PT1871912E - Método para determinar metilação de adn em amostras de sangue ou urina - Google Patents

Description

ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método para determinar metilação de ADN em amostras de sangue ou urina"

CAMPO DO INVENTO 0 invento refere-se genericamente a composições e métodos novos e substancialmente melhorados para proporcionar fragmentos de ADN derivados de uma amostra remota e para análises dos mesmos.

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS 0 presente pedido reivindica o direito de prioridade dos pedidos de patente US provisórios: 60/672 242 apresentado a 15 de Abril de 2005/ 60/676 997 apresentado a 2 de Maio de 2005/ 60/697 521 apresentado a 8 de Julho de 2005/ 60/723 602 apresentado a 4 de Outubro de 2005/ e 60/780 248 apresentado a 8 de Março de 2006.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Inclui-se e anexa-se uma listagem de sequências compreendendo SEQ ID NOS :1-15, em papel, como parte deste pedido.

ANTECEDENTES DE ASPECTOS DO INVENTO

Desenvolvimento de um ensaio médico. A probabilidade de curar uma doença (e.g. uma doença cancerosa) depende muitas vezes predominantemente de uma detecção da doença tão precoce quanto possível. É também muitas vezes vantajoso detectar uma predisposição para uma doença ou se por exemplo, a doença já está avançada, fazer uma estimativa relativamente ao tratamento mais promissor para a doença. Tais detecção, previsão ou estimativa tão precoces quanto possível, reduzem os custos directos ou associados a tratamento médico. Asseguram também uma maior qualidade de vida para o doente afectado. 2 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Tal leva à situação de um conjunto de amostras derivadas de indivíduos com suspeita de uma doença ter que ser ensaiado e a maioria pode não estar afectada pela doença. Ou, no caso de doentes com uma doença diagnosticada ter que ser ensaiado um conjunto de amostras e apenas uma pequena percentagem responderá a determinado tratamento.

De um modo geral, pretende-se que um ensaio deva apresentar uma sensibilidade tão elevada quanto possível, uma especificidade tão elevada quanto possível e uma precisão tão elevada quanto possível. A sensibilidade é uma medida da capacidade do ensaio detectar correctamente a doença alvo num indivíduo a ser ensaiado. Um ensaio com baixa sensibilidade traduz-se numa taxa elevada de falsos negativos, i.e., indivíduos que têm a doença mas que são falsamente identificados como não tendo essa doença específica. 0 perigo potencial de um falso negativo é o de que o indivíduo doente permaneça sem diagnóstico e sem tratamento durante um período de tempo durante o qual a doença pode progredir para um estágio mais avançado em que os tratamentos, caso existam, podem ser menos eficazes. Matematicamente pode descrever-se como: Sensibilidade = TP/(TP+FN). Aqui, TP representa um resultado positivo verdadeiro e FN um resultado falso negativo. Um resultado positivo verdadeiro significa que o ensaio é positivo e que a doença está presente enquanto um resultado falso negativo é quando o ensaio é negativo mas a doença não está presente.

Um exemplo de um ensaio que tem baixa sensibilidade é um ensaio de sangue baseado em proteína para VIH. Este tipo de ensaio apresenta fraca sensibilidade porque falha na detecção da presença do vírus até que a doença esteja bem estabelecida e que o vírus tenha invadido a corrente sanguínea em números substanciais. Contrariamente, um exemplo de um ensaio com elevada sensibilidade é a detecção da carga vírica utilizando a reacção de polimerização em cadeia (PCR). Atinge-se elevada sensibilidade porque este tipo de ensaio pode detectar quantidades muito pequenas do vírus. A elevada sensibilidade é particularmente importante quando as consequências da falha de diagnóstico são importantes. 3 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ A especificidade, por outro lado, é uma medida da capacidade de um ensaio identificar exactamente os doentes que estão isentos do estado de doença. Um ensaio com baixa especificidade produz uma taxa elevada de falsos positivos, i.e., indivíduos que são falsamente identificados como tendo a doença. Uma desvantagem dos falsos positivos é o de forçar os doentes a submeterem-se a procedimentos médicos ou tratamentos desnecessários com os riscos e problemas emocionais e financeiros inerentes e que poderão ter efeitos adversos na saúde do doente. Uma característica das doenças que dificulta o desenvolvimento de ensaios de diagnóstico com elevada especificidade é que os mecanismos da doença, nomeadamente em cancro, envolvem muitas vezes uma grande variedade de genes e proteínas. Adicionalmente, determinadas proteínas podem apresentar níveis elevados por motivos não relacionados com um estado de doença. Matematicamente pode descrever-se especificidade como: Especificidade = TN/(FP+TN). Aqui, TN representa um resultado negativo verdadeiro e FP um resultado falso positivo. Um resultado negativo verdadeiro é quando o ensaio é negativo e a doença não está presente. Um resultado falso positivo é quando o ensaio é positivo mas a doença não está presente.

Um exemplo de um ensaio com elevada especificidade é um ensaio baseado em gene que pode detectar uma mutação p53. A especificidade é importante quando o custo ou risco associados a procedimentos de diagnóstico adicionais ou a intervenção médica adicional são muito elevados. A exactidão é uma medida da capacidade de um ensaio de por um lado detectar correctamente a doença alvo num indivíduo a ser ensaiado e simultaneamente por outro identificar correctamente doentes que estão livres do estado de doença. Portanto a exactidão descreve a sensibilidade de um ensaio e simultaneamente a sua especificidade. Matematicamente define-se como: Exactidão = (TP+TN)/N, em que TP representa resultados positivos verdadeiros, TN resultados negativos verdadeiros e N o número de doentes ensaiados.

Em geral, devido a razões óbvias, um ensaio de eleição seria caracterizado adicionalmente por pelo menos um dos seguintes critérios, mas claro que de preferência por todos 4 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ eles: (i) elevado grau de padronização, (ii) grande capacidade para automatização, (iii) evitar contaminações cruzadas de amostras, (iv) pouco esforço de manipulação, (v) preço reduzido, (vi) facilidade de manipulação, (vii) elevada reprodutibilidade, (viii) elevada fiabilidade.

Claro que todas as especificações anteriormente descritas aplicam-se não apenas ao próprio ensaio, mas igualmente ao fluxograma desde a recolha de uma amostra ao inicio efectivo do ensaio. Por outras palavras um fluxograma adequado deve permitir definir um ensaio com as especificações referidas.

Material de partida para um ensaio. É vantajoso para um ensaio relativamente a redução de custos e a uma elevada qualidade de vida do doente, que este possa ser efectuado de forma não invasiva. Se tal não for possível é desejável efectuá-lo por meios invasivos que afectem o menos possível o doente, que sejam fáceis de efectuar, que impliquem custos reduzidos ou combinações destes. Por essa razão as amostras remotas tais como por exemplo sangue, expectoração, fezes ou fluidos corporais são o material de partida de eleição para um ensaio.

Contudo, a utilização de amostras remotas é bastante limitada pela quantidade reduzida de ADN, em particular pela quantidade reduzida de ADN proveniente da célula ou tecido doente. Assim, o fluxograma desde a recolha de amostra até ao início do ensaio tem que ser caracterizado por elevados rendimentos de ADN.

Na maioria dos casos o ADN de interesse está muito diluído na amostra. Tipicamente menos de 1% é relevante para a questão subjacente ao ensaio. Tal enfatiza a necessidade de um planeamento de análise para recolha, fornecimento e processamento de ADN antes do ensaio ter que ser caracterizado por rendimentos elevados de ADN.

Uma dificuldade adicional para a utilização de amostras remotas é que as amostras podem ser contaminadas por uma quantidade elevada de células e seu ADN. A contaminação é assim completamente não relacionada com a questão na qual se baseia o ensaio. Por exemplo tais contaminações são bactérias 5 ΕΡ 1 871 912/PT tais como E. coli em amostras de fezes ou eritrócitos em amostras de plasma ou soro. Estas contaminações são especialmente criticas se interferirem com a detecção do ADN de interesse ou se estiverem presentes em grandes quantidades. Neste último caso, a percentagem do ADN de interesse torna-se tão pequena que já não pode ser detectada. Por esse motivo um fluxograma para recolha, fornecimento e processamento de ADN antes de um ensaio tem que assegurar a remoção eficaz de tais contaminações.

Além disso, o ADN de interesse pode estar parcialmente degradado numa amostra remota. Tal depende do tipo de amostra remota e também da forma de recolher e manusear a amostra remota. É possível que ocorra fragmentação do ADN numa amostra remota até um tamanho de fragmento de 100 pb e inferior. Assim um fluxograma desde a recolha de uma amostra até ao início de um ensaio deve assegurar que se proporcionam fragmentos de ADN pequenos assim como grandes e que o ADN não é fragmentado adicionalmente.

Existem numerosos documentos que se referem a estes problemas. Como exemplo citam-se apenas os seguintes aqui: Diehl F., et al. (2005) PNAS 102(45), 16368-16373; e Li J., et al. (2006) Journal of Molecular Diagnostics, 8(1), 22-30.

Análise de metilação. Tal como divulgado em anos recentes, uma das abordagens mais poderosas e promissoras para detectar uma doença, a predisposição para uma doença ou para estimar uma resposta provável relativamente a determinado tratamento de doença é a análise de metilação do ADN genómico do doente.

