DE60201441T2

DE60201441T2 - Verfahren zur analyse der dna-methylierung unter verwendung von fluoreszenzpolarisation

Info

Publication number: DE60201441T2
Application number: DE60201441T
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2022-01-30
Also published as: WO2002061123A3; EP1390529A2; DE10104937A1; ATE278036T1; DE10104937B4; WO2002061123A2; AU2002238524A1; DE60201441D1; EP1390529B1; US20040121359A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in genomischer DNA, zur Verwendung in Analyseverfahren mit hohem Durchsatz, in der Forschung oder in klinischen Einrichtungen. Dieses Verfahren nutzt die Bisulfitbehandlung und Fluoreszenzpolarisationsanalysetechniken.
Hintergrund der Erfindung
Die in den letzten Jahren in der Molekularbiologie studierten Beobachtungsebenen konzentrierten sich auf Gene, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die Transkription der RNA in Proteine. Die Analyse der Regulationsmechanismen in Zusammenhang mit der Genkontrolle war stärker beschränkt. Die Genregulation, zum Beispiel auf welcher Stufe der Entwicklung eines Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird, und der gewebsspezifische Charakter dieser Regulierung sind weniger gut verstanden. Jedoch kann dies mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung des Gens oder Genoms korreliert werden. Aus dieser Beobachtung kann sinnvollerweise gefolgert werden, dass pathogene genetische Störungen mittels abweichender genetischer Methylierungsmuster detektiert werden können.
Stand der Technik
Methylierung und Krankheit
Die Bemühungen des Humangenom-Projektes konzentrieren sich auf die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Man erwartet, dass dies bedeutenden therapeutischen und diagnostischen Nutzen für die Behandlung von Krankheiten erbringt. Diese Bemühungen waren bisher jedoch außerstande, sich einem signifikanten Aspekt genetischer Störungen, dem epigenetischen Faktor, zuzuwenden. Es hat sich gezeigt, dass die epigentische Regulation der Gentranskription viele Störungen verursacht. Einer der signifikantes ten bisher identifizierten epigenetischen Mechanismen ist die Methylierung von Cytosin. Die Methylierung von Cytosin in der 5-Position ist die einzige bekannte Modifikation genomischer DNA. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche die DNA-Methylierung die DNA-Transkription beeinflusst, unbekannt sind, ist der Zusammenhang zwischen Krankheit und Methylierung gut belegt. Insbesondere scheinen Methylierungsmuster von CpG-Inseln innerhalb regulatorischer Bereiche des Genoms hoch gewebsspezifisch zu sein. Daraus folgt daher, dass die Fehlregulation von Genen durch Vergleich ihres Methylierungsmusters mit phänotypisch „normalen" Expressionsmustern vorhergesagt werden kann. Die folgenden Beispiele sind Krankheitsfälle, die mit modifizierten Methylierungsmustern assoziiert sind.

– Hals- and Nacken-Krebs (M. Sanchez-Cespedes et al., „Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients", Cancer Res. 2000 Feb. 15; 60 (4): 892–5)
– Hodgkinsche Krankheit (J. F. Garcia et al., „Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease", Lab. invest. 1999 Dec; 79 (12): 1453–9)
– Magenkrebs (Y. Yanagisawa et al., „Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability", Int. J. Cancer 2000 Jan 1; 85 (1): 50–3)
– Prader-Willi/Angeluran-Syndrom (Zeschnigh et al., „Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method", Human. Mol. genetics (1997) (6) 3, Seiten 387–395)
– ICF-Syndrom (Tuck-Muller et al., „CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients", Cytogenet. Call. Genet. 2000; 89(1–2): 121–8)
– Dermatofibrom (T. C. Chen et al., „Dermatofibroma is a clonal proliferative disease", J. Cutan Pathol. 2000 Jan; 27 (1): 36–9)
– Hypertonie (S. D. Lee et al. „Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension", J. clin. Invest. 1998 März 1, 101 (5): 927–34)
– Autismus (S. M. Klauck et al. „Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet. 1997 Aug; 100 (2): 224–9)
– Fragiles-X-Syndrom (I. K. Hornstra et al., „High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome", Hum. Mol. Genet. 1993 Okt., 2(10): 1659–65)
– Huntingtonsche Krankheit (J. Ferluga et al., „Possible organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma", Med. hypotheses 1989 Mai; 29 (1); 51–4)

Der Stand der Technik umfasst zwei grundlegende Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern und Nukleinsäuren. Das erste betrifft ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern an spezifischen Stellen im Genom. Das zweite betrifft ein Verfahren, das die Fluoreszenzpolarisation zur Analyse von Nukleinsäuren nutzt.
Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA
Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5-Methylcytosin repräsentiert den epigenetischen Parameter, welcher bis heute der am meisten untersuchte und am besten verstandene ist. Trotzdem ist die Charakterisierung dieses epigenomischen Parameters noch nicht auf gleicher Höhe mit der Genotypisierung von Zellen und Individuen. Es besteht noch Bedarf an der Entwicklung weiterer Methoden für Analyseverfahren mit hohem Durchsatz und zur Charakterisierung von Methylierungsmustern von Zellen. Das umfassendste Patent auf diesem Gebiet ist die WO 99/28498. Diese Erfindung stellt ein Mittel zur detaillierten Analyse von Methylierungsmustern bereit. Die offenbarte Erfindung soll eine alternative Lösung zur Analyse von Methylierungsmustern unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisations-Techniken bereitstellen. Sie soll ein einfaches Methylierungsassay bereitstellen, welches besonders für einen mittleren Durchsatz im klinischen Bereich geeignet ist.
Standardverfahren in der Sequenzanalyse wie Klonieren und PCR sind für die Methylierungsanalyse ungeeignet, da kovalente Modifikationen der DNA, wie Methylierungen, nicht erhalten bleiben.
