DNA von unmethylierter DNA zu unterscheiden.
- • Primer
sollten eine minimale Anzahl von Nicht-CpG-Cytosinen in ihrer Sequenz besitzen, um
nur Bisulfit- umgesetzte DNA zu amplifizieren. Primer mit mehr Nicht-CpG-Cytosinen
sind bevorzugt, da die Bisulfit-Umsetzung in manchen Fällen unvollständig sein
kann.
- • Der
Primer-Satz für
methylierte DNA und der Satz für
unmethylierte DNA sollte die gleichen CpG-Stellen in seiner Sequenz
haben. Wenn zum Beispiel ein Forward-Primer für methylierte DNA diese Sequenz
hat: ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA, muss der Forward-Primer für unmethylierte DNA
auch die beiden CpG-Stellen wie der methylierte Forward-Primer haben.
Sie können
sich jedoch in ihrer Länge
und ihrer Startposition unterscheiden.
- • Beide
Primersätze
sollten eine ähnliche
Annealing-Temperatur
haben. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
sind alle Primer verlängert, insbesondere
mittels einer Polymerasereaktion. Wenn eine Polymerase verwendet
wird ist die resultierende doppelsträngige Nukleinsäure denaturiert,
bevorzugt mittels Wärmebehandlung.
Es werden aufeinander folgende Zyklen von Primer-Annealing, Extension
und Denaturierung entsprechend der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt, wie
im Stand der Technik bekannt ist.
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In
den obigen Ausführungsbeispielen
werden die von jedem der Primerpaare gebildeten Amplifikate gemessen
und die Menge der durch jeden Primer gebildeten Amplifikate wird
bestimmt.
-
Die
Amplifikationsreaktion (120) erzeugt Amplifikate von allen
Primer-Spezies, die von jenen unterscheidbar sind, die jeweils von
den anderen Primerpaaren gebildet werden. Deshalb ist es erforderlich,
dass jede Amplifikat-Spezies von anderen Amplifikat-Spezies beispielsweise aufgrund
ihrer Länge, Sequenz
oder mittels eines detektierbaren Markers (155) unterscheidbar
ist.
-
Wenn
die Amplifikate aufgrund ihrer Länge getrennt
werden, kann das durch jegliches chromatographische Mittel, das
im Stand der Technik bekannt ist (150), zum Beispiel Gel-Elektrophorese,
durchgeführt
werden. Die getrennten Fragmente können dann zum Beispiel durch
Anfärben
mittels Ethidiumbromid oder mittels Hybridisierung mit markierten Sonden
(Southern Blot) sichtbar gemacht werden und die Menge einer Amplifikat-Spezies
relativ zu einer anderen kann mittels der Größe der entsprechenden Banden
bestimmt werden. Bei der Bestimmung des Methylierungsgrads einer
jeden analysierten CpG-Position, kann dann die Menge einer Amplifikat-Spezies
im Verhältnis
zu einer anderen mittels der Größe der entsprechenden
Banden bestimmt werden.
-
In
einem weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel
kann die anschließende
Messung des Auftretens jeder Amplifikat-Spezies in der Lösung mittels
der Inkorporation einer detektierbaren Markierung (155)
durchgeführt
werden. Ausgeführt werden
kann dies durch Markierung jeder Primer-Spezies. Es können unterschiedliche
Formen von Markierungen verwendet werden, aber bevorzugt sind Fluoreszenzmarker,
Radionuklide oder abspaltbare Molekülfragmente, die eine spezifische Masse
besitzen, die in einem Massenspektrometer detektiert werden kann.
-
Üblicherweise
werden auf diesem Gebiet fluoreszent markierte Nukleinsäuren verwendet
und eine breite Auswahl von Fluoreszenzmolekülen ist für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet. Die Bindung des Fluoreszenzmarkers an die Primer ist im
Stand der Technik bekannt. Die einfache Bindung von Cy3- und Cy5-Farbstoffen an das
5'-OH der Primer
ist insbesondere für
Fluoreszenzmarkierungen geeignet. Cy3- und Cy5-Farbstoffe sind,
wie viele geeignete Fluoreszenz-Moleküle, kommerziell erhältlich.