Muitas doenças, nomeadamente doenças cancerígenas, são acompanhadas por expressão génica modificada. Tal pode ser uma mutação desses próprios genes, que leva a uma expressão de proteínas modificadas ou a uma inibição ou sobrexpressão das proteínas ou enzimas. Pode contudo também ocorrer uma modulação da expressão por modificações epigenéticas, em particular por alterações no padrão de metilação de ADN. Tais modificações epigenéticas não afectam a sequência efectiva de codificação do ADN. Verificou-se que os processos de metilação de ADN têm implicações substanciais para a saúde e parece ser evidente que o conhecimento acerca dos processos e 6 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ modificações de metilação do metabolismo de metilo e de metilação de ADN são essenciais para compreender doenças, para a profilaxia, diagnóstico e terapia de doenças. 0 controlo exacto de genes, que representam apenas uma pequena parte do genoma completo de mamíferos, envolve regulação tendo em consideração o facto que a parte principal do ADN no genoma não é codificante. A presença de tal ADN "bagagem" contendo intrões, elementos repetitivos e elementos potencialmente activamente transponíveis, requer mecanismos eficazes para a sua supressão durável (silenciamento). Aparentemente, a metilação de citosina por ADN metiltransferases dependentes da S-adenosilmetionina (SAM), que formam 5-metilcitosina, representa um desses mecanismos para a modificação das interacções ADN-proteína. Os genes podem ser transcritos por promotores isentos de metilação, mesmo quando as regiões transcritas ou não transcritas adjacentes são vastamente metiladas. Tal permite a utilização e regulação de promotores de genes funcionais, enquanto o ADN bagagem incluindo os elementos transponíveis é suprimido. A metilação também ocorre durante a supressão a longo prazo de genes ligados a X e pode levar a um redução ou a um aumento do grau de transcrição, dependendo do local onde ocorre metilação nas unidades de transcrição.

Praticamente toda a metilação natural de ADN em mamíferos está restrita a sequências palindrómicas de dinucleótido citosina-guanosina (CpG), que são controladas por ADN metil transferases. Os dinucleótidos CpG representam cerca de 1 a 2% de todos os dinucleótidos e concentram-se em ilhas CpG. De acordo com uma definição reconhecida na especialidade, uma região considera-se como uma ilha CpG quando o conteúdo C+G ao longo de 200 pb é de pelo menos 50% e a percentagem de dinucleótidos CG observados comparativamente com os dinucleótidos CG esperados é maior que 0,6 (Gardiner-Garden, M., Frommer, M. (1987) J. Mol. Biol. 196, 261-282). Tipicamente, as ilhas CpG têm pelo menos 4 dinucleótidos CpG numa sequência com um comprimento de 100 pb.

As ilhas CpG localizadas em regiões de promotor têm frequentemente uma função reguladora da expressão do gene correspondente. Por exemplo, no caso da ilha CpG ser 7 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ hipometilada ο gene pode expressar-se. Por outro lado, a hipermetilação leva frequentemente a uma supressão da expressão. Normalmente os genes supressores de tumor são hipometilados. Mas caso se tornem hipermetilados a sua expressão é suprimida. Tal observa-se muitas vezes em tecidos de tumor. Contrariamente, os oncogenes são hipermetilados no tecido saudável e são hipometilados em muitos locais em tecidos de tumor. A metilação de citosina tem efeito ao nivel da ligação de proteínas que é normalmente proibida e que regula a transcrição de genes. Tal leva a uma alteração da expressão do gene. Relativamente a cancro a expressão de genes reguladores da divisão celular é assim alterada, por exemplo, a expressão de um gene apoptótico é regulada negativamente, enquanto a expressão de um oncogene é regulada positivamente. Adicionalmente, a hipermetilação pode ter uma influência a longo prazo na regulação. As proteínas, que desacetilam as histonas, são capazes de se ligar através do seu domínio de ligação 5-metilcitosina ao ADN quando as citosinas se metilam. Tal resulta em desacetilação das histonas, o que leva a um empacotamento mais compacto do ADN. Por esse motivo as proteínas reguladoras não são excluídas de ligação ao ADN.

Consequentemente, a detecção eficaz dos padrões de metilação de ADN é uma ferramenta importante para desenvolver novas abordagens para compreender doenças e para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças e para o rastreio de alvos associados a doenças. Mas por outro lado, os métodos para uma detecção eficaz de metilação de ADN requerem padrões de elevada qualidade relativamente ao material de partida do ADN genómico. Preferentemente, os padrões são: I) A amostra de ADN utilizada é compreendida por uma quantidade suficiente de ADN caracterizada por um padrão de metilação específico para uma doença definida. Esta quantidade de ADN suficiente depende do método para detectar o padrão de metilação assim como do próprio padrão de metilação. Os valores típicos estão na gama de cerca de 20 pg a cerca de 10 ng. Mas deve considerar-se que a quantidade real deste ADN na amostra retirada de um doente tem que ser muito mais elevada, por um factor de pelo menos 4-8 vezes. A razão para 8 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ este facto é a perda de ADN durante o fornecimento de amostra e processamento de amostra, por exemplo, isolamento de ADN; II) A amostra de ADN utilizada tem que estar isenta de ADN que possa interferir com um método escolhido para detectar um padrão de metilação pretendido; III) A amostra de ADN utilizada deve também não conter de preferência uma grande contaminação de ADN que não esteja relacionado com o problema subjacente. Este é por exemplo ADN de E. coli em amostras de fezes ou ADN de eritrócitos em amostras de plasma ou soro; e IV) O ADN utilizado deve estar de preferência isento de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN assim como nucleótidos ou bases associados ou ligados que não façam parte do esqueleto de ADN. Estes podem causar impedimento estérico à detecção de metilação.

Enunciado da necessidade na especialidade. Presentemente o requerente não está ciente de qualquer método relevante da especialidade anterior. Neste âmbito relevante significa que preenche os critérios tal como especificados anteriormente para proporcionar ADN de amostras remotas, para proporcionar ADN adequado para análise de metilação e para ensaios médicos em geral.

Podem considerar-se os seguintes documentos como a especialidade prévia mais aproximada: Utting M., et al. (2002) Clinicai Câncer Research 8, 35-40. Este estudo indica que a análise de marcador de microssatélite utilizando ADN livre em suspensão em urina ou sangue poderia ser relevante para diagnóstico e rastreio de cancro de bexiga. Proporcionar a amostra assim como proporcionar o ADN das amostras é efectuado de acordo com procedimentos padrão.

Wong I.H.N., et al. (2003) Clinicai Câncer Research 9, 047-1052 descrevem um novo método denominado RTQ-MSP que é uma combinação de MSP (PCR sensivel a metilação) e PCR em tempo real. Os autores demonstram que é possivel detecção de uma sequência de ADN especifica derivada de tumor em células de 9 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ plasma, soro e de sangue de doentes já diagnosticados com carcinoma hepatocelular. US 6 927 028 descreve um método para diferenciar espécies de ADN originárias de células de indivíduos diferentes em amostras biológicas através de PCR específica de metilação. Proporcionar a amostra assim como proporcionar o ADN das amostras é efectuado de acordo com procedimentos padrão.

Lecomte T., et al. (2002) Int. J. Câncer 100, 542-548 ensaiaram ADN livre em circulação derivado de plasma de doentes com cancro colorrectal, relativamente à presença de mutações KRAS2, para metilação do promotor do gene pl6 ou ambos. Os autores sugerem que doentes com ADN associado a tumor livre em circulação no sangue têm uma menor probabilidade de sobrevivência de dois anos isenta de recidivas do que doentes para os quais não se detecta qualquer ADN associado a tumor livre em circulação no sangue.

SUMÁRIO DE ASPECTOS DO INVENTO

Aspectos do presente invento referem-se a composições e métodos para determinar o estado de metilação de pelo menos uma citosina, um padrão de metilação ou ambos no ADN de uma amostra de sangue, de uma amostra de soro ou de uma amostra de urina.

Preferentemente estes aspectos compreendem uma etapa de subdivisão, uma etapa de concentração ou suas combinações.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura 1 apresenta uma visão geral de uma concretização do invento. A figura 2 apresenta uma visão geral de um exemplo de estratégia de recolha em conjunto e concentração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE ASPECTOS DO INVENTO

Para conseguir atingir vários objectivos técnicos, os aspectos do invento apresentam composições e métodos para 10 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ proporcionar fragmentos de ADN derivados de uma amostra remota. As referidas composições e métodos compreendem proporcionar uma amostra remota compreendendo ADN, isolar o ADN da amostra remota e tratar o ADN isolado com um reagente ou enzima que permite diferenciação de citosina metilada e não metilada.

Vantagens de aspectos do invento.

Em aspectos específicos, o exemplo de método do invento tem as seguintes vantagens:

Caracteriza-se por elevados rendimentos de ADN proporcionado. Tal consegue-se apesar das amostras remotas se caracterizarem por compreender apenas níveis reduzidos de ADN, especialmente níveis reduzidos de ADN de interesse. Por outro lado, em muitos casos a quantidade de uma amostra remota não é limitada. Assim de acordo com o invento processa-se de preferência grandes quantidades de amostras remotas.

