WO2002046454A2 - Diagnose von mit angiogenese assoziierten krankheiten durch bestimmung der methylierung von mit angiogenese assoziierten genen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenzen von mit Angiogenese assoziierten Genen, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes von mit Angiogenese assoziierten Genen sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen.

Description

Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten

Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen und insbesondere deren Methylie- rungsstatus in Zusammenhang stehen.

Stand der Technik

Die Angiogenese beschreibt den Prozess der Bildung neuer Blutgefäße. Dieser auch als Neovascularisation bezeichne- te Prozess findet normalerweise während der Embryogenese und der plazentalen Entwicklung statt, aber auch im adul- ten Organismus und während der Wundheilung. Eine Stimulation durch ein oder mehrere bekannte Wachstumsfaktoren initiiert die Angiogenese, doch sind möglicherweise auch andere, bis jetzt nicht identifizierte Faktoren, daran beteiligt. Die Angiogenese wird kontrolliert durch das Gleichgewicht zwischen Stimulatoren und Inhibitoren und wird unter normalen physiologischen Bedingungen unterdrückt. Eine Verschiebung dieses Gleichgewichts spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer Viel- zahl von Erkrankungen, wobei die Unterschiede dieses

Gleichgewichts in den unterschiedlichen Organen variieren.

Zu den pathogenen Zuständen, mit denen die Angiogenese in Zusammenhang steht gehören zum Beispiel Augenerkrankungen, proliferative Retinopathie, neovasculares Glaukom, solide Tumoren und Erkrankungen, die mit Gewebsentzündun- gen wie Rheumatischer Arthritis zusammenhängen (Moses MA, Langer R. Inhibitors of angiogenesis. Biotechnology (N Y) . 1991 Jul;9(7) :630-4) : Weiterhin diabetische Retinopathie, maculare Degeneration aufgrund von Neovasculari- sation, Psoriasis oder Artheriosklerose (Cherrington JM, Strawn LM, Shawver LK. New paradigms for the treatment of cancer: the role of anti-angiogenesis agents. Adv Cancer Res. 2000;79:1-38), ulcerativer Darmkatarrh (Thorn M,

Raab Y, Larsson A, Gerdin B, Hallgren R. Intestinal muco- sal secretion of basic fibroblast growth factor in pa- tients with ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol. 2000 Apr;35 (4) : 408-12) oder entzündliche Darmerkrankun- gen, wie Morbus Crohn (Bousvaros A, Leichtner A, Zura- kowski D, Kwon J, Law T, Keough K, Fishman S. Elevated serum vascular endothelial growth factor in children and young adults with Crohn 's disease. Dig Dis Sei. 1999 Feb;44 (2) :424-30) . Auch bei Krebs spielt die Angiogenese eine entscheidende Rolle (Papac RJ. Spontaneous regres- sion of cancer: possible mechanisms. In Vivo. 1998 Nov- Dec;12 (6) : 571-8; Giavazzi R, Taraboletti G. Angiogenesis and angiogenesis inhibitors in cancer. Forum (Genova) . 1999 Jul-Sep;9(3) :261-72) . Hier werden durch die Blutge- fäßformation in dem wachsenden Tumorgewebe Sauerstoff und Nährstoffe zu den Tumorzellen geliefert; ebenso wird ge- wissermaßen ein Leitungssystem bereitgestellt, über das Tumorzellen überall im Körper metastasieren können.

Die Beteiligung der Angiogenese an solch unterschiedli- chen Erkrankungen wie Krebs, Augenerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen hat dazu geführt, Methoden zu entwickeln, die sich speziell mit der Inhibierung von Angiogenese beschäftigen. Für Krebspatienten stellen solche Methoden einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmli- chen Methoden, wie z.B. Chemotherapie mit ihren massiven Nebenwirkungen, die teilweise in einer inakzeptablen Mor- bidität resultieren oder bis zum Tod des Patienten führen, dar. In der Praxis limitieren diese mit Krebstherapien assoziierten unerwünschten Nebenwirkungen, oftmals die Behandlung, die einem Patienten helfen könnte.