Die Detektion (
145) der Fluoreszenz der hybridisierten
Sonden kann beispielsweise mittels eines konfokalen Mikroskops erfolgen. Alternativ
kann die Amplifikat-Synthese in Echtzeit mittels Fluoreszenzpolarisation
beobachtet werden, wie zum Beispiel in den deutschen Patenten
DE 101 04 938 und
DE 100 65 814 , K. Berlin
und J. Distler beschrieben.
-
Eine
große
Auswahl von Fluorophoren ist für die
Verwendung in Fluoreszenzpolarisationstechniken geeignet. Die Auswahl
geeigneter Fluorophore ist im Stand der Technik bekannt. Bevorzugte
Fluorophore schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf, 5'-Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxy-X-Rhodamin
(ROX), N,N,N',N',-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin
(TMR), BODIPY-Texasrot (BTR), CY5, CY3, FITC, DAPI, HEX und TET.
Die Länge
der Linker, die verwendet werden um die Fluorophore an die Basen der
Nukleinsäuren
zu binden, sollte minimal gehalten werden während maximale Steifheit erreicht
wird. Kurze und/oder steife Linker minimieren die Bewegung des Fluorophors
relativ zum Oligonukleotid, wodurch die Empfindlichkeit des Assays
erhöht
wird. Die Empfindlichkeit der Detektion der Fluoreszenzpolarisation
kann weiterhin erhöht
werden, indem die Rotationsbeweglichkeit der Bisulfit-behandelten
DNA oder des Primers durch Erhöhung
ihrer Masse verringert wird.
-
Im
Fall von Massen-Markierungen kann die Visualisierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI) oder unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
werden. MALDI-TOF ("time
of flight") Spektrometrie
ist insbesondere zur Analyse von Biomolekülen geeignet. Bei der MALDI-TOF-Spektrometrie
spielt die Auswahl der Matrix eine ganz besonders wichtige Rolle.
Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens kann mittels chemischer Modifizierung
der Amplifikate, durch die sie Peptiden ähnlicher werden, weiter erhöht werden. Phosphorthioat-Nukleinsäuren, bei
denen die üblichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thi ophosphate ersetzt sind, können unter Verwendung einfacher
Alkylierungsverfahren (I. G. Gut, S. Beck. A procedure for selective
DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids
Res. 25. April 1995; 23(8):1367–73)
in eine ladungsneutrale DNA überführt werden.
Die Kopplung eines Ladungs-Markers an die modifizierte DNA resultiert
in einem Anstieg der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, das
man für
Peptide ermittelt hat. Ein weiterer Vorteil des Ladungs-Taggings
ist die gesteigerte Stabilität
der Analyse gegenüber
Verunreinigungen, welche die Detektion unmodifizierter Substrate
wesentlich erschweren.
-
In
einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann der Detektionsschritt (145) für synthetisierte Amplifikate
gleichzeitig mit der Amplifikationsreaktion (120) durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann die PCR-Amplifikation
derart durchgeführt
werden, dass alle Amplifikate eine detektierbare Markierung tragen.
Es kann eine Auswahl von Markierungen, die im Stand der Technik
Standard sind, verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt
auf, Fluoreszenmarkern, insbesondere Fluoreszenzpolarisationsmarkern.
In diesem Ausführungsbeispiel
des Verfahrens werden die Amplifikate mittels Oligonukleotid-Sonden
detektiert, welche gleichzeitig mit der Amplifikation der Nukleinsäure-Probe
an die Bisulfit-behandelte
DNA hybridisieren.
-
Ein
insbesondere bevorzugtes Ausführungsbeispiel
dieses Verfahrens ist die Verwendung von fluoreszenz-basierter quantitativer
Real-Time-PCR (Held et al., Genome Res. 6:986–994, 1996, siehe auch United
States Pat. Nr.