Nomeadamente seleccionou-se um método de isolamento de ADN de entre o enorme número de possíveis métodos de isolamento de ADN que permitem a utilização de volumes elevados de amostras iniciais. De acordo com o invento poderá conseguir-se a utilização de volumes ainda maiores de amostra remota por divisão desta em subamostras efectuar paralelamente o isolamento de ADN, juntar o ADN isolado e concentrar o ADN num volume adequado para processamento posterior.

Os rendimentos elevados de ADN proporcionado são adicionalmente determinados por selecção de um método para discriminação entre citosina metilada e não metilada que permita uma discriminação completa e fiável e simultaneamente minimize uma fragmentação de ADN adicional de entre o enorme número de métodos de discriminação.

Adicionalmente, os elevados rendimentos de ADN após a etapa de isolamento de ADN e a etapa de tratamento com bissulfito podem ser ainda adicionalmente mais elevados de acordo com o invento por aplicação de uma etapa opcional de amplificação do genoma completo de ADN tratado com bissulfito. 11 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ Ο exemplo de método do invento caracteriza-se adicionalmente em que as contaminações são adicional e principalmente evitadas. Tal baseia-se em concretizações de recolha de amostra que removem eficazmente componentes da amostra retirada de um indivíduo e que não são de interesse. Por exemplo, a remoção de eritrócitos de sangue para obter a amostra de plasma. Desse modo é de especial importância por um lado remover eficazmente todos os eritrócitos mas minimizando danos a estes. Devido a tal conduzir a uma libertação do ADN do eritrócito, que é o motivo pelo qual se removem os eritrócitos. 0 método é adicionalmente caracterizado por se proporcionarem fragmentos de ADN pequenos assim como fragmentos de ADN longos. Primeiramente, tal é permitido de acordo com o invento por selecção de um método de isolamento de ADN que isola fragmentos de ADN com pelo menos 100 pb com elevada eficácia de entre um enorme número de métodos de isolamento de ADN. Em segundo lugar, tal é permitido de acordo com o invento por selecção de métodos do invento para concentração de ADN, para tratamento com bissulfito, em especial para purificação e/ou dessulfonação de ADN tratado com bissulfito e para amplificação de genoma completo de entre o enorme número de outros métodos possíveis. O método é adicionalmente caracterizado em que o ADN proporcionado compreende fragmentos de ADN pequenos assim como fragmentos de ADN longos uma vez que estão presentes na amostra remota inicial. Esta vantagem específica consegue-se de acordo com o invento i) por selecção de um método de isolamento de ADN que isola fragmentos de ADN pequenos pelo menos tão pequenos como 100 pb assim como fragmentos de ADN longos de entre o enorme número de métodos possíveis de isolamento de ADN; ii) por selecção de dispositivos para concentração e purificação de ADN de ADN tratado com bissulfito que retém fragmentos de ADN pequenos assim como fragmentos de ADN longos de entre o enorme número de dispositivos possíveis; e iii) por amplificação eficaz de fragmentos de ADN pequenos tratados com bissulfito assim como fragmentos de ADN longos tratados com bissulfito pela etapa opcional de amplificação de genoma completo de ADN tratado com bissulfito. 12 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ Ο método é adicionalmente caracterizado em que o ADN proporcionado está isento de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN, nucleótidos ou bases associados ou ligados assim como reagentes quimicos interferentes. Baseia-se em i) selecciona-se um método de isolamento de ADN que se caracteriza por uma remoção eficaz de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN, nucleótidos ou bases associados ou ligados de entre o enorme número métodos de isolamento de ADN possíveis; ii) dispositivos para concentração e purificação de ADN de ADN tratado com bissulfito que remove eficazmente nucleótidos ou bases associados de entre o enorme número de dispositivos possíveis; e iii) selecciona-se método para discriminar entre citosina metilada e não metilada que minimiza fragmentação de ADN adicional de entre o enorme número de métodos de discriminação. A remoção de tais componentes é de especial importância porque pode provocar impedimentos estéricos à análise de metilação.

Tomados conjuntamente, devido às vantagens anteriormente descritas, o método permite a utilização de amostras remotas para análise de metilação. Nomeadamente, a referida utilização caracteriza-se por ser fiável e reprodutível. Tais são dois requisitos necessários para um ensaio médico.

Mas claro que o método também se caracteriza por outros critérios preferidos de um ensaio médico. De acordo com o exemplo de método do invento pode processar-se uma elevada quantidade de amostras. Por exemplo, é possível efectuar o exemplo de método do invento numa escala de placa. Além disso as diferentes etapas podem ser automatizadas e padronizadas e consequentemente pode também utilizar-se robótica. As diferentes etapas são adicionalmente caracterizadas por um esforço de manipulação reduzido. A execução em escala de placa, a adequação do método para automatização e padronização e o reduzido esforço de manipulação também levam a uma redução de custos. Além disso os custos são adicionalmente reduzidos pela utilização de dispositivos e soluções que estão já disponíveis a baixo custo. Outra vantagem do método do invento é que cada etapa pode ser facilmente efectuada porque apenas é necessário equipamento padrão de laboratório para a sua execução. Devido à sua simplicidade, a sua adequação para 13 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ automatização, ο seu esforço de manipulação reduzido assim como a sua facilidade de manipulação, o método do invento tem também uma elevada fiabilidade e reprodutibilidade.

Assim o método permite um ensaio médico baseado em metilação que se baseia em meios não invasivos ou métodos invasivos que afectam o menos possível o doente, que são de fácil execução e que têm custos reduzidos. 0 método torna disponíveis amostras remotas para metilação com base na divulqação de marcadores. Nomeadamente permite a identificação de marcadores caracterizada por elevada sensibilidade, elevada especificidade ou ambos. Método de aspectos do invento.

Sucintamente, o método do invento é um método para determinar o estado de metilação de pelo menos uma citosina, um padrão de metilação ou ambos no ADN de uma amostra de sangue, uma amostra de plasma, uma amostra de soro ou uma amostra de urina de um indivíduo, compreendendo: proporcionar a referida amostra compreendendo ADN, isolar ADN da referida amostra, e determinar o estado de metilação de pelo menos uma citosina no ADN da referida amostra, estando cada citosina localizada numa posição definida e/ou de um padrão de metilação no ADN da referida amostra com uma reacção de amplificação baseada em polimerase e/ou um ensaio baseado em amplificação em que o referido ADN tratado com bissulfito é submetido directamente à etapa de determinação de metilação sem qualquer dessulfonação anterior e em que a dessulfonação ocorre durante o aumento inicial de temperatura da reacção de amplificação.

Em aspectos específicos, o método do invento é um método que compreende a recolha e pré-processamento de uma amostra remota. A amostra remota é desse modo caracterizada como compreendendo ADN genómico. 0 método do invento compreende adicionalmente a extracção de ADN da amostra remota recolhida e pré-processada. De acordo com o invento, o ADN extraído é submetido a um tratamento que permite diferenciar se o ADN 14 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ está ou não metilado em determinada posição. Tal tratamento pode ser qualquer tipo de tratamento. Preferentemente o tratamento compreende a utilização de um reagente bissulfito. Desse modo a enzima pode ser qualquer tipo de enzima, mas de preferência a enzima é uma molécula de proteína ou de ARN. 0 referido reagente pode também ser qualquer tipo de reagente por exemplo entre outros, um reagente químico, um reagente farmacêutico, um reagente biológico ou um reagente médico.

Numa concretização, o método do invento é um método em que o ADN de uma amostra remota se caracteriza em que menos de cerca de 5%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 1% ou menos de cerca de 0,1% do ADN deriva de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão definidos. Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que o ADN da amostra remota se caracteriza em que menos de cerca de 1 % do ADN deriva de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão definidos.

De acordo com uma concretização, a amostra remota proporcionada compreende menos de cerca de 5%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 1% ou menos de cerca de 0,1% de ADN originário da mesma célula, grupo de células, tecido ou órgão definidos. Preferentemente, menos de cerca de 1% do ADN deriva da mesma célula, grupo de células, tecido ou órgão definidos. Desse modo o referido ADN caracteriza-se por ter o mesmo padrão de metilação num alelo ou local genómico definido.

Numa concretização do invento, a presença ou ausência do referido ADN pode detectar-se com um intervalo de confiança superior a cerca de 99% , com um intervalo de confiança superior a cerca de 95% , com um intervalo de confiança superior a cerca de 90% , com um intervalo de confiança superior a cerca de 80% , com um intervalo de confiança superior a < oerca de 70% ou com um intervalo de confiança superior a cerca de 60 %. É especialmente preferido um intervalo de confiança superior a cerca de 95%.

De acordo com uma concretização, a percentagem do referido ADN pode ser determinada com um intervalo de confiança superior a cerca de 99%, superior a cerca de 95%, superior a cerca de 90%, superior a cerca de 80%, superior a cerca de 70% 15 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ ou superior a cerca de 60%. Preferentemente aplica-se um intervalo de confiança superior a cerca de 95%.

Numa concretização, o método do invento é um método em que a amostra remota se caracteriza por compreender menos de cerca de 100 ng de ADN em 1 ml, menos de cerca de 60 ng de ADN em 1 ml ou menos de cerca de 10 ng de ADN em 1 ml. Numa concretização preferida, a amostra remota compreende menos de cerca de 10 ng de ADN em 1 ml de amostra remota.

