DE10245779A1 - Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen - Google Patents

Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen Download PDF

Info

Publication number
DE10245779A1
DE10245779A1 DE2002145779 DE10245779A DE10245779A1 DE 10245779 A1 DE10245779 A1 DE 10245779A1 DE 2002145779 DE2002145779 DE 2002145779 DE 10245779 A DE10245779 A DE 10245779A DE 10245779 A1 DE10245779 A1 DE 10245779A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sequences
seq
nucleic acid
methylation
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE2002145779
Other languages
English (en)
Inventor
John Foekens
Nadia Harbeck
Thomas König
Sabine Maier
John Martens
Fabian Model
Inko Nimmrich
Tamas Rujan
Armin Schmitt
Manfred Schmitt
Heinz HÖFLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Priority to DE2002145779 priority Critical patent/DE10245779A1/de
Priority to DE60328618T priority patent/DE60328618D1/de
Priority to AU2003300504A priority patent/AU2003300504B2/en
Priority to EP03808704A priority patent/EP1554407B1/de
Priority to AT03808704T priority patent/ATE437962T1/de
Priority to US10/517,741 priority patent/US8101359B2/en
Priority to JP2005501274A priority patent/JP4649331B2/ja
Priority to EP09009372.5A priority patent/EP2157191B1/de
Priority to CA002500255A priority patent/CA2500255A1/en
Priority to ES03808704T priority patent/ES2330328T3/es
Priority to PCT/EP2003/010881 priority patent/WO2004035803A2/en
Priority to ES09009372.5T priority patent/ES2447566T3/es
Publication of DE10245779A1 publication Critical patent/DE10245779A1/de
Priority to US11/011,332 priority patent/US20060024684A1/en
Priority to US11/628,703 priority patent/US20090269736A1/en
Priority to AU2009251178A priority patent/AU2009251178A1/en
Priority to US13/352,238 priority patent/US20120184455A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte und genomische Sequenzen, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands von genomischer DNA sowie ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort eines Subjekts mit einer proliferativen Erkrankung der Brustgewebe auf Behandlung mit dem Wirkstoff Tamoxifen.

Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die Niveaus der Beobachtung, die durch die methodologischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie untersucht wurden, sind die Gene selber, die Translation dieser Gene in RNA und die daraus resultierenden Proteine. Die Frage, welches Gen zu welchem Zeitpunkt im Verlauf der Entwicklung eines Individuums angeschaltet wird, und wie die Aktivierung und Inhibierung von spezifischen Genen in spezifischen Zellen und Geweben kontrolliert werden, ist mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung des Gens oder des Genoms korrelierbar. In dieser Hinsicht können sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster von individuellen Genen oder des Genoms manifestieren.
  • Die DNA-Methylierung spielt beispielsweise eine Rolle bei der Regulation der Transkription, beim genetischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist, wie Cytosin. Darüber hinaus geht die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information bei einer PCR-Amplifikation vollständig verloren.
  • Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin, beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24): 5064–6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
  • Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
  • Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2): 94–8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. 1997 Nov;17(3): 275–6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12): 2529–31, WO Patent 9500669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12): 2532–4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
  • Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6): 431–6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3): 387–95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4): 695–6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2): 261–4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
  • Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
  • Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
  • Matrix-unterstützte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20): 2299–301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
  • MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147–57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich weniger effizient. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrizes für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8): 1367–73). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA führt zu der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
  • Genomische DNA wird von der DNA aus zellulären, Gewebe- oder anderen Testproben unter der Verwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standard-Methodologie kann in Literaturstellen, wie zum Beispiel Fritsch und Maniatis eds.; Molecular Clonin: A Laboratory Manual, 1989, gefunden werden.
  • Brustkrebs ist augenblicklich der zweit-häufigste Typ von Krebs bei Frauen. Im Jahr 2001 wurden über 190.000 neue Fälle von invasivem Brustkrebs und über 47.000 weitere Fälle von in situ-Brustkrebs diagnostiziert. Das Auftreten und die Todesrate nimmt mit dem Alter zu, für die Zeitspanne von 1994–1998 war das Auftreten von Brustkrebs unter Frauen im Alter zwischen 20 und 24 nur 1,5 pro 100.000 Einwohnerinnen. Das Risiko steigt jedoch bis zu 498,7 innerhalb der Altersgruppe von 75–79 an. Die Mortalitätsraten nahmen um ungefähr 5% über das letzte Jahrzehnt hinweg ab und Faktoren, die die 5-Jahres-Überlebensraten beeinflussen, schließen Alter, Phase des Krebses, sozioökonomische Faktoren und Rasse ein.
  • Brustkrebs wird definiert als die unkontrollierte Zellteilung von Zellen innerhalb der Brustgewebe. Die Brüste bestehen aus 15 bis 20 Lappen, die miteinander durch Gänge ver bunden sind. Krebs entsteht am häufigsten in einem Gang (Ductus), wird jedoch auch in den Lappen gefunden, wobei der seltenste Typ von Krebs entzündlicher Brustkrebs genannt wird.
  • Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, daß ein ständiger Bedarf besteht, die Verfahren des frühen Nachweises, der Klassifikation und Behandlung von Brustkrebs zu verbessern. Im Unterschied zum Nachweis von einigen anderen verbreiteten Krebsarten, wie zum Beispiel Cervix- und Hautkrebs, bestehen inhärente Schwierigkeiten bei der Klassifizierung und dem Nachweis von Brustkrebs.
  • Der erste Schritt jeder Behandlung ist die Ermittlung des Zustands des Patienten im Vergleich zu definierten Klassifikationen der Erkrankung. Der Wert eines solchen Systems hängt jedoch inhärent von der Qualität der Klassifizierung ab. Brustkrebs wird gemäß seiner Größe, seiner Lokalisierung und des Auftretens von Metastasen eingestuft. Verfahren der Behandlung schließen die Anwendung von Chirurgie, Bestrahlungstherapie und Hormontherapie ein, die auch als Anschlußtherapien an die Chirurgie angewendet werden.
  • Endokrine Therapien wurden entwickelt, um die Effekte von Estrogen auf Krebszellen zu blockieren oder die Serum-Estrogenspiegel zu verringern. Tamoxifen (TAM) ist der am meisten verbreitet verwendete anti-Estrogene Wirkstoff für Brustkrebs-Patientinnen. Er wirkt durch die Blockierung der Estrogen-Stimulierung von Brustkrebszellen, wobei sowohl die Translokation als auch die nukleare Bindung des Estrogenrezeptors inhibiert wird. TAM wird in Anschlußtherapie-Ansätzen bei primären Brustkrebs-Patientinnen und bei der Behandlung von metastatischer Erkrankung verwendet, und seine Effektivität wurde durch verschiedene klinische Studien bestätigt. Die Behandlung über fünf Jahre hinweg reduziert das jährliche Wiederauftreten der Erkrankung um 47% und die jährlichen Todesfälle um 26%, und diese Reduktion ist ähnlich in verschiedenen Altersgruppen. Auch verringert es das Auftreten der Entwicklung von contra-lateralen Brusttumoren. TAM befindet sich unter den am wenigsten toxischen antineoplastischen Mitteln, da es aber in einigen Geweben estrogenische Eigenschaften hat, erhöht es das Risiko von endometriellem Krebs 3-fach.
  • Der Hormon-Rezeptorstatus sollte vor Beginn der TAM Behandlung getestet werden, da nur eine Gruppe von Patienten von dieser Therapie profitieren wird. Zu diesem Zweck werden der ER(Estrogenrezeptor)- und PR(Progesteronrezeptor)-Status routinemäßig in allen Patienten getestet und als prädiktive Marker einer Antwort angesehen (ein prädiktiver Marker oder Faktor ist jede Messung, die mit einer Antwort oder dem Fehlen einer Antwort auf eine bestimmte Therapie assoziiert ist). Der ER-Status ist für die Antwort bei Anschluß-TAM-Ansatz und auch bei fortschreitender metastatischer Erkrankung prädiktiv.
  • Nur ER positive und/oder PR positive Patientinnen erhalten TAM und die verbleibenden 10% Patientinnen erhalten Chemotherapie. Das Problem ist, daß die Behandlung nur bei einer Untergruppe von Hormonrezeptor-positiven Patientinnen effektiv ist und daß eine kleine Untergruppe von ER-negativen Patientinnen anfänglich auf TAM anzusprechen scheinen. Dann würde diese nicht ansprechende Untergruppe nicht nur von der TAM Behandlung nicht profitieren, sondern diese würde gegenteilige Effekte hervorrufen, und diese würde nicht die Gelegenheit haben, statt dessen eine Chemotherapie zu erhalten. Auf der anderen Seite würde die ER-negative Untergruppe, die von der Tamoxifen-Behandlung profitiert haben könnte, statt dessen eine Chemotherapie erhalten. Mehrere verschiedene Tests sind erhältlich, um PR und ER zu messen, einschließlich biochemischer und IHC (immun-histochemischer) Analyse, jedoch fehlt eine Standardisierung von Färbemethoden und ist inter-Laborvariabilität vorhanden (Clin Cancer Res 2000, 6: 616–621).
  • Im Augenblick werden verschiedene prädiktive Marker untersucht. Unter diesen zeigten hohe bcl-2-Spiegel eine vielversprechende Korrelation mit der TAM-Therapieantwort in Patientinnen mit metastatischer Erkrankung und verlängertem Überleben und fügten wertvolle Informationen zu der ER-negativen Patientinnen-Untergruppe hinzu (J Clin Oncology 1997, 15 5: 1916–1922; Endocrine, 2000, 13(1): 1–10. Es bestehen in Konflikt stehende Hinweise im Hinblick auf den unabhängigen prädiktiven Wert von c-erbB2 (Her2/neu) für die Expression in Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die eine weitere Evaluierung und Verifizierung erfordern (British J of Cancer 1999, 79 (7/8): 1220–1226; J Natl Cancer Inst, 1998,90 (21): 1601–1608).
  • Andere prädiktive Marker schließen SRC-1 (Steroidrezeptor-Coaktivator-1), CGA-Gen Überexpression, Zellkinetiken und S-Phase Fraktionstests (Breast Cancer Res and Treat, 1998, 48: 87–92; Oncogene 2001, 20: 6955–6959) ein. Kürzlich erwiesen sich uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und PAI-1 (Plasminogenaktivator Inhibitor Typ 1) zusammen als brauchbar, um eine Untergruppe von Patientinnen zu definieren, die eine schlechtere Prognose aufweisen und die von einer Anschluß-systemischen Therapie profitieren würden (J Clini cal Oncology, 2002, 20 n° 4). Alle diese Marker erfordern noch weitere Untersuchungen in durchzuführenden Studien, da keiner von diesen bisher ein validierter Antwortmarker ist.
