DE10104938A1

DE10104938A1 - Fluorescence Polarisation 1

Info

Publication number: DE10104938A1
Application number: DE10104938A
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin; Juergen Distler
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2021-01-30
Also published as: AU2002249148A1; WO2002061124A2; EP1358358A2; US20040161763A1; WO2002061124A3; DE10104938B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, die folgenden Schritte umfassend: DOLLAR A (a) die genomische DNA wird in einer solchen Art chemisch behandelt, dass Cytosin zu Uracil oder einer gleichartigen Base bezüglich des Basenpaarungsverhaltens in der DNA-Duplex umgesetzt wird, 5-Methylcytosin bleibt jedoch unverändert; DOLLAR A (b) die chemisch behandelte DNA wird unter Verwendung von mindestens einer Oligonukleotid-Spezies (Typ A) als Primer in einer Polymerasereaktion amplifiziert; DOLLAR A (c) das Amplifikat wird mit einer oder mehreren Spezies von Fluorophor-markierten Nukleotiden und einer oder mehreren Oligonukleotid-Spezies (Typ B) in der Lösung belassen, worin das Typ B Oligonukleotid unter geeigneten Bedingungen mit seinem 3'-Ende direkt an oder bis zu 10 Basen von der zu untersuchenden Position entfernt, hybridisiert und worin genanntes Typ B Oligonukleotid zumindest teilweise nukleaseresistent ist; DOLLAR A (d) das hybridisierte Oligonukleotid (Typ B) wird mittels einer Polymerase durch mindestens ein Nukleotid verlängert, wodurch die Extension vom Methylierungsstatus der jeweiligen Cytosin-Position in der genomischen DNA-Probe abhängig ist; DOLLAR A (e) die Lösung wird mit einer Phosphodiesterase inkubiert, die geeignet ist, Nukleinsäuren zu verdauen, jedoch die Typ B Oligonukleotide und deren Extensionsprodukte unvollständig verdaut; DOLLAR A (f) die Fluoreszenzpolarisation der Lösung wird gemessen, wobei man für jeden ...

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in genomischer DNA, zur Verwendung in der Analyse von hohen Durchsatzmengen, Forschung oder klinischen Einrichtungen. Dieses Verfahren nutzt die Bi sulfitbehandlung und Fluoreszenzpolarisationsanalysetech niken aus.

Hintergrund der Erfindung

Die Beobachtungsebenen, die in den letzten Jahren in der Molekularbiologie studiert worden sind, haben sich auf Gene, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die Transkription der RNA zum Protein konzentriert. Es hat eine begrenztere Analyse der Regulationsmechanismen stattgefunden, die in Zusammenhang stehen mit der Gen kontrolle. Genregulation, zum Beispiel auf welcher Stufe der Entwicklung eines Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird und der gewebespezifische Charakter dieser Regulierung wir nicht so gut verstanden. Jedoch kann sie mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung des Gens oder Genoms kor reliert werden. Von dieser Beobachtung ist es sinnvoll abzuleiten, dass pathogene genetische Störungen aus ab weichenden genetischen Methylierungsmustern detektiert werden können.

Stand der Technik Methylierung und Krankheit

Die Bemühungen des Humangenom-Projektes sind auf die Se quenzierung des Humangenoms konzentriert. Es wird erwar tet, dass dieses bedeutenden therapeutischen und diagnos tischen Nutzen für die Behandlung von Krankheiten er bringt. Diese Bemühungen waren bisher jedoch außerstande, sich einem signifikanten Aspekt genetischer Störungen, dem epigenetischen Faktor, zuzuwenden. Es hat sich ge zeigt, dass die epigenetische Regulation der Gentranskription viele Störungen verursacht. Einer der signifikantesten, bisher identifizierten epigenetischen Mechanismen, ist die Methylierung von Cytosin gewesen. Die Methylierung von Cytosin in der 5-Position ist die einzige bekannte Modifikation von genomischer DNA. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche die DNA- Methylierung die DNA-Transkription beeinflusst, unbekannt sind, ist der Zusammenhang zwischen Krankheit und Methy lierung gut belegt worden. Insbesondere scheinen Methy lierungsmuster von CpG-Inseln innerhalb regulierender Be reiche des Genoms hoch gewebespezifisch zu sein. Daraus folgt daher, dass Missregulation von Genen durch Ver gleich ihres Methylierungsmusters mit phenotypisch "nor malen" Expressionsmustern vorhergesagt werden können. Die folgenden sind Krankheitsfälle, in Zusammenhang gebracht mit modifizierten Methylierungsmustern.

- Hals- und Nacken-Krebs (Sanchez-Cespedes, M. et al., "Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients", Cancer Res. 2000, Feb. 15; 60 (4): 892-5)
- Hodgkinsche Krankheit (Garcia, J. F. et al., "Loss of p16 protein expression associated with methyla tion of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease", Lab. invest. 1999 Dec; 79 (12): 1453-9)
- Magenkrebs (Yanagisawa, Y. et al., "Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability", Int. J. Cancer 2000, Jan. 1; 85 (1): 50-3)
- Prader-Willi/Angelmans Syndrom (Zeschnigh et al., "Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method", Human. Mol. genetics (1997) (6) 3pp 387-395)
- ICF Syndrom (Tuck-Muller et al., "CMDNA hypomethyla tion and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients", Cytogenet. Call. Genet. 2000; 89(1-2): 121-8)
- Dermatofibroma (Chen, T. C. et al., "Dermatofibroma is a clonal proliferative disease", J. Cutan Pathol. 2000, Jan. 27 (1): 36-9
- Hypertension (Lee, S. D. et al. "Monoclonal endothe lial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension", J. clin. In vest. 1998, Mar 1, 101 (5): 927-34
- Autismus (Klauck, S. M. et al. "Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet. 1997 Aug; 100 (2): 224-9
- Fragile X Syndrom (Hornstra, I. K. et al., "High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome", Hum. Mol. Genet. 1993 Oct, 2(10): 1659-65)
- Huntigtonsche Krankheit (Ferluga, J. et al., "Possi ble organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma", Med. hypotheses 1989 May; 29 (1); 51-4)

Alle obigen Dokumente werden hiermit als Referenz inkor poriert.