Es gibt gegenwärtig drei Verfahren zur Unterscheidung zwischen 5-Methylcytosin und unmethylierten Cytosin in einer DNA-Sequenz.
Das erste Verfahren nutzt Restriktionsenzyme. Restriktionsendonukleasen schneiden DNA-Sequenzen an spezifischen Orten, durch Erkennung einer spezifischen, gewöhnlich 4–8 Basen langen Sequenz. Diese Enzyme sind hochspezifisch in Bezug auf die Sequenz, die sie erkennen. In einigen Fällen, bekannt als „methylierungs-sensitiv", schneiden sie nicht an der methylierten Version der Erkennungssequenz. Infolgedessen können methylierungs-sensitive Enzyme zur Identifizierung von Methylierungen innerhalb von Restriktionsschnittstellen verwendet werden.
Die Position der Schnitte kann durch Gelelektrophorese, gefolgt von Blotting und Hybridisierung bestimmt werden. Dieses Verfahren hat sich aus zwei Gründen nicht als nützlich für die effiziente Identifikation von methylierten CpG-Stellen im Genom erwiesen. Erstens liegen die meisten methylierten CpG-Inseln nicht innerhalb der Erkennungssequenz der meisten Restriktionsenzyme. Zweitens ist die Empfindlichkeit dieses Verfahrens extrem niedrig (A. P. Bird; E. M. Southern; J. Mol. Biol. 118, 27–47). Die Empfindlichkeit kann durch Amplifizierung der Region nach dem Restriktionsendonuklease-Verdau verbessert werden. Dazu werden zwei Primer benutzt, welche die Erkennungsstelle des Enzyms flankieren. Falls der Verdau stattfindet, erfolgt keine Amplifizierung. Die Amplifizierungsprodukte können dann durch Blotting und Hybridisierung analysiert werden, um die Schnittstelle zu identifizieren. Theoretisch kann die Auflösung dieser Technik ein Basenpaar betragen. Weil sie jedoch höchst arbeitsintensiv und kostspielig ist, ist sie keine praktische Lösung zur großtechnischen Analyse von Methylierungsmustern (R. Shemer et al., PNAS 93, 6371–6376).
Das zweite Verfahren nutzt das Sequenzierungsverfahren, nach Maxam und Gilbert zur Identifizierung von 5-Methylcytosin. Diese Technik umfasst die partielle chemische Spaltung der gesamten DNA, gefolgt von Ligation, Amplifizierung und Hybridisierung. Theoretisch können Bereiche mit einer Größe von weniger als 1000 Basenpaaren analysiert werden. Jedoch ist dieses Verfahren so kompliziert und unzuverlässig, dass es selten benutzt wird.
Ein drittes Verfahren nutzt die Bisulfit-Behandlung von genomischer DNA, gefolgt von Taqman-Analyse der modifizierten DNA (WO 00/70090).
Bisulfit-Behandlung
Das bevorzugte Verfahren zur Methylierungsanalyse ist mit einer chemischen Modifikation der DNA-Sequenz verbunden. Das Verfahren basiert auf der Umsetzung von Cytosin zu Uracil mittels Bisulfit. Die DNA wird denaturiert und dann mit einer Bisulfitlösung behandelt. Dies resultiert in der Umsetzung von Cytosin zu Uracil, wobei die methylierten Cytosine unmodifiziert bleiben. Uracil reagiert bei der Basenpaarung als Analogon zu Thymin statt zu Cytosin. Als Resultat der Bisulfit-Behandlung der DNA sind Stränge, die ursprünglich komplementär zueinander waren, die kodierenden und Templat-Stränge, nicht länger komplementär.
Nun können Oligonukleotid-Primer für die Amplifizierung eines jeden Bisulfit-behandelten Stranges konstruiert werden. Die enzymatische Amplifizierung der Sequenz resultiert im Einbau von Thymin-Nukleotiden an den Positionen, an denen sich in der Originalsequenz Cytosin befunden hatte.
Die Amplifizierung der mit Bisulfit-behandelten DNA unter Verwendung Bisulfit-spezifischer Primer resultiert in der Bildung eines komplementären Stranges, dessen Sequenz vom Methylierungsstatus der genomischen Probe abhängt und demzufolge einzigartig gegenüber dem ursprünglichen komplementären Strang vor der Bisulfit-Behandlung ist. Die Bisulfit-Behandlung und nachfolgende Amplifizierung resultiert deshalb in der Bildung von vier einzigartigen Nukleinsäurefragmenten. Diese vier Stränge enthalten alle dieselbe Information, unter der Voraussetzung, dass die Methylierung symmetrisch war, das heißt, dass beide Stränge an der CpG-Position methyliert waren. Der Methylierungsstatus jeder CpG-Position kann deshalb unabhängig voneinander viermal nachgewiesen werden.
Gebräuchliche Verfahren zum Nachweis des Methylierungsstatus einer in der CpG-Position mit Bisulfit umgesetzten Sequenz schließen chromatographische Standard-Analysen, Hybridisierungsanalysen oder massenspektrometrische Analysen ein.
Alle Verfahren erfordern die Reinigung der PCR-Produkte, beispielsweise durch Gelelektrophorese, die auch direkt zur Analyse dienen kann. Bei der Hybridisierungsanalyse werden die mit Bisulfit behandelten und PCR-amplifizierten Nukleinsäuren chemisch markiert und mit komplementären Oligonukleotiden hybridisiert. Die amplifizierten Fragmente werden untersucht, wobei zwei markierte Oligonukleotide verwendet werden, von denen eines für unmethylierte DNA spezifisch und deshalb CpG-haltig und das andere für methylierte DNA spezifisch ist und kein CpG enthält. Die Hybridisierung wird dann durch einen Nachweis der Markierung detektiert. Diese Art der Analyse kann in Form eines DNA-Arrays durchgeführt werden, was eine Analyse mit hohem Durchsatz ermöglicht. Ein alternatives Verfahren unter Verwendung von massenspektrometrischer MALDI-Analyse von Nukleinsäuren ist von F. Kirpekar et. al. „DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry" Nucleic Acid Research: 26, 2354–9 beschrieben worden.