  • Das Gen MSMB (Zugangsnummer NM_002443) wurde auf 10q11.2 kartiert. Es kodiert das beta-Microseminoprotein (MSP), das Eines der hauptsächlich durch die Prostata sekretierten Proteine ist. Weiterhin könnte es als ein diagnostischer Marker für Prostatakrebs brauchbar sein. Unter der Verwendung von mRNA Analyse wurden niedrige Spiegel von beta-MSP mRNA Expression und Protein mit dem Fortschreiten unter endokriner Therapie in Zusammenhang gebracht und es wurde postuliert, daß es vielleicht für potentiell aggressiven Prostatakrebs Indikativ sein könnte (siehe Sakai H, Tsurusaki T, Kanda S, Koji T, Xuan JW, Saito Y. 'Prognostic significance of beta-microseminoprotein mRNA expression in prostate cancer.' Prostate. 1999 Mar 1;38(4): 278–84.).
  • Das Gen TP53 (Zugangsnummer NM_000546) kodiert für das Protein p53, eines des am besten charakterisierten Tumorsuppressor-Proteine. Das p53 Protein fungiert als ein Transkriptionsfaktor und dient als ein Schlüsselregulator des Zellzyklus. Die Inaktivierung dieses Gens durch Mutation unterbricht den Zellzyklus, der, im Gegenzug, bei der Tumorbildung hilft. Die Methylierungsveränderungen, die mit diesem Gen assoziiert sind, wurden als signifikant bei Brustkrebs berichtet. Saraswati et. al. (Nature 405, 974–978 (22 Jun 2000) "Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours" berichteten, daß niedrige Spiegel von p53 mRNA in Brusttumoren mit der Methylierung des HOXA5 Gens korreliert waren. Das Produkt des HOX5A Gens bindet an die Promotorregion des p53 und vermittelt die Expression des Gens. Die Methylierung der Promotorregion des p53-Gens selber wurde berichtet (Kang JH, Kim SJ, Noh DY, Park IA, Choe KJ, Yoo OJ, Kang HS. "Methylation in the p53 promoter is a supplementary route to breast carcinogenesis: correlation between CpG methylation in the p53 promoter and the mutation of the p53 gene in the progression from ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma." Lab Invest. 2001 Apr;81(4): 573–9.). Es wurde dort gezeigt, daß CpG-Methylierung in der p53 Promotorregion in Brustkrebs gefunden wird und es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die Methylierung in der p53 Promotorregion ein alternativer Signalweg für das neoplastische Fortschreiten in Brusttumoren sein kann. Es wurde beobachtet, daß die Behandlung mit Tamoxifen den Spiegel der Expression des p53-Gens abnehmen läßt (Farczadi E, Kaszas I, Baki M, Szende B. 'Changes in apoptosis, mitosis, Her-2, p53 and Bcl2 expression in breast carcinomas after short-term tamoxifen treatment.' Neoplasma. 2002;49(2): 101–3).
  • Das Gen CYP2D6 (Zugangsnummer: NM_000106) ist ein Mitglied der menschlichen Cytochrom P450 (CYP) Superfamilie. Viele Mitglieder dieser Familie sind am Wirkstoff-Metabolismus beteiligt (siehe zum Beispiel Curr Drug Metab. 2002 Jun; 3(3): 289–309. Rodrigues AD, Rushmore TH.), von diesen ist Cytochrom P450 CYP2D6 eines der am extensivsten charakterisierten. Es ist hoch polymorph (mehr als 70 Variationen des Gens wurden beschrieben), und die allelische Variation kann sowohl zu erhöhter als auch verringerter enzymatischer Aktivität führen. Das CYP2D6 Enzym katalysiert den Stoffwechsel einer großen Zahl von klinisch wichtigen Wirkstoffen, einschließlich antidepressiven Mitteln, Neuroleptika, einigen Antiarrhythmika (Nature 1990 Oct 25;347(6295): 773–6 Identification of the primary gene defect at the cytochrome P450 CYP2D locus.Gough AC, Miles JS, Spurr NK, Moss JE, Gaedigk A, Eichelbaum M, Wolf CR.).
  • Das Gen PTGS2 (Zugangsnummer NM_000963) kodiert für ein induzierbares Isozym der Prostaglandin-Endoperoxidsynthase (Prostaglandin-Endoperoxidsynthase 2). Die aberrante Methylierung dieses Gens wurde in Lungenkarzinomen identifiziert (Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002 Mar;11(3): 291–7 Hierarchical clustering of lung cancer cell lines using DNA methylation markers.Virmani AK, Tsou JA, Siegmund KD, Shen LY, Long TI, Laird PW, Gazdar AF, Laird-Offringa IA.).
  • Das Gen PSA (Zugangsnummer NM_021154) sollte nicht mit dem auch als PSA bezeichneten Gen (Zugangsnummer NM_001648) verwechselt werden, das für Prostata spezifisches Antigen kodiert, und dessen technisch korrekter Name Kallikrein 3 ist. Das Gen PSA kodiert für das Protein Phosphoserinaminotransferase, die das den zweiten Schritt katalysierende Enzym im Serine-Biosyntheseweg darstellt. Veränderungen in den Genexpressionsspiegeln wurden durch mRNA-Expressionsanalyse verfolgt und Hochregulation des Gens wurde in Colonkarzinomen in einer Studie mit 6 Proben identifiziert (Electrophoresis 2002 Jun;23(11): 1667–76 mRNA differential display of gene expression in colonic carcinoma.Ojala P, Sundstrom J, Gronroos JM, Virtanen E, Talvinen K, Nevalainen TJ.).
  • Das Gen CGA (Zugangsnummer NM_000735) kodiert für das alpha-Polypeptid der Glycoproteinhormone. Weiterhin wurde es als ein Estrogenrezeptor alpha (ER alpha)-responsives Gen identifiziert, und Überexpression des Gens wurde mit ER-Positivität in Brusttumoren in Zusammenhang gebracht. Bieche et. al. untersuchten mRNA-Spiegel des Gens in 125 ER alpha-positiven post-menopausalen Brustkrebspatientinnen, die mit primärer Chirurgie behandelt wurden, gefolgt durch Anschluß-Tamoxifentherapie. Anfängliche Ergebnisse zeigten signifikante Verbindungen zwischen CGA-Gen-Überexpression und Scarff-Bloom-Richardson histopathologischem Grad I+II und Progesteron- und Estrogenrezeptor Positivität, was vermuten ließ, daß CGA ein Marker niedriger Tumoraggressivität ist ('Identification of CGA as a Novel Estrogen Receptor-responsive Gene in Breast Cancer: An Outstanding Candidate Marker to predict the Response to Endocrine TherapyCancer Research' 61, 1652–1658, February 15, 2001. Ivan Bièche, Béatrice Parfait, Vivianne Le Doussal, Martine Olivi, Marie-Christine Rio, Rosette Lidereau and Michel Vidaud). Die weitere mRNA Expressionsanalyse verband die CGA-Expressionsspiegel mit Tamoxifenantwort, es wurde postuliert, daß, wenn mit der Analyse des Markers ERBB2 (ein schlecht antwortender Marker) verbunden, das Gen möglicherweise als ein prädiktiver Marker der Tamoxifen-Empfindlichkeit in Brustkrebs geeignet wäre (Oncogene 2001 Oct 18;20(47): 6955–9 The CGA gene as new predictor of the response to endocrine therapy in ER alpha-positive postmenopausal breast cancer patients. Bieche I, Parfait B, Nogues C, Andrieu C, Vidaud D, Spyratos F, Lidereau R, Vidaud M.). Die Autoren stellten signifikante Daten zur Verfügung, die die Expression des Gens CGA mit der Tamoxifen-Behandlungsantwort in Zusammenhang brachten. Jedoch waren diese Analysen alle auf die Analyse relativer Spiegel von mRNA-Expression fokussiert. Dies stellt weder ein Verfahren dar, das für ein mittleres- oder High-Throughput-Format geeignet ist, noch eine geeignete Basis für die Entwicklung eines klinischen Tests.
  • Das Gen FGFR1 (Zugangsnummern NM_000604 & NM_015850) kodiert für den Heparinbindenden Wachstumsfaktorrezeptor, auch als der Fibroblasten Wachstumsfaktorrezeptor 1 bekannt. Es wurde angenommen, daß die Überexpression von FGFR1 mit kleinen, gutdifferenzierten diploiden Tumoren assoziiert zu sein scheint (Int J Cancer 1994 Nov 1;59(3): 373–8 Expression of the FGFR1 gene in human breast-carcinoma cells. Jacquemier J, Adelaide J, Parc P, Penault-Llorca F, Planche J, deLapeyriere O, Birnbaum D.).
  • Beschreibung
  • Die vorliegenden Erfindung stellt Verfahren und Nukleinsäuren zur Evaluierung der Antwort eines Patienten mit einer Zell-proliferativen Erkrankung der Brustgewebe auf die Behandlung mit dem Wirkstoff Tamoxifen zur Verfügung. Unter der Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Nukleinsäuren, können statistisch signifikante Modelle der Patienten- Empfindlichkeit auf das Behandlungsschema entwickelt werden und dazu verwendet werden, Patienten und behandelnden Ärzten bei der Bestimmung von Behandlungsoptionen zu assistieren. Das beschriebene Verfahren soll dazu verwendet werden, die Eignung von Tamoxifen als eine Therapie für Patienten, die an einer Zell-proliferativen Erkrankung der Brustgewebe leiden, zu ermitteln. Daher wird die vorliegende Erfindung als die Probleme reduzierend angesehen, die mit der augenblicklichen Behandlungsantwort assoziiert sind.
  • Unter der Verwendung der wie hier beschriebenen Verfahren und Nukleinsäuren, kann die Patienten-Empfindlichkeit vor oder während der Behandlung mit dem Wirkstoff Tamoxifen auf eine Zell-proliferativen Erkrankung der Brustgewebe evaluiert werden, um dem Patienten und dem behandelnden Arzt somit wichtige Information im Hinblick auf die Risiken, Nachteile und Vorteile, die mit der Tamoxifen-Behandlung assoziiert sind, zur Verfügung zu stellen. Es wird daher ersichtlich sein, daß die hier beispielhaft dargestellten Verfahren und Nukleinsäuren dazu dienen können, die Lebensqualität eines Patienten und Unstimmigkeiten des Behandlungserfolgs zu verbessern, indem sowohl dem Patienten als auch dem behandelnden Arzt eine genauere Ermittlung der Behandlungsoptionen des Patienten ermöglicht werden.
