CN102618645B - 基于荧光偏振的egfr基因启动子甲基化状态均相检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测方法。本发明克服了现有技术存在的成本高、操作步骤繁琐、易发生污染和影响检测结果准确性问题，本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的甲基化特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测靶区域甲基化，检测结果更客观准确。结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于检测临床血液或组织标本。
Description
技术领域：
本发明涉及EGFR基因启动子甲基化状态的检测领域。尤其涉及一种均相检测法，其通过改变荧光偏振值以监测样品中存在的EGFR基因启动子甲基化状态。
背景技术：
表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR) 基因位于7号染色体p13～q22区，全长约200kb，是HER／ERB-B跨膜受体激酶家族成员之一，由胞外段、跨膜区和胞内激酶活性区构成。EGFR胞外段的主要功能是结合表皮生长因子(EGF)等配体，激活胞内段酪氨酸激酶活性，启动信号传导通路，在组织中起到调节细胞增殖、分化的作用。EGFR基因5′调控区包括1个富含GC岛的启动子，CpG岛的异常高甲基化并没有改变基因序列，却可以调控基因的表达，导致转录失活，使该基因表达沉默。EGFR的表达受其启动子DNA甲基化调控，EGFR的转录沉默与CpG岛高甲基化相关。部分实体瘤患者EGFR低表达或不表达,EGFR转录沉默且CpG岛呈现高甲基化，EGFR靶向药疗效差。EGFR基因异常甲基化是多种癌肿发生的一个早期事件，可以作为多种癌肿早期诊断的分子标志物和预防的检测。并且，DNA甲基化是可以逆转的过程，抑制DNA甲基化，使已发生甲基化的基因去甲基化，激活沉默失活的基因，可作为肿瘤治疗的新途径。因此，EGFR基因启动子甲基化检测不仅广泛用于表观遗传学研究，也能预警肿瘤发生、预测疗效，为肿瘤早期诊断、预后判定及指导预见性个体化用药提供依据。而且DNA甲基化不仅存在于组织中，在外周血、积液和痰液中均可检出，这一优点对相关的表观遗传学研究及开展早期、敏感无创的诊断意义重大。
目前，国外对EGFR基因启动子甲基化状态的测定分析方法已有一些报道，如Bisulfite Sequencing PCR (BSP)、 MSP(methylation Specific PCR)、COBRA assay、DHPLC、Methylight、微阵列、焦测序技术等技术方法，这些检测方法需要多种反应步骤、、操作复杂，检测多需洗脱纯化待检分子和电泳检测，多步后处理费时费力、成本高，仪器设备昂贵，不能做到既简单快速完成反应又简单客观检测分析，效率有待提高，因而难于推广应用。
因此，需要获得一种操作简便、特异准确、易标准化和自动化、低成本的基因甲基化液相检测新方法。
本发明的实施方案提供了一种测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术的原理如下：具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大，荧光偏振数值增加。
发明内容：
本发明涉及一种用于测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：（1）从样品中得到提取物：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，再用另一种试剂或试剂盒处理基因组DNA并纯化，得到纯化的提取物；（2）扩增结合：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl2，1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，浓度为0.5-2.0μmol/L的EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化上游引物、下游引物，以及浓度为0.05-0.2μmol/L的靶基因的5’端带荧光标记的探针，所述反应条件是：94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45个循环，最后室温15-30℃孵育；（3）：检测：检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.)，t检验统计阴性、阳性对照反应终液FP值分布，阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态：
待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态,
待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶区域CpG位点为甲基化状态,
阳性临界值Cut-off值＜待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测。
方法中涉及EGFR基因启动子甲基化状态的阳性和阴性对照，可通过一般的分子生物学方法利用已知的甲基化或非甲基化的序列克隆得到。
进一步，步骤（1）包括：在试剂或试剂盒中进行处理获取基因组DNA；以及将所述基因组DNA在试剂或试剂盒中进行处理，通过化学反应，使未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，发生了甲基化的胞嘧啶保持不变，将有无甲基化修饰的差异转变为核苷酸序列的差异；其中所述获取基因组DNA的试剂或试剂盒为内含蛋白酶K、细胞裂解液的DNA提取液，及内含酚／氯仿、乙醇或DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱的试剂；其中所述处理基因组DNA的试剂或试剂盒为内含过硫酸氢钠(NaHSO3)的试剂或试剂盒，回收的DNA通过PCR来扩增，在PCR扩增过程中，5′位置上甲基化的胞嘧啶保持完整。
进一步的，其中所述引物为EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化通用的上游引物、下游引物，所述5’端带荧光标记的探针为EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化同源的探针，能够与所获得的扩增子结合以产生能够检测的荧光偏振值变化；荧光偏振仪检测所述各反应终液以获得荧光偏振测量值；以及将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值为阴性对照反应终液FP均值、Cut-off值。
在优选技术方案中，根据待测EGFR基因的启动子DNA序列，避开CG位点设计通用引物，其中所述覆盖EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化通用上游引物、下游引物序列为：正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',探针序列为5'-ttgggagagtcggagcgagttt-3'，或5'-ttcggggagtagcgatgcgatt-3'，或5'-agtcggagcgagtttttcggg-3'，或5'-gagtagcgatgcgatt-3'，或5'-tttcgggacggtcggggt-3'，或5'-agcgtttttggcgttgt-3'，或 5'-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'。
在优选的技术方案中，其中所述末端标记的荧光素为TAMRA（四甲基罗丹明），或FAM（羧基荧光素）、R110（罗丹明）、FITC（异硫氰酸荧光素）、TET（四氯荧光素）、HEX（六氯荧光素）、ROX 、BTR。