Fluoreszenz-Assays
Das offenbarte Verfahren stellt eine neue Anwendung für ein bekanntes Fluoreszenz-Assay bereit, um eine neuartige Lösung des Problems der Analyse von chemisch modifizierten, methylierten genomischen DNA-Sequenzen bereitzustellen.
Die Verwendung von Fluoreszenz-Techniken zur Analyse kleiner Biomoleküle ist wohlbekannt. Gegenwärtig gibt es vier kommerziell erhältliche Verfahren für die Röhrchen lumineszenz-Analyse (closed tube) enzymatischer Amplifikationsprodukte. Dies sind Taqman-, Molecular Beacons-, LightCycler- und Amplifluor-Assays. Alle Verfahren basieren auf der Nutzung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET). FRET ist eine Form von molekularem Energietransfer, wobei Energie zwischen Donor- und Akzeptor-Spezies übertragen wird. Die Energie wird strahlungslos zwischen einem Akzeptor-Molekül und einem Donor-Molekül übertragen. Der Donor absorbiert ein Photon und überträgt dieses strahlungslos auf das Akzeptor-Molekül, wodurch dieses fluoresziert. Wenn zwei Fluorophore, deren Anregungs- und Emissions-Spektren überlappen, in enger Nachbarschaft zueinander sind, wird die Anregung eines Fluorophors dazu führen, dass er Licht solcher Wellenlängen emittiert, die vom zweiten Fluorophor absorbiert werden, wodurch dieser angeregt wird und im Gegenzug fluoresziert.
Alle auf FRET basierenden Verfahren zeichnen sich durch relativ hohe Signal-Rausch-Verhältnisse sowie eine gute Unterscheidbarkeit von positiven und negativen Reaktionen aus. Jedoch haben sie alle ihre Grenzen insofern, als entweder eine zweifach markierte Sonde bzw. ein zweifach markierter Primer oder zwei separate Sonden pro Target verwendet werden müssen. Das kompliziert die Sonden-Gestaltung und -Synthese ernsthaft. Zusätzlich sind die Möglichkeiten zur Mehrfachdetektion (Multiplexdetektion) begrenzt, weil immer Markierungsubstanzen mit schnell abklingender Fluoreszenz und breiten Emissionspeaks eingesetzt werden. Die Erfindung schlägt die Verwendung von Fluoreszenzpolarisation an Stelle von FRET vor.
Fluoreszenzpolarisation
Die meisten Fluoreszenz-Assays nutzen die Fluoreszenztransfereigenschaften von Donor- und Akzeptorgruppen aus, um die Eigenschaften kleiner Biomoleküle zu beobachten.
Der Gebrauch von Fluoreszenzpolarisations-Techniken war bis vor kurzem auf kleinere Analyte im Molekulargewichtsbereich von ca. 1000 Dalton begrenzt. Sie wurden hauptsächlich für eine Anzahl von Immunoassays und für die Messung von Mikroviskosität und molekularem Volumen verwendet. Einer der Hauptvorteile der Fluoreszenzpolarisations-Techniken im Vergleich zu anderen Verfahren ist, dass sie die Analyse von homogenen Lösungen erlauben, das heißt, dass keine Reinigungsverfahren notwendig sind.
Das Prinzip der Fluoreszenzpolarisation ist schon seit den 1920er Jahren bekannt. Es handelt sich um eine Messung von über die Zeit gemittelten Rotationsbewegungungen fluoreszierender Moleküle.
Die Fluoreszenzpolariations-Technik erlaubt die Beobachtung von Änderungen der Rotationseigenschaften von Molekülen in einer Lösung. Moleküle in Lösung rotieren und taumeln um zahlreiche Achsen. Die Fluoreszenzpolarisation beruht darauf, dass ein stationäres fluoreszierendes Molekül linear polarisiertes Licht emittiert. Wenn linear polarisiertes Licht zur Bestrahlung eines fluoreszierenden Moleküls verwendet wird, wird das Molekül nur dann linear polarisiertes Licht zwischen Anregung und Emission emittieren, wenn es stationär ist. Größere Moleküle, d. h. solche von größerem Molekulargewicht und/oder Volumen, taumeln langsamer um ihre Achsen als kleinere Moleküle. Da der Grad an Polarisation des durch das fluoreszierende Molekül emittierten Lichts von dem Grad der Bewegung des Moleküls abhängig ist, ist es möglich, auf der Grundlage des Polarisierungsgrades des Lichts zwischen kleineren und größeren Molekülen zu unterscheiden.
Bei Fluoreszenzpolarisations-Techniken wird das fluoreszierende Molekül zuerst durch polarisiertes Licht angeregt. Die Polarisation der Emission wird durch Messung der relativen Intensität der Emission (i) parallel zur Ebene des polarisierten Anregungslichts und (ii) senkrecht zur Ebene des polarisierten Anregungslichts gemessen. Eine Änderung der Geschwindigkeit der Taumelbewegung aufgrund einer Änderung der Größe und/oder der Starrheit geht mit einer Änderung im Verhältnis zwischen der Ebene des Anregungslichts und der Ebene der emittierten Fluoreszenz, d. h. einer Änderung in der Fluoreszenzpolarisation, einher. Die beobachtete FP einer Spezies wird durch die Perrin-Gleichung beschrieben und ist abhängig vom Verhältnis der rotatorischen Relaxationszeit und der Fluoreszenz-Lebensdauer.