  • Das Ziel der Erfindung wird mittels der Analyse der Methylierungsmuster eines oder einer Kombination der Gene, ausgewählt aus der Gruppe FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 (siehe Tabelle 1) und/oder deren regulatorischen Regionen gelöst. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eines oder einer Kombination der Gene, ausgewählt aus der Gruppe FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 mit einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien in Kontakt gebracht wird, die in der Lage sind, zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der genomischen Sequenz von Interesse zu unterscheiden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parameter von genomischer DNA zur Verfügung. Das Verfahren dient der verbesserten Behandlung und Überwachung von Brustzell-proliferativen Erkrankungen durch ein Ermöglichen der genauen Vorhersage der Antwort eines Patienten auf eine Behandlung mit dem Wirkstoff Tamoxifen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ermöglicht das Verfahren der Erfindung die Differenzierung zwischen Patienten, die auf die Therapie mit dem Wirkstoff Tamoxifen reagieren und denjenigen, die dies nicht tun.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung kann für die Analyse einer großen Vielzahl von Zellproliferativen Erkrankungen der Brustgewebe verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, ductale Karzinome in situ, lobuläre Karzinome, kolloidale Karzinome, tubuläre Karzinome, medulläre Karzinome, metaplastische Karzinome, intraductale Karzinome in situ, lobuläre Karzinome in situ und papilläre Karzinome in situ.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung ist insbesondere für die Vorhersage der Antwort auf Tamoxifen-Behandlung in den zwei hauptsächlichen Anwendungen von Tamoxifen brauchbar. In einer Ausführungsform wird das Verfahren bei Patienten angewendet, die Tamoxifen-Behandlung in einem Anschluß-Ansatz erhalten (d.h. als sekundäre Behandlung einer primären Behandlung, wie zum Beispiel Chirurgie), wie in 1 dargestellt. Solch eine Behandlung wird oft Patienten verschrieben, die an Phase 1 bis 3-Karzinomen leiden. In dieser Ausführungsform werden Ansprechende als diejenigen definiert, die keinen nachweisbaren Rückfall des Brustkrebs innerhalb einer angegebenen Zeitdauer aufweisen, nicht-Ansprechende sind diejenigen, die einen Rückfall innerhalb der Zeitdauer aufweisen. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, daß die Zielnukleinsäure ein Gen oder eine Kombination von Genen ist/sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorische Regionen. In dieser Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, daß das Verfahren gemäß der Erfindung nur bei den Patienten angewendet wird, die Estrogen und/oder Progesteronrezeptormarker sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren bei Patienten angewendet, die an einem metastatischen Krebs leiden, wobei Tamoxifen die primäre Behandlung ist, wie in 2 dargestellt. Solch eine Behandlung wird oft Patienten verschreiben, die an Karzinomen späterer Phasen leiden, wobei insbesondere Metastasen aufgetreten sind. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, daß die Zielnukleinsäure ein oder eine Kombination von Genen ist, ausgewählt aus der Gruppe PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorischen Regionen. In dieser Ausführungsform sind Ansprechende diejenigen, die in eine teilweise oder vollständige Remission eintreten, d.h. Subjekte, deren Krebs sich auf nicht nachweisbare Spiegel rückbildet, im Gegensatz zu denjenigen, deren Erkrankungen weiter metastasieren oder oberhalb nachweisbarer Spiegel verbleiben. Dies Verfahren stellt weitere Verbesserungen über den Stand der Technik zur Verfügung, da das Verfahren bei jedem Subjekt angewendet werden kann, unabhängig von dem Estrogen- und/oder Progesteronrezeptor-Status. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform von dem Subjekt nicht gefordert, daß es auf Estrogen- oder Progesteronrezeptor-Status getestet wurde. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Verfahren bei Subjekten angewendet, die keine Chemotherapie erhalten haben.
  • Weiterhin ermöglicht das Verfahren die Analyse von Cytosin-Methylierungen und „Single Nucleotide Polymorphisms" innerhalb der Gene.
  • Eine Aufgabe der Erfindung wird mittels der Analyse der Methylierungsmuster der Gene FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorischen Regionen gelöst, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die Sequenzen im wesentlichen SEQ ID Nrn.: 15, 31, 32, 63, 40, 9 und 33 und dazu komplementäre Sequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren durch in Kontakt bringen der Nukleinsäuresequenzen in einer biologischen Probe, wobei die Probe von einem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien, wobei das Reagenz oder einer Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Zielnukleinsäure unterscheidet, gelöst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
    In einem ersten Schritt des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe aus Quellen isoliert werden, wie zum Zelllinien, histologischen Schnitten, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatischer Flüssigkeit, lymphatischem Gewebe, Ductus-Zellen, Ductus-Lavageflüssigkeit, Brustwarzen-Austrittsflüssigkeit, Knochenmark und Kombinationen davon. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für den Fachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergenzlysaten, die Beschallung und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor dem nächsten Schritt des Verfahrens gespalten werden, dies kann durch jedes Mittel geschehen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere, jedoch nicht begrenzt auf, mit Restriktions-Endonukleasen.
  • Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die genomische DNA Probe auf solch eine Weise behandelt, daß die Cytosinbasen, die an der 5'-Position nicht-methyliert sind, zu Uracil, Thymin oder einer anderen Base konvertiert werden, die im Hinblick auf das Hybridisierungsver halten verschieden von Cytosin ist. Dies wird hier im folgenden als „Vorbehandlung" verstanden.
  • Die oben beschriebene Behandlung der genomischen DNA wird bevorzugterweise mit Bisulfit (Sulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse durchgeführt, die zu einer Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil oder einer anderen Base führt, die sich im Hinblick auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Falls eine Bisulfitlösung für die Reaktion verwendet wird, findet eine Addition an den nicht-methylierten Cytosinbasen statt. Darüber hinaus muß ein denaturierendes Mittel oder ein Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger vorhanden sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse ermöglicht dann die Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil. Die konvertierte DNA wird dann für den Nachweis von methylierten Cytosinen verwendet.
  • Fragmente der vorbehandelten DNA werden unter der Verwendung von Sets von Primer-Oligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzebeständigen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Überlegungen werden bevorzugterweise mehr als zehn verschiedene Fragmente, die eine Länge von 100–2000 Basenpaaren aufweisen, amplifiziert. Die Amplifikation von verschiedenen DNA-Segmenten kann gleichzeitig in ein- und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Gewöhnlicherweise wird die Amplilfikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
  • Der Aufbau solcher Primer ist dem Durchschnittsfachmann ersichtlich. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide enthalten, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Segment der Basensequenzen sind, die in dem Appendix angegeben sind SEQ ID Nrn.: SEQ ID Nrn.: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272. Die Primeroligonukleotide sind bevorzugterweise dadurch gekennzeichnet, daß sie keine CpG-Dinukleotide enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Sequenz der Primeroligonukleotide so aufgebaut, um selektiv nur an die Brustzell-spezifische DNA von Interesse zu annealen und diese zu amplifizieren, wodurch die Amplifikation von Hintergrund- oder nicht relevanter DNA minimiert wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll Hintergrund DNA genomische DNA bedeuten, die kein relevantes Gewebe-spezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei in diesem Fall die relevanten Gewebe Brustgewebe sind.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß während der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Die verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet werden, wobei die feste Phasen-Oberfläche bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist, wobei aber auch andere Materialien, wie zum Beispiel Nitrozellulose oder Plastikmaterialien als möglich verwendet werden können.
  • Die mittels Amplifikation erhaltenen Fragmente können einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker tragen. Bevorzugt sind Marker in Form von Fluoreszenzmarkern, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten, die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei es bevorzugt ist, daß die Fragmente, die produziert werden, eine einzelne positive oder negative Nettoladung zum besseren Nachweis im Massenspektrometer aufweisen. Der Nachweis kann durchgeführt werden und visualisiert werden mittels Matrix-assistierter Laserdesorptions-/Inonisierungs-Massenspektrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI).
  • Im nächsten Schritt werden die Nukleinsäureamplifikate analysiert, um den Methylierungsstatus der genomischen DNA vor der Behandlung zu bestimmen.
  • Die post-Behandlungsanalyse der Nukleinsäuren kann unter der Verwendung alternativer Verfahren durchgeführt werden. Verschiedene Verfahren für die Methylierungsstatus-spezifische Analyse der behandelten Nukleinsäuren sind unten beschrieben, andere alternative Verfahren werden dem Durchschnittsfachmann ersichtlich sein.
  • Unter der Verwendung verschiedener im Stand der Technik bekannter Verfahren kann die Analyse während des Amplifikationsschritts des Verfahrens durchgeführt werden. In einer solchen Ausführungsform kann der Methylierungsstatus von ausgewählten CpG-Positionen innerhalb der Gene FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorischen Regionen durch die Verwendung von Methylierungs-spezifschen Primeroligonukleotiden nachgewiesen werden. Diese Technik wurde in U.S.-Patent 6,265,171 von Herman beschrieben. Die Verwendung von Methylierungsstatus-spezifischen Primern für die Amplifikation von mit Bisulfit behandelter DNA ermöglicht die Differenzierung zwischen methylierten und nicht-methylierten Nukleinsäuren. MSP-Primerpaare enthalten mindestens einen Primer, der an ein Bisulfit behandeltes CpG-Dinukleotid hybridisiert. Daher umfaßt die Sequenz des Primers mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid. Für nicht-methylierte DNA spezifische MSP-Primer enthalten ein „T" an der 3'-Position der C-Position im CpG. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es daher bevorzugt, daß die Basensequenz der Primer erforderlicherweise eine Sequenz umfaßt, die eine Länge von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 oder 272 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert, wobei die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid umfaßt.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens kann der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels Hybridisierungsanalyse bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens werden die im zweiten Schritt erhaltenen Amplifikate an eine Anordnung oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. In diesem Kontext findet die Hybridisierung auf die wie folgt beschriebenen Weise statt. Das Set von Sonden, das während der Hybridisierung verwendet wird, setzt sich bevorzugterweise aus mindestens 4 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zusammen. Im Verfahren dienen die Amplifikate als Sonden, die an Oligonukleotide hybridisieren, die vorher an eine feste Phase gebunden wurden. Die nicht-hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz, die eine Länge von 10 Nukleotiden aufweist, die revers komplementär oder identisch ist zu einem Segment der Basensequenzen, die im Appendix angegeben sind, wobei das Segment mindestens ein CpG- oder ein TpG-Dinukleotid enthält. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Cytosin des CpG-Dinukleotids, oder im Fall von TpG das Thiamin, das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 10-mers. Ein Oligonukleotid existiert für jedes CpG- oder TpG-Dinukleotid.
  • Die nicht hybridisierten Amplifikate werden dann entfernt. Im letzten Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. In diesem Kontext ist es bevorzugt, daß an die Amplifikate angebrachte Marker an jeder Position der festen Phase identifizierbar sind, an der eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels Oligonukleotidsonden ermittelt werden, die an die behandelte DNA zusammen mit den PCR-Amplifikationsprimern hybridisiert werden (wobei die Primer entweder Methylierungs-spezifisch oder Standard sein können).