在优选的技术方案中，其进一步包括下述步骤： 提供多个EGFR基因启动子的待测靶CpG岛区甲基化阴性对照，提供多个EGFR基因的启动子待测靶CpG岛区甲基化阳性对照，每个阴、阳性对照溶液具有不同的EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化已知浓度；每个阴性对照、阳性对照加入反应试剂进行扩增结合反应；以及测量每个所述标准对照反应液的荧光偏振值以提供多个对应于已知EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化阴性对照、阳性对照的荧光偏振数值，满足: 阳性对照反应终液FP均值<阴性对照反应终液FP均值-阴性对照FP标准差(S.D.)。
在优选技术方案中，其中所述Cut-off值为用SPSS软件计算阴性对照、多个阳性对照反应终液FP值均值和标准差，t检验法统计阴、阳性对照反应终液FP值分布，所得到的Cut-off值,满足:阳性对照反应终液FP值<阴性对照反应终液FP均值，阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态。
在优选技术方案中，其中所述待测样品FP值与阴性对照反应终液FP均值、Cut-off值比较即知靶区域各CpG位点甲基化状态具体是指：如待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态,如待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶区域CpG位点为甲基化状态,如待测样品FP值>阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测。
本发明进一步提供实施所述检测的试剂盒、引物和或探针等。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1）、本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。
2）、成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的甲基化特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测靶区域甲基化，检测结果更客观准确。
3）、结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于研究和检测样本甲基化状态。
附图说明
图1为患者甲DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态测序结果。
图2为患者乙DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态测序结果。
图3为患者丙DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态测序结果。
图4为患者丁DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态测序结果。
具体实施方式：
本发明中，从样品中提取到DNA，经过硫酸氢钠处理，与引物和探针发生扩增和结合反应,由此而引起荧光偏振度数值的变化，该变化随EGFR基因启动子甲基化状态的改变而改变。本发明的优选实施方案提供了一种EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，该方法灵敏、快速、简单且成本低。
优选的实施方案描述：
实施方案1
肺癌患者外周血EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
健康志愿者外周血提取DNA和用SssI甲基化转移酶(New England Biolabs, Boston, USA)处理的健康志愿者外周血提取DNA分别经过硫酸氢钠处理转化后，用EGFR基因的启动子靶CpG岛区正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3'扩增,扩增产物克隆入
pGEM-T-easy Vectors (Promega, USA)构建阴、阳性对照。 测序法验证对照品的甲基化状态。含经过硫酸氢钠处理转化后的用SssI甲基化转移酶(New England Biolabs, Boston, USA)处理的健康志愿者外周血提取DNA的质粒pGEM-T-methylated-EGFR作为阳性对照标准品，含经过硫酸氢钠处理转化后的健康志愿者外周血提取DNA的质粒pGEM-T-Umethylated-EGFR作为阴性对照标准品，于260nm检测OD值定量。
以本室克隆的含有1-1000拷贝/毫升的EGFR基因启动子甲基化DNA的质粒pGEM-T-methylated-EGFR作为阳性对照标准品，以含有1-107拷贝/毫升的EGFR基因启动子未甲基化DNA的质粒pGEM-T-Umethylated-EGFR为阴性对照标准品。分别抽取甲、乙患者外周血1毫升，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，提取产物应用亚硫酸氢盐或甲基化试剂盒转变进行基因组DNA的甲基化修饰, 未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，发生了甲基化的胞嘧啶保持不变，回收产物。基因组DNA的提取和甲基化处理，按照说明书程序操作。
EGFR基因启动子甲基化DNA的GEM-T-methylated-EGFR阳性对照标准品、EGFR基因启动子未甲基化DNA的pGEM-T-Umethylated-EGFR阴性对照标准品及回收甲、乙患者外周血的DNA模板5μL分别加入反应试剂50μL进行扩增结合：所述PCR扩增结合试剂包括10×PCR缓冲液5μL；浓度各为 2.5mM的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，3.5mmol/L的MgCl2，1.5U的TaqDNA聚合酶，浓度为200nM的EGFR基因的启动子靶CpG岛区正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',以及浓度为50nM的靶基因的荧光标记探针5'TAMRA-ttgggagagtcggagcgagttt- 3'，反应条件是：94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45个循环，最后室温15-30℃孵育检测。每个反应均作复孔。
应用Fluorescence Polarization Capable Instrument Victor (PerkinElmer Life Science,美国)或YG-O6高通量基因分析仪（陕西阳光生物工程股份有限公司，中国）检测对照品和样本反应产物的荧光偏振值FP。荧光偏振测定在室温下进行，荧光偏振检测仪于激发波长535nm，吸收波长590nm检测每个对照品及样本反应产物的TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine）荧光的偏振值FP,以mP为国际单位。
应用SPSS统计软件对实验结果进行分析，计算每个对照及样本的FP均值(means)及标准差(S.D.)。t检验统计阳性对照及阴性对照反应终液FP值分布，得到阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态：
待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态。
待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶区域CpG位点为甲基化状态。
阳性临界值Cut-off值＜待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测。