De acordo com uma concretização considera-se a amostra remota que compreende menos de cerca de 1 000 ng, menos de cerca de 500 ng, menos de cerca de 100 ng, menos de cerca de 80 ng, menos de cerca de 60 ng ADN, menos de cerca de 40 ng, menos de cerca de 20 ng, menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 1 ng ou menos de cerca de 0,1 ng por mililitro de amostra remota. Preferentemente, a concentração de ADN de uma amostra remota é inferior a 10 ng/ml.

Numa concretização o método do invento é um método em que a perda de ADN é minimizada por pelo menos um dos seleccionados do grupo que compreende: selecção de um método de isolamento de ADN caracterizado por elevado rendimento de ADN, selecção de um método para diferenciação entre citosina não metilada e metilada caracterizado por precisão elevada e fiabilidade elevada, alta precisão de pipetagem, reutilização de um dispositivo de pipetagem, reutilização do dispositivo posto em contacto com o ADN.

De acordo com uma concretização, é muito importante que tanto quanto possivel do ADN de interesse seja proporcionado para análise de metilação. Esta importância baseia-se no facto do ADN da amostra remota compreender apenas uma pequena percentagem de ADN que é relevante para a questão subjacente. Isto já foi especificado anteriormente. Assim, de preferência, é possivel minimizar a perda de ADN através de pelo menos uma das seguintes disposições: a) selecção de um método adequado para extracção de ADN; b) selecção de um método adequado para diferenciar se um local genómico ou alelo está ou não metilado; c) assegurar-se uma elevada precisão de pipetagem; d) reutilização de dispositivos de pipetagem; e 16 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ e) reutilização de dispositivos que são postos em contacto com o ADN de uma amostra remota.

Um método adequado para extracção de ADN é um método que permite e assegura um elevado rendimento de ADN. Caracteriza-se adicionalmente por ter uma possibilidade de padronização, possibilidade de automatização e elevada fiabilidade, reprodutibilidade elevada e exclusão de contaminação com por exemplo, entre outros, ADN de outras amostras remotas. Claro que um método adequado deve também preencher tanto quanto possivel os critérios anteriormente especificados para um ensaio médico, para processamento de uma amostra remota e para análise de metilação. Assim, numa concretização preferida especifica, extrai-se o ADN através de pelo menos uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para grandes volumes (Roche Diagnostics GmbH) ou pelo menos um dispositivo com ele relacionado.

Um método adequado para diferenciar se um local genómico ou alelo está ou não metilado caracteriza-se por permitir ou assegurar uma taxa de diferenciação o mais elevada possivel com alta fiabilidade e alta precisão. Preferentemente a diferenciação é possivel para praticamente todos os locais únicos que são capazes de ser metilados. Além disso um método adequado não deve levar a fragmentação do ADN. Claro que um método adequado deve também verificar tão bem quanto possivel e tanto quanto possivel os critérios especificados anteriormente para um ensaio médico, para processamento de amostras remotas e para análise de metilação. Assim, trata-se o ADN com bissulfito tal como essencialmente efectuado tal como descrito em W005/03805.

Uma elevada precisão de pipetagem caracterizada em que apenas a quantidade necessária de ADN seja transferida para etapas subsequentes que permita aproveitar a amostra remota de ADN tanto quanto possivel. Assegura adicionalmente que se utiliza a quantidade óptima de ADN e de outros reagentes. Tal resulta em reacções óptimas e por isso um ADN de elevada qualidade. A perda de ADN pode ocorrer, por exemplo entre outros, pela sua degradação e por isso fica minimizado. 17 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ A reutilização de dispositivos de pipetagem é também vantajosa. Tal como conhecido na especialidade o ADN liga-se a superfícies plásticas tal como, por exemplo, pontas de pipetas. Mas liga-se menos ADN a uma superfície que já esteve em contacto uma vez com o referido ADN. Claro que o mesmo é verdadeiro para recipientes de ADN por exemplo, entre outros, placas de microtitulação, tubos, colunas. Contudo a reutilização também está limitada por riscos de contaminações. Assim, apenas se reutilizam dispositivos postos em contacto com ADN de uma amostra remota para utilização em amostras ou ADN que sejam derivados do mesmo doente ou para a mesma amostra recolhida de um doente. Noutra concretização preferida, minimiza-se a utilização de dispositivos postos em contacto com a amostra remota de ADN.

Numa concretização o método do invento é um método em que o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 1, 5 ml, cerca de 2 ml, cerca de 3 ml, cerca de 4 ml, cerca de 5 ml, cerca de 6 ml, cerca de 7 ml, cerca de 8 ml, cerca de 9 ml, cerca de 10 ml, cerca de 11 ml, cerca de 12 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 40 ml ou cerca de 50 ml. Numa concretização preferida o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 36 ml, cerca de 38 ml, cerca de 40 ml, cerca de 42 ml ou cerca de 45 ml. Numa concretização especialmente preferida o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 40 ml. Noutra concretização preferida o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 15 ml, cerca de 18 ml, cerca de 20 ml, cerca de 23 ml ou cerca de 25 ml. Numa concretização especialmente preferida o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 20 ml. Numa concretização preferida adicional o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 4 ml, cerca de 5 ml, cerca de 6 ml, cerca de 7 ml, cerca de 8 ml ou cerca de 9 ml. Numa concretização especialmente preferida o volume da amostra remota é de pelo menos cerca de 6 ml ou cerca de 8 ml.

De acordo com uma concretização a amostra remota é tirada ou recolhida de um indivíduo. A referida amostra remota tem um volume de pelo menos cerca de 1,5 ml, cerca de 2 ml, cerca de 3 ml, cerca de 4 ml, cerca de 5 ml, cerca de 6 ml, cerca de 7 ml, cerca de 8 ml, cerca de 9 ml, cerca de 10 ml, cerca de 11 ml, cerca de 12 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca 18 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 40 ml ou cerca de 50 ml.

Preferentemente o volume é de pelo menos cerca de 36 ml, cerca de 38 ml, cerca de 40 ml, cerca de 42 ml ou cerca de 45 ml.

Com a maior preferência o volume é de pelo menos cerca de 40 ml. Também de preferência o volume é pelo menos cerca de 15 ml, cerca de 18 ml, cerca de 20 ml, cerca de 23 ml ou cerca de 25 ml e com a maior preferência o volume é pelo menos cerca de 20 ml. Também de preferência o volume é pelo menos cerca de 4 ml, cerca de 5 ml, cerca de 6 ml, cerca de 7 ml, cerca de 8 ml ou cerca de 9 ml. Com a maior preferência o volume é de pelo menos cerca de 6 ml ou cerca de 8 ml.

No método do invento a amostra remota é seleccionada do grupo que compreende: amostra de sangue, amostra de plasma, amostra de soro e amostra de urina. A amostra remota é uma amostra que se caracteriza por compreender pelo menos uma componente que se localiza principalmente à distância de outras componentes da referida amostra. Por exemplo o sangue não é uma amostra remota relativamente a um eritrócito mas é uma amostra remota relativamente a um fragmento de ADN derivado de um tumor localizado no pulmão. Uma amostra remota é uma amostra de sangue, plasma, soro ou urina.

Numa concretização o método do invento é um método em que a amostra remota é plasma e a obtenção da amostra remota compreende um ou mais dos seguintes: obter pelo menos cerca de 5 ml, cerca de 10 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 35 ml, cerca de 40 ml, cerca de 45 ml, cerca de 50 ml de sangue de um indivíduo; adicionar EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ao sangue compreendendo agitação suave; ajustar o sangue a uma concentração final de cerca de 2,2 ymol/l, cerca de 3,2 ymol/l, cerca de 3,7 ymol/l, cerca de 4,0 ymol/l, cerca de 4,5 ymol/l, cerca de 4,9 ymol/l, cerca de 5,4 ymol/l, cerca de 5,9 ymol/l ou cerca de 6,9 ymol/l de EDTA de dipotássio (etilenodiaminotetracetato de dipotássio) compreendendo agitação suave; 19 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ centrifugar a mistura sangue-EDTA a cerca de 750 x g, cerca de 1000 x g, cerca de 1500 x g ou cerca de 2000 x g durante cerca de 4 min, cerca de 8 min, cerca de 10 min, cerca de 12 min ou cerca de 20 min a cerca de 1°C, cerca de 4°C, cerca de 7°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 21°C ou cerca de 27°C; transferir o plasma para um novo recipiente; centrifugar o plasma a cerca de 750 x g, cerca de 1000 x g, cerca de 1500 x g ou cerca de 2000 x g durante cerca de 4 min, cerca de 8 min, cerca de 10 min, cerca de 12 min ou cerca de 20 min a cerca de 1°C, cerca de 4°C, cerca de 7°C ou cerca de 10°C : transferir o plasma recentrifugado para um novo recipiente; arrefecer o plasma compreendendo a amostra a cerca de 0°C, cerca de 2°C, cerca de 4°C, cerca de 6°C ou cerca de 10°C; congelar, armazenar ou transportar uma amostra compreendendo plasma pelo menos a cerca de -10°C, cerca de -20°C, cerca de -50°C, cerca de -60°C, cerca de -70°C, cerca de -80°C, cerca de -90°C ou cerca de -196°C; e efectuar a obtenção da amostra remota a partir da obtenção de sangue de um indivíduo até ao congelamento do respectivo plasma recentrifugado no período de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 8 horas.