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Verwendung von Fluoreszenz-basierter Echtzeit-Quantitativer-PCR (Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996), die eine dual-markierte fluoreszente Oligonukleotidsonde verwendet (TaqManTMPCR, unter der Verwendung eines ABI Prism 7700 Sequenznachweissystems, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). Die TaqManTMPCR-Reaktion nutzt die Verwendung eines nicht-verlängerbaren Untersuchungs-Oligonukleotids, das TaqManTM-Sonde genannt wird und das so aufgebaut ist, um an eine GpC-reiche Sequenz zu hybridisieren, die zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-Amplifikationsprimern lokalisiert ist. Die TaqManTM-Sonde umfaßt weiterhin eine fluoreszente „Reportergruppe" und eine „Quenchergruppe", die kovalent an Linkergruppen gebunden sind (z. B. Phosphoramidite), die an die Nukleotide des TaqManTM-Oligonukleotids angebracht sind. Zur Analyse von Methylierung innerhalb von Nukleinsäuren im Anschluß an die Bisulfitbehandlung ist es erforderlich, daß die Sonde Methylierungs-spezifisch ist, wie in U.S. 6,331,393 (hier durch Bezugnahme mit aufgenommen) beschrieben ist, was auch als MethylLight-Test bekannt ist. Variationen der TaqManTM-Nachweismethodologie, die ebenfalls zur Verwendung mit der beschriebenen Erfindung brauchbar sind, schließen die Verwendung von dualer Sondentechnologie (LightcyclerTM) oder fluoreszenten Amplifikationsprimern (SunriseTM-Technologie) ein. Diese beiden Techniken können auf eine geeignete Weise an die Verwendung mit Bisulfit behandelter DNA angepaßt werden, und darüber hinaus zur Methylierungsanalyse innerhalb von CpG-Dinukleotiden.
  • Ein weiter geeignetes Verfahren zur Verwendung von Sonden-Oligonukleotiden zur Bestimmung von Methylierung durch Analyse von Bisulfit-behandelten Nukleinsäuren ist die Verwendung von blockierenden Oligonukleotiden. Die Verwendung von solchen Oligonukleotiden wurde in BioTechniques 23(4), 1997, 714–720 D. Yu, M. Mukai, Q. Liu, C. Steinman beschrieben. Blockierende Oligonukleotidsonden werden an die Bisulfit-behandelte Nukleinsäure gemeinsam mit den PCR-Primern hybridisiert. Die PCR-Amplifikation der Nukleinsäure bricht an der 5'-Position der blockierenden Sonden ab, wodurch die Amplifikation einer Nukleinsäure unterdrückt wird, wenn die komplementäre Sequenz zu der blockierenden Son de vorhanden ist. Die Sonden können so aufgebaut sein, um an die Bisulfit-behandelte Nukleinsäure auf einen Methylierungsstatus-spezifische Weise zu hybridisieren. Zum Beispiel würde für den Nachweis von methylierten Nukleinsäuren innerhalb einer Population von nicht-methylierten Nukleinsäuren eine Unterdrückung der Amplifikation von Nukleinsäuren, die an der fraglichen Position nicht-methyliert sind, durch die Verwendung von blockierenden Sonden bewirkt werden, die ein „CG" an der fraglichen Position umfassen, im Gegensatz zu einem „CA".
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der Nachweis des Methylierungsstatus der CpG-Positionen durch die Verwendung von Templat-gesteuerter Oligonukleotidverlängerung durchgeführt, wie zum Beispiel MS-SNuPE, wie durch Gonzalgo und Jones (Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531) beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird die Bestimmung des Methylierungsstatus der CpG-Positionen durch Sequenzierung und anschließende Sequenzanalyse des im zweiten Schritt des Verfahrens erzeugten Amplifikats ermöglicht (Sanger F., et al., 1977 PNAS USA 74: 5463–5467).
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus von genomischer DNA ohne den Bedarf für eine Vorbehandlung. In den ersten und zweiten Schritten des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe erhalten und aus dem Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zellinien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeit oder in Paraffin eingebettetes Gewebe einschließen. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für den Fachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergenzlysaten, Beschallung und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, dies kann durch jedes Mittel erfolgen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere mit Restriktions-Endonukleasen. In dem dritten Schritt wird die DNA dann mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so ausgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle für den Methylierungszustand eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird dies unter der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt.
  • Im letzten Schritt werden die Amplifikate nachgewiesen. Der Nachweis kann durch jedes Mittel das Standard im Stand der Technik ist erfolgen, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Gelelektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Array-Analyse, MALDI- oder ESI-Analyse.
  • Das oben erwähnte Verfahren wird bevorzugterweise zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA angewendet.
  • Um dieses Verfahren weiter zu ermöglichen, stellt die Erfindung weiterhin die modifizierte DNA von Genen ausgewählt aus der Gruppe von FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 zur Verfügung, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen innerhalb dieser Gene. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß genetische und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster der genomischen DNAs insbesondere für die verbesserte Behandlung und die Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen geeignet sind.
  • Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Analyse von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA verwendet werden.
  • Die Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 18 Basen der vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und dazu komplementärer Sequenzen enthält, gelöst.
  • Die modifizierten Nukleinsäuren konnten bis jetzt nicht mit der Ermittlung von Erkrankungsrelevanten genetischen und epigenetischen Parametern in Zusammenhang gebracht werden.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder ein Oligomer zur Analyse von vorbehandelter DNA zum Nachweis des genomischen Cytosin-Methylierungszustands gelöst, wobei das Oligonukleotid mindestens eine Basensequenz enthält, die eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte genomische DNA gemäß SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 hybridisiert. Die Oligomersonden gemäß der vorliegenden Erfindung stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, die es zum ersten Mal ermöglichen, spezifische genetische und epigenetische Parameter während der Analyse von biologischen Proben auf mit der Antwort eines Patienten auf Tamoxifen-Behandlung zusammenhängende Merkmale zu ermitteln. Die Oligonukleotide ermöglichen die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugterweise mindestens ein CpG- oder TpG-Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptid-Nukleinsäure) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Insbesondere bevorzugt sind Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung, in denen das Cytosin des CpG-Dinukleotids innerhalb des mittleren Drittels des Oligonukleotids liegt, z. B. das 5.–9. Nukleotid vom 5'-Ende eines 13-mer-Oligonukleotids; oder im Fall eines PNA-Oligomers ist es bevorzugt, daß das Cytosin des CpG-Dinukleotids das 4.–6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers ist.
  • Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in so genannten „Sets" verwendet, die mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb von SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 enthalten.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Oligomere gemäß SEQ ID Nrn.: 955, 955, 956, 956, 957, 957, 958, 958–964 zur Vorhersage der Antwort eines Subjekts auf Tamoxifen Behandlung in einem Anschluß-Ansatz verwendet. In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Oligomere gemäß SEQ ID Nrn.: 941–954 zur Vorhersage der Antwort eines Subjekts auf Tamoxifen Behandlung in einem metastatischen Ansatz verwendet.
  • Im Fall der Sets der Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Es ist weiter bevorzugt, daß alle Oligonukleotide eines Sets an eine feste Phase gebunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Set von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands von genomischer DNA verwendet werden, durch Analyse der Sequenz oder behandelten Versionen der Sequenz (der Gene FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6, wie im Sequenzprotokoll und in Tabelle 1 angegeben und dazu komplementären Sequenzen). Diese Sonden ermöglichen eine verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen.
  • Das Set von Oligomeren kann auch dazu verwendet werden, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) durch die Analyse der Sequenz oder behandelten Versionen der Sequenz (der Gene FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6, wie im Sequenzprotokoll und in Tabelle 1 angegeben) nachzuweisen.
  • Es wird einem Fachmann offensichtlich sein, daß das Verfahren gemäß der Erfindung durch die Inkorporation von Markern und klinischen Indikatoren, die im Stand der Technik bekannt sind, und augenblicklich als prädiktiv für den Ausgang der Tamoxifen-Behandlung verwendet werden, verbessert und ergänzt werden wird. Weiter bevorzugt schließen diese Marker Knotenstatus, Alter, menopausalen Status, Phase, Estrogen- und Progesteronrezeptoren ein Die Gene und/oder Nukleinsäuren, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, können dazu verwendet werden, ein „Gen-Panel" zu bilden, d.h. eine Sammlung, die die bestimmten genetischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung und/oder deren jeweilige informative Methylierungsstellen umfaßt. Die Bildung von Gen-Panels ermöglicht eine schnelle und spezifische Analyse von spezifischen Aspekten der Brustkrebsbehandlung. Die wie in dieser Erfindung beschriebenen und angewendeten Gen-Panels) können mit überraschend hoher Effizienz für die Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen durch eine Vorhersage des Ausgangs der Behandlung mit dem Wirkstoff Tamoxifen verwendet werden.
  • Die Effizienz des Verfahrens gemäß der Erfindung ist verbessert, wenn bei Patienten angewendet, die nicht mit Chemotherapie behandelt wurden. Daher ist dies eine besonders bevor zugte Ausführungsform des Verfahrens, wobei das Verfahren zur Ermittlung von Subjekten verwendet wird, die keiner Chemotherapie unterzogen wurden.
  • Die Verbindung von multiplen CpG-Stellen aus einer diversen Anordnung von Genen, erlaubt zusätzlich ein überraschend hohes Ausmaß an Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu diagnostischen und Nachweis-Werkzeugen auf der Basis von einzelnen Genen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes „Array") durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, und auf eine solche Weise vorliegt, daß es ähnlich an eine feste Phase gebunden ist. Diese Anordnung von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie an der festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die feste Phase-Oberfläche ist bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch können Nitrozellulose, sowie Plastikmaterialien, wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Pellets oder auch als Harz-Matrices vorliegen können, geeignete Alternativen sein.
  • Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines an einem Trägermaterial befestigten Arrays zur verbesserten Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. In diesem Verfahren wird mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekoppelt. Verfahren zur Herstellung solcher Arrays sind bekannt, zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,744,305 mittels Festphasen-Chemie und photolabilen Schutzgruppen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip für die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Der DNA-Chip enthält mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. DNA-Chips sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,837,832 bekannt.
  • Darüber hinaus ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagenz, einem Set von Primeroligonukleotiden, das mindestens zwei Oligomere, deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment der Basensequenzen, die in SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 angegeben sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens zusammengesetzt ist.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann das Kit weiterhin Standardreagenzien zur Durchführung einer CpG-Positions-spezifischen Methylierungsanalyse umfassen, wobei die Analyse eine oder mehrere der vorliegenden Techniken umfaßt: MS-SNuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl und Nukleinsäuresequenzierung. Jedoch kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung auch nur einen Teil der oben genannten Komponenten enthalten.
  • Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung oder Arrays davon sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung sind für die Anwendung bei der verbesserten Behandlung und Überwachung von Brustzell- proliferativen Erkrankungen gedacht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren bevorzugterweise für die Analyse von wichtigen genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb genomischer DNA verwendet, insbesondere zur Anwendung bei der verbesserten Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden für die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankung von Brustzellen durch Ermöglichen von besser fundierten Behandlungsschemata verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die nachteilig oder relevant für die Patienten oder Individuen sind, in denen wichtige genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb genomischer DNA – wobei diese Parameter mittels der vorliegenden Erfindung erhalten wurden – mit einem anderen Set von genetischen oder epigenetischen Parametern verglichen werden können, wobei die Unterschiede als Basis für die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dienen, die für Patienten oder Individuen nachteilig oder relevant sind. Beispiele solcher Parameter schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, die Ermittlung von Estrogen- und Progesteronmarkern.
  • Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Bindung eines Oligonukleotids unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an eine vollständig komple mentäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben-DNA verstanden werden.
  • "Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von genomischer DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere werden als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) bezeichnet.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „Methylierungszustand" als das in einer Nukleinsäure von Interesse vorhandene Ausmaß an Methylierung bedeutend verstanden werden, dies kann in absoluten oder relativen Ausdrücken geschehen, d.h. als ein Prozentsatz oder anderer numerischer Wert oder durch Vergleich mit anderem Gewebe und das darin als hypermethyliert, hypomethyliert oder als einen signifikant ähnlichen oder identischen Methylierungs-Status aufweisend beschrieben ist.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „regulatorische Region" eines Gens als Nukleinsäuresequenzen bedeutend verstanden werden, die die Expression eines Gens beeinflussen. Diese regulatorischen Regionen können innerhalb, proximal oder distal des Gens lokalisiert sein. Diese regulatorischen Regionen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, konstitutive Promotoren, Gewebs-spezifische Promotoren, Entwicklungs-spezifische Promotoren, induzierbare Promotoren und ähnliche. Promotor-regulatorische Elemente können auch bestimmte Enhancer-Sequenzelemente einschließen, die die Transkriptions- oder Translations-Effizienz des Gens kontrollieren.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Chemotherapie" als die Verwendung von Wirkstoffen oder chemischen Substanzen zur Behandlung von Krebs bedeutend verstanden werden. Diese Definition schließt eine Bestrahlungstherapie (Behandlung mit Strahlung hoher Energie oder Partikeln), Hormontherapie (Behandlung mit Hormonen oder Hormon-Analoga (synthetischen Substituten) und chirurgische Behandlung aus.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind "epigenetische Parameter" insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere Modifikationen von DNA-Basen genomischer DNA und Sequenzen, die weiter für deren Regulation benötigt werden. Weitere epigenetische Parameter schließen beispielsweise die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Anschluß-Behandlung" als eine Therapie eines Krebspatienten unmittelbar im Anschluß an eine anfängliche nicht chemotherapeutische Therapie, z.B. Chirurgie bedeutend verstanden werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird die Anschluß-Therapie unter der Verwendung von Tamoxifen durchgeführt. Im allgemeinen ist es der Zweck einer Anschluß-Therapie, ein signifikant geringeres Risiko des Rückfalls, verglichen zu keiner Anschluß-Therapie, zur Verfügung zu stellen.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Estrogen- und/oder Progesteronrezeptor positiv" als Zellen bedeutend verstanden werden, die auf ihrer Oberfläche Rezeptoren exprimieren, die gegenüber der Bindung von Estrogenen und/oder Progesteronen empfindlich sind.
  • Im folgenden wird die Erfindung genauer auf der Basis der Sequenzen, Figuren und Beispiele beschrieben werden, ohne darauf begrenzt zu werden.
  • 1 zeigt eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Die X-Achse zeigt die Tumormasse(n), wobei die Linie '2' die Grenze der Nachweisbarkeit anzeigt. Die Y-Achse zeigt die Zeit an. Dem zufolge zeigt die Figur ein vereinfachtes Modell der Tamoxifen-Behandlung eines Phase 1–3 Brusttumors, wobei die primäre Behandlung Chirurgie war (an Punkt 1), gefolgt von einer Anschluß-Therapie mit Tamoxifen. In einem ersten Szenario ist ein Ansprechender auf die Behandlung (4) als unterhalb der Grenze der Nachweisbarkeit während der Dauer der Beobachtung verbleibend gezeigt. Ein nicht-Ansprechender auf die Behandlung (5) weist eine Periode von Erkrankungs-freiem Überleben auf (2), gefolgt von einem Wiederauftreten, als die Karzinommasse die Grenze der Nachweisbarkeit erreicht.
  • 2 zeigt eine weitere bevorzugte Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Die X-Achse zeigt die Tumormasse(n), wobei die Linie '2' die Grenze der Nachweisbarkeit anzeigt. Die Y-Achse zeigt die Zeit an. Dem zufolge zeigt die Figur ein vereinfachtes Modell der Tamoxifen-Behandlung eines späte Phase-Brusttumors, wobei die primäre Behandlung Chirurgie war (an Punkt 1), gefolgt von einem Rückfall, der mit Tamoxifen behandelt wurde (2). In einem ersten Szenario ist ein Ansprechender auf die Behandlung (4) als unterhalb der Grenze der Nachweisbarkeit während der Dauer der Beobachtung verbleibend gezeigt. Ein nicht-Ansprechender auf die Behandlung (5) erholt sich nicht von dem Rückfall.
  • 3 bis 10 zeigen eine gewichtete Matrix weiterer Daten, die gemäß Beispiel 4 erhalten wurden, die Unterschieden in der CpG-Methylierung zwischen den Klassen von Geweben entsprechen, unter der Verwendung eines Algorithmus. 3, 5, 7 und 9 sind in Graustufungen gezeigt, wobei die am meisten signifikanten CpG-Positionen sich in der Matrix unten befinden, wobei die Signifikanz nach oben hin abnimmt. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung an einer angegebenen CpG-Position, weiß stellt keine Methylierung an der besonderen Position dar, wobei die Ausmaße der Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (niedriger Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung). Jede Zeile stellt eine spezifische CpG-Position innerhalb eines Gens dar und jede Spalte das Methylierungsprofil für die verschiedenen CpGs für eine Probe dar. Auf der linken Seite ist eine CpG- und Gen-Bezeichnung gezeigt, diese kann mit der beigefügten Tabelle (Tabelle 3) verglichen werden, um das fragliche Gen und das verwendete Nachweisoligomer zu bestimmen. Auf der rechten Seite sind p-Werte für die einzelnen CpG-Positionen gezeigt. Die p-Werte sind die Wahrscheinlichkeiten dafür, daß die beobachtete Verteilung in dem Datenset zufällig auftrat. 4, 6, 8 und 10 sind die rot-grün Versionen der voranstehenden Figuren (d.h. jeweils 3, 5, 7 und 9). Rot zeigt eine vollständige Methylierung an einer angegebenen CpG-Position, grün stellt keine Methylierung an der bestimmten Position dar.
  • SEQ ID Nrn.: 15, 31, 32, 63, 40, 9 und 33 stellen 5' und/oder regulatorische Regionen und/oder CpG-reiche Regionen der Gene gemäß Tabelle 1 dar. Diese Sequenzen sind aus der Genbank abgeleitet und sollen als alle kleineren Variationen des Sequenzmaterials einschließend angesehen werden, die im Augenblick nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.
  • SEQ ID Nrn.: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 zeigen die vorbehandelte Sequenz von DNA, die von der genomischen Sequenz gemäß Tabelle 1 abgeleitet ist. Diese Sequenzen sollen als alle kleineren Variationen des Sequenzmaterials einschließend angesehen werden, die im Augenblick nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.
  • SEQ ID Nr.: 459 bis SEQ ID Nr.: 964 zeigen die Sequenz von Oligomeren, die für die Analyse von CpG-Positionen innerhalb genomischer DNA gemäß SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 63 gemäß Tabellen 2 und 3 geeignet sind.
  • SEQ ID Nr.: 941 bis SEQ ID Nr.: 964 zeigen die Sequenz von Oligomeren, die für die Analyse des Methylierungszustands von CpG-Positionen innerhalb genomischer DNA gemäß SEQ ID Nrn.: 15, 31, 32, 63, 40, 9 und 33 besonders geeignet sind.
  • Tabelle 1: Informative Markergene
    Figure 00260001
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Das Gen CYP2D6 wurde unter der Verwendung der „Methylated CpG Island Amplification" (MCA)-Technik als verschieden hypermethyliert in Tamoxifen nicht-Ansprechenden, verglichen mit Tamoxifen-Ansprechenden, identifiziert. Dies Verfahren identifiziert hypermethylierte Sequenzen in einer Population genomischer DNA, verglichen mit einer zweiten Population, durch selektives Eliminieren von Sequenzen, die die hypermethylierten Regionen nicht enthalten. Dies wird durch Verdau von genomischer DNA mit einem Methylierungssensitiven Enzym durchgeführt, das nicht-methylierte Schnittstellen spaltet, um so „blunt" Enden zurückzulassen, gefolgt von Spaltung mit einem Isoschizomer, das Methylierungs insensitiv ist und „sticky" Enden zurückläßt. Dies wird von einer Amplikon-Herstellung und subtraktiver Hybridisierung der „Tester"-Population mit der „Driver"-Population gefolgt.
  • Alle Proben stammten von Patienten, die mit Tamoxifen als eine Anschluß-Therapie unmittelbar im Anschluß an Chirurgie behandelt wurden, wie in 1 dargestellt.
  • Dieser McST wurde nur in einem Vergleich gefunden: Tamoxifen Ansprechende-Pool gegenüber Tamoxifen nicht-Ansprechende Pool und war in dem nicht-Ansprechende-Pool hypermethyliert. Der Ansprechende Pool bestand aus 16 Proben (jeweils 1,5 μg, insgesamt 24 μg). Nicht-Ansprechende Pools waren 8 Proben (jeweils 3 μg, gesamt von 24 μg). Die Ansprechenden-Pools waren „Driver", die nicht-Ansprechenden waren „Tester".
  • In den Ausgangs-Reaktionen wurden 5 μg jedes genomischen DNA-Pools mit SmaI in einer 100 μl Reaktion über Nacht bei 25°C in NEB Puffer 4 + BSA und 100 Einheiten von Enzym (10 μl) verdaut. Die Pools wurden dann weiter mit XmaI (2 μl = 100 U) verdaut, 6 Stunden bei 37°C.
  • 500 ng des gereinigten verdauten Materials wurden an die Adapterprimer SEQ ID Nr.: 965 und SEQ ID Nr.: 966 (Sequenz: SEQ ID Nr.: 965: AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAC; SEQ ID Nr.: 966: CCGGGTCGGTGA) ligiert. Diese wurden hybridisiert, um den Adapter durch Erhitzen zusammen bei 70°C und langsames Abkühlen auf RT in einer 30 μl Reaktion über Nacht bei 16 Grad mit 400 U (1 μl) T4 Ligase Enzym herzustellen. 3 μl des Ligationsgemisches für sowohl Tester- und Driverpopulationen wurden in jeder anfänglichen PCR verwendet, um die Startamplikons zu erzeugen. Zwei PCR-Reaktionen wurden für die Tester und acht für die Driver durchgeführt. Die Reaktionen waren 100 μl, mit 1 μl 100 μM Primer SEQ ID Nr.: 965 (AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAC), 10 μl PCR Puffer, 1,2 μl 25 mM dNTPs, 68,8 uL Wasser, 1 μl Titan Taq, 2 μl DMSO und 10 μl 5 M Betain. Ein anfänglicher 95 Grad für 1 Min-Schritt, gefolgt von 25 Zyklen bei 95 Grad für 1 Min, gefolgt von 72 Grad für 3 Min und einer finalen Extension bei 72 Grad für 10 Min wurden durchgeführt.