Fluoreszenzpolarisation (im Folgenden als FP bezeichnet) wird als Verhältnis von polarisiertem zu nicht polarisiertem Licht ausgedrückt. Als solche hat sie einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Formen der Fluoreszenzdetektion insofern, als sie unabhängig von der anfänglichen Fluoreszenzkonzentration in der Lösung ist. So lange die Menge an Fluoreszenz noch deutlich detektierbar ist, können exakte Ergebnisse erhalten werden. Die FP-Differenz zwischen komplett gebundener und komplett ungebundener DNA repräsentiert den vollständigen dynamischen Bereich der FP. So lange eine statistisch signifikante Differenz abgeleitet werden kann aus der Wechselwirkung der mit niedermolekularen Fluorophoren markierten Nukleinsäuren und jener, die mit größeren Nukleinsäurernolekülen hybridisieren, kann FP ein geeignetes Verfahren zur Detektion von chemischen Wechselwirkungen sein. Jedoch kann es aufgrund der lokalen Bewegung des Fluorophors nicht immer möglich sein, die Werte für geeignete Proben voraus zu sagen, und sie müssten dann empirisch bestimmt werden.
In einem System, in welchem ein Fluorophor an eine Nukleinsäure mit geringem Molekulargewicht oder Volumen ge bunden ist und welches dann mit einer größeren Nukleinsäure hybridisiert wird, kann die beobachtete Fluoreszenz (P) wie folgt beschrieben werden: P = Pmax[OLIGO]b + Pmin ([OLIGO]i – [OLIGO]b)worin P_max die für mit der größeren Nukleinsäure hybridisierten fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide beobachtete Polarisation ist. P_min ist die beobachtete Polarisation der nicht eingebauten farbstoffmarkierten Oligonukleotide, wobei [OLIGO]i die Anfangskonzentration der fluoreszenzfarbstoffmarkierten Oligonukleotide und [OLIGO]b die Konzentration der eingebauten farbstoffmarkierten Oligonukleotide ist.
Es ist selbstverständlich, dass die Fluoreszenzpolarisation alle Verfahren zur Analyse von polarisiertem Licht einschließt, welches von einer an ein dNTP gebundenen oder mit einer Polynukleotidgruppe verbundenen fluorophoren Gruppe emittiert wird. Dies ist Stand der Technik und wird von M. E. Jolley, J. Analytical Toxicology 1981 (5) 236–240 beschrieben, wobei dieser Stand der Technik durch Bezugnahme Teil der Offenbarung sein soll.
Die Anwendung von FP-Techniken zur Nukleinsäure-Analyse wurde in der Patentanmeldung EP 0 382 433 B1 offenbart, die durch Bezugnahme Teil der Offenbarung sein soll. Die Anwendung von FP zur Nukleinsäuresequenz-Analyse wurde in den Patentveröffentlichungen WO 92/18650 und WO 00/11220 offenbart, welche hiermit durch Bezugnahme Teil der Offenbarung sein sollen und ist im Stand der Technik bekannt. Jedoch ist die Anwendung der Fluoreszenzpolarisation als ein Instrument zur Analyse von DNA-Methylierungsmustern unbekannt. Die Aufgabe der Erfindung liegt in der Analyse dieser speziellen Form von Nukleinsäure-Sequenzen. Die Analyseverfahren sind gegenwärtig nur mög- lich unter Verwendung von Chromatographie-, Hybridisierungs- und MALDI Massenspektrometer-Techniken.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion von DNA-Methylierungsmustern. Der Stand der Technik umfasst verschiedene Verfahren zur Analyse von mit Bisulfit umgesetzten genomischen Sequenzen. Jedoch bringen alle zwangsläufig ein zweistufiges Verfahren mit sich, worin sich an die Bisulfit-Umsetzung eine PCR-Amplifizierung und eine nachfolgende Analyse anschließen. Alle bekannten Analyse-Verfahren erfordern die Reinigung der Nukleinsäure-Produkte nach der enzymatischen Amplifizierung, gewöhnlich durch eine Form von Gel-Elektrophorese. Die vorliegende Erfindung stellt eine signifikante Verbesserung des Standes der Technik bereit, indem die Bisulfit-Sequenzanalyse in homogener Lösung ausgeführt werden kann. Das gestattet die Analyse der Sequenz in einem geschlossenen Röhrchen, d. h. gleichzeitig mit oder nach Beendigung der enzymatischen Amplifizierung, ohne dass eine weitere Reinigung notwendig ist. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren an andere Diagnoseverfahren, beispielsweise High Density DNA-Chip-Analyse, angepasst werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein kosteneffektives Analyseverfahren bereit. Die Ergebnisse sind Minuten nach Durchführung der methylierungsspezifischen Reaktion erhältlich.
Die vorgeschlagene Erfindung stellt eine innovative Lösung des Problems dar, und zwar durch Bereitstellung eines neuen Verfahrens, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Behandlung einer Nukleinsäure-Probe mit einer chemischen Lösung um das nicht methylierte Cytosin zu Uracil umzusetzen;
b) Amplifizieren dieser behandelten Nukleinsäure unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die für die umgesetzte Sequenz spezifisch sind;
c) Kontaktieren der amplifizierten Sequenz mit fluorophormarkierten Oligonukleotid-Sonden;
e) Hybridisieren einer fluorophormarkierten Oligonukleotid-Sonde an die amplifizierte Sequenz
f) Detektieren der Fluoreszenzpolarisation der markierten Oligonukleotid-Sonden.