Der Stand der Technik umfasst zwei grundlegende Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern und Nukleinsäuren. Das erste betrifft ein Verfahren zur Analyse von Methy lierungsmustern an spezifischen Stellen im Genom. Das zweite betrifft ein Verfahren, das Fluoreszenzpolarisati on zur Analyse von Nukleinsäuren ausnutzt.

Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA

Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5- Methylcytosin repräsentiert den epigenetischen Parameter, welcher bis heute der am meisten untersuchte und am bes ten verstandene ist. Trotzdem ist die Charakterisierung dieses epigenomischen Parameters noch nicht auf gleicher Stufe mit der Genotypisierung von Zellen und Individuen. Es ließen sich noch weitere Verfahren für die massenhafte Analyse und Charakterisierung von Methylierungsmustern von Zellen entwickeln. Das inhaltsreichste Patent, das dieses Gebiet umfasst ist WO 99/28498, welches hiermit als Referenz inkorporiert ist. Genannte Erfindung stellt ein Mittel zur detaillierten Analyse von Methylierungs mustern bereit. Die offenbarte Erfindung bezweckt eine alternative Lösung unter Ausnutzen von Fluoreszenzpolarisations-Techniken in der Analyse von Methylierungsmustern bereitzustellen. Sie wird ein einfaches Methylierungsas say bereitstellen, besonders geeignet für eine klinische Umgebung mit mittlerem Durchsatz.

Standardverfahren der Sequenzanalyse wie Klonieren und PCR sind für die Analyse von Methylierungen ungeeignet, da kovalente Modifikationen an der DNA, wie Methylierun gen, nicht erhalten bleiben.

Es werden gegenwärtig drei Verfahren, für die Unterschei dung zwischen 5-Methylcytosin und dem nicht methylierten Cytosin in der DNA-Sequenz verwendet.

Das erste Verfahren benutzt Restriktionsenzyme. Restrik tionsendonukleasen schneiden DNA-Sequenzen an spezifi schen Orten, durch Erkennung einer spezifischen Sequenz, gewöhnlich 4-8 Basen lang. Diese Enzyme sind hochspezi fisch in Bezug auf die Sequenz, die sie erkennen. In ei nigen Fällen, bekannt als "methylierungs-sensitiv", wer den sie nicht an der methylierten Version der Erkennungs sequenz schneiden. Infolgedessen können methylierungs- sensitive Enzyme verwendet werden, um Methylierung inner halb von Restriktionsenzym-Stellen zu identifizieren.

Die Position der Schnitte kann durch Gel-Elektrophorese bestimmt werden, gefolgt von Blotting und Hybridisierung. Dieses Verfahren hat sich aus zwei Gründen nicht als nützlich für die effiziente Indentifikation von methy lierten CpG-Stellen im Genom erwiesen. Erstens sind die meisten CpG-Inseln, die methyliert sind, nicht innerhalb der Erkennungssequenz der meisten Restriktionsenzyme.

Zweitens ist die Empfindlichkeit dieses Verfahrens extrem niedrig (Bird, A. P.; Southern, E. M.; J. Mol. Biol. 118, 27-47). Die Empfindlichkeit kann durch Amplifikation der Region nach Restriktionsendonuklease-Verdau verbessert werden. Zwei Primer werden benutzt, welche die Erken nungsstelle des Enzyms flankieren. Im Falle dass der Ver dau stattfindet, wird sich die Amplifikation nicht ereig nen. Die Amplifikationsprodukte können dann durch Blot ting und Hybridisierung analysiert werden, um die Stelle des Schnitts zu identifizieren. In der Theorie kann die Auflösung dieser Technik ein Basenpaar sein. Weil sie je doch höchst arbeitsintensiv und kostspielig ist, ist sie keine praktische Lösung zur Analyse von Methylierungs mustern im großen Umfang (Shemer, R. et al., PNAS 93, 6371-6376).

Das zweite Verfahren nutzt das Sequenzierungsverfahren, entwickelt von Maxam Gilbert, zur 5-Methylcytosin- Identifikation aus. Die Technik schließt die partielle chemische Spaltung der gesamten DNA, gefolgt von Ligati on, Amplifikation und Hybridisierung ein. In der Theorie können Bereiche mit einer Größe von weniger als 1000 Ba senpaaren analysiert werden. Jedoch ist dieses Verfahren so kompliziert und unzuverlässig, dass es selten benutzt wird.

Bisulfit-Behandlung

Das bevorzugte Verfahren der Methylierungs-Analyse schließt eine chemische Modifikation der DNA-Sequenz ein. Das Verfahren basiert auf der Bisulfit-Umwandlung von Cy tosin zu Uracil. DNA wird denaturiert und dann unter Ver wendung einer Bisulfit-Lösung behandelt. Das resultiert in der Umsetzung von Cytosin zu Uracil, was die methy lierten Cytosine unmodifiziert lässt. Uracil reagiert als Analogon von Thymin zu Zwecken der Basenpaarung, im Ge gensatz zu Cytosin. Als ein Ergebnis der Bisulfit- Behandlung der DNA sind Stränge, die ursprünglich komple mentär zueinander waren, wobei die codierenden und Templat-Stränge nicht länger komplementär sind.

Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation eines jeden Bisulfit-behandelten Stranges können dann konstruiert werden. Enzymatische Amplifikation der Sequenz resultiert im Einbau von Thymin-Nukleotiden an den Positionen, die in der Originalsequenz Cytosin waren.

Amplifikation der mit Bisulfit-behandelten DNA, Bisulfit- spezifische Primer verwendend, resultiert in der Bildung eines komplementären Stranges, dessen Sequenz abhängig ist von Methylierungs-Status der genomischen Probe und demzufolge einzigartig gegenüber dem ursprünglichen kom plementären Strang vor der Bisulfit-Behandlung. Die Bi sulfit-Behandlung und nachfolgende Amplifikation resul tiert deshalb in der Bildung von 4 einzigartigen Nuklein säurefragmenten. Diese vier Stränge enthalten alle die selbe Information, voraussetzend dass die Methylierung symmetrisch gewesen ist, was heißt, dass beide Stränge der CpG-Position methyliert worden sind. Der Methylie rungs-Status jeder CpG-Position kann deshalb vier mal un abhängig bewertet werden.