Für andere pathologische Zustände, die mit abnormaler Angiogenese assoziiert sind, wie z. B. diabetische Retino- pathie, gibt es in Ermangelung an Retina Transplantaten keine effektiven Behandlungen. Sollte dennoch eine Netzhaut transplantiert werden, würde die neue Retina den gleichen Bedingungen unterworfen sein wie die Original Retina. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, die molekularen Interaktionen zu identifizieren, die in Zusammen- hang mit der bei bestimmten pathologischen Zuständen vorkommenden Angiogenese stehen, um Methoden zur Diagnose und spezielle Therapien zu entwickeln. Bisher wurden im Prinzip zwei Hauptansätze zur Detektion und Inhibierung von pathogener Angiogenese verfolgt: erstens die Inhibie- rung des Prozesses der Angiogenese und der Gefäßanordnung (Anti-Antiangiogense) und zweitens die direkte Eingrenzung und Zerstörung der Tumorgefässbildung (vascular- targeting) (Giavazzi R, Taraboletti G. Angiogenesis and angiogenesis inhibitors in cancer. Forum (Genova) . 1999 Jul-Sep;9(3) :261-72) . ω ω t K3 P¹ cπ 0 Cπ O Cπ O cπ

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resse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von

Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersu- chende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and im- proved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24 (24) : 5064-6) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie- rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic me- thylation differences at the SNRPN locus . Eur J Hum Ge- net. 1997 Mar-Apr; 5 (2) : 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifi- ziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation i print. Nat Genet. 1997 Nov; 17 (3) : 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at speeifie sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic

Acids Res. 1997 Jun 15; 25 (12) : 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25 (12) : 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5- methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16 (6) : 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as deter- mined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet.

1997 Mar;6(3) : 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromo- somes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22 (4) : 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethyla- tion in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(l-2) :261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 95/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge- netics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5 ' -OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of pro- teins with molecular asses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60 (20) : 2299-301) . Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase beför- dert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur A- nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57) . Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leis- tungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Pep- tid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thi- ophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. O O to to P¹ P¹ cπ O cπ o Cπ o cπ

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zugterweise umfasst die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Beson- ders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. - 9. Nukle- otid vom 5 ' -Ende des 13 rαers ist, im Falle von PNA- Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 9 mers ist.

Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Di- nukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No.l bis Seq ID No.208 und zu deren komplementären Se- quenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfasst.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA- Oligomeren) , die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase ge- bunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang von mit Angiogenese assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays co CO t to P» P> cπ o Cπ o Cπ o Cπ

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Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.

Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit An- giogenese assoziierten Genen verwendet werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb von mit Angiogenese assoziierten Genen.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose und/oder Therapie von Augenerkrankungen, proliefe- rativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren, GewebsentZündungen, rheumatischer Arthritis, dia- betischer Retinopathie, acularer Degeneration aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen, ulcerativem Darmkatarrh, Mor- bus Crohn und Krebserkrankungen.

Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 können für die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit An- giogenese assoziierten Genen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Thera- peutikums zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylie- rungsmustern von mit Angiogenese assoziierten Gene, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikums dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikums zur von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit Angiogenese assoziierten Genen, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von mit Angiogenese assoziierten Genen mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaa- rungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37 °C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Mit dem Begriff "funktioneile Varianten" sind alle DNA- Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA- Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entspre- chenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.

"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von mit Angiogenese assozi- ierten Genen und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Inser- tionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleo- tide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymorphismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.

"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen von mit Angiogenese assoziierten Genen und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert .

Tabelle 1

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 1, 3, 5, ...) zeigen jeweils unterschiedliche Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit Angiogenese assoziierten Genen.

Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) zeigen jeweils die zu den unterschiedlichen Sequenzen, komplementären Sequenzen (z.B ist die zu Seq. ID No.l komplementäre Sequenz Seq. ID No.2, zu Seq. ID No.3 die komplementäre Sequenz Seq. ID No.4 usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit Angiogenese assoziierten Genen.

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von einem mit Angiogenese assoziierten Gen, hier TIMP-3 in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylie- rungsstatus hin untersucht wird.

Beispiel 1: Durchführung der Methylierungsanalyse in dem mit Angiogenese assoziierten Gen TIMP-3

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens Metalloproteinase-3 (TIMP-3) , in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base e- thylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hin- sichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cyto- sine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 M und 6 M verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Rea- genz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt ver- dünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desul- fonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymeraseketten- reaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-

Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens TIMP-3 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Prime- roligonukleotiden AGAGAAATTGGAGGGGTAGT und CCCTCAAACCAATAACAAAA ein definiertes Fragment der Länge 401 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise GGATTTAGCGGTAAGTAT, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 223 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleo- tiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem

Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybri- disierungsprodukt . ω t tv> P¹ P¹ o cπ o cπ o Cπ

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Beispiel 3: Durchführung der Methylierungsanalyse im Gen CDKN2A

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Ver- wendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cyto- sine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba- sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-

Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten

Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Die PCR Reaktionen wurden in einem Thermocycler (Eppendorf GmbH) durchgeführt. Es wurden für einen 25μl Ansatz 10 ng DNA, O.OδμM von jedem Primeroligonukleotid l,6mM dNTPs und eine Einheit HotstarTaq eingesetzt. Die übrigen Bedingungen wurden gemäß Herstellerangaben gewählt. Für die PCR wurde zuerst eine Denaturierung für 15 Minuten bei 96 °C durchgeführt, danach 40 Zyklen (60 Sekunden bei 96°C, 45 Sekunden bei 55 °C und 75 Sekunden bei 65 °C) und eine abschließenden Elongation von 10 Minuten bei 72 °C. Das Vorhanden der PCR Produkte wurde auf Agarosegelen überprüft.