Gemäß eines ersten Gegenstands der Erfindung wird ein verfahren zur Analyse der Methylierung spezifischer Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben bereitgestellt, worin die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(a) die genomische DNA wird chemisch derart behandelt, dass Cytosin zu Uracil oder einer bezüglich des Basenpaarungsverhaltens in der DNA-Duplex ähnlich reagierenden Base umgesetzt wird, 5-Methylcytosin jedoch im Wesentlichen unmodifiziert bleibt;
(b) die chemisch behandelte DNA wird amplifiziert, wobei mindestens ein Oligonukleotid (Typ A) als Primer in einer Polymerase-Reaktion verwendet wird und die beiden Stränge der Polymerase-Reaktionsprodukte in ungleichen Mengen hergestellt werden;
(c) das Amplifizierungsprodukt wird mit einem oder mehreren Paaren von Oligonukleotiden (Typ B) hybridisiert, welche an die Positionen hybridisieren, welche bezüglich ihres Methylierungs-Status in der genomischen DNA-Probe untersuchen werden sollen, wobei ein Oligonukleotid eines jeden Paares in jedem Fall bevorzugt hybridisiert, wenn in der genomischen DNA-Probe die Position methyliert war, während das andere Oligonukleotid des Paares bevorzugt hybridisiert, wenn die Position unmethyliert war. Jedes Oligonukleotid eines Paares ist mit einem einzelnen Fluoreszenzmarker markiert;
d) die Fluoreszenzpolarisations-Eigenschaften der Lösung werden gemessen, wobei man für jeden verwendeten Fluoreszenzmarker den Polarisationsgrad bestimmt.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass das hybridisierte Oligonukleotid mittels Deoxynukleotiden und einer Polymerase verlängert wird.
Es ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Fluoreszenzpolarisation der fluorophormarkierten Oligonukleotide vor der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt und nochmals nach der Hybridisierung mit dem Amplifizierugsprodukt gemessen wird. Hierbei ist es insbesondere bevorzugt, dass die Oligonukleotid-Hybridisierung durch einen Anstieg der Fluoreszenzpolarisation detektiert wird.
Es ist auch bevorzugt, dass dieses Fluorophor ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend 5'-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-X-rhodamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin, BODIPY, Texas-Red, Cy3, Cy5, FAM, FITC, DAPI, HEX und TET.
Erfindungsgemäß ist es äußerst bevorzugt, dass die DNA-Probe vor der Bisulfit-Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
Erfindungsgemäß ist es auch äußerst bevorzugt und ein Hauptmerkmal, dass die enzymatische Amplifizierung der chemisch behandelten DNA so durchgeführt wird, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
Bevorzugt ist es auch, dass die DNA-Probe vor der Bisulfit-Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
Es ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, dass die DNA-Probe aus Säugetier-Quellen, z. B. Zell-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Gehirn, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe, zum Beispiel Augengewebe, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und alle möglichen Kombinationen isoliert wird.
Es ist auch besonders bevorzugt, dass die Fluoreszenzpolarisation der enzymatisch amplifizierten DNA direkt in dem Behälter gemessen wird, in dem die Amplifizierungs-Reaktion durchgeführt wurde.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Typ-B-Oligonukleotid vor der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt an einer Oberfläche immobilisiert wird.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass mit Bisulfit behandelte DNA vor der Hybridisierung mit dem Typ-B-Oligonukleotid an eine Oberfläche gebunden wird. Dabei ist es auch bevorzugt, dass die Oberfläche Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold umfasst.
Erfindungsgemäß ist es auch bevorzugt, dass die über den Methylierungs-Status der Target-Stelle erzeugte Information einer Rechneranlage zugeführt wird, welche eine oder mehrere Datenbanken umfasst. Bevorzugt ist es auch, dass die über den Methylierungs-Status der Target-Stelle erzeugte Information einer Rechneranlage zugeführt wird, welche einen oder mehrere lernende Algorithmen umfasst.
Es wird auch ein Diagnosekit zur Detektion der Methylierung spezifischer Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben offenbart, das ein oder mehrere Paare fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide umfasst, welche so gestaltet sind, dass sie an eine Target-Stelle eines DNA-Templats hybridisieren.
Detaillierte Beschreibung
Die erfindungsgemäße Methodik umfasst die folgenden Schritte:
Zuerst muss die genomische DNA-Probe aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Bei Säugetieren, vorzugsweise Menschen, kann die DNA-Probe aus jedem Gewebe entnommen werden, von dem vermutet wird, dass die Target-Region im Genom exprimiert wird. Bei Säugetieren, vorzugsweise Menschen, können solche Quellen Zell-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Spinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Augen, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber sowie histologische Schnitte einschließen. Die Extraktion kann mit für den Fachmann geläufigen Mitteln erfolgen, einschließlich der Verwendung von Detergentien, Ultraschall und Vortexing mit Glasperlen. In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Extraktion jedoch in einer kleinen Menge Öl statt, um den DNA-Verlust zu minimieren. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische doppelsträngige DNA für die Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die resultierenden geschnittenen Enden der gespaltenen DNA zu kurzen, doppelsträngigen Nukleinsäure-Sequenzen ligiert werden. Diese Sequenzen, im Folgenden als „Adaptoren" bezeichnet, können einzelsträngige überhängende Enden aufweisen. Die Adaptoren können z. B. mittels eines thermo labilen Ligaseenzyms, wie T4 DNA-Ligase, angehängt werden. Die Ligare wird dann vor der chemischen Modifikation der DNA-Probe durch Hitze denaturiert. Die Adaptoren können eine solche Sequenz aufweisen, dass sie trotz der zur Unterscheidung von methylierten und unmethylierten DNA-Sequenzen eingesetzten chemischen Behandlung unmodifiziert bleiben. Diese Adaptoren können zur enzymatischen Amplifizierung der DNA-Probe verwendet werden, indem sie ein Target für die Hybridisierung von Oligonukleotid-Primern darstellen. Die Verwendung von Adaptor-Molekülen ist im Stand der Technik wohl bekannt und wird deshalb nicht weiter ausgeführt.
Die Proben-DNA wird dann chemisch behandelt, um die methylierten Cytosin-Basen zu Uracil umzusetzen. Die chemische Modifikation kann mittels im Stand der Technik bekannten üblichen Verfahren durchgeführt werden, z. B. (aber nicht begrenzt auf) Behandlung mit Bisulfitlösung.
In beiden Fällen resultiert die Behandlung in der Umsetzung von unmethylierten Cytosin-Basen zu Uracil, während methylierte Cytosin-Basen unmodifiziert bleiben.
Wenn die chemische Modifikation durch Bisulfit-Behandlung der DNA stattfindet, können die folgenden Schritte folgen.