Gebräuchliche Verfahren zur Bewertung des Methylierungs- Status einer in der CpG-Position mit Bisulfit umgesetzten Sequenz enthalten chromatographische Standard-Analysen, Hybridisierungsanalyse oder massenspektroskopische Analy se.

Alle Verfahren erfordern die Reinigung der PCR-Produkte, beispielsweise durch Gel-Elektrophorese, die auch direkt zur Analyse dienen kann. In der Hybridisierungsanlyse werden die Bisulfit-behandelten und PCR-amplifizierten Nukleinsäuren chemisch markiert und zu komplementären O ligonukleotiden hybridisiert. Die amplifizierten Fragmen te werden untersucht, zwei markierte Oligonukleotide ver wendend, eins davon ist spezifisch für unmethylierte DNA und deshalb CpG-haltig und ein anderes, spezifisch für methylierte DNA, welches kein CpG enthält. Die Hybridi sierung wird dann durch ein Assay für die Markierung de tektiert. Diese Form der Analyse kann in Form eines DNA- Arrays durchgeführt werden, das eine Analyse von hohen Durchsatzmengen erlaubt. Ein alternatives Verfahren, un ter Verwendung der MALDI Massenspektrometer-Analyse von Nukleinsäuren, ist von Kirpekar, F. et. al. "DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry", Nucleic Acid Re search: 26, 2354-9 beschrieben worden.

Fluoreszenz-Assays

Das offenbarte Verfahren stellt eine neue Anwendung für eine bestehende Form von Fluoreszenz-Assays bereit, um eine neuartige Lösung des Problems der Analyse von che misch modifizierter, methylierter genomischer DNA-Sequenz bereitzustellen.

Die Verwendung von Fluoreszenz-Techniken zur Analyse kleiner Biomoleküle ist wohlbekannt. Gegenwärtig gibt es vier kommerziell erhältliche Verfahren für die Röhrchenlumineszenz-Analyse (closed tube) enzymatischer Amplifikationsprodukte. Diese sind Taqman-, Molecular Beacons-, LightCycler- und Amplifluor-Assays. Alle basie ren auf dem Gebrauch von Fluoreszenzresonanzenergietrans fer (FRET). FRET ist eine Form von molekularem Energie transfer, wobei Energie zwischen Donor- und Akzeptor- Spezies übergeht. Energie geht strahlungslos zwischen ei nem Akzeptor-Molekül und einem Donor-Molekül über. Der Donor absorbiert ein Photon und überträgt dieses strah lungslos auf das Akzeptor-Molekül, und veranlasst es da durch zu fluoreszieren. Wenn zwei Fluorophore, deren An regungs- und Emissions-Spektren überlappen, einander sehr nahe sind, wird die Anregung eines Fluorophors diesen Licht emittieren lassen bei Wellenlängen, die vom zweiten Fluorophor absorbiert werden und ihn anregen und ihn dann wieder veranlassen zu fluoreszieren.

Alle Verfahren, basierend auf FRET, sind durch relativ hohe Signal-Rausch-Verhältnisse und ein gute Befähigung zwischen positiven und negativen Reaktionen zu unter scheiden, charakterisiert. Jedoch sind sie alle begrenzt in dem Sinne, dass entweder eine zweifach markierte Sonde oder Primer oder zwei separate Sonden pro Target verwen det werden müssen. Das kompliziert die Sonden-Gestaltung und -Synthese erheblich. Zusätzlich, weil sie alle Mar kierungen mit schnell abklingender Fluoreszenz und brei ten Emissionspeaks einsetzen, sind die Möglichkeiten zur Mehrfachdetektion begrenzt. Die Erfindung schlägt die Verwendung von Fluoreszenzpolarisation an Stelle von FRET vor.

Fluoreszenzpolarisation

Die meisten Fluoreszenz-Assays nutzen die Fluoreszenz transfereigenschaften von Donor- und Akzeptorgruppen aus, um die Eigenschaften kleiner Biomoleküle zu beobachten. Die Verwendung von Fluoreszenzpolarisations-Techniken war bis vor kurzem auf kleinere Analyte im Bereich von einem Molekulargewicht von ca. 1000 Dalton begrenzt. Diese ist hauptsächlich bei einer Zahl von Immunoassays und für die Messung von Mikroviskosität und molekularem Volumen be nutzt worden. Einer der Hauptvorteile der Fluoreszenzpo larisations-Techniken im Vergleich zu anderen Verfahren ist, dass sie die Analyse von homogenen Lösungen erlaubt, das heißt es besteht kein Bedarf an Reinigungsverfahren.

Der Begriff der Fluoreszenzpolarisation ist schon seit den Jahren ab 1920 bekannt gewesen. Es ist eine Messung von zeitgemittelten Rotationsbewegungen von fluoreszie renden Molekülen.

Die Fluoreszenzpolariations-Technik erlaubt die Beobach tung von Änderungen in den Rotationseigenschaften von Mo lekülen in einer Lösung. Moleküle in Lösung rotieren und taumeln um vielfache Achsen. Fluoreszenzpolarisation be ruht auf der Eigenschaft, dass linear polarisiertes Licht durch ein stationäres fluoreszierendes Molekül emittiert wird. Wenn linear polarisiertes Licht verwendet wird, um ein fluoreszierendes Molekül zu bestrahlen, wird das Mo lekül linear polarisiertes Licht zwischen Anregung und Emission nur dann emittieren, wenn es stationär ist. Größere Moleküle, d. h. solche von größerem Molekulargewicht und/oder Volumen, taumeln langsamer um ihre Achsen als kleinere Moleküle. Da der Grad an Polarisation des durch das fluoreszierende Molekül emittierte Licht von dem Grad der Bewegung der Moleküle abhängig ist, ist es möglich zwischen kleineren und größeren Molekülen zu unterschei den, basierend auf dem Grad der Polarisierung des Lichts.