6331393
B1 , Laird et al.). Es gibt zwei bevorzugte Ausführungsbeispiele
der Durchführung
dieses Verfahrens. Ein Ausführungsbeispiel,
bekannt als das TaqMan
TM-Assay, verwendet
eine doppelt-markierte fluoreszente Oligonukleotid-Sonde. Die TaqMan
TM-PCR-Reaktion nutzt die Verwendung eines
nicht verlängerbaren
abfragenden ("nonexten dible
interrogating")
Oligonukleotids, TaqMan
TM-Sonde genannt,
welche derart designed ist, dass sie an eine Target-Sequenz hybridisiert,
die sich zwischen den Forward- und
Reverse-Amplifikationsprimern befindet. Die TaqMan
TM-Sonde umfasst weiterhin
einen fluoreszenten "Reporter-Teil" und einen "Quencher-Teil", der kovalent gebunden
an einen Linker-Teil (z. B. Phosphoramidite) ist, welcher an die Nukleotide
des TaqMan
TM-Oligonukleotids gebunden ist.
Hybridisierte Sonden werden ausgetauscht und mittels der Polymerase
der Amplifikationsreaktion abgebaut, wodurch es zu einem Anstieg
der Fluoreszenz kommt. Zur Analyse der Methylierung in Nukleinsäuren im
Anschluss an die Bisulfit-Behandlung ist es weiterhin bevorzugt,
dass die Sonde methylierungsspezifisch ist, wie in Laird et al.
beschrieben wurde (hiermit in ihrer Gesamtheit als Referenz einbezogen),
auch bekannt als MethyLight
TM-Assay.
-
Die
zweite bevorzugte Ausführungsform
dieser Technologie ist die Doppelsonden-Technologie (LightcyclerTM). Jede Sonde trägt einen Fluoreszenz-Donor-
oder Fluoreszenz-Empfänger-Rest,
wobei die Hybridisierung zweier benachbarter Sonden durch einen
Anstieg fluoreszierender Amplifikationsprimer angezeigt wird. Diese
Technik kann auch derart angepasst werden, dass sie zur Methylierungsanalyse
von CpG-Dinukleotiden in den Amplifikaten geeignet ist.
-
Der
Methylierungsgrad wird an jeder CpG-Position aus dem Verhältnis zwischen
der Menge an Amplifikat, die von methylierten und nicht-methylierten
Primern an jeder analysierten CpG-Position gebildet wird, abgeleitet
(170).
-
In
dem zweiten bevorzugten Ausführungsbeispiel,
dargestellt in 3, werden mindestens drei Primer-Oligonukleotid-Paare
bei der Amplifikation verwendet. Extraktion (310), Bisulfit-Behandlung (315)
und Amplifikation (320) werden wie in der ersten Ausführungsform
durchgeführt,
die unter Bezugnahme auf 2 beschrieben wurde. Ein Primerpaar (330)
amplifiziert eine Referenz- Sequenz
und wenigstens zwei Primerpaare sind spezifisch für eine Target-CpG-Position
oder -Positionen (325). Von den Primerpaaren gebildete
Amplifikate werden detektiert und gemessen (345), wie es
für das
in 2 dargestellte Ausführungsbeispiel beschrieben
wurde (145). Es wird quantitative Echtzeit-Analyse (322)
wird zur Detektion und Messung von Amplifikaten (345) eingesetzt.
In Schritt (370) wird der Methylierungsgrad der zu analysierenden
Sequenz aus dem Verhältnis zwischen
der Menge an Amplifikat, das von jedem methylierungsspezifischen
Primer gebildet wird und der Menge an Amplifikat abgeleitet, das
vom Referenz-Primer gebildet wird.
-
In
einem dritten bevorzugten Ausführungsbeispiel
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus
eines CpG-Dinukleotids oder mehrerer CpG-Dinukleotide in einer Nukleinsäure-Probe
bereit. Die zu analysierende Nukleinsäure wird derart mit einem Umsetzungs-Agens
behandelt, dass Cytosin-Basen, die an der 5-Position unmethyliert sind, in Uracil
oder eine andere Base umgesetzt werden, die sich im Hinblick auf
ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Methylierungsspezifische
Primerpaare werden zur Amplifikation von einer Target-Nukleinsäure oder
mehrerer Target-Nukleinsäuren der
behandelten Nukleinsäure
und einer Referenz-Probe oder mehrerer Referenz-Proben verwendet.