回收的患者外周血DNA同时以测序法检测EGFR基因启动子甲基化状态，以验证荧光偏振检测结果。回收的DNA 5μL加入普通测序反应试剂50μL进行扩增结合：所述PCR扩增结合试剂包括10×PCR缓冲液5μL；浓度各为2.5mM的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，2.5mmol/L的MgCl2，1.5 U的TaqDNA聚合酶，200nM的EGFR基因的启动子靶CpG岛区正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',反应条件是：95℃变性4min后，95℃孵育20秒，57℃孵育40秒，72℃孵育20秒，35个循环，72℃延伸5min，最后PCR反应结束后样品经1.2%琼脂糖凝胶电泳验证，应用紫外光凝胶成像系统观察结果。扩增产物纯化送测序（ABI 377 instrument，AmpliCycle sequencing kit，Perkin Elmer, USA).
2）、 结果总结于下列表1
表1.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)=176-6.4=169.6，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)=176+6.4=182.4，故据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该患者甲外周血DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，患者乙外周血DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态，该判断与测序法结果一致（附图1，2）。
实施方案2
宫颈癌患者肿瘤组织EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
以本室克隆的含有1-1000拷贝/毫升的EGFR基因启动子甲基化DNA的质粒pGEM-T-methylated-EGFR作为阳性对照标准品，以含有1-107拷贝/毫升的EGFR基因启动子未甲基化DNA的质粒pGEM-T-Umethylated-EGFR为阴性对照标准品。分别取丙、丁患者肿瘤组织1-10毫克，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行样品DNA提取，提取产物应用亚硫酸氢盐或甲基化试剂盒转变进行基因组DNA的甲基化修饰, 未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，发生了甲基化的胞嘧啶保持不变，回收产物。基因组DNA的提取和甲基化处理，按照说明书程序操作。靶基因的荧光标记探针为5'FAM-tttcgggacggtcggggt-3'，其他步骤如实施例1。
2）、结果总结于下列表2
表2.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)= 154-4.9=149.1，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)= 154+4.9=159.9，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该患者丙DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态，患者丁DNA样本的EGFR基因启动子呈甲基化状态，该判断与测序法结果一致（附图3，4）。
实施方案3
表观遗传学研究：正常人EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
取1号献血者外周血1毫升，使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，靶基因的荧光标记探针为5' R110-agtcggagcgagtttttcggg-3'，其他步骤如实施例1。
2）、结果总结于下列表2。
表3.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)= 157-6.6=149.1，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)= 157+6.6=163.6，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，该判断与测序法结果一致（图省略）。
实施方案4
表观遗传学研究：正常人EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
取2号献血者外周血1毫升，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，靶基因的荧光标记探针为5' FITC-ttcggggagtagcgatgcgatt-3'，其他步骤如实施例1。
2）、结果总结于下列表2。
表4.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)=164-6.9=157.1，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)=164+6.9=170.9，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，该判断与测序法结果一致（图省略）。
实施方案5
表观遗传学研究：正常人EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
取3号鲜血者外周血1毫升，使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，靶基因的荧光标记探针为5' TET-agcgtttttggcgttgt-3'，其他步骤如实施例1，
2）、结果总结于下列表2
表5.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)=143-6.7=136.3，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)= 143+6.7=149.7，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，该判断与测序法结果一致（图省略）。
实施方案6
表观遗传学研究：正常人EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
取4号献血者外周血1毫升，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，靶基因的荧光标记探针为5' ROX-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'，其他步骤如实施例1，
2）、结果总结于下列表2
表6.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)=173-7.9=167.1，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)=173+7.9=180.9，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，该判断与测序法结果一致（图省略）。
实施方案7
表观遗传学研究：正常人EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测
1）、材料和方法
取5号献血者外周血1毫升，使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（天根生物，北京）进行外周血样品DNA提取，靶基因的荧光标记探针为或5'BTR-gagtagcgatgcgatt-3'，其他步骤如实施例1，
2）、结果总结于下列表2
表7.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S.D.)