In Fluoreszenzpolarisations-Techniken, wird das fluores zierende Molekül zuerst durch polarisiertes Licht ange regt. Die Polarisation der Emission wird gemessen durch Messung der relativen Intensität der Emission (i) paral lel zur Ebene des polarisierten Anregungslichts und (ii) senkrecht zur Ebene des polarisierten Anregungslichts. Eine Änderung in der Taumelrate aufgrund einer Änderung in Größe und/oder Starrheit wird begleitet von einer Än derung im Verhältnis zwischen der Ebene des polarisierten Lichts und der Ebene der emittierten Fluoreszenz, d. h. einer Änderung in der Fluoreszenzpolarisation. Die beo bachtete FP einer Spezies wird durch die Perrin-Gleichung beschrieben und ist abhängig vom Verhältnis der rotatori schen Relaxationszeit und der Fluoreszenz-Lebensdauer.

Fluoreszenzpolarisation (im weiteren als FP bezeichnet) wird als Verhältnis von polarisiertem zu nicht polari siertem Licht ausgedrückt. Als solches hat es einen ent scheidenden Vorteil gegenüber anderen Formen der Fluores zenzdetektion, da es unabhängig ist von der anfänglichen Fluoreszenzkonzentration in der Lösung. So lange die Men ge an Fluoreszenz noch deutlich detektierbar ist, können exakte Ergebnisse gegeben werden. Die FP-Differenz zwi schen komplett gebundener und komplett ungebundener DNA stellt den vollständigen dynamischen Bereich der FP dar. So lange eine statistisch signifikante Differenz auf die Wechselwirkung niedermolekularer, Fluorophor-markierter Nukleotide und solchen, eingebaut in größere Nukleinsäu remoleküle zurückgeführt werden kann, kann FP eine nütz liches Verfahren zur Detektion von chemischen Wechselwir kungen sein. Jedoch wird es aufgrund der lokalen Bewegung des Fluorophors vielleicht nicht immer möglich sein, die Werte für die Reaktionen vorauszusagen und es wird erfor derlich sein, diese empirisch abzuleiten.

Für ein System in welchem ein Fluorophor an eine Nuklein säure mit geringem Molekulargewicht oder Volumen gebunden ist und dann in einen Oligonukleotid-Primer, hybridisiert mit einer größeren Nukleinsäure, eingebaut wird, kann die beobachtete Fluoreszenz (P) wie folgt beschrieben werden:

P = P_max [NTP]b + P_min ([NTP]i - [NTP]b)

worin P_max die beobachtete Polarisation für Fluoreszenz- markierte NTPs ist, die in den Oligonukleotid-Primer ein gebaut wurden. P_min ist die beobachtete Polarisation des nicht eingebauten, Farbstoff-markierten dNTPs, wobei [NTP]i die anfängliche Konzentration des Fluoreszenzfarb stoff-markierten dNTPs ist und [NTP]b ist die Konzentra tion des eingebauten Farbstoff-markierten dNTP.

Es ist klar, dass Fluoreszenzpolarisation alle Verfahren der Analyse von polarisiertem Licht einschließt, das von einer Fluorophor-Gruppe emittiert wird, die an ein dNTP gebunden oder in einer Polynukleotidgruppe vereinigt ist. Das ist Stand der Technik und wird von M. E. Jolley, J. Analytical Toxicology 1981 (5) 236-240 beschrieben, was hiermit als Referenz integriert wird.

Die Anwendung von FP-Techniken zur Nukleinsäure-Analyse wurde in der Patentanmeldung EP 0382433 B1 offenbart, die hiermit als Referenz integriert wird. Der Gebrauch von FP zur Nukleinsäuresequenz-Analyse wurde in den Patentveröf fentlichungen WO 92/18650 und WO 00/11220 offenbart, wel che hiermit als Referenz integriert werden, und welche im Stand der Technik bekannt sind. Jedoch ist die Anwendung der Fluoreszenzpolarisation als ein Werkzeug zur Analyse von DNA-Methylierungsmustern bisher nicht bekannt. Die Aufgabe der Erfindung liegt in der Analyse dieser spe ziellen Form von Nukleinsäure-Sequenzen. Die Analysever fahren sind gegenwärtig nur unter Verwendung von Chroma tographie-, Hybridisierungs- und MALDI Massenspektrome ter-Techniken möglich.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion von DNA- Methylierungsmustern. Der Stand der Technik besteht aus verschiedenen Verfahren zur Analyse von mit Bisulfit um gewandelten genomischen Sequenzen. Jedoch ziehen alle zwangsläufig ein zweistufiges Verfahren nach sich, worin die Bisulfit-Umsetzung von einer PCR-Amplifikation und nachfolgender Analyse gefolgt wird. Alle gegenwärtigen Analyse-Verfahren erfordern die Reinigung der Nukleinsäu re-Produkte nach der enzymatischen Amplifikation, gewöhn lich durch eine Form von Gel-Elektrophorese. Die vorlie gende Erfindung stellt eine signifikante Verbesserung des Standes der Technik bereit, indem die Bisulfitsequenz- Analyse in homogener Lösung ausgeführt werden kann. Dies gestattet die Analyse der Sequenz im geschlossenen Röhr chen, d. h. gleichzeitig mit oder nach Beendigung der en zymatischen Amplifikation, ohne dass eine weiteer Reini gung notwendig ist. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren an andere Diagnoseverfahren angepasst werden, beispielsweise high density DNA-Chip-Analyse. Das erfin dungsgemäße Verfahren stellt ein kosteneffektives Analy severfahren bereit. Die Ergebnisse sind Minuten nach Durchführung der methylierungsspezifischen Reaktion er hältlich.

Die vorgeschlagene Erfindung stellt eine innovative Lö sung des Problems dar, und zwar bereit durch Bereitstel lung einer neuartigen Anwendung bekannter Verfahren, wel che die folgenden Schritte umfasst:

a) Behandlung einer Nukleinsäure-Probe mit einer chemi schen Lösung, um das nicht methylierte Cytosin zu Uracil umzusetzen,
b) Amplifizierung der behandelten Nukleinsäure unter Ver wendung von Oligonukleotid-Primern, die für die umgesetz te Sequenz spezifisch sind,
c) Hybridisierung genannter Amplifikate mit Oligonukleo tid-Primern,
d) Verlängern der genannten Primer mittels Fluorophor- markierten Oligonukleotid-Sonden und Polymerase,
e) Verdauen der Reaktionslösung mit Phosphodiesterase,
f) Detektieren der Fluoreszenzpolarisation der markierten Nukleotide.