Die Amplifikation wird mittels einer Polymerase-Enzymreaktion mit
Hilfe von einem methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid-Paar
oder zwei methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid-Paaren
pro CpG-Position durchgeführt,
so dass sich die durch jede Primerpaar-Spezies gebildeten Amplifikate
zumindest unterscheiden in Länge,
Sequenz oder einer detektierbaren Markierung, die ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Fluoreszenzmarkern, Massen-Markern und radioaktiven
Markern. Die durch die Primerpaare in jeder Probe gebildeten Amplifikate
werden detektiert und die Menge der durch jedes Primerpaar in jeder Probe gebildeten
Amplifikate werden gemessen. In dem Verfahren wird der Umfang der
Methylierung in der behandelten Sequenz an jeder analysierten CpG-Position
durch die Bestimmung der Menge an Amplifikat, das in der behandelten
Probe gebildet wurde, im Vergleich zur Menge an Amplifikat, das
in der beziehungsweise den Referenzprobe(n) für jedes Primerpaar gebildet
wurde, abgeleitet. In diesem Ausführungsbeispiel kann die methylierte
Version entweder eine vollständig
methylierte Version der zu analysierenden Sequenz oder eine vollständig unmethylierte Version
der zu analysierenden Sequenz sein. Es ist jedoch insbesondere bevorzugt,
dass beide Referenz-Proben verwendet werden. Die vollständig methylierte
Referenz-Probe kann
durch jedes verfügbare
Mittel hergestellt werden oder von einer kommerziellen Quelle bezogen
werden. In einem Ausführungsbeispiel
kann sie durch die Behandlung einer Nukleinsäure-Probe (aus klinischen Quellen
oder von kommerziellen Anbietern) mit dem Enzym SssI Methylase und
einem geeigneten Methyldonor-Co-Faktor wie S-Adenosylmethionin in einer geeigneten
Pufferlösung
(zum Beispiel Mss1-Puffer) bei einer geeigneten Temperatur (bevorzugt
37 Grad) über
einen geeigneten Zeitraum (beispielsweise, aber nicht begrenzt auf,
sechzehn Stunden) hergestellt werden. Die vollständig unmethylierte Referenz-Probe
kann durch jedes verfügbare
Mitte hergestellt werden oder von einer kommerziellen Quelle bezogen
werden. In einem Ausführungsbeispiel
kann sie mittels enzymatischer Amplifikation einer Proben-Nukleinsäure (aus
klinischen Quellen oder von kommerziellen Anbietern) unter Verwendung
von Standard-Mitteln, wie Polymerase-Kettenreaktion, hergestellt werden.
-
Die
Bisulfit-Behandlung der Test- und Referenz-Proben wird wie in den vorher beschriebenen Ausführungsbeispielen
durchgeführt.
Die behandelte Test-Probe und die Referenz-Probe(n) wird beziehungsweise
werden dann unter Verwendung von einem Primerpaar oder mehreren
Prim erpaaren amplifiziert. Es ist bevorzugt, dass jede CpG-Position unter Verwendung
von sowohl den methylierten strangspezifischen Primerpaaren (d.
h., worin der Primer ein CpG-Dinukleotid oder mehrere CpG-Dinukleotide umfasst),
als auch dem unmethylierten strangspezifischen Primerpaar (d. h.,
worin der Primer ein TpG- oder CpA-Dinukleotid oder mehrere TpG- oder CpA-Dinukleotide
umfasst) analysiert wird. Das Verfahren ist jedoch auch noch mittels
der Verwendung von nur einer Primer-Spezies durchführbar.
-
Das
Design von Primern für
die Amplifikation wird wie in vorher beschriebenen Ausführungsbeispielen
durchgeführt,
und auch die Amplifikationsbedingungen sind dort beschrieben.
-
Die
durch jedes Primerpaar in jeder Probe gebildeten Amplifikate werden
detektiert und die Menge der Amplifikate wird mittels Detektionsverfahren,
wie in vorhergehenden Ausführungsbeispielen, bestimmt.
Zur Quantifizierung werden die synthetisierten Amplifikate jeder
Probe dann relativ miteinander verglichen.