De acordo com uma concretização a amostra remota é plasma. De acordo com uma concretização preferida a obtenção de plasma compreende uma ou mais das seguintes etapas: obter pelo menos cerca de 5 ml, cerca de 10 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 35 ml, cerca de 40 ml, cerca de 45 ml, cerca de 50 ml de sangue de um indivíduo; adicionar EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ao sangue compreendendo agitação suave; ajustar o sangue a uma concentração final de cerca de 2,2 ymol/l, cerca de 3,2 ymol/l, cerca de 3,7 ymol/l, cerca de 4,0 ymol/l, cerca de 4,5 ymol/l, cerca de 4,9 ymol/l, cerca de 5,4 ymol/l, cerca de 5,9 ymol/l ou cerca de 6,9 ymol/l de EDTA de dipotássio (etilenodiaminotetracetato de dipotássio) compreendendo agitação suave por inversão imediata pelo menos 20 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ cerca de 2 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 12 vezes, cerca de 14 vezes ou cerca de 18 vezes; centrifugar a mistura sangue-EDTA a cerca de 750 x g, cerca de 1000 x g, cerca de 1500 x g ou cerca de 2000 x g durante cerca de 4 min, cerca de 8 min, cerca de 10 min, cerca de 12 min ou cerca de 20 min a cerca de 1°C, cerca de 4°C, cerca de 7°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 21°C ou cerca de 27°C ; transferir a fase superior clarificada para um recipiente novo, no qual o recipiente centrifugado é mantido na vertical e a pipeta é inclinada de modo a tocar no bordo do recipiente centrifugado e na superfície da fase superior clarificada, transferindo apenas a quantidade suficiente da fase superior clarificada para que a superfície esteja a uma distância superior a cerca de 20 mm, cerca de 10 mm, cerca de 7 mm, cerca de 5 mm ou cerca de 4 mm da superfície da próxima camada da camada leuco-plaquetária; centrifugar a amostra de plasma a cerca de 750 x g, cerca de 1000 x g, cerca de 1500 x g ou cerca de 2000 x g durante cerca de 4 min, cerca de 8 min, cerca de 10 min, cerca de 12 min ou cerca de 20 min a cerca de 1°C, cerca de 4°C, cerca de 7°C ou cerca de 10°C ; transferir a amostra de plasma recentrifugada para um recipiente novo no qual mais do que cerca de 20 ml, cerca de 12 ml, cerca de 8 ml, cerca de 5 ml ou cerca de 4 ml da amostra de plasma recentrifugado mais baixa permanece no recipiente de centrifugação; arrefecer uma amostra de sangue, amostra de plasma ou amostra intermédia a cerca de 0°C, cerca de 2°C, cerca de 4°C, cerca de 6°C ou cerca de 10°C; congelar, armazenar ou transportar uma amostra de plasma ou uma amostra intermédia pelo menos a cerca de -10°C, cerca de -20°C, cerca de -50°C, cerca de -60°C, cerca de -70°C, cerca de -80°C, cerca de -90°C ou cerca de -196°C; e efectuar a obtenção da amostra remota com início na obtenção de sangue de um indivíduo e finalização no congelamento da amostra de plasma recentrifugada correspondente no período de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 8 horas. 21 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que a amostra remota é uma amostra de plasma e a obtenção da amostra remota compreende um ou mais dos seguintes: obter pelo menos cerca de 35 ml, cerca de 40 ml, cerca de 45 ml ou cerca de 50 ml de sangue de um indivíduo; ajustar o sangue a uma concentração final de cerca de 3.7 ymol/l, cerca de 4,0 ymol/l, cerca de 4,5 ymol/l, cerca de 4.9 ymol/l ou cerca de 5,4 ymol/l de EDTA de dipotássio (etilenodiaminotetracetato de dipotássio) compreendendo agitação suave; centrifugar a mistura sangue-EDTA a cerca 1500 x g durante cerca de 10 min a cerca de 4°C, de preferência não se utiliza travão para parar a centrífuga; transferir o plasma para um recipiente novo; centrifugar o plasma a cerca 1500 x g durante cerca de 10 min a cerca de 4°C, de preferência não se utiliza travão para parar a centrífuga; transferir o plasma recentrifugado para um recipiente novo; arrefecer a amostra compreendendo plasma a cerca de 0°C, cerca de 2°C ou cerca de 4°C; congelar, armazenar ou transportar uma amostra compreendendo plasma pelo menos a cerca de -70°C, cerca de -80°C ou cerca de - 9 0 ° C; e efectuar a obtenção da amostra remota desde a obtenção do sangue de um indivíduo até ao congelamento do plasma recentrifugado correspondente num periodo de cerca de 4 horas.

De acordo com uma concretização preferida, a amostra remota é uma amostra de plasma e a obtenção da amostra de plasma compreende uma ou mais das seguintes etapas: obter pelo menos cerca de 35 ml, cerca de 40 ml, cerca de 45 ml ou cerca de 50 ml de sangue de um indivíduo; ajustar o sangue a uma concentração final de cerca de 3.7 ymol/l, cerca de 4,0 ymol/μ, cerca de 4,5 ymol/l, cerca de 4.9 ymol/l ou cerca de 5,4 ymol/l de EDTA de dipotássio (etilenodiaminotetracetato de dipotássio) compreendendo 22 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ agitação suave por inversão imediata durante cerca de 10 vezes; centrifugar a mistura sangue-EDTA a cerca 1500 x g durante cerca de 10 min a cerca de 4°C, de preferência não se utiliza travão para parar a centrífuga; transferir a fase superior clarificada para um recipiente novo, no qual o recipiente centrifugado é mantido na vertical e a pipeta é inclinada de modo a tocar no bordo do recipiente centrifugado e na superfície da fase superior clarificada, transferindo apenas a quantidade suficiente da fase superior clarificada para que a superfície esteja a uma distância superior a cerca de 5 mm da superfície da próxima camada da camada leuco-plaquetária; centrifugar a amostra de plasma a cerca de 1500 χ g durante cerca de 10 min a cerca de 4°C, de preferência não se utiliza travão para parar a centrífuga; transferir a amostra de plasma recentrifugada para um recipiente novo, no qual mais do que cerca de 5 ml da amostra de plasma recentrifugada mais baixa permanecem no recipiente de centrifugação; arrefecer uma amostra de sangue, amostra de plasma ou amostra intermédia a cerca de 0°C, cerca de 2°C ou cerca de 4°C; congelar, armazenar ou transportar uma amostra de plasma ou amostra intermédia pelo menos a cerca de -70°C, cerca de -80°C ou cerca de -90°C; e efectuar a obtenção da amostra remota desde a obtenção do sangue de um indivíduo e finalizando com o congelamento da amostra de plasma recentrifugada correspondente, num período de cerca de 4 horas.

Numa concretização, o método do invento é um método em que a amostra remota é urina e a obtenção da amostra remota compreende um ou mais dos seguintes: efectuar palpação prostática, massagem prostática ou ambas desde o meio da próstata para o lado esquerdo da próstata, para o lado direito da próstata ou ambos durante cerca de 10 s, cerca de 30 s, cerca de 50 s, cerca de 60 s, cerca de 75 s ou cerca de 120 s; 23 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ recolher os primeiros cerca de 5 ml, cerca de 10 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 40 ml de urina esvaziada; adicionar EDTA à urina; ajustar a urina a uma concentração final de cerca de 3 mmol/1, cerca de 6 mmol/1, cerca de 7 mmol/1, cerca de 8 mmol/1, cerca de 9 mmol/1, cerca de 9,80 mmol/1, cerca de 10 mmol/1, cerca de 11 mmol/1, cerca de 12 mmol/1, cerca de 13 mmol/1, cerca de 14 mmol/1, cerca de 18 mmol/1 ou cerca de 25 mmol/1 de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) com um pH de cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 7,5, cerca de 8,0, cerca de 8,5, cerca de 9,0, cerca de 10; arrefecer a amostra compreendendo urina a cerca de 0°C, cerca de 2°C, cerca de 4°C, cerca de 6°C ou cerca de 10°C; congelar, armazenar ou transportar a amostra compreendendo urina pelo menos a cerca de -20°C, cerca de -50°C, cerca de -60°C, cerca de -70°C, cerca de -80°C, cerca de -90°C ou cerca de -19 6 ° C; e efectuar a obtenção da amostra de urina desde a recolha do primeiro ml de urina esvaziada até ao congelamento da correspondente mistura urina-EDTA num período de cerca de 15, cerca de 30, cerca de 45, cerca de 60, cerca de 75, cerca de 90 ou cerca de 120 min.