Detaillierte Beschreibung

Die Methodik umfasst die folgenden Schritte:
Zuerst muss die genomische DNA-Probe aus Gewebe oder zel lulären Quellen isoliert werden. Bei Säugetieren, vor zugsweise Menschen, kann die DNA-Probe aus jedem Gewebe genommen werden, von dem vermutet wird, dass die Target- Region innerhalb des Genoms zu exprimieren. Für Säugetie re, vorzugsweise Menschen, können solche Quellen Zell- Linien, Blut, Sputum, Faeces, Urin, Cerebrospinalflüssig keit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Ge webe aus Augen, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber sowie histologische Schnitte ein schließen. Die Extraktion kann mit den Mitteln erfolgen, die dem Fachmann geläufig sind, diese schließen die Ver wendung von Dertergentien, Aufschluss mit Ultraschallund Vortexing mit Glasperlen ein. In einem bevorzugten Aus führungsbeispiel findet die Extraktion jedoch in einer kleinen Menge von Öl statt, um den DNA-Verlust zu mini mieren. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische, doppelsträngige DNA zur Analyse ver wendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle Mittel im Stand der Technik bekannten Mittel, insbe sondere Restriktionsendonukleasen. Genannte Endonukleasen können Cytosin in der 5'-CpG-3'-Umgebung in ihrer Erken nungssequenz einschließen, so dass die DNA nur gespalten wird, wenn die Cytosine in der Erkennungssequenz in der unmethylierten Form vorliegen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die resultierenden Schnitt-Enden der gespaltenen DNA zu kur zen, doppelsträngigen Nukleinsäure-Sequenzen ligiert wer den. Genannte Sequenzen, im Folgenden als "Adaptoren" be zeichnet, können einzelsträngige überhängende Enden auf weisen. Die Adaptoren können z. B. mittels eines thermo labilen Ligaseenzyms, wie T4 DNA-Ligase, angehängt wer den. Die Ligase wird dann vor der chemischen Modifikation der DNA-Probe durch Hitze denaturiert. Die Adaptoren kön nen eine solche Sequenz aufweisen, dass sie trotz der chemischen Behandlung zur Unterscheidung von methylierten und unmethylierten DNA-Sequenzen unmodifiziert bleiben. Genannte Adaptoren können zur enzymatischen Amplifikation der DNA-Probe verwendet werden, indem sie ein Target für die Hybridisierung von Oligonukleotid-Primern darstellen. Die Verwendung von Adaptor-Molekülen ist im Stand der Technik wohl bekannt und wird deshalb nicht weiter ausge führt.

Die Proben-DNA wird dann chemisch behandelt, um die me thylierte Cytosin-Basen zu Uracil umzusetzen. Die chemi sche Modifikation kann z. B. (aber nicht begrenzt auf) mittels einer Bisulfit-Lösung erfolgen. Genannte chemi sche Umsetzung kann mittels jeder im Stand der Technik bekannten Form erfolgen. Das schließt die Modifikation in Agarose-Gel oder in denaturierenden Lösemitteln ein, ist aber nicht darauf beschränkt.

Wenn die chemische Modifikation durch Bisulfit-Behandlung der DNA stattfindet, können die folgenden Schritte erfol gen:
Die doppelsträngige DNA muss denaturiert werden. Dies kann durch Hitze-Denaturierung geschehen, die bei ver schiedenen Temperaturen ausgeführt wird. Für eine DNA mit hohem Molekulargewicht ist die Denaturierungs-Temperatur gewöhnlich größer als 90°C. Jedoch kann die Analyse von kleineren Fragmenten erfolgen, die keine so hohen Tempe raturen benötigen. Zusätzlich nimmt die Komplementarität zwischen den Strängen ab, wenn die Reaktion voranschrei tet und die Cytosin-Reste zu Uracil umgesetzt werden. Deshalb kann ein cyclisches Reaktionsprotokoll verschie dene Denaturierungs-Temperaturen umfassen.

Die Bisulfit-Umsetzung umfasst des weiteren zwei wichtige Schritten, der Sulfonierung des Cytosins und der nachfol genden Deaminierung. Die Reaktionsgleichgewichte sind bei zwei unterschiedlichen Temperaturen für jede Stufe der Reaktion auf der richtigen Seite. Berücksichtigt man die Reaktionskinetiken, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter cyclischen Bedingungen stattfindet, mit wechselnden Temperaturen, stattfindet. Die Temperaturen und Reakti onszeiten, bei denen jede Stufe ausgeführt wird, können entsprechend den spezifischen Anforderungen im Einzelfall variiert werden. Jedoch umfasst eine bevorzugte Variante des Verfahrens eine Temperaturänderung von 4°C (10 Minu ten) auf 50°C (20 Minuten). Diese Art der Bisulfit- Umsetzung ist Stand der Technik in Bezug auf WO 99/28498.

Diese chemische Umsetzung kann in jeder im Stand der Technik bekannten Form stattfinden. Das schließt ein, ist aber nicht begrenzt auf, die Modifizierung innerhalb von Agarose-Gelen, in denaturierenden Lösemitteln oder inner halb von Kapillaren.

Bisulfit-Umsetzung innerhalb von Agarose-Gel ist Stand der Technik und wurde von Olek et al. Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066 beschrieben. Das DNA-Fragment wird in Agarose-Gel eingebettet, und die Umsetzung von Cytosin zu Uracil findet mittels Hydrogensulfit und einem Radikal fänger statt. Die DNA kann dann amplifiziert werden, ohne dass weitere Reinigungsschritte nötig sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die DNA-Umsetzung ohne Agarose-Matrix stattfinden. Die DNA kann bei erhöhten Temperaturen mit Hydrogensulfit und ei nem Radikalfänger inkubiert werden. Diese Reaktion findet in einem organischen, denaturierenden Lösemittels statt. Beispiele für denaturierende Lösemittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Polyethylenglykoldialkyl Poly ethylenglykoldialkylether, Dioxan und substituierte Deri vate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre Alko hole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, DMSO oder THF.

In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Probe vor der chemischen Behandlung in eine beheizbare Kapillare überführt, die für kleine Moleküle permeabel ist. Die Re aktionsschritte der chemischen Modifikation können dann in den Kapillarenröhrchen, mittels Zugabe und Entfernen von Reagenzien durch verbundene Kapillaren ausgeführt werden.