-
Der
Vergleich der Amplifikate wird dann analog zum zweiten Ausführungsbeispiel,
das oben beschrieben wurde, durchgeführt. In einem insbesondere
bevorzugten Ausführungsbeispiel
wird die Amplifikation in Echtzeit überwacht. Es wird eine erste
Kalibrierungskurve für
jede Primer-Spezies gezeichnet, wobei die Menge des Amplifikats
in jeder Probe (sowohl Referenz als auch behandelt) gegen die Zykluszahl
aufgetragen wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie
bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist,
bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische
Phase eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm
berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl,
bei welcher das Amplifikationssignal die Kreuzungslinie schneidet, und
der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der Probe vorgelegen
hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals (ausgedrückt als
Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration
direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen
können
unter Verwendung der "Fit Points"- und "Second Derivative
Maximum"-Verfahren
durchgeführt
werden. Das "Second
Derivative Maximum"-Verfahren
ist bevorzugt, wenn Proben mit einer großen Kopienzahl (über 1000
Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren
Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das "Fit Points"-Verfahren bevorzugt.
-
Wenn
ein Referenz-Primer eingesetzt wurde, werden die Amplifikate von
allen anderen Primerpaaren durch den Vergleich mit dem Amplifikat,
das durch den Referenz-Primer
synthetisiert wurde, normalisiert, wodurch ein relativer Vergleich
zwischen der in der Probe vorliegenden Menge methylierter gegenüber nicht-methylierter
Target-DNA ermöglicht wird.
-
In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
des Verfahrens, wird die Amplifikatmenge von jedem MSP-Primerpaar
mit der Amplifikatmenge, die von den anderen MSP-Primern synthetisiert
wurde und mit der Amplifikatmenge, die durch den Referenz-Primer
synthetisiert wurde, verglichen. Amplifikate aller anderen Primerpaare
werden durch den Vergleich mit dem Amplifikat, das durch den Referenz-Primer synthetisiert
wurde, normalisiert. Die Amplifikatmengen, die von jedem dieser
Primer sythetisiert wurden, werden dann relativ miteinander verglichen,
wodurch eine relative Quantifizierung des Methylierungsgrads in
einer ausgewählten
Region des Genoms ermöglicht
wird (370).
-
In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
des Verfahrens wird die Amplifikatmenge von jedem MSP-Primerpaar
mit der Amplifikatmenge, die von den anderen MSP-Primern synthetisiert
wurde, und mit Amplifikatmenge, die vom Referenz-Primer synthetisiert wurde, verglichen.
Durch den Ver gleich mit der Amplifikatmenge, die durch den Referenz-Primer gebildet wurde,
ist es möglich,
die Level der Methylierung an einer speziellen Position auf den
Level der Nicht-Methylierung zu normalisieren. Das Verfahren gestattet
es deshalb, sowohl quantitativ den Methylierungsgrad an einer spezifischen
Position zu bewerten, als auch den relativen Level der Methylierung an
einer spezifischen Position in einer ausgewählten Region des Genoms zu
ermitteln.
-
Die
oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele
können
auf verschiedene Anwendungen adaptiert werden. In einem Ausführungsbeispiel
kann das Verfahren verwendet werden, um den Methylierungsgrad an
einer spezifischen CpG-Dinukleotid-Position zu bestimmen. Dadurch wird
die Analyse heterogener Nukleinsäure-Proben – d. h.
Proben, die sowohl Nukleinsäuremoleküle, die an
der in fraglichen Position methyliert sind wie auch Nukleinsäuremoleküle, die
an der fraglichen Position unmethyliert sind, enthalten. Klinische
Proben fester Tumore, wie Brusttumore, bestehen häufig aus
multiplen Gewebetypen (d. h. Tumor- und umgebende Gewebe). Die Amplifikationsreaktion
wird unter Verwendung von zwei Primerpaaren pro CpG-Dinukleotid-Position
(wie bei einer Standard-MSP-Reaktion) durchgeführt. Ein
Primerpaar ist spezifische für
die methylierte Version des CG-Dinukleotids und enthält deshalb
ein CG an der fraglichen Position, und das andere Primerpaar ist
spezifisch für
die unmethylierte Version der fraglichen CG-Position und enthält deshalb
ein TG-Dinukleotid an der fraglichen Position. Amplifikation der
Nukleinsäure-Probe
unter Verwendung der methylierungs- und nicht-methylierungsspezifischen
Primer führt
zur Bildung einer gemischten Population von Amplifikaten, wobei
die relativen Level der Methylierung an den fraglichen CpG-Positionen
durch den Vergleich mit den Leveln der durch das Referenz-Primeroligonukleotid
synthetisierten Amplifikate bestimmt werden.