De acordo com uma concretização a amostra remota é urina. De acordo com uma concretização, a obtenção de uma amostra de urina compreende pelo menos uma das etapas seguintes: efectuar palpação prostática, massagem prostática ou ambas desde o meio da próstata para o lado esquerdo da próstata, para o lado direito da próstata ou ambos durante cerca de 10 s, cerca de 30 s, cerca de 50 s, cerca de 60 s, cerca de 75 s ou cerca de 120 s; recolher os primeiros cerca de 5 ml, cerca de 10 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, cerca de 30 ml, cerca de 40 ml de urina esvaziada imediatamente após a palpação prostática, a massagem prostática ou ambas; adicionar imediatamente à urina EDTA de dipotássio; ajustar a urina a uma concentração final de cerca de 3 mmol/1, cerca de 6 mmol/1, cerca de 7 mmol/1, cerca de 8 mmol/1, cerca 24 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de 9 mmol/1, cerca de 9,80 mmol/1, cerca de 10 mmol/1, cerca de 11 mmol/1, cerca de 12 mmol/1, cerca de 13 mmol/1, cerca de 14 mmol/1, cerca de 18 mmol/1 ou cerca de 25 mmol/1 de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) com um pH de cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 7,5, cerca de 8,0, cerca de 8,5, cerca de 9,0, cerca de 10 compreendendo agitação suave por inversão imediatamente após recolha; arrefecer a amostra de urina a cerca de 0°C, cerca de 2°C, cerca de 4°C, cerca de 6°C ou cerca de 10°C; congelar, armazenar ou transportar a amostra de urina pelo menos a cerca de -20°C, cerca de -50°C, cerca de -60°C, cerca de -70°C, cerca de -80°C, cerca de -90°C ou cerca de -196°C; e efectuar a obtenção da amostra de urina desde a recolha do primeiro ml de urina esvaziada até ao congelamento da correspondente mistura urina-EDTA num período de cerca de 15, cerca de 30, cerca de 45, cerca de 60, cerca de 75, cerca de 90 ou cerca de 120 min.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que a obtenção da amostra remota de urina compreende um ou mais dos seguintes: efectuar palpação prostática, massagem prostática ou ambas desde o meio da próstata para o lado esquerdo da próstata, para o lado direito da próstata ou ambos durante cerca de 60 s ; recolher os primeiros cerca de 20 ml de urina esvaziada; ajustar a urina a uma concentração final de cerca de 9 mmol/1, cerca de 9,80 mmol/1, cerca de 10 mmol/1 ou cerca de 11 mmol/1 de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) com um pH de cerca de 7,5, cerca de 8,0 ou cerca de 8,5; arrefecer a amostra compreendendo urina a cerca de 0°C, cerca de 2°C ou cerca de 4°C; congelar, armazenar ou transportar a amostra compreendendo urina pelo menos a cerca de -70°C, cerca de -80°C ou cerca de - 9 0 ° C; e efectuar a obtenção da amostra de urina desde a recolha do primeiro ml de urina esvaziada até ao congelamento da 25 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ correspondente mistura urina-EDTA num período de cerca de 60 min.

De acordo com uma concretização preferida, a amostra remota é uma amostra de urina e a obtenção da amostra de urina compreende pelo menos uma das seguintes etapas: efectuar palpação prostática, massagem prostática ou ambas desde o meio da próstata para o lado esquerdo da próstata, para o lado direito da próstata ou ambos durante cerca de 60 s ; recolher os primeiros cerca de 20 ml de urina esvaziada imediatamente após a palpação prostática, a massagem prostática ou ambas; ajustar a urina a uma concentração final de cerca de 9 mmol/1, cerca de 9,80 mmol/1, cerca de 10 mmol/1 ou cerca de 11 mmol/1 de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) com um pH de cerca de 7,5, cerca de 8,0 ou cerca de 8,5 imediatamente após recolha compreendendo agitação suave por inversão imediatamente após recolha; arrefecer a amostra de urina a cerca de 0°C, cerca de 2°C ou cerca de 4°C; congelar, armazenar ou transportar a amostra de urina pelo menos a cerca de -70°C, cerca de -80°C ou cerca de -90°C; e efectuar a obtenção da amostra de urina desde a recolha do primeiro mililitro de urina esvaziada até ao congelamento da correspondente amostra de urina num período de cerca de 60 min.

Numa concretização, a obtenção de uma amostra remota compreende o processamento de uma lista de verificação, um protocolo padronizado ou ambos.

De acordo com uma concretização, a obtenção de uma amostra remota compreende o processamento de uma lista de verificação, um protocolo ou ambos. De acordo com uma concretização preferida, a lista de verificação utilizada para obter uma amostra remota compreende a descrição etapa por etapa de acções que são necessárias, que têm apenas que ser executadas ou ambas. Pode compreender adicionalmente uma nota sobre uma precaução. De acordo com uma concretização, um protocolo 26 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ utilizado para obter uma amostra remota compreende i) a obtenção e utilização de pelo menos um número de identificação de amostra remota, de preferência uma combinação de números e letras ou de preferência um código legivel por computador tal como um código de barras, ii) um registo de dados caracteristicos da amostra, iii) um registo de dados cegos caracteristicos do individuo do gual se retirou a amostra, iv) ou suas combinações.

Numa concretização o método do invento é um método em gue a amostra remota é dividida em diferentes subamostras após se proporcionar a amostra remota.

De acordo com uma concretização a amostra remota é dividida em diferentes subamostras. Tal é especialmente efectuado, de modo a obter rendimentos elevados de ADN de uma amostra recolhida de um doente. De acordo com uma concretização o volume de uma amostra remota recolhida de um único doente pode ser superior ao volume adeguado para processamento adicional. Assim a amostra remota recolhida é dividida em subamostras. Estas subamostras são então adicionalmente consideradas como amostras remotas. Preferentemente estas amostras remotas são processadas em paralelo. A separação de amostras remotas é efectuada especialmente relativamente à etapa de extracção de ADN.

Numa concretização, o método do invento é um método em que a amostra remota ou pelo menos uma componente da amostra remota é concentrada subsequentemente à obtenção da amostra remota.

De acordo com uma concretização a amostra remota é concentrada. De acordo com uma concretização, pelo menos uma componente de uma amostra remota é concentrada. Preferentemente esta componente é uma componente compreendendo ADN. A concentração de uma amostra remota ou pelo menos uma sua componente é especialmente efectuada de modo a obter rendimentos elevados de ADN de uma amostra recolhida de um doente. De acordo com uma concretização, o volume de uma amostra remota recolhido de um único doente pode ser superior ao volume adequado para processamento adicional. Assim concentra-se uma amostra remota recolhida ou pelo menos uma 27 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ componente da amostra remota. Numa concretização preferida, utiliza-se um kit de ácido nucleico virico High Pure ou pelo menos uma sua componente i) para obter uma amostra remota, ii) para isolar ADN, iii) para tratar ADN com um reagente ou enzima que permita a diferenciação entre citosina metilada ou não metilada, iv) ou suas combinações.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que a concentração compreende ultrafiltração, redução de volume ou ambas. Numa concretização preferida o método do invento é um método em que a concentração compreende digestão de proteina. As referidas concretizações preferidas são efectuadas independentemente do isolamento do ADN ou como uma subetapa deste.

De acordo com uma concretização, a concentração de uma amostra remota ou pelo menos de uma componente da amostra remota compreende ultrafiltração, redução de volume ou ambas. Preferentemente a concentração compreende digestão de proteina. As referidas concretizações são parte da obtenção de uma amostra remota ou são parte do isolamento de ADN. De acordo com uma concretização preferida, a concentração de uma amostra remota ou pelo menos de uma sua componente compreende pelo menos um dos seleccionados do grupo compreendendo: protease, serina protease, tiol protease, carboxilo protease, metaloprotease, proteinase K, dispositivo de ultrafiltração, dispositivo de filtro Microcon por exemplo, entre outros, coluna Y-30 Microcon, dispositivo de filtro, superfície de silica, membrana de silica, particula magnética, partícula de polistirol, superfície de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp DNA Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico virico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma 28 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®, precipitação com etanol, precipitação com propanol ou concentração em vácuo entre outros através de uma centrífuga. Um perito na especialidade sabe seleccionar outros dispositivos ou kits adequados tendo em consideração as especificações anteriormente mencionadas e os kits nomeados. Os referidos dispositivos ou kits são bem conhecidos na especialidade, consultar seguidamente uma lista de fabricantes actuais.

Numa concretização, o método do invento é um método em que o isolamento de ADN compreende um ou mais dos seguintes: tratar a amostra remota com uma protease, tratar a amostra remota com pelo menos um reagente ou solução de degradação de proteína, por o ADN da amostra remota em contacto com um dispositivo de purificação de ADN, lavar o ADN no dispositivo de purificação de ADN e recuperar o ADN do dispositivo de purificação de ADN.

De acordo com uma concretização a amostra remota é submetida a pelo menos uma das seguintes etapas: i) tratar a amostra remota com uma protease ou um reagente de degradação de proteína; ii) tratar a amostra remota com pelo menos um reagente ou solução de degradação de proteína; purificar o ADN pondo-o em contacto com um dispositivo de purificação de ADN; lavar o ADN; e eluir o ADN do dispositivo de purificação de ADN.

De acordo com uma concretização, o isolamento de ADN de uma amostra remota compreende o tratamento com um reagente de degradação de proteína. Tal reagente pode ser qualquer tipo de reagente tal como conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, entre outros, o reagente de degradação de proteína é brometo de cianogénio.

De acordo com uma concretização, o isolamento de ADN de uma amostra remota compreende o tratamento com um reagente de degradação de proteína. Tal reagente pode ser qualquer tipo de reagente tal como conhecido pelos peritos na especialidade. 29 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Por exemplo, entre outros, o reagente de degradação de proteína é um sal caotrópico tal como cloridrato de guanidina ou ureia; ou um detergente tal como dodecilsulfato de sódio (SDS) .