*数据以FP值均值（means）±标准差S.D表示.
这些结果显示了本发明的荧光偏振FP值与EGFR基因启动子甲基化状态具有良好的相关性，阴性对照pGEM-T-unmethylated-EGFR 荧光偏振FP值与阳性对照pGEM-T-methylated-EGFR荧光偏振FP值有显著的分布差异，荧光偏振值随EGFR基因启动子呈甲基化而降低。阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)-阴性对照FP标准差(S.D.)=124-5.3=118.7，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值 (means)+阴性对照FP标准差(S.D.)=124+5.3=129.3，因此，据此结果，判断该法灵敏度高、检测限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达107拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，判断该DNA样本的EGFR基因启动子呈未甲基化状态，该判断与测序法结果一致（图省略）。
核苷酸序列表
EGFR基因的启动子靶CpG岛区引物序列为：
正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，
反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',
EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化探针序列为：5'-ttgggagagtcggagcgagttt-3'，
5'-ttcggggagtagcgatgcgatt-3'，
5'-agtcggagcg agtttttcggg-3'，
5'-gagtagcgatgcgatt-3'，
5'-tttcgggacggtcggggt-3'，
5'-agcgtttttggcgttgt-3'，
5'-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'。
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测法
<160> 9
<170> PatentIn Version3.5
<210> 1
<211>25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 正向引物
ggttttttgattttgtttagtattg
<210> 2
<211> 20
<213> 人工序列
<400> 反向引物
ccttacctttcttttcctcc
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
Ttgggagagtcggagcgagttt
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
Ttcggggagtagcgatgcgatt
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
agtcggagcg agtttttcggg
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
Gagtagcgatgcgatt
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
tttcgggacggtcggggt
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
agcgtttttggcgttgt
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 探针
ttgcgttttgttcggcgagtcgggt
Claims (3)
1.一种用于测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的非疾病诊断目的的均相检测法，所述方法包括下列步骤：（1）从样品中提取基因组DNA：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，再用另一种包含亚硫酸氢钠(NaHSO3)的试剂或试剂盒处理基因组DNA并纯化，得到纯化的提取物；其中提取基因组DNA的试剂或试剂盒含有蛋白酶K、细胞裂解液，酚／氯仿、乙醇以及DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱；（2）扩增结合：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl2，1-5U/μl的Taq DNA聚合酶，浓度为0.5-2.0μmol/L的覆盖EGFR基因启动子靶CpG岛区甲基化或非甲基化的通用上下游引物以及浓度为0.05-0.2μmol/L的5’端带荧光标记的探针，所述反应条件是：94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45个循环，最后室温15-30℃孵育，所述上游引物序列为： 5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，下游引物序列为：5'-ccttacctttcttttcctcc-3',探针序列为5'-ttgggagagtcggagcgagttt-3'，或5'-ttcggggagtagcgatgcgatt-3'，或5'-agtcggagcg agtttttcggg-3'，或5'-gagtagcgatgcgatt-3'，或5'-tttcgggacggtcggggt-3'，或5'-agcgtttttggcgttgt-3'，或 5'-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'；（3）检测：检测反应溶液以及阴阳性对照反应液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.)，t检验统计阴性、阳性对照反应终液FP值分布，阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态；待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态；待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶区域CpG位点为甲基化状态；阳性临界值Cut-off值＜待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测；所述阳性对照为含有EGFR基因启动子甲基化的DNA序列，所述阴性对照为含有EGFR基因启动子未发生甲基化的DNA序列。
2.权利要求1的检测法，其中所述探针5’端的荧光标记选自TAMRA（四甲基罗丹明）、FAM（羧基荧光素）、罗丹明R110、FITC（异硫氰酸荧光素）、TET（四氯荧光素）、HEX（六氯荧光素）、ROX或BTR。
3.权利要求1或2的检测法，其特征在于：用SPSS软件计算阴性对照、阳性对照反应液荧光偏振值的Cut-off值，Cut-off值满足:阳性对照反应终液FP值<阴性对照反应终液FP均值，阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，将待测样品FP值与Cut-off值比较知靶区域甲基化状态。
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