  • Die Testeramplikons wurden dann mit XmaI wie oben beschreiben verdaut, was überhängende Enden ergab, und die Driveramplikons wurden mit SmaI, wie oben, verdaut, was blunt-Enden Fragmente ergab.
  • Ein neues Set von Adapterprimern (wie für die RXMA Primer beschrieben hybridisiert) SEQ ID Nr.: 967 und SEQ ID Nr.: 968 (SEQ ID Nr.: 967: ACCGACGTCGACTATCCATGAACC; SEQ ID Nr.: 968: CCGGGGTTCATG) wurden nur an die Tester, unter Anwendung derselben Bedingungen wie vorher, ligiert.
  • Fünf μg von verdauten Tester- und 40 μg von verdauten Driver-Amplikons wurden in einer Lösung, die 4 μl EE (30 mM EPPS, 3 mM EDTA) und 1 μl 5 M NaCl enthielt, bei 67°C für 20 Stunden hybridisiert. Eine selektive PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von Primer SEQ ID Nr.: 967 (Sequenz: SEQ ID Nr.: 967: ACCGACGTCGACTATCCATGAACC) durchgeführt. Die Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: Ein anfänglicher Auffüllschritt von 72 Grad 5 Min, gefolgt von 95 Grad für 1 Min, 72 Grad für 3 Min für 10 Zyklen. 10 μl Mung Bean Nuklease Puffer plus 10 μl Mung Bean Nuklease (10 U) wurden hinzugefügt und bei 30 Grad für 30 Min inkubiert. Diese Reaktion wurde gereinigt und als ein Templat für 25 weitere Zyklen von PCR unter der Verwendung des SEQ ID Nr.: 967 Primer und denselben Bedingungen verwendet.
  • Das sich ergebende PCR-Produkt (Tester) wird dann nochmals unter der Verwendung von XmaI wie oben verdaut und ein dritter Adapter, SEQ ID Nr.: 969 und SEQ ID Nr.: 970 (Sequenz: SEQ ID Nr.: 969: AGGCAACTGTGCTATCCGAGTGAC; SEQ ID Nr.: 970: CCGGGTCACTCG) wurde ligiert. Der Tester (500 ng) wurde ein zweites Mal an den original verdauten Driver (40 μg) in 4 μl EE (30 mM EPPS, 3 mM EDTA) und 1 μl 5 M NaCl bei 67°C für 20 Stunden hybridisiert. Eine selektive PCR wurde unter der Verwendung von SEQ ID Nr.: 969 Primer (Sequenz: SEQ ID Nr.: 969: AGGCAACTGTGCTATCCGAGTGAC) wie folgt durchgeführt: ein anfänglicher Auffüllschritt von 72 Grad, 5 Min, gefolgt von 95 Grad für 1 Min, 72 Grad für 3 Min für 10 Zyklen. 10 μl Mung Bean Nuklease Puffer plus 10 μl Mung Bean Nuklease (10 U) wurden hinzugefügt und bei 30 Grad für 30 Min inkubiert. Diese Reaktion wurde gereinigt und als ein Templat für 25 weitere Zyklen PCR unter der Verwendung von SEQ ID Nr.: 969 Primer und denselben Bedingungen verwendet.
  • Das sich ergebende PCR-Produkt (1,8 μg) wurde mit XmaI verdaut (in 50 μl Gesamtvolumen, NEB Puffer 4 + BSA und 2 μl = 100 U XmaI, 6 Stunden bei 37°C) und in den Vektor pBCSk – vorverdaut mit XmaI und phosphatasiert (675 ng) – ligiert. 5 μl einer 30 μl Ligation wurden verwendet, um chemisch kompetente TOP 10 Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu transformieren. Die Transformationen wurden auf LB/XGal/IPTG/CAM-Platten plattiert.
  • Ungefähr 50 Insert-enthaltende Kolonien, aufgrund ihres Fehlens von blauer Farbe ersichtlich, wurden zur Sequenzierung ausgewählt.
  • Die erhaltenen Insert-positiven Klone wurde unter der Verwendung von Vektorprimern sequenziert und die Sequenz wurde mit der EnsEMBL Golden Path Genom-Datenbank unter Verwendung des NCBI BLAST Programms (Ref.), das sich auf einem internen Server befand, verglichen.
  • Beispiele 2 und 3
  • In den folgenden Beispielen wurde eine Multiplex PCR einer großen Auswahl von Genen gemäß Tabelle 2 an Gewebeproben von Brustkrebs-Patientinnen durchgeführt, die mit dem Wirkstoff Tamoxifen behandelt wurden, dann wurden Vergleiche von Ansprechenden auf den Wirkstoff gegenüber den nicht-Ansprechenden auf den Wirkstoff in sowohl den Anschluß- als auch den metastatischen Ansätzen durchgeführt (siehe 1 und 2).
  • Jede Probe wurde auf die unten in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, um den Methylierungsstatus der CpG-Positionen abzuleiten, wobei die CpG-Methylierungs-Information für jede Probe kollationiert wurde und dann in einer Analyse, wie in Beispiel 3 angegeben, verwendet.
  • Beispiel 2
  • Im ersten Schritt wurde die genomische DNA aus den Zellproben unter der Verwendung des Wizzard Kits von Promega isoliert.
  • Die isolierte genomische DNA ausn den Proben wurden unter der Verwendung einer Bisulfitlösung (Hydrogensulfit, Disulfit) behandelt. Die Behandlung ist solchermaßen, daß alle nicht-methylierten Cytosine innerhalb der Probe in Thiamidin überführt wurden, umgekehrt verbleiben 5-methylierte Cytosine innerhalb der Probe nicht-modifiziert.
  • Die behandelten Nukleinsäuren wurden dann unter der Verwendung von Multiplex-PCRs amplifiziert, wobei acht Fragmente pro Reaktion mit Cy5 fluoreszent markierten Primern amplifiziert wurden. Die verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 2 beschrieben. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt.
  • Reaktionslösung:
    • 10 ng Bisulfit-behandelte DNA
    • 3,5 mM MgCl2
    • 400 μM dNTPs
    • 2 pMol jedes Primers
    • 1 U HotStar Taq (Qiagen)
  • Vierzig Zyklen wurden wie folgt durchgeführt. Denaturierung bei 95°C für 15 Min, gefolgt von Annealing bei 55°C für 45 Sec, Primer Elongation bei 65°C für 2 Min. Eine finale Elongation bei 65°C wurde für 10 Min durchgeführt.
  • Alle PCR-Produkte von jeder individuellen Probe wurden dann an Glas-Objektträger hybridisiert, die ein Paar von immobilisierten Oligonukleotiden für jede CpG Position unter Analyse trugen. Jedes dieser Nachweis-Oligonukleotide war so aufgebaut, um an die Bisulfitkonvertierte Sequenz um eine CpG-Stelle herum zu hybridisieren, die entweder anfänglich nicht-methyliert (TG) oder methyliert (CG) war. Siehe Tabelle 3 für weitere Details aller verwendeten Hybridisierungs-Oligonukleotide. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt, um den Nachweis der einzelnen Nukleotid-Unterschiede zwischen den TG- und CG-Varianten zu ermöglichen.
  • 5 μl Volumen jedes Multiplex-PCR-Produkts wurden in 10 × Ssarc Puffer (10 × Ssarc:230 ml 20 × SSC, 180 ml Natriumlauroylsarcosinat-Lösung 20%, verd. auf 1000 ml mit dH2O) verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde dann an die Nachweis-Oligonukleotide wie folgt hybridisiert. Denaturierung bei 95°C, Abkühlen auf 10°C, Hybridisierung bei 42°C über Nacht, gefolgt von Waschen mit 10 × Ssarc und dH2O bei 42°C.
  • Die Fluoreszenzsignale für jedes hybridisierte Oligonukleotid wurden unter der Verwendung des Genepix-Scanners und -software nachgewiesen. Die Verhältnisse für die zwei Signale (von dem CG-Oligonukleotid und dem TG-Oligonukleotid, das dazu verwendet wurde, um jede CpG-Position zu analysieren) wurde basierend auf dem Vergleich der Intensität der Fluoreszenzsignale berechnet.
  • Beispiel 3
  • Die nach Beispiel 2 erhaltenen Daten wurden dann gemäß den Unterschieden in der CpG-Methylierung zwischen den beiden Klassen von Geweben unter der Verwendung eines Algorithmus in eine gewichtete Matrix einsortiert (wie in 1 gezeigt). Die am meisten signifikanten CpG-Positionen befinden sich unten in der Matrix, wobei die Signifikanz nach oben hin abnimmt. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung an einer gegebenen CpG-Position, weiß stellt keine Methylierung an einer bestimmten Position dar, wobei Anteile von Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (niedriger Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung). Jede Zeile stellt eine spezifische CpG-Position innerhalb eines Gens dar und jede Spalte zeigt das Methylierungsprofil für die verschiedenen CpGs für eine Probe. Auf der linken Seite ist ein CpG und Gen-Identifizierer gezeigt, der mit der beigefügten Tabelle (Tabelle 3) übereinstimmt, um das fragliche Gen und das verwendete Nachweisoligomer zu bezeichnen. Auf der rechten Seite sind die p-Werte für die einzelnen CpG-Positionen gezeigt. Die p-Werte sind die Wahrscheinlichkeiten, daß die beobachtete Verteilung in dem Datenset zufällig auftrat.
  • Für ausgewählte Unterscheidungen wurde eine Lern-Algorithmus durch die Erfinder trainiert (Support Vector Maschine, SVM). Die SVM (wie diskutiert von F. Model, P. Adorjan, A. Olek, C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer classification. Bioinformatics. 2001 Jun;17 Suppl 1: S 157–64) konstruiert eine optimale Diskriminante zwischen zwei Klassen von gegebenen Trainingsproben. In diesem Fall wird jede Probe durch die Methylierungsmuster (CG/TG Verhältnisse) an den untersuchten CpG-Stellen beschrieben. Die SVM wurde an einem Unterset von Proben jeder Klasse trainiert, die mit der Diagnose beigefügt präsentiert wurden. Unabhängige Testproben, die nicht der SVM vorher gezeigt wurden, wurden dann präsentiert, um zu ermitteln, ob die Diagnose basierend auf dem in der Trainingsrunde kreierten Prädiktor richtig vorhergesagt werden kann. Dieses Verfahren wurde mehrere Male unter der Verwendung von verschiedenen Partitionen der Proben wiederholt, ein Verfahren, das Kreuzvalidierung genannt wird. Es ist zu bemerken, daß alle Runden ohne die Verwendung von in den vorherigen Läufen erhaltenem Wissen durchgeführt wurden. Die Zahl von korrekten Klassifizierungen wurde über alle Läufe hinweg Bemittelt, was eine gute Abschätzung unserer Testgenauigkeit ergibt (Prozent von korrekten Klassifizierungen über alle Runden hinweg).