De acordo com uma concretização, o isolamento de ADN de uma amostra remota compreende a lavagem de ADN, em particular se estiver em contacto com o dispositivo de purificação de ADN. As soluções e reagentes adequados são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, entre outros, a solução de lavagem pode ser qualquer mistura de um álcool de cadeia curta com água tal como 70% de etanol em água.

De acordo com uma concretização, o isolamento de ADN de uma amostra remota compreende a eluição de ADN de um dispositivo de purificação de ADN. Tal reagente pode ser qualquer tipo de reagente tal como conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, entre outros, a solução de eluição é água ou qualquer tampão de eluição fornecido com o dispositivo de purificação de ADN.

Numa concretização, o método do invento é um método compreendendo o isolamento de ADN através do tratamento da amostra remota com uma protease em que a protease é pelo menos uma seleccionada do grupo compreendendo: serina protease, tiol protease, carboxilo protease, metaloprotease e proteínase K.

De acordo com uma concretização, a extracção de ADN de uma amostra remota compreende a utilização de pelo menos uma protease seleccionada do grupo compreendendo: serina protease, tiol protease, carboxilo protease, metaloprotease e proteínase K.

Numa concretização, o método do invento é um método compreendendo o isolamento de ADN através de por o ADN da amostra remota em contacto com um dispositivo de purificação de ADN, em que o dispositivo de purificação de ADN é pelo menos um seleccionado do grupo compreendendo: ultrafiltração, dispositivo de filtro Microcon por exemplo, entre outros, coluna Y-30 Microcon, dispositivo de filtro, superfície de sílica, membrana de sílica, partícula magnética, partícula de polistirol, superfície de polistirol, superfície carregada 30 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp DNA Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico virico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®. O perito na especialidade pode também pensar em outras possibilidades tal como por exemplo, entre outras, precipitação com etanol ou precipitação com propanol, concentração em vácuo entre outros através de uma centrífuga. Um perito na especialidade sabe seleccionar outros dispositivos ou kits adequados tendo em consideração as especificações anteriormente mencionadas e os kits nomeados. Os referidos dispositivos ou kits são bem conhecidos na especialidade. Os fabricantes actuais são: Roche Diagnostics GmbH para o kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes ou o kit de ácido nucleico virico High Pure; Quiagen, Inc. para o kit QIAamp UltraSens Virus, kit QIAamp DNA Micro ou para o kit QIAamp DNA Blood Maxi; Invitek Gesellschaft fur Biotechnik & Biodesign mbH para o kit RTP DNA/RNA Virus Supersense; chemagen AG para o kit especial chemagic Virai DNA/RNA ou o kit especial de ADN de sangue chemagic; Gentra Systems, Inc. para o kit de isolamento de ADN Puregene; Epicentre Technologies para o kit de purificação de ADN e ARN MasterPure™ Complete, Millipore Inc. para o dispositivo de filtração Microcon, Zymo Research Corporation para o kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, Promega U.S. para o kit de purificação de ADN genómico Wizard e bioMérieux SA para o kit de isolamento NucliSens®. Claro que se podem utilizar outros dispositivos ou kits desde que se baseiem nestes dispositivos ou em kits iguais caso estejam disponíveis na altura em que o invento foi feito ou no futuro. 31 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização, o dispositivo de purificação de ADN que se utiliza para isolamento ou extracção de ADN caracteriza-se por pelo menos um critério seleccionado do grupo compreendendo ultrafiltração, dispositivo de filtro Microcon por exemplo, entre outros, coluna Y-30 Microcon, dispositivo de filtro, superfície de silica, membrana de silica, particula magnética, particula de polistirol, superfície de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna de kit QIAamp DNA Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do ki t especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do ki t especial de sangue chemagic DNA, uma componente do ki t de ácido nucleico vírico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®, precipitação com etanol, precipitação com propanol ou concentração em vácuo entre outros através de uma centrífuga.

Claro que se podem utilizar outros dispositivos ou kits de acordo com o invento desde que a sua utilização seja óbvia para o perito na especialidade quando ler as especificações anteriores e os kits nomeados.

Numa concretização, o método do invento é um método em que o isolamento de ADN é efectuado por utilização de pelo menos um kit seleccionado do grupo compreendendo: kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, kit QIAamp UltraSens Virus, kit QIAamp DNA Blood Maxi, kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, kit especial chemagic Virai DNA/RNA, kit especial de sangue chemagic DNA, kit de ácido nucleico vírico High Pure, kit de isolamento Puregene DNA, kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou kit de isolamento NucliSens®. Um perito na especialidade sabe seleccionar outros kits adequados considerando os kits anteriormente denominados. Os referidos kits são bem 32 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ conhecidos na especialidade. É favor procurar anteriormente o nome dos fabricantes correspondentes. Claro que se podem utilizar outros kits desde que se baseiem nestes kits iguais caso estejam disponíveis na altura em que o invento foi feito ou no futuro.

De acordo com uma concretização, utiliza-se pelo menos um dos seguintes kits para extracção de ADN: kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, kit QIAamp UltraSens Virus, kit QIAamp DNA Blood Maxi, kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, kit especial chemagic Virai DNA/RNA, kit especial de sangue chemagic DNA, kit de ácido nucleico virico High Pure, kit de isolamento Puregene DNA, kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou kit de isolamento NucliSens®. Um perito na especialidade pode pensar em outros kits quando ler os nomes dos kits anteriormente mencionados. Claro que esses também se podem utilizar de acordo com o invento. Tal inclui também em particular kits que se baseiam na mesma tecnologia do que os kits anteriormente especificados mas têm nome diferente ou semelhante ou podem ser produzidos por um fabricante diferente. A utilização dos referidos kits para isolar ADN é preferida porque cada um deles verifica os critérios seguintes: i) elevados rendimentos de ADN; ii) evitar contaminações cruzadas; iii) elevado grau de padronização; iv) elevado grau de automatização; v) reduzido esforço de manipulação; vi) baixo preço; vii) facilidade de manipulação; viii) purificam-se tanto fragmentos pequenos como fragmentos longos, consoante estejam presentes na amostra; ix) elevada reprodutibilidade; x) elevada fiabilidade; xi) remoção eficaz de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN, nucleótidos ou bases.

De acordo com uma concretização preferida, utilizam-se o kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes ou o kit QIAamp UltraSens Virus para isolamento de ADN. A razão para tal é por verificarem com vantagem os critérios anteriormente especificados.

De acordo com uma concretização especialmente preferida, utiliza-se o kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure 33 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Compact (I) para volumes grandes para isolamento de ADN por apresentar a reprodutibilidade mais elevada e a fiabilidade mais elevada.

Numa concretização, o método do invento é um método em que ADN isolado derivado de diferentes amostras é recolhido conjuntamente, concentrado ou recolhido conjuntamente e concentrado.

De acordo com uma concretização o ADN extraído derivado do mesmo indivíduo é recolhido conjuntamente. De acordo com uma concretização o ADN extraído derivado do mesmo indivíduo é enriquecido. De acordo com uma concretização o ADN extraído derivado do mesmo indivíduo é simultaneamente recolhido conjuntamente e enriquecido.

Numa concretização, o método do invento é um método em que o ADN isolado é concentrado e a concentração de ADN isolado compreende pelo menos um seleccionado do grupo compreendendo ultrafiltração, dispositivo de filtro Microcon por exemplo, entre outros, coluna Y-30 Microcon, dispositivo de filtro, precipitação com etanol, precipitação com propanol, superfície de sílica, membrana de sílica, partícula magnética, partícula de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, concentração por vácuo, concentração por vácuo através de uma centrífuga, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp DNA Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico vírico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®. Um perito na especialidade sabe seleccionar outros dispositivos ou kits adequados considerando as especificações anteriores e os kits anteriormente denominados. Os referidos kits são bem 34 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ conhecidos na especialidade. É favor procurar anteriormente o nome dos fabricantes correspondentes. Claro que se podem utilizar outros dispositivos ou kits desde que se baseiem em dispositivos ou kits iguais caso estejam disponíveis na altura em que o invento foi feito ou no futuro.