Im Anschluss an die chemische Behandlung können die zwei DNA-Stränge nicht länger komplementär sein.

Fraktionen der so behandelten genomischen DNA werden dann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primer enzymatisch amplifiziert. Diese Oligonukleotide, welche zum Beispiel komplementär zum Adaptor-Molekül sein können, werden im weiteren als Typ-A-Primer bezeichnet. Die Länge und Ges taltung diser Primer kann für den zu analysierenden Be reich des Genoms spezifisch sein. Als solche ist eine große Auswahl an Primern zur Verwendung für diese Technik geeignet. Solche Primer-Gestaltung ist Stand der Technik. Die Amplifikation kann derartig sein, dass ein Strang des Doppelstranges bevorzugt amplifiziert wird, d. h. dass ein Strang in größerer Menge amplifiziert wird als der andere.

Die amplifizierte DNA-Lösung wird dann mit thermolabilen Enzymen behandelt. Überschüssige dNTPs werden unter Ver wendung von Phosphatase, z. B. alkalische Garnelen- Phosphatase, verdaut. Das Enzym wird dann mittels Hitze behandlung denaturiert.

Das besondere der Erfindung liegt in der Analyse der mit Bisulfit-behandelten DNA. Bei anderen Arten der Methylie rungs-Analyse ist ein Reinigungsschritt erforderlich, be vor die weitere Analyse der Methylierungsmuster stattfin den kann. Einer der Vorteile der Erfindung ist jedoch, dass die Amplifizierungsprodukte der Bisulfit-behandelten DNA in Lösung belassen werden können.

In einer Ausführungsform, betrifft die vorliegende Erfin dung ein Verfahren zur Detektion von methylierten Positi onen innerhalb Cytosin-reicher Nukleinsäure-Proben. In einer solchen Ausführungsform umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen der Oligonukleotid-Primer und der Nukleotide mit der DNA-Lösung. Ein variabler Teil der Nukleotide kann mit einem fluoreszierenden Anteil mar kiert sein. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt wei terhin den Gebrauch mehrerer fluoreszierender Spezies als Nukleotid-Markierungen, wobei jede Spezies einzigartig ist und unter Verwendung der Fluoreszenzpolarisation se parat beobachtet werden kann. In einer bevorzugten Aus führungsform ist die Konzentration der fluoreszierend markierten Nukleotide niedriger oder gleich zur erwarte ten Target-Stellen Konzentration ausgewählt. Der Oligo nukleotid-Primer ist derart gestaltet, um zwischen 1-10 Basen upstream der zu analysierenden Target-Stelle zu hybridisieren. Die Primer und Sequenzen können unter zur Hybridisierung führenden Bedingungen zusammengebracht werden. Die Abschätzung der geeigneten Hybridisierungsbe dingungen ist Stand der Technik. Die Primer werden dann unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Effizienz für Farbstoff-markierte Nukleotide, beispielsweise Ampli Taq, verlängert. In einer bevorzug ten Ausführungsform findet dann die Primer-Extension die ser Primer mit den Fluoreszenz-markierten Nukleotiden statt.

Nach der erfolgten Primer-Extensionsreaktion, wird die Reaktionslösung mit einer Phosphodiesterase behandelt, wobei dieses Enzym die DNA in einer 5'- zu 3'-Richtung verdaut. Der Verdau wird ausgeführt um alle nicht spezi fischen Nebenprodukte abzubauen, z. B. Typ-A-Primer, die am Amplifikat hybridisiert haben und mittels der Fluo rophor-markierten Nukleotide verlängert wurden. Der Ein bau der Fluorophor-markierten Nukleotide in ein solches Produkt führt zu einem Anstieg der Fluoreszenzpolarisati on und ergibt falsch-positive Ergebnisse. Die Typ-B- Oligonukleotide können derat gestaltet werden, dass eine blockierende Gruppe, wie ein Thiophosphat oder Me thylphosphonate oder ihre Alkylderivate ohnen daruf be schränkt zu sein, eine oder mehrere Basenpositionen be setzt. Wenn diese in der Folge der Phosphodiesterase aus gesetzt werden, findet der Verdau nur bis zur blockierten Basenposition statt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Typ-A-Oligonukleotid-Primer und deren sein Ex tensionsprodukt vollständig verdaut.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fluoreszenzpolarisation der fluoreszierend markierten Nukleotide vor dem Einbau in die DNA-Duplex gemessen. Die Fluoreszenzpolarisation des fluoreszierend markierten Nukleotids wird dann nach dem Einbau in die DNA-Duplex gemessen. Ein Anstieg der FP korelliert mit dem Einbau der markierten Nukleotide in die Primer-Extension. Dieses Verfahren erlaubt die Analyse von Nukleinsäuren, die ei ner Normierung von Reaktionsbedingungen nicht zugänglich sind.

In einer weiteren Ausführungsform können die Nukleotide die Form von Dideoxynukleotiden (ddNTPs) haben. In einer solchen Ausführungsform wird der Einbau der Dideoxynukle otid-Nukleotide in die Primer-Extension die Primer- Extensionsreaktion beenden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein variabler Anteil des Nukleotids ddNTPs sein.

Es wird in Betracht gezogen, alle Reaktionsschritte in einem einzelnen Behälter stattfinden zu lassen. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann die Reaktion an Feststoffoberflächen gebunden stattfinden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die genannte Primer-Extensionsreaktion durch eine Polymeraseketten reaktion ersetzt werden. In dieser Ausführungsform würden die markierten Nukleotide in die amplifizierten Sequenzen eingebaut werden und zu einem Anstieg der Fluoreszenzpo larisation führen. In einer solchen Ausführungsform ist es vorteilhaft, dass die Konzentration an markierten Nukleotiden im Überschuss zur ursprünglichen Target- Sequenz ist. In einer solchen Ausführungsform können die Nukleotide während mehrfacher PCR-Zyklen eingebaut wer den, um so einen Anstieg des Signals zu bewirken.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung die Form eines Kits annehmen. Die Komponenten dieses Kits sollten Behältnisse für folgende Substanzen in ausrei chender Menge umfassen, um die Ausführungsbeispiele aus zuführen:

1. Nukleinsäure-Primer
2. Fluorophor-markierte Nukleotide
3. Eine DNA-Polymerase, die mit dem Primer, Probe und Nukleotid reagiert, um eine 3'-Extension eines Polynukleo tids zu erzeugen
4. Gebrauchsanweisung
5. Reagenzien für die Bisulfit-Umsetzung der Proben-DNA zur Bisulfit-Sequenz

Der Begriff "Gebrauchsanweisung" sollte einen fassbaren Ausdruck abdecken, um die Reagenz-Konzentration für das Assay-Verfahren, Parameter wie die relative Menge der zu sammen zu führenden Reagenzien, Reaktionszeiten für Rea genzien/Proben-Mischungen, Temperatur, Puffer-Bedingungen und dergleichen zu beschreiben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein variabler Anteil der Nukleotide die Form von Dideoxy nukleotiden haben.