  • Beispiel 4
  • Die zusätzlichen nach den Beispielen 2 und 3 erhaltenen Daten werden dann unter der Verwendung eines Algorithmus in eine gewichtete Matrix einsortiert (wie in 3 bis 10 gezeigt), in Übereinstimmung mit den CpG-Methylierungs-Unterschieden zwischen den zwei Klassen von Geweben. 3, 5, 7 und 9 sind in Grauwerten dargestellt, wobei sich die am meisten signifikanten CpG-Positionen Beispiel unten in der Matrix befinden, wobei die Signifikanz nach oben hin abnimmt. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung an einer gegebenen CpG-Position, weiß stellt keine Methylierung an einer bestimmten Position dar, wobei Anteile von Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (niedriger Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung). Jede Zeile stellt eine spezifische CpG-Position innerhalb eines Gens dar und jede Spalte zeigt das Methylierungsprofil für die verschiedenen CpGs für eine Probe. Auf der linken Seite ist ein CpG und Gen-Identifizierer gezeigt, der mit der beigefügten Tabelle (Tabelle 3) übereinstimmt, um das fragliche Gen und das verwendete Nachweis-Oligomer zu bezeichnen. Auf der rechten Seite sind die p-Werte für die einzelnen CpG-Positionen gezeigt. Die p-Werte sind die Wahrscheinlichkeiten, daß die beobachtete Verteilung in dem Datenset zufällig auftrat. 4, 6, 8 und 10 sind die rot-grün-Versionen der voranstehenden Figuren (d.h. jeweils 3, 5, 7 und 9). Dunkelgrau zeigt eine vollständige Methylierung an einer gegebenen CpG-Position an, hellgrau stellt keine Methylierung an der bestimmten Position dar.
  • Für ausgewählte Unterscheidungen wurde eine Lern-Algorithmus durch die Erfinder trainiert (Support Vector Maschine, SVM). Die SVM (wie diskutiert von F. Model, P. Adorjan, A. Olek, C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer classification: Bioinformatics. 2001 Jun;17 Suppl 1: S 157–64) konstruiert eine optimale Diskriminante zwischen zwei Klassen von gegebenen Trainingsproben. In diesem Fall wird jede Probe durch die Methylierungsmuster (CG/TG Verhältnisse) an den untersuchten CpG-Stellen beschrieben. Die SVM wurde an einem Unterset von Proben jeder Klasse trainiert, die mit der Diagnose beigefügt präsentiert wurden. Unabhängige Testproben, die der SVM vorher nicht gezeigt wurden, wurden dann präsentiert, um zu ermitteln, ob die Diagnose basierend auf dem in der Trainingsrunde kreierten Prädiktor richtig vorhergesagt werden kann. Dieses Verfahren wurde mehrere Male unter der Verwendung von verschiedenen Partitionen der Proben wiederholt, ein Verfahren, das Kreuzvalidierung genannt wird. Es ist zu bemerken, daß alle Runden ohne die Verwendung von in den vorherigen Läufen erhaltenem Wissen durchgeführt wurden. Die Zahl von korrekten Klassifizierungen wurde über alle Läufe hinweg gemittelt, was eine gute Abschätzung unserer Testgenauigkeit ergibt (Prozent von korrekten Klassifizierungen über alle Runden hinweg).
  • Anschluß-Ansatz
  • Die Analyse der Methylierungsmuster der mit Tamoxifen als eine Anschluß-Therapie unmittelbar im Anschluß an Chirurgie (siehe 1) von behandelten Patienten-Proben ist in den Matrizes gemäß den 3 bis 6 gezeigt. In dieser Analyse kann gesehen werden, daß die Gene PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 signifikant verschieden zwischen den zwei Klassen von Geweben (auf die Therapie Ansprechende und nicht-Ansprechende auf die Therapie) methyliert waren.
  • In der in den 3 und 4 gezeigten Klassifikation, waren die Gene TP53 und MSMB in nicht-Ansprechenden auf den Wirkstoff Tamoxifen signifikant mehr methyliert, wobei Subjekte mit einem Erkrankungs-freien Überleben von weniger als 36 Monaten als nicht-Ansprechende klassifiziert wurden und Subjekte mit einem Erkrankungs-freien Überleben von mehr als 60 Monaten als Ansprechende klassifiziert wurden. Diese Klassifizierung wurde mit einer Sensitivität von 0,84 und einer Sensitivität von 0,16 durchgeführt.
  • In der in den 5 und 6 gezeigten Klassifizierung war das Gen PTGS2 signifikant höher methyliert in nicht-Ansprechenden auf den Wirkstoff Tamoxifen, wobei Subjekte mit einem Erkrankungs-freien Überleben von weniger als 24 Monaten als nicht-Ansprechende klassifiziert wurden und Subjekte mit einem Erkrankungs-freien Überleben von mehr als 100 Monaten als Ansprechende klassifiziert wurden. Diese Klassifizierungen wurde mit einer Sensitivität von 0,89 und einer Sensitivität von 0,48 durchgeführt.
  • Metastatischer Ansatz
  • Die Analyse der Methylierungsmuster von Patientenproben, die mit Tamoxifen in einem metastatischen Ansatz (siehe 2) behandelt wurden, ist in den Matrizes gemäß den 7 bis 10 gezeigt. Die analysierten Subjekte in dieser Klassifizierung wiesen einen Rückfall im Anschluß an eine anfängliche Behandlung auf, wobei die anschließende Metastasierung durch Tamoxifen behandelt wurde.
  • In der in 7 und 8 gezeigten Klassifikation waren die Gene FGFR1 und PSA waren signifikant weniger methyliert in nicht-Ansprechenden auf den Wirkstoff Tamoxifen. Subjekte mit einer progressiven Erkrankung wurden als nicht-Ansprechende klassifiziert, und Subjekte die eine teilweise oder vollständige Remission erzielten, wurden als Ansprechende klassifiziert. Diese Klassifizierung wurde mit einer Sensitivität von 0,45 und einer Sensitivität von 0,81 durchgeführt.
  • Die Sensitivität dieser Klassifikation konnte verbessert werden, indem nur diejenigen Patienten analysiert wurden, die nicht eine Chemotherapie unterzogen wurden. In dieser in den 9 und 10 gezeigten Klassifikation waren die Gene FGFR1, PSA und CGA signifikant weniger methyliert in nicht-Ansprechenden auf den Wirkstoff Tamoxifen. Die Sensitivität der Klassifikation wurde dadurch auf 0,54 verbessert und die Spezifität auf 0,85.
  • Tabelle 2: PCR Primer und Amplifikate
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Tabelle 3: Hybridisierungsoligonucleotide.
    Figure 00390002
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001

Claims (49)

  1. Verfahren zur Vorhersage der Empfindlichkeit eines Subjekts mit einer proliferativen Erkrankung der Zellen der Brustgewebe auf eine Therapie, die den Wirkstoff Tamoxifen umfaßt, umfassend a) Analysieren des Methylierungsmusters einer Zielnukleinsäure umfassend eines oder eine Kombination der Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FGFR1, PSA, CGA, PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorischer Regionen, durch ein in Kontakt bringen einer Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien, wobei das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Zielnukleinsäure unterscheidet, und b) Vergleichen des Methylierungsmusters der mindestens einen Zielnukleinsäure mit dem Methylierungsmuster der Zielnukleinsäure aus einem unbehandelten Subjekt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielnukleinsäure oder -säuren im wesentlichen eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn: 15, 31, 32, 63, 40, 9 und 33 und dazu komplementäre Sequenzen umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die proliferative Erkrankung der Zellen des Brustgewebes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ductalem Karzinom in situ, lobulärem Karzinom, colloidalem Karzinom, tubulärem Karzinom, medullärem Karzinom, metaplastischem Karzinom, intraductalem Karzinom in situ, lobulärem Karzinom in situ und papillärem Karzinom in situ.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Tamoxifen-Therapie eine Anschluß-Behandlung ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Subjekte Estrogen- und/oder Progesteronrezeptor positiv sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Zielnukleinsäure ausgewählt ist aus den Genen PTGS2, MSMB, TP53 und CYP2D6 und/oder deren regulatorischen Regionen und Kombinationen davon.
  7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Tamoxifen-Therapie zur Behandlung eines Rückfalls oder einer metastatischen proliferativen Erkrankungen von Zellen der Brustgewebe dient.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Subjekte keine Chemotherapie erhalten haben.
  9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8, wobei die Zielnukleinsäure ausgewählt ist aus den Genen FGFR1, PSA und CGA und/oder deren regulatorische Regionen und Kombinationen davon.
  10. Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen aus einer Sequenz mit einer Längen von mindestens 18 Basen gemäß einer der Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 und dazu komplementären Sequenzen besteht.
  11. Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer im wesentlichen aus einer Basensequenz mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden besteht, die hybridisiert an oder identisch ist zu einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID Nrn: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272.
  12. Oligomer nach Anspruch 11, wobei die Basensequenz mindestens eine CpG-Dinukleotidsequenz einschließt.
  13. Oligomer nach Anspruch 12, wobei das Cytosin des CpG-Dinukleotids ungefähr im mittleren Drittel des Oligomers lokalisiert ist.
  14. Set von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomere nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
  15. Set von Oligomeren nach Anspruch 14, umfassend Oligomere zum Nachweis des Methylierungsstatus aller CpG-Dinukleotide innerhalb der Gruppe von SEQ ID Nrn.: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 58 und dazu komplementärer Sequenzen.
  16. Set von mindestens zwei Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 11 bis 15, das als Primer-Oligonucleotide für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen von einer der SEQ ID Nrn. 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 58 und dazu komplementärer Sequenzen verwendet wird.
  17. Set von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 14 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist.
  18. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden, umfassend mindestens drei der Oligomere nach einem der Ansprüche 11 bis 17, zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands und/oder Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) innerhalb der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nrn: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 und dazu komplementärer Sequenzen.
  19. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung der verschiedenen Oligomeren (Array), die an ein Trägermaterial fixiert sind, zur Vorhersage der Antwort von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen auf eine Tamoxifen-Behandlung durch Analyse des Methylierungsstatus von einem der CpG-Dinukleotide der Gruppe von SEQ ID Nrn: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272, wobei mindestens ein Oligomer nach einem der Ansprüche 11 bis 17 an eine feste Phase gekoppelt wird.