Im vorliegenden Fall werden Cytosine aus der potentiellen Promotorregion des Gens CDKN2A untersucht. Mit Sequenzen co co IV) t

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Die erste (in Figur 1 bzw. 2 die linke) Gruppe beinhaltet 26 Proben beiden Geschlechts, die zweite enthält ebenfalls 26 Proben (in Figur 1 bzw. 2 auf der rechten Seite) . Die p-Wert gewichtete Methylierung zeigt eine klare Unterscheidung zwischen den beiden Gruppen auf, 12 CpG Positionen (rot, bzw. graue Farbschattierung) von 11 verschiedenen Genen werden signifikant unterschieden (korrigierter p-Wert <0.05) zwischen den beiden Gruppen. Die kreuzvalidierte Genauigkeit der Klassifizierung, durch SVM (support vector machine) (F. Model, P. Adorjan,A. 0- lek,C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer classification. Bioinformatics. 2001 Jun; 17 Suppl 1: S157-64) bestimmt, wird berechnet als 77,0 % mit einer Standardabweichung von 4,4 %. Im Rahmen einer größeren Studie wurde hier das CDKN2A Gen untersucht, welches durch die Gen Identifizierungsnummer 2035 dargestellt wird.

Tabelle 2

Beschreibung der Figur 1

Unterscheidung von Plattenzellkarzinomen der Lunge mit dem entsprechenden angrenzenden Normalgewebe. Eine hohe t P» P¹ o Cπ o cπ

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Claims

Patentansprüche

1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen.

2. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA) -Oligomer) zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen hybridisiert.

3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst .

4. Oligomer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

5. Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens eine Ba- sensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA gemäß einer der mit Angiogenese assoziierten Gene ALK-1 (AH005451) , Beta-Tubulin (J00314) , CCM1 (AF198881) , CD44 (AJ251595) , ERK (D31661) , FGF6 (X57075) , FGF re- ceptor-1 (M34641) , FLT (E13256) , GM-CSF (AJ224149) , Platelet glycoprotein IV (AW613186) , Gro-alpha co co to to cπ σ Cπ O Cπ

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nukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5.

7. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 5, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungs- zustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5.

8. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonukleotide zur Amplifi- kation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

9. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

10. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

11. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unterschiedlichen Oligo- meren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA- Oligomere aus Anspruch 5 stehenden Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an eine feste Phase gekoppelt wird.

12. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) nach einem der Ansprüche 2 bis 4.

13. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

14. Array gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 , dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

15. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.

16. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder e- pigenetischen Parametern zur Diagnose und/oder Therapie von bestehenden Erkrankungen oder der Prädisposi- tion für bestimmte Erkrankungen durch Analyse von Cy- tosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:

a) in einer genomischen DNA- robe werden durch chemi- sehe Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cyto- sinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaa- rungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;

b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Pri- meroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;

c) Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden gemäß der Ansprüche 2 bis 4 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14; hybridisiert;

d) die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lö- sung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt .

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschied- liehe Fragmente amplifiziert werden, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von meh- reren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitze- beständige DNA-Polymerase ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymeraseketten- reaktion (PCR) durchgeführt wird.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, da- durch gekennzeichnet, dass die Markierungen der

Amplifikate Radionuklide sind.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet dass die Markierungen der Apli- fikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, da- durch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und/oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektier- barkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visuali- siert.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zellli- nien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo- logische Objektträger und alle möglichen Kombinatio- nen hiervon umfassen.

29. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA- Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

30. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 29, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend mindestens ein

Oligomer zur Detektion des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5 zur Diagnose von Augenerkrankungen, proliferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren, GewebsentZündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration aufgrund von Neovascu- larisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen, ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.

31. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers gemäß einem der

Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 29, ei- nes Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend mindestens ein Oligomer zur Detektion des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus einer der Se- uenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 208 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5 zur Therapie von Augenerkrankungen, proliferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren, Gewebsentzün- düngen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration aufgrund von Neovascu- larisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen, ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.

32. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA- Oligomere gemäß Anspruch 31.