Zahlreiche Varianten von Fluorophoren sind zur Verwendung für Fluoreszenzpolarisations-Techniken geeignet. Die Aus wahl geeigneter Fluorophore ist Stand der Technik. Bevor zugte Fluorophore umfassen, aber sind nicht begrenzt auf 5'-Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX); N,N,N'N'-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin (TMR); BODIPY- Texas-Red (BTR), CY5, CY3, FITC, DAPI, HEX und TET. Die Anlagerung der fluoreszierenden Marker an das Nukleotid ist Stand der Technik. In einer bevorzugten Ausführungs form der Erfindung, wird die Länge der Linker, welche verwendet werden um den Fluorophor an die Basen der Nuk leinsäuren anzulagern, so klein wie möglich gehalten, um eine maximale Starrheit zu erreichen. Kurze und/oder starre Linker halten die Bewegung der Fluorophore, rela tiv zum Oligonukleotid, auf einem Minimum. Das ermöglicht eine Steigerung der Empfindlichkeit des Assays.

Die Empfindlichkeit des Assays kann auch dadurch erhöht werden, dass die rotatorische Bewegungsfähigkeit der Bi sulfit-behandelten DNA oder des Primers durch Erhöhung deren Masse verringert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Erhöhung der Masse durch Bindung der amplifizierten DNA an kleine Glaskugeln, kleine Latex- Kugeln sowie hydrophil-funktionalisierte Makromoleküle oder Dendrimere erreicht werden. Die Bindung solcher Mo leküle wird in der Patentanmeldung WO 0023785 beschrie ben, welche hiermit durch Bezugnahme Teil der Offenbarung wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Primer vor Hybridisierung mit Bisulfit-behandelter DNA an einer Oberfläche immobilisiert sein. Die Oberfläche oder feste Phase kann z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, eine Kugel (bead), ein Microplate-Well oder ein DNA-Chip sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kön nen auch andere Reagenzien der Reaktion, wie die Polyme rase, an die Oberfläche gebunden werden. In dieser Aus führungsform können alle Reagenzien an einer Microplate- Well fixiert werden, so dass das Assay einfach durch Zu gabe geeigneter Puffer und der Bisulfit-behandelten DNA- Probe ausgeführt werden kann.

Es wird vorausgesetzt, dass dieses Verfahren für die Ana lyse genomischer DNA-Proben mit hohem Durchsatz verwendet wird. Deshalb umfassen die Ansprüche auch ein Verfahren zur Analyse von Daten unter Verwendung von Rechneranla gen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann diese Vor richtung eine oder mehrere Datenbanken umfassen. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrich tung einen oder mehrere "lernende Algorithmen" umfassen.

Beschreibung der Diagramme

Fig. 1: Inkorporations-Assay:
A - Genomisches DNA-Fragment, worin die Target-Sequenz methyliert ist;
B - Genomisches DNA-Fragment, worin die Target-Sequenz nicht methyliert ist.

Die genomische DNA wird chemisch so modifiziert, dass un methylierte Cytosin-Basen zu Uracil (1) umgesetzt werden. Die Target-Stelle wird durch Polymerasekettenreaktion (2) amplifiziert. Die Amplifikation kann so durchgeführt wer den, dass nur ein Strang amplifiziert wird. Die amplifi zierte Sequenz unterscheidet sich von genomischer Sequenz dadurch, dass methyliertes Cytosin durch Thymin ersetzt wird, weshalb die doppelten Stränge der DNA nicht länger komplementär sein können.

Die überschüssigen Nukleotide können dann mittels einer Phosphatase (3) verdaut werden. Der Oligonukleotid-Primer (5) und Farbstoff-markierte Nukleotide (6) werden dann mit dem Amplikon in Kontakt gebracht. Der Primer wird mit dem Amplikon hybridisiert, und zwar in einem Abstand von 1-10 Basen zur der Stelle, die analysiert werden soll und unter Verwendung von Farbstoff-markierten Nukleotiden (7) verlängert. Die Reaktionslösung wird mittels Phospho diesterase verdaut und die Fluoreszenzpolarisation einer jeden Markierung gemessen (8).

Fig. 2: Messung der Fluoreszenzpolarisation:
Nicht polarisiertes Licht (1) einer Lichtquelle (2) wird durch Polarisations- und Farbfilter (3) geleitet. Das li near polarisierte Licht (4A) wird dann vor dem Nukleotid- Einbau durch die Reaktionslösung geleitet. Das polari sierte Licht regt den Fluoreszenzmarker (5), gebunden an das Nukleotid (6), derart an, dass der Fluoreszenzmarker Licht emittiert (7). Da das Nukleotid frei in Lösung ist, hat dieses und der Fluoreszenzmarker ein hohes Maß an Be wegung, und die Emissionen sind nicht polarisiert (7).

Das markierte Nukleotid wird dann in eine größere Nuk leinsäure (8) eingebaut. Aufgrund des Anstiegs des Mole kulargewichts hat der Fluoreszenzmarker jetzt ein gerin geres Maß an Bewegung. Daher weisen die Emissionen (9) einen höheren Grad an Polarisation auf, wenn die Anregung durch linear polarisiertes Licht (4B) erfolgt. Die Emis sionen werden dann durch Polarisations- und Farbfilter geleitet (10). Die Emissionen werden mittels eines Fluo rimeters gemessen (11).