-
In
einem alternativen Ausführungsbeispiel kann
das beschriebene Verfahren für
die Untersuchung großer
Populationen, zum Beispiel bei wissenschaftlichen Untersuchungen
von gepoolten Proben eingesetzt werden. Indem Proben gepoolt und
unter Verwendung des beschrieben Verfahrens untersucht werden, ist
es möglich,
zeitsparend und wirtschaftlich das Auftreten von Methylierung an
den untersuchten CpG-Positionen in einer einzigen Reaktion zu ermitteln.
Ein anderes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel
schließt
ein Kit ein, das zur Durchführung
der hierin beschriebenen Polynukleotid-Amplifikationsreaktion geeignet
ist. Ein solches Kit kann (1) ein Umsetzungs-Agens, bevorzugt eine Lösung von
Natriumdisultit oder Hydrogensulfit, (2) mindestens zwei Paare Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation ders
Bisulfit-behandelten Nukleinsäuren,
(3) Reagenzien zur Durchführung
der Polynukleotid-Amplifikationsreaktion, wobei die Reagenzien Desoxynukleotidtriphosphate
und ein DNA-polymerisierendes Enzym einschließen, und (4) Anleitungen zur
Durchführung
der Amplifikationsreaktion und für
die spezielle Detektion der Amplifikate enthalten. Optional kann das
Kit weiterhin detektierbar markierte Oligonukleotid-Sondenmoleküle zur Verwendung
bei der Quantifizierung von Methylierung in den Proben enthalten.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die erfindungsgemäßen Aspekte
weiter.
-
Beispiel 1
-
Das
folgende Beispiel beschreibt die Analyse einer CpG-reichen Insel
in der 5'-Region
des Gens TPEF (NM 016192). Die Hypermethylierung dieser Region ist
früher
mit der Tumorgenese in Tumor-Zell-Linien in Zusammenhang gebracht
worden (Cancer Research 60, 4907-4912, 1. September, 2000).
-
DNA
kann unter Verwendung geeigneter kommerziell erhältlicher Kits, z. B. dem QiagenTM-Extrationskit, extra hiert werden. Die
DNA-Probe wird dann unter Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogensulfit,
Disulfit) gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren
(Olek et al. 1996) behandelt. Die Behandlung geschieht derart, dass
alle nicht methylierten Cytosine in der Probe in Thymidin überführt werden.
Im Gegensatz dazu verbleiben 5-methylierte Cytosine in der Probe
unmodifiziert. Der Methylierungsstatus wird mittels eines methylierungsspezifischen
Assays bestimmt, das für
die interessierende CpG-Insel designed wurde. Das CpG-Insel-Assay
deckt sowohl CpG-Stellen in den Primern als auch der TaqmanTM-artigen Sonde ab. Verfahren: Das für die methylierte
Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz der folgenden
Primer und Sonden ausgeführt:
Primer:
TTTTCGTCGTTTTAGGTTATCG (SEQ ID NR: 1);
Primer: TTTTTGTTGTTTTAGGTTATTGG
(SEQ ID NR: 2); und
Sonde: TTCGGACGTCGTTGTTCGGTCGATGT (SEQ
ID NR: 3). Das korrespondierende Assay, das spezifisch für die unmethylierte
Version der CpG-Insel ist, wird unter Einsatz der folgenden Primer
und Sonden ausgeführt:
Primer:
TTTTTGTTGTTTTAGGTTATTGG (SEQ ID NR: 4);
Primer: CATATGCTGTGAATAAATTAC
(SEQ ID NR: 5); und
Sonde: TTTGGATGTTGTTGTTTGGTTGATGT (SEQ
ID NR: 6). Die Reaktion wird unter den folgenden Assay-Bedingungen
durchgeführt:
Reaktionslösung:
(900 nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase;
200 μM dNTPs,
7 μl DNA,
in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen:
(95 °C 10
Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95 °C 15 Sekunden lang; 60 °C 1 Minute
lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen
Geräts,
wie dem "ABI PRISM
7700" Sequenz-Detektor, überwacht.