Die doppelsträngige DNA muss denaturiert werden. Das kann durch Hitze- oder chemischen Denaturierung geschehen. Die Hitze-Denaturierung kann bei verschiedenen Temperaturen ausgeführt werden. Für hochmolekulare DNA ist die Denaturierungs-Temperatur gewöhnlich größer als 90°C. Jedoch kann die Analyse von kleineren Fragmenten erfolgen, die keine so hohen Denaturierungstemperaturen benötigen. Zusätzlich nimmt die Komplementarität zwischen den Strängen ab, wenn die Reaktion voranschreitet und die Cytosin- Reste zu Uracil umgesetzt werden. Deshalb kann ein cyclisches Reaktionsprotokoll verschiedene Denaturierungs-Temperaturen umfassen.
Die Bisulfit-Umsetzung umfasst des weiteren zwei wichtige Schritte, die Sulfonierung des Cytosins und die nachfolgende Deaminierung. Die Reaktionsgleichgewichte sind bei zwei unterschiedlichen Temperaturen für jede Stufe der Reaktion auf der richtigen Seite. Wenn man die Reaktionskinetiken berücksichtigt, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter cyclischen Bedingungen, mit wechselnden Temperaturen, stattfindet. Die Temperaturen und Reaktionszeiten, bei denen jeder Schritt durchgeführt wird, können je nach den spezifischen Anforderungen im Einzelfall variiert werden. Jedoch umfasst eine bevorzugte Variante des Verfahrens eine Temperaturänderung von 4°C (10 Minuten) auf 50°C (20 Minuten). Diese Art der Bisulfit-Umsetzung ist Stand der Technik in Bezug auf WO 99/28498.
Diese chemische Umsetzung kann in jeder im Stand der Technik bekannten Form stattfinden. Das schließt ein, ist aber nicht begrenzt auf, die Modifizierung innerhalb von Agarose-Gelen, in denaturierenden Lösemitteln oder innerhalb von Kapillaren.
Die Bisulfit-Umsetzung innerhalb von Agarose-Gelen ist Stand der Technik und wurde von Olek et al., Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064–5066 beschrieben. Das DNA-Fragment wird in Agarose-Gel eingebettet, und die Umsetzung von Cytosin zu Uracil findet mittels Hydrogensulfit und einem Radikalfänger statt. Die DNA kann dann amplifiziert werden, ohne dass weitere Reinigungsschritte nötig sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die DNA-Umsetzung ohne Agarose-Matrix stattfinden. Die DNA kann bei erhöhten Temperaturen mit Hydrogensulfit und ei nem Radikalfänger inkubiert werden. Diese Reaktion findet in einem organischen, denaturierenden Lösemittel statt. Beispiele für denaturierende Lösemittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Polyethylenglykoldialkyl Polyethylenglykoldialkylether, Dioxan und substituierte Derivate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, DMSO oder THF.
In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Probe vor der chemischen Behandlung in eine beheizbare Kapillare überführt, die für kleine Moleküle permeabel ist. Die Reaktionsschritte der chemischen Modifikation können dann mittels Zugabe und Entfernen von Reagenzien durch verbundene Kapillaren in den Kapillarenröhrchen ausgeführt werden.
Im Anschluss an die chemische Behandlung könnten die zwei DNA-Stränge nicht länger komplementär sein.
Fraktionen der so behandelten genomischen DNA werden dann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern enzymatisch amplifiziert. Diese Oligonukleotide, welche zum Beispiel komplementär zum Adaptor-Molekül sein können, werden im Folgenden als Typ-A-Primer bezeichnet. Die Länge und Gestaltung dieser Primer kann für den zu analysierenden Bereich des Genoms spezifisch sein. Als solche ist eine große Auswahl an Primern zur Verwendung für diese Technik geeignet. Diese Primer-Gestaltung ist Stand der Technik. Die Amplifizierung kann so sein, dass ein Strang des Doppelstranges bevorzugt amplifiziert wird, d. h. dass ein Strang in größerer Menge amplifiziert wird als der andere.
Das Besondere der Erfindung liegt in der Analyse der mit Bisulfit behandelten DNA. Bei anderen Arten der Methylie rungs-Analyse ist ein Reinigungsschritt erforderlich, bevor die weitere Analyse der Methylierungsmuster stattfinden kann. Einer der Vorteile der Erfindung ist jedoch, dass die Amplifizierungsprodukte der mit Bisulfit behandelten DNA in Lösung belassen werden können.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren ein, um eine methylierte Sequenz von einer unmethylierten Sequenz zu unterscheiden. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das die Analyse von Methylierungsmustern an CpG-Stellen und beliebigen regulatorischen Regionen innerhalb des Genoms ein. Im Anschluss an die PCR-Amplifizierung der mit Bisulfit umgesetzten Sequenz werden Oligonukleotide mit der mit Bisulfit behandelten DNA in Kontakt gebracht. Dieser Kontakt kann in jeder Form erfolgen. Die Oligonukleotide bestehen aus multiplen Paaren. Jedes dieser Oligonukleotid-Paare anneliert mit einer spezifischen CpG-Stelle, die innerhalb der Target-Sequenz analysiert werden soll. Jede Oligonukleotid-Spezies ist unter Verwendung eines einzigartigen Fluoreszenz-Markers kovalent markiert. Jeder Bestandteil eines jeden Paares spricht spezifisch auf eine bestimmte methylierungsspezifische, mit Bisulfit behandelte Konformation der Target-Stelle an. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Konzentration dieser markierten Oligonukleotide so berechnet werden, dass die Konzentration einer jeden Spezies nicht im Überschuss zur Konzentration der Target-DNA ist. Die Gestaltung der für die mit Bisulfit behandelten DNA-Sequenz spezifischen Oligonukleotide ist Stand der Technik.