  20. Anordnung von verschiedenen Oligomeren (Array) erhältlich nach Anspruch 19.
  21. Array von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese Oligonucleotide auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
  22. Array nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist.
  23. DNA- und/oder PNA-Array zur Vorhersage der Antwort von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen auf eine Tamoxifen-Behandlung durch Analyse des Methylierungsstatus von einem der CpG-Dinukleotide innerhalb der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nrn: 15, 31, 32, 63, 40, 9, 33, 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272, umfassend mindestens eine Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, von einem Subjekt, b) Extrahieren der genomischen DNA aus der Probe, c) Konvertieren von Cytosinbasen in der genomischen DNA Probe, die an der 5-Position nicht-methyliert sind, durch chemische Behandlung zu Uracil oder eine andere Base, die vom Basenpaarungsverhalten her von Cytosin verschieden ist; d) Amplifzieren mindestens eines Fragments der vorbehandelten genomischen DNA, wobei die Fragmente eine oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn: 109, 110, 234, 235, 141, 142 267, 268, 143, 144, 269, 270, 205, 206, 331, 332, 159, 160, 285, 286, 97, 98, 223, 224, 145, 146, 271 und 272 und dazu komplementären Sequenzen umfassen, e) Bestimmen des Methylierungsstatus der genomischen CpG-Dinukleotide durch Analyse der Amplifikat-Nukleinsäuren.
  25. Verfahren nach Anspruch 24 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach SEQ ID Nr: 955, 956, 956, 957, 957, 958, 958–964 durchgeführt wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach SEQ ID Nr: 941–954 durchgeführt wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach den Ansprüchen 11 bis 17 durchgeführt wird.
  28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach den Ansprüchen 11 bis 17 durchgeführt wird, und Verlängerung der/des hybridisierten Oligonukleotid(e) mittels mindestens einer Nukleotidbase.
  29. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Sequenzierung durchgeführt wird.
  30. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt d) unter der Verwendung von Methylierungs-spezifischen Primern durchgeführt wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels einer Kombination von mindestens zwei der in den Ansprüchen 27 bis 30 beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfit oder Disulfit durchgeführt wird.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, von einem Subjekt, b) Extrahieren der genomischen DNA aus der Probe, c) Verdauen der genomischen DNA, die eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr: 15, SEQ ID Nr: 31, SEQ ID Nr: 32, SEQ ID Nr: 63, SEQ ID Nr: 40, SEQ ID Nr: 9 und SEQ ID Nr.: 33 und dazu komplementäre Sequenzen umfaßt, mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen, und d) Nachweisen der DNA-Fragmente, die in dem Verdau von Schritt c) erzeugt wurden.
  34. Verfahren nach Anspruch 33 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsequenz oder -sequenzen, die in Schritt C verdaut werden, einer oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn: 72–78 umfassen.
  35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsequenz oder -sequenzen, die in Schritt C verdaut werden, einer oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn: 64–71 umfassen.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei der DNA-Verdau vor Schritt d) amplifiziert wird.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32 und 36, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als zehn verschiedenen Fragmente amplifiziert werden, die je eine Länge von 100–2000 Basenpaare aufweisen.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, 36 und 37 dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von mehreren DNA-Segmenten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32 und 36 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine Hitze-resistente DNA-Polymerase ist.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32 und 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
  41. Verfahren nach einem der 24 bis 32 und 36 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate nachweisbare Marker tragen.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Marker fluoreszente Marker, Radionuklide und/oder ablösbare Molekülfragmente sind, die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden kann.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate in dem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 42 und/oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung für eine bessere Nachweisbarkeit in dem Massenspektrometer aufweisen.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis ausgeführt und visualisiert wird mittels Matrix unterstützter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray Massenspektrometrie (ESI).
  46. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA aus Zellen oder zellulären Komponenten, die DNA enthalten erhalten werden, wobei die Quellen für DNA zum Beispiel Zelllinien, histologische Objektträger, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, lymphatisches Geweben, Ductus-Zellen, ductale Lavageflüssigkeit, Brustwarzen-Austrittsflüssigkeit, Knochenmark und Kombinationen davon umfassen.
  47. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit)-Reagenz, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 11 bis 17.
  48. Kit nach Anspruch 47, weiterhin umfassend Standardreagenzien zur Durchführung eines Methylierungstests aus der Gruppe bestehend aus MS-SNuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl, Nukleinsäuresequenzierung und Kombinationen davon.
  49. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 19 und 24 bis 46, einer Nucleinsäure nach Anspruch 10, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers nach einem der Ansprüche 11 bis 17, eines Kits nach Anspruch 43 oder 44, eines Arrays nach einem der Ansprüche 21 bis 23 oder eines Sets von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 14 bis 17 für die Charakterisierung, Klassifizierung und/oder Differenzierung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen, oder der Prädisposition gegen Zell-proliferative Erkrankungen.
DE2002145779 2002-10-01 2002-10-01 Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen Ceased DE10245779A1 (de)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2002145779 DE10245779A1 (de) 2002-10-01 2002-10-01 Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen
EP09009372.5A EP2157191B1 (de) 2002-10-01 2003-10-01 Verwendung von PITX2 Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Mammazellen
PCT/EP2003/010881 WO2004035803A2 (en) 2002-10-01 2003-10-01 Method and nucleic acids for the treatment of breast cell proliferative disorders
EP03808704A EP1554407B1 (de) 2002-10-01 2003-10-01 Verfahren für die behandlung von proliferativen erkrankungen von brustzellen
AT03808704T ATE437962T1 (de) 2002-10-01 2003-10-01 Verfahren für die behandlung von proliferativen erkrankungen von brustzellen
US10/517,741 US8101359B2 (en) 2002-10-01 2003-10-01 Method for determining risk of relapse of breast cancer following tamoxifen adjuvant therapy
JP2005501274A JP4649331B2 (ja) 2002-10-01 2003-10-01 乳房細胞増殖障害の改良治療方法および核酸
DE60328618T DE60328618D1 (de) 2002-10-01 2003-10-01 Verfahren für die behandlung von proliferativen erkrankungen von brustzellen
CA002500255A CA2500255A1 (en) 2002-10-01 2003-10-01 Method and nucleic acids for the treatment of breast cell proliferative disorders
ES03808704T ES2330328T3 (es) 2002-10-01 2003-10-01 Procedimiento para el tratamiento de trastornos proliferativos de celulas mamarias.
AU2003300504A AU2003300504B2 (en) 2002-10-01 2003-10-01 Method and nucleic acids for the improved treatment of breast cell proliferative disorders
ES09009372.5T ES2447566T3 (es) 2002-10-01 2003-10-01 Uso de ácidos nucleicos de PITX2 para mejorar el tratamiento de trastornos proliferativos de células mamarias
US11/011,332 US20060024684A1 (en) 2002-10-01 2004-12-13 Prognostic markers for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients
US11/628,703 US20090269736A1 (en) 2002-10-01 2005-06-06 Prognostic markers for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients
AU2009251178A AU2009251178A1 (en) 2002-10-01 2009-12-24 Method and nucleic acids for the improved treatment of breast cell proliferative disorders
US13/352,238 US20120184455A1 (en) 2002-10-01 2012-01-17 Method and Nucleic Acids for the Improved Treatment of Breast Cell Proliferative Disorders

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2002145779 DE10245779A1 (de) 2002-10-01 2002-10-01 Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10245779A1 true DE10245779A1 (de) 2004-04-29

Family

ID=32049180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2002145779 Ceased DE10245779A1 (de) 2002-10-01 2002-10-01 Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE10245779A1 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1693468A1 (de) 2005-02-16 2006-08-23 Epigenomics AG Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure
US8101359B2 (en) 2002-10-01 2012-01-24 Epigenomics Ag Method for determining risk of relapse of breast cancer following tamoxifen adjuvant therapy
EP2481810A1 (de) 2005-04-15 2012-08-01 Epigenomics AG Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind
US9695478B2 (en) 2005-04-15 2017-07-04 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for the analyses of cellular proliferative disorders

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10054974A1 (de) * 2000-11-06 2002-06-06 Epigenomics Ag Diagnose von mit Cdk4 assoziierten Krankheiten
WO2002046454A2 (de) * 2000-12-06 2002-06-13 Epigenomics Ag Diagnose von mit angiogenese assoziierten krankheiten durch bestimmung der methylierung von mit angiogenese assoziierten genen
DE10104937A1 (de) * 2001-01-29 2002-08-14 Epigenomics Ag Fluoreszenzpolarisation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10054974A1 (de) * 2000-11-06 2002-06-06 Epigenomics Ag Diagnose von mit Cdk4 assoziierten Krankheiten
WO2002046454A2 (de) * 2000-12-06 2002-06-13 Epigenomics Ag Diagnose von mit angiogenese assoziierten krankheiten durch bestimmung der methylierung von mit angiogenese assoziierten genen
DE10104937A1 (de) * 2001-01-29 2002-08-14 Epigenomics Ag Fluoreszenzpolarisation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CA AN 134:338771 *
CA AN 135:342239 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8101359B2 (en) 2002-10-01 2012-01-24 Epigenomics Ag Method for determining risk of relapse of breast cancer following tamoxifen adjuvant therapy
EP1693468A1 (de) 2005-02-16 2006-08-23 Epigenomics AG Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure
EP2481810A1 (de) 2005-04-15 2012-08-01 Epigenomics AG Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind
US9695478B2 (en) 2005-04-15 2017-07-04 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for the analyses of cellular proliferative disorders
US10385402B2 (en) 2005-04-15 2019-08-20 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for analyses of cellular proliferative disorders
US10731215B2 (en) 2005-04-15 2020-08-04 Epigenomics Ag Method for determining the presence or absence of methylation in a sample
US11186879B2 (en) 2005-04-15 2021-11-30 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for analyses of cellular proliferative disorders

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10130800B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung mit hoher Sensitivität
US20200172963A1 (en) Dna methylation in colorectal and breast cancer diagnostic methods
DE60317045T2 (de) Verfahren und nukleinsäuren zur analyse von störungen der proliferation kolorektaler zellen
EP1432828B1 (de) Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung in cpg-inseln
CA3083314C (en) Diagnostic gene marker panel for colorectal cancer
EP1463841A2 (de) Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierungsmustern durch exponentielle ligation hybridisierter sondenoligonukleotide (mla)
DE10348407A1 (de) Prognostische und diagnostische Marker für Zell-proliferative Erkrankungen von Brustgeweben
DE10161625A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse einer Lungenzell-Zellteilungsstörung
DE10132212B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten
US20070184438A1 (en) Methods and nucleic acids for the analysis of colorectal cell proliferative disorders
DE10128508A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren
DE10139283A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren zur Analyse von Colon-Krebs
DE20121960U1 (de) Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Metastase assoziierten Krankheiten
DE10061338A1 (de) Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten
WO2002036814A2 (de) Diagnose von mit cdk4 assoziierten krankheiten durch bestimmung des methylierungszustandes des cdk4
DE10245779A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen
EP1339873B1 (de) Diagnose von mit humos assoziierten krankheiten
DE10037769A1 (de) Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten
DE10128509A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata- und Nierenkarzinomen
DE10392538T5 (de) Verfahren zur Analyse von methylierten Nukleinsäuren
DE10317955A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen
DE10230692A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des DD3-Gens
DE10255104A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen
DE10164501A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse einer Lymphoid-Zellteilungsstörung
DE10329240A1 (de) Verfahren zur Analyse des Cytosin-Methylierungsstatus von Cancer-Testis-Antigenen für eine individualisierte Immuntherapie

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8131 Rejection