-
Die
relativen Amplifikatmengen, die gebildet werden dann verwendet,
um den relativen Level von methylierten gegenüber nicht methylierten Nukleinsäuren in
der Probe zu bestimmen.
-
Beispiel 2
-
Das
folgende Beispiel beschreibt die Analyse einer CpG-reichen Insel
in der 5'-Region
des Gens Calcitonin. Untersuchungen am Calcitonin-Gen haben offen
gelegt, dass Hypermethylierung der Promotor-Region des Gens in neoplastischen
Zellen verschiedener Krebstypen, insbesondere akuter Leukämie, vorliegt.
-
DNA
kann unter Verwendung geeigneter kommerziell erhältlicher Kits, z. B. dem QiagenTM-Extrationskit, extrahiert werden. Die
DNA-Probe wird dann unter Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogensulfit,
Disulfit) gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren
(Olek et al. 1996) behandelt. Die Behandlung geschieht derart, dass
alle nicht methylierten Cytosine in der Probe in Thymidin überführt werden.
Im Gegensatz dazu verbleiben 5-methylierte Cytosine in der Probe
unmodifiziert. Der Methylierungsstatus wird mittels eines methylierungsspezifischen
Assays bestimmt, das für
die interessierende CpG-Insel und ein Referenz-Fragment designed wurde.
-
Das
für die
methylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz
der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: CGGATACGATTTCGGGG
(SEQ ID NR: 7);
Primer: ATACGATAAACGCAACAACGAC (SEQ ID NR:
8); und
Sonde: ATTTGGAGTTTCGTGATTCGCGTTACGGA (SEQ ID NR: 9).
Das korrespondierende Assay, das spezifisch für die unmethylierte Version
der CpG-Insel ist, wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden
ausgeführt:
Primer:
TGGATATGATTTTGGGGTA (SEQ ID NR: 10);
Primer: ATATGATAAATGCAACAATGACAT
(SEQ ID NR: 11); und
Sonde: .ATTTGGAGTTTTGTGATTTGTGTTATGGA (SEQ
ID NR: 12).
-
Das
korrespondierende Referenz-Assay wurde unter Einsatz der folgenden
Primer und Sonden ausgeführt:
Primer:
TCCATATTCCAAACCCTATACCAAA (SEQ ID NR: 13);
Primer: TGGGATTGAGGGTAAGAGGGAT
(SEQ ID NR: 14). Die Reaktion wird unter den folgenden Assay-Bedingungen
durchge führt:
Reaktionslösung: (900
nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase;
200 μM dNTPs,
7 μl DNA,
in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen:
(95 °C 10
Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95 °C 15 Sekunden lang; 60 °C 1 Minute
lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen
Geräts,
wie dem "ABI PRISM
7700" Sequenz-Detektor, überwacht.
-
Die
Menge an methylierter Nukleinsäure
in der Tumor-Probe
wird durch Aufzeichnung einer ersten Kalibrierungskurve quantifiziert,
worin die Amplifikatmenge jeder Probe gegen die Zykluszahl aufgetragen
wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie
bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist,
bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische
Phase eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm
berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl,
bei welcher das Amplifikationssignal die Kreuzungslinie schneidet,
und der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der
Probe vorgelegen hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals
(ausgedrückt
als Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration
direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen können unter
Verwendung der "Fit
Points"- und "Second Derivative
Maximum"-Verfahren
durchgeführt werden.
Das "Second Derivative
Maximum"-Verfahren
ist bevorzugt, wenn Proben mit einer großen Kopienzahl (über 1000
Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren
Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das "Fit Points"-Verfahren bevorzugt.
-
Beispiel 3
-
Im
folgenden Beispiel wird das methylierungsspezifische Assay gemäß Beispiel
2 an drei verschiedenen Proben durchgeführt.
-
Eine
erste Probe wird aus einer Tumor-Probe erhalten und wird unter Verwendung
eines kommerziell erhältlichen
Kits, z. B. dem QiagenTM-Extraktionskit,
extrahiert.
-
Eine
zweite genomische DNA-Probe, kommerziell von Promega erhältlich,
wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens künstlich methyliert:
-
Reagenzien
-
- DNA
- SssI Methylase (Konzentration 2 Units/μl).