Die Oligonukleotide und Amplifizierungsprodukte können dann unter Hybridisierungsbedingungen zusammen gebracht werden. Das ist Stand der Technik. Die Hybridisierungsbedingungen werden so gewählt, dass die Hybridisierung auf nur eine einzelne Oligonukleotid-Spezies an jede Target- CpG-Stelle begrenzt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert eine Spezies dieses Oligonukleotids an die Target-Sequenz. Die Fluoreszenzpolarisation wird dann für jeden Fluoreszenz-Marker gemessen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können diese Oligonukleotid-Sonden als Extensions-Primer für enzymatische Amplifizierung der Nukleinsäure verwendet werden. Nach der Hybridisierung des Oligonukleotids an die Target-Sequenz kann das Oligonukleotid durch Hinzufügen einer DNA-Polymerase und Nukleotiden verlängert werden. In dieser Ausführungsform führt die Erhöhung der Masse des hybridisierten Nukleotids zu einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit des Assays.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Fluoreszenzpolarisation der markierten Oligonukleotide vor der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt und nochmals nach der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt gemessen werden. Die Hybridisierung des Oligonukleotids kann dann durch einen Anstieg der Fluoreszenzpolarisation nach der Hybridisierung beobachtet werden. Dieses Verfahren erlaubt die Analyse von Nukleinsäuren, die einer Normierung der Reaktionsbedingungen nicht zugänglich sind.
Es wird auch ein Diagnosekit offenbart. Die Komponenten dieses Kits sollten Behältnisse für folgende Substanzen in ausreichender Menge umfassen, um die Beispiele auszuführen:

1) Reagenzien für die Bisulfit-Umsetzung der Proben-DNA zur Bisulfit-Sequenz;
2) Fluorophor-markierte Nukleinsäureoligonukleotide;
3) Gebrauchsanweisung.

Der Begriff "Gebrauchsanweisung" sollte einen fassbaren Ausdruck abdecken, um die Reagenz-Konzentration für das Assay-Verfahren, Parameter wie die relativen Mengen der zusammen zu führenden Reagenzien, Reaktionszeiten für Reagenzien/Proben-Mischungen, Temperatur, Puffer-Bedingungen und dergleichen zu beschreiben.
Zahlreiche Varianten von Fluorophoren sind zur Verwendung für Fluoreszenzpolarisations-Techniken geeignet. Die Auswahl geeigneter Fluorophore ist Stand der Technik. Bevorzugte Fluorophore umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, 5'-Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX); N,N,N'N'-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin (TMR), BODIPY-Texas-Red (BTR), CY5, CY3, FITC, DAPI, HEX und TET. Die Gestaltung geeigneter Oligonukleotide und ihre Synthese mit Fluoreszenz-Markern ist Stand der Technik. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Länge der für die Kopplung der Fluorophore an die Oligonukleotidbasen verwendeten Linker auf einem Minimum gehalten, um maximale Starrheit zu erreichen. Kurze und/oder starre Linker halten die Bewegung der Fluorophore, relativ zum Oligonukleotid, auf einem Minimum. Das ermöglicht eine Steigerung der Empfindlichkeit des Assays.
Die Empfindlichkeit des Assays kann auch dadurch erhöht werden, dass die rotatorische Bewegungsfähigkeit des Fluorophors durch Erhöhen der Masse der Typ-B-Oligonukleotide oder der DNA-Amplifizierungsprodukte begrenzt wird. Die Kopplung von Massen-Markern ist Stand der Technik und wird in der Patentanmeldung WO 0023785 detailliert beschrieben, welche hiermit durch Bezugnahme Teil der Offenbarung wird. Die vorliegende Erfindung umfasst zwei Verfahren, um dies zu erreichen. In einer ersten Ausführungsform wird das mit Bisulfit behandelte DNA-Amplifizierungsprodukt vor der Hybridisierung mit den fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden durch Anbindung an eine Oberfläche oder ein Makromolekül immobilisiert. Die DNA kann durch jede im Stand der Technik bekannte chemische oder physikalische Methode aufgebracht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren in inhomogener Art, d. h. unter Einschluss eines Trennungsschrittes durchgeführt werden. Nach der Hybridisierung der Oligonukleotid-Sonde an das Amplifizierungsprodukt und Messung der Fluoreszenzpolarisation kann die Sonde entfernt werden, zum Beispiel durch Hitze-Denaturierung der DNA-Duplex, gefolgt von Waschen. Die oberflächengebundene DNA kann dann an eine andere Oligonukleotid-Sonde hybridisiert werden. Dieses Verfahren kann vielfach wiederholt werden. Dieses Verfahren erlaubt die Analyse eines DNA-Fragments mittels multipler Sätze von Sonden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Typ-B-Oligonukleotide vor der Hybridisierung an einer Oberfläche oder festen Phase immobilisiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren in inhomogener Art, d. h. unter Einschluss eines Trennungsschritts durchgeführt werden. Nach der Hybridisierung des Amplifizierungsprodukts an die Oligonukleotid-Sonde und Messung der Fluoreszenzpolarisation kann das Amplifizierungsprodukt entfernt werden, zum Beispiel durch Hitze-Denaturierung der DNA-Duplex, gefolgt von Waschen. Die oberflächengebundenen Sonden können dann an ein anderes DNA-Fragment hybridisiert werden. Dieses Verfahren kann vielfach wiederholt werden. Dieses Verfahren erlaubt es, einen Satz von Oligonukleotid-Sonden für die Analyse von multiplen Sätzen von DNA-Fragmenten zu verwenden.
Die Messung der Fluoreszenzpolarisation kann unter Verwendung kommerziell erhältliche Fluorimeter durchgeführt werden. Es versteht sich, dass die Fluoreszenzpolarisation alle Verfahren einschließt, welche die Analyse von durch ein Fluorophor nach Anregung durch linear polarisiertes Licht emittiertem linear polarisiertem Licht umfassen.