Fig. 3: Phosphodiesterase-Verdau von Nebenprodukten:
Das Amplifikat (1) mit der Target-Stelle (2) wird mit ei nem Typ-B-Oligonukleotid-Primer (3) hybridisiert. Das Typ-B-Oligonukleotid (3) trägt eine Gruppe (4), die den Nuklease-Verdau blockiert, und das Oligonukleotid (3) wird mittels Fluoreszenz-markierten Nukleotiden (5A) ver längert. Ein Typ-A-Oligonukleotid (6) aus einer vorherge henden Reaktion hat sich auch an das Amplifikat angela gert und ist mittels fluoreszenzmarkierter Nukleotide (5B) verlängert worden, was zu einem Anstieg der Fluoreszenzpolarisation führt, die unabhängig vom Status der Target-Stelle ist.

Die Reaktionslösung wird mittels Phosphodiesterase (7) verdaut, die vom 5'-Ende zum 3-Ende verdaut. Das Typ-A- Primer-Nebenprodukt wird vollständig verdaut (8), die Fluoreszenz-markierten Nukleotide werden in die Lösung freigesetzt und die Fluoreszenzpolarisation verringert sich. Das Typ-B-Oligonukleotid-Produkt wird nur teilweise verdaut (9), da der vollständige Verdau durch die Gruppe (4) blockiert ist. Da die Fluoreszenz-markierten Nukleo tide noch immer in einem größeren Molekül eingebaut sind, ist die Fluoreszenzpolarisation hoch.

Referenzen Artikel

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Patente

EP 0382433 B1
WO 92/18650
WO 00/11220
WO 99/28498

Claims

1. Verfahren zur Analyse der Methylierung von Cytosin- Basen in genomischen DNA-Proben, die folgenden Schritte umfassend:

a) die genomische DNA wird in einer solchen Art chemisch behandelt, dass Cytosin zu Uracil oder ei ner gleichartigen Base bezüglich des Basenpaarungs verhaltens in der DNA-Duplex umgesetzt wird, 5- Methylcytosin bleibt jedoch unverändert;
b) die chemisch behandelte DNA wird unter Verwen dung von mindestens einer Oligonukleotid-Spezies (Typ A) als Primer in einer Polymerasereaktion amplifiziert;
c) das Amplifikat wird mit einer oder mehreren Spe zies von Fluorophor-markierten Nukleotiden und einer oder mehreren Oligonukleotid-Spezies (Typ B) in der Lösung belassen, worin das Typ B Oligonukleotid un ter geeigneten Bedingungen mit seinem 3'-Ende direkt an oder bis zu 10 Basen von der zu untersuchenden Position entfernt, hybridisiert und worin genanntes Typ B Oligonukleotid zumindest teilweise nukleasere sistent ist;
d) das hybridisierte Oligonukleotid (Typ B) wird mittels einer Polymerase durch mindestens ein Nukle otid verlängert, wodurch die Extension vom Methylie rungsstatus der jeweiligen Cytosin-Position in der genomischen DNA-Probe abhängig ist;
e) die Lösung wird mit einer Phosphodiesterase in kubiert, die geeignet ist Nukleinsäuren zu verdauen, jedoch die Typ B Oligonukleotide und deren Extensi onsprodukte unvollständig verdaut;
f) die Fluoreszenzpolarisation der Lösung wird ge messen, wobei man für jeden verwendeten Fluoreszenz marker den Grad der Polarisation bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin alle oder ein vari abler Anteil der Fluorophor-markierten Nukleotide Dideoxynukleotide sind.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei nach der Polymerase-Amplifikation der Bisulfit-DNA die Nukleotide der Polymerase-Reaktion mittels einer Phosphatase vermindert werden und die Phosphatase nachfolgend thermisch denaturiert wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, worin die Fluoreszenzpolarisation der Fluorophor-markierten Nukleotide und/oder Dideoxynukleotide vor dem Einbau in die DNA-Duplex und wiederum nach Einbau in die DNA-Duplex gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Primer- Extension durch einen Anstieg der Fluoreszenzpolari sation detektiert wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, worin genann tes Fluorophor ausgewählt wird aus der Gruppe beste hend aus 5'-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-X- rhodamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxy-X- rhodamin, BODIPY, TexasRed, Cy3, Cy5, FITC, DAPI, HEX und TET.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die DNA-Probe vor der Bisulfit-Behandlung mit Restrikti onsendonukleasen gespalten wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die DNA-Probe aus menschlichen Quellen, z. B. Zell- Linien, Blut, Sputum, Faeces, Urin, Gehirn, Ce rebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Augengewebe, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Schnitte und allen möglichen Kombina tionen, isoliert wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, worin die Fluoreszenzpolarisation der enzymatisch amplifizier ten DNA direkt in dem Behälter gemessen wird, in dem die Polymerase-Reaktion durchgeführt wurde.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, worin die Typ B Primer vor der Hybridisierung mit dem Amplifikat an Oberflächen immobilisiert werden.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, worin die Bi sulfit-behandelte DNA vor der Hybridisierung mit den Fluorophor-markierten Nukleotiden an einer Oberfläche immobilisiert wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 10 und 11, wobei die Oberfläche Silikon, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold um fasst.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die ü ber den Methylierungs-Status der Target-Stelle er zeugte Information einer Rechneranlage bereitge stellt wird, welche eine oder mehrere Datenbanken umfasst.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die ü ber den Methylierungs-Status der Target-Stelle er zeugte Information einer Rechneranlage bereitge stellt wird, welche eine oder mehrere lernende Algo rithmen umfasst.

15. Diagnostik-Kit umfassend:

a) einen oder mehrere Oligonukleotid-Primer, gestal tet, um mit Bisulfit-behandelter DNA-Sequenz inner halb von 1-10 Basen 3' von der Target-Stelle zu hybridisieren;
b) wenigstens eine Nukleotid-Spezies, worin jede Nukleotid-Spezies kovalent mit einem einzigartigen Fluorophor verknüpft ist;
c) DNA-Polymerase, die mit dem Oligonukleotid-Primer und Nukleotiden reagiert, um eine 3'-Extension des Primers herzustellen.

16. Kit nach Anspruch 14, worin alle oder ein variabler Anteil der Fluorophor-gebundenen Nukleotide in der Form von Dideoxynukleotiden vorliegen.