- SAM (S-Adenosylmethionin)
- 4,5 μl
Mss1-Puffer (NEB Buffer B+ (10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl,
0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 500 μg/ml BSA, 50 % Glycerin (pH
7,4 bei 25 °C)
pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,1 mg/ml BSA)
- dd Wasser (0,2 μm-filtriert
autoklaviert, DNasen, RNasen, Proteasen, Phosphatase-frei).
-
Verfahren
-
Die
Reagenzien werden vereinigt und bei 37 Grad 16 Stunden lang inkubiert.
Die Probe kann dann im Kühlschrank
gelagert werden (+4 °C).
-
Eine
dritte genomische DNA-Probe, kommerziell von Promega erhältlich,
wird mittels einer Polymerase-Reaktion
unter Verwendung der folgenden Reagenzien amplifiziert, um sicherzustellen, dass
in der Probe keine Methylierung vorhanden ist.
-
Alle
drei Proben werden dann gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren Bisulfit-behandelt.
-
Das
für die
methylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz
der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: CGGATACGATTTCGGGG
(SEQ ID NR: 7);
Primer: ATACGATAAACGCAACAACGAC (SEQ ID NR:
8); und
Sonde: ATTTGGAGTTTCGTGATTCGCGTTACGGA (SEQ ID NR: 9).
Das korrespondierende, für
die unmethylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz
der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TGGATATGATTTTGGGGTA
(SEQ ID NR: 10);
Primer: ATATGATAAATGCAACAATGACAT (SEQ ID NR:
11); und
Sonde: ATTTGGAGTTTTGTGATTTGTGTTATGGA (SEQ ID NR: 12).
-
Jede
der Reaktionen wird unter den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt: Reaktionslösung: (900
nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase; 200 μM dNTPs,
7 μl DNA,
in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen:
(95 °C 10
Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95 °C 15 Sekunden lang; 60 °C 1 Minute
lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen
Geräts,
wie dem "ABI PRISM
7700" Sequenz-Detektor, überwacht.
Die Menge an methylierter Nukleinsäure in der Tumor-Probe wird
durch Aufzeichnung einer ersten Kalibrierungskurve quantifiziert,
wobei die Amplifikatmenge jeder Probe gegen die Zykluszahl aufgetragen
wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie
bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist,
bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische Phase
eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm
berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl,
bei welcher das Amplifikationssignal die Kreuzungslinie schneidet,
und der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der
Probe vorgelegen hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals
(ausgedrückt
als Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration
direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen können unter
Verwendung der "Fit
Points"- und "Second Derivative
Maximum"-Verfahren
durchgeführt werden.
Das "Second Derivative
Maximum"-Verfahren
ist bevorzugt, wenn Proben mit einer großen Kopienzahl (über 1000
Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren
Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das "Fit Points"-Verfahren
bevorzugt.
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Andere
Aspekte der Erfindung werden im Rückblick auf die Beschreibung
bevorzugter erfindungsgemäßer Ausführungsbeispiele,
in Verbindung mit den beigefügten
Zeichnungen, offensichtlich werden. Die Erfindung wird jedoch durch
die angefügten Ansprüche dargelegt.
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Zusammenfassung
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Es
wird ein Verfahren beschrieben, welches die Analyse des Methylierungsgrades
innerhalb einer Nukleinsäure-Probe gestattet,
einschließlich
des Methylierungsgrades in den CpG-Inseln. Nach der Behandlung einer
Nukleinsäure-Probe
mit Bisulfit, zur Umwandlung von Cytosinen in Uracile, werden multiple
Spezies von gepaarten Oligonukleotid-Primern und optional methylierungsunempfindlichen
Reference-Primer-Paaren verwendet, um Zielsequenzen innerhalb der
Probe mittels methylierungsspezifischer PCR zu amplifizieren. Die
Amplifikation multipler Primerpaare wird mit der Verwendung der
Real-time-PCR kombiniert. Die Amplifikate der Primerpaare werden
nachgewiesen und durch Vergleichen quantifiziert, wobei es ermöglicht wird,
eine genauere, spezifischere und quantifizierbare Analyse des Methylierungsstaus
innerhalb complexer CpG Methylierungsmuster in den Nukleinsäure-Proben
zu erzielen. Primerpaare und ein Kit werden ebenfalls beschrieben.