Es wird vorausgesetzt, dass dieses Verfahren für die Analyse genomischer DNA-Proben mit hohem Durchsatz verwendet wird. Deshalb umfassen die Ansprüche auch ein Verfahren zur Analyse von Daten unter Verwendung einer Rechneranlage. In einer bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung eine oder mehrere Datenbanken umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung einen oder mehrere "lernende Algorithmen" umfassen.
Beschreibung der Diagramme
1: Hybridisierungs-Assay

A – Genomisches DNA-Fragment, Target-Sequenz methyliert.
B – Genomisches DNA-Fragment, Target-Sequenz nicht methyliert.

Die genomische DNA wird derart modifiziert, dass unmethylierte Cytosin-Basen zu Uracil umgesetzt werden (1). Die Target-Stelle wird durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert (2). Die Amplifizierung kann so durchgeführt werden, dass nur ein Strang amplifiziert wird. Die amplifizierte Sequenz unterscheidet sich von der genomischen Sequenz dadurch, dass methyliertes Cytosin durch Thymin ersetzt ist, weshalb die Doppelstränge der DNA nicht länger komplementär sein können.
Das Amplikon wird dann mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Paaren in Kontakt gebracht (3), in diesem Fall ROX und TMR. Die Fluoreszenzpolarisation der Marker wird dann gemessen (4). Das komplementäre Oligonukleotid wird dann an die Target-Stelle hybridisiert (5). Die Fluoreszenzpolarisation wird dann nochmals gemessen (6).
2: Messung der Fluoreszenzpolarisation
Nicht polarisiertes Licht (1) einer Lichtquelle (2) wird durch Polarisations- und Farbfilter geleitet (3). Das linear polarisierte Licht (4A) wird dann vor der Oligonukleotid-Hybridisierung durch die Reaktionslösung geleitet. Das polarisierte Licht regt den Fluoreszenzmarker (5), der an das Oligonukleotid gebunden ist (6), so an, dass der Fluoreszenzmarker Licht emittiert (7). Da das Oligonukleotid frei in Lösung ist, hat der Fluoreszenz-Marker ein hohes Maß an Bewegung, und die Emissionen sind nicht polarisiert (7). Die Fluoreszenzpolarisation von (7) kann dann gemessen werden. In einer solchen Ausführungsform werden die Emissionen durch Polarisations- und Farbfilter geleitet (10). Die Emissionen werden unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen (11).
Die Hybridisierungsbedingungen werden angewendet (8). Das markierte Oligonukleotid wird an eine längere Nukleinsäure (9) hybridisiert. Aufgrund des Anstiegs des Molekulargewichts hat der Fluoreszenz-Marker einen niedrigeren Grad an Bewegung. Wenn er durch linear polarisiertes Licht (4B) angeregt wird, weisen die Emissionen (10) daher einen höheren Polarisationsgrad auf. Die Emissionen werden dann durch Polarisations- und Farbfilter geleitet (11). Die Emissionen werden unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen (12).

Claims

Verfahren zur Analyse der Methylierung spezifischer Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden: (a) die genomische DNA wird chemisch derart behandelt, dass Cytosin zu Uracil oder einer bezüglich des Basenpaarungsverhaltens in der DNA-Duplex ähnlich reagierenden Base umgesetzt wird, 5-Methylcytosin jedoch im Wesentlichen unmodifiziert bleibt; (b) die chemisch behandelte DNA wird amplifiziert, wobei mindestens ein Oligonukleotid (Typ A) als Primer in einer Polymerase-Reaktion verwendet wird und die beiden Stränge der Polymerase-Reaktionsprodukte in ungleichen Mengen hergestellt werden; (c) das Amplifizierungsprodukt wird mit einem oder mehreren Paaren von Oligonukleotiden (Typ B) hybridisiert, welche an die Positionen hybridisieren, welche bezüglich ihres Methylierungs-Status in der genomischen DNA-Probe untersuchen werden sollen, wobei ein Oligonukleotid eines jeden Paares in jedem Fall bevorzugt hybridisiert, wenn in der genomischen DNA-Probe die Position methyliert war, während das andere Oligonukleotid des Paares bevorzugt hybridisiert, wenn die Position unmethyliert war. Jedes Oligonukleotid eines Paares ist mit einem einzelnen Fluoreszenzmarker markiert; d) die Fluoreszenzpolarisations-Eigenschaften der Lösung werden gemessen, wobei man für jeden verwendeten Fluoreszenzmarker den Polarisationsgrad bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das hybridisierte Oligonukleotid mittels Deoxynukleotiden und einer Polymerase verlängert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die Fluoreszenzpolarisation der fluorophormarkierten Oligonukleotide vor der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt und nochmals nach der Hybridisierung mit dem Amplifizierugsprodukt gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Oligonukleotid-Hybridisierung durch einen Anstieg der Fluoreszenzpolarisation detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Fluorophor ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend 5'-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-X-rhodamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-Carboxy-X-rhodamin, BODIPY, TexasRed, Cy3, Cy5, FAM, FITC, DAPI, HEX und TET.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Probe vor der Bisulfit-Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die enzymatische Amplifizierung der chemisch behandelten DNA so durchgeführt wird, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Probe aus Säugetier-Quellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fluoreszenzpolarisation der enzymatisch amplifizierten DNA direkt in dem Behälter gemessen wird, in dem die Amplifizierungs-Reaktion durchgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Typ-B-Oligonukleotid vor der Hybridisierung mit dem Amplifizierungsprodukt an einer Oberfläche immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mit Bisulfit behandelte DNA vor der Hybridisierung mit dem Typ-B-Oligonukleotid an eine Oberfläche gebunden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12, worin die Oberfläche Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin die über den Methylierungs-Status der Target-Stelle erzeugte Information einer Rechneranlage zugeführt wird, welche eine oder mehrere Datenbanken umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die über den Methylierungs-Status der Target-Stelle erzeugte Information einer Rechneranlage zugeführt wird, welche einen oder mehrere lernende Algorithmen umfasst.