De acordo com uma concretização, o enriquecimento de ADN é efectuado através de pelo menos um dos seguintes ou suas combinações: ultrafiltração, dispositivo de filtro Microcon por exemplo, entre outros, coluna Y-30 Microcon, dispositivo de filtro, precipitação com etanol, precipitação com propanol, superfície de sílica, membrana de sílica, partícula magnética, partícula de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, concentração por vácuo, concentração por vácuo através de uma centrífuga, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp DNA Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Vírus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico vírico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®. A utilização dos referidos dispositivos é especialmente preferida porque estes verificam vantajosamente os seguintes critérios para um ensaio médico baseado numa amostra remota: i) elevados rendimentos de ADN; ii) evitar contaminações cruzadas; iii) elevado grau de padronização; iv) elevado grau de automatização; v) reduzido esforço de manipulação; vi) baixo preço; vii) facilidade de manipulação; viii) purificam-se tanto fragmentos pequenos como fragmentos longos, consoante estejam presentes na amostra; ix) elevada reprodutibilidade; x) elevada fiabilidade; xi) remoção eficaz de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN, nucleótidos ou bases. 35 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização especialmente preferida, utilizam-se dispositivos de ultrafiltração, em particular dispositivos de filtro Microcon para enriquecimento ou concentração porque apresentam o mais elevado rendimento de ADN e permitem uma recuperação tanto de fragmentos pequenos como de fragmentos longos consoante estejam presentes na amostra. 0 método do invento é um método em que o reagente de bissulfito que permite diferenciação entre citosina metilada e não metilada converte citosina não metilada a uracilo e deixa inalterada a citosina metilada. 0 tratamento que permite diferenciar se o ADN está ou não metilado em determinada posição é um tratamento que leva a uma conversão de citosina não metilada a uracilo enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. 0 tratamento compreende a utilização de um reagente de bissulfito. 0 método do invento é um método compreendendo um reagente de conversão como um reagente que permite diferenciação, em que o reagente que converte citosina não metilada a uracilo e deixa a citosina metilada inalterada é um reagente de bissulfito. 0 perito na especialidade sabe como aplicar um reagente de bissulfito. Estão disponiveis kits adequados para aplicação de reagente de bissulfito a ADN, por exemplo entre outros: kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corporation), kit de modificação de ADN Methylamp (Epigentek Inc.), kit de modificação de ADN com bissulfito MethylEasy (Human Genetic Signatures Pty Ltd). 0 tratamento que leva a uma conversão de citosina não metilada a uracilo enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas compreende a utilização de um reagente de bissulfito. 0 perito na especialidade conhece métodos ou kits aplicáveis para tratamento com bissulfito. Por exemplo, entre outros, os kits podem ser: kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corporation), kit de modificação de ADN Methylamp (Epigentek Inc.), kit de modificação de ADN com bissulfito MethylEasy (Human Genetic Signatures Pty Ltd). 36 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ Ο tratamento com bissulfito é essencialmente efectuado tal como descrito em W005/038051. De acordo com tal, numa concretização faz-se reagir o ADN com um reagente de bissulfito, caracterizado em que a referida reacção é efectuada na presença de um composto de entre o grupo de dioxano, um dos seus derivados e um éter cíclico alifático semelhante.

Numa concretização faz-se reagir ADN com um reagente de bissulfito, caracterizado em que a referida reacção é efectuada na presença de um composto com a seguinte fórmula:

Rl°

2 n = 1-35000 m = 1-3 RI = H, Me, Et, Pr, Bu R2 = H, Me, Et, Pr, Bu São assim preferidos compostos n-alquilenoglicol, particularmente os seus éteres de dialquilo e especialmente éter dimetílico de dietilenogicol (DME). A conversão com bissulfito pode ocorrer tanto em solução tal como também em ADN ligado a uma fase sólida. Preferentemente utiliza-se dissulfito de sódio (= bissulfito de sódio/metabissulfito de sódio) , dado ser mais solúvel em água do que o sulfito de sódio. O sal de dissulfito dismuta em solução aquosa a aniões de hidrogenossulfito necessários para a conversão de citosina. Quando a concentração de bissulfito é discutida seguidamente, tal refere-se à concentração de aniões hidrogenossulfito e sulfito na solução reaccional. Para o método de acordo com o invento são possíveis gamas de concentração entre 0,1 e 6 mol/1. É especialmente preferida uma gama de concentração entre 1 e 6 mol/1 e a mais especialmente preferida, 2-4 mol/1. Contudo, quando se utiliza dioxano a concentração máxima de bissulfito que se pode utilizar é menor (ver seguidamente). Na selecção da concentração de bissulfito deve considerar-se que uma concentração de bissulfito elevada leva a uma conversão 37 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ elevada, mas leva igualmente a uma taxa de decomposição elevada devido ao menor pH.

Pode utilizar-se dioxano em diferentes concentrações. Preferentemente, a concentração de dioxano vai até 10 a 35% (vol/vol), sendo especialmente preferido 20 a 30% e o mais especialmente preferido é 22 a 28%, especialmente 25%. Uma concentração dioxano superior a 35% é problemática dado que tal resulta na formação de duas fases na solução reaccional. Nas concretizações especialmente preferidas com uma concentração de dioxano de 22-28%, a concentração de bissulfito final preferida vai até 3,3 a 3,6 mol/1 e na concretização mais especialmente preferida com uma concentração de dioxano de 25%, vai até 3,5 mol/1 (consultar os exemplos).

Os compostos n-alquilenoglicol de acordo com o invento podem utilizar-se numa gama de concentração diferente. O DME é utilizado de preferência a concentrações entre 1-35% (vol/vol) . Há preferência por valores entre 5 e 25% e com a maior preferência DME a 10%.

Os agentes de captura utilizados de acordo com o invento são derivados de cromano, e.g., ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico (também denominado Trolox-C™). Listam-se agentes de captura adicionais no pedido de patente WO 01/98528 (= DE 100 29 915; = pedido US 10/311 661). A conversão com bissulfito pode ser efectuada numa vasta gama de temperaturas desde 0 a 95°C. Contudo, como a temperaturas mais elevadas as velocidades de conversão e de decomposição do ADN aumentam, numa concretização preferida a temperatura de reacção está entre 0-80°C, de preferência entre 30-80°C. É especialmente preferida uma gama entre 50-70°C; a mais especialmente preferida entre 57-65°C. O tempo de reacção óptimo do tratamento com bissulfito depende da temperatura de reacção. O tempo de reacção normalmente vai até entre 1 e 18 horas (consultar: Grunau et al. 2001, Nucleic Acids Res. 2001, 29(13) :E65 — 5) . O tempo de reacção é habitualmente 4-6 horas para uma temperatura de reacção de 60°C. 38 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Numa concretização especialmente preferida do método de acordo com o invento, a conversão com bissulfito é efectuada a temperaturas de reacção suaves em que a temperatura de reacção é então nitidamente aumentada durante um curto período de tempo pelo menos uma vez no decurso da conversão. Deste modo, a eficácia da conversão com bissulfito pode ser surpreendente e claramente aumentada. Os aumentos de temperatura de curta duração denominam-se seguidamente "termopicos". A temperatura de reacção "padrão" fora dos termopicos denomina-se como a temperatura de reacção básica. A temperatura de reacção básica vai até entre 0 e 80°C, de preferência entre 30-80°C, com maior preferência entre 50-70°C, com a maior preferência entre 57-65°C, tal como descrito anteriormente. A temperatura de reacção durante um termopico aumenta até mais de 85°C e ocorre pelo menos um termopico. O número óptimo de termopicos é função da temperatura de reacção básica. Quanto maior for o número óptimo de termopicos, menor será a temperatura de reacção básica. É necessário pelo menos um termopico em cada caso. Por outro lado, em princípio, é possível um qualquer número de termopicos. Claro que se deve considerar que com um elevado número de aumentos de temperatura, a velocidade de decomposição do ADN também aumenta e já não se assegura uma conversão óptima. O número preferido de termopicos é assim entre 1 e 10 termopicos de cada vez, dependendo da temperatura de reacção básica. Um número entre dois e 5 termopicos é assim especialmente preferido. Os termopicos aumentam a temperatura de reacção de preferência para 85 a 100°C, especialmente de preferência para 90-100°C e com a maior preferência para 94°C-100°C. A duração temporal dos termopicos também depende do volume do lote reaccional. Deve assegurar-se que a temperatura é aumentada uniformemente ao longo da solução reaccional total. Para um lote reaccional de 20 μΐ quando se utiliza um termociclador prefere-se uma duração entre 15 segundos e 1,5 minutos, especialmente uma duração entre 20 e 50 segundos. Numa concretização preferida particular a duração é de 30 segundos. Para operações com um volume de 100 μΐ a gama preferida está entre 30 segundos e 5 minutos, especialmente entre 1 e 3 minutos. São especialmente preferidos 1,5-3 minutos. Para um volume de 600 μΐ, prefere-se uma duração de 39 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 1 a 6 minutos, especialmente entre 2 e 4 minutos. É especialmente preferida uma duração de 3 minutos. 0 perito na especialidade será capaz de determinar facilmente as durações adequadas de termopicos relativamente a vários volumes reaccionais. A utilização de termopicos anteriormente descrita leva a velocidades de conversão significativamente melhores da reacção de conversão com bissulfito, mesmo quando não se utilizam os solventes desnaturantes anteriormente descritos.

De acordo com o invento, o tratamento de ADN com bissulfito tem várias vantagens importantes comparativamente com outros métodos ou kits conhecidos no estado da especialidade. Essas vantagens são: i) maior rendimento de ADN convertido; ii) conversão praticamente completa de citosina não metilada enquanto a citosina metilada permanece inalterada; e iii) praticamente não há qualquer fragmentação adicional de ADN. Estas vantagens baseiam-se em condições reaccionais mais suaves devido a i) desnaturação térmica do ADN; ii) concentração de bissulfito comparavelmente baixa; iii) pH ligeiramente mais alcalino; e iv) utilização de uma agente de captura radicalar mais eficiente e mais eficaz.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que tratar ADN com um reagente de bissulfito compreende: misturar cerca de 10 a cerca de 250 μΐ de uma solução compreendendo ADN com cerca de 45 a cerca de 750 μΐ de solução de bissulfito, tendo a solução de bissulfito um pH na gama de cerca de 5,45 a cerca de 5,50 compreendendo cerca de 4,83 a cerca de 4,93 mol/1 de hidrogenossulfito; adicionar cerca de 5 a cerca de 500 μΐ de uma solução orgânica de agente de captura radicalar, compreendendo a solução orgânica de agente de captura radicalar um solvente orgânico e cerca de 10 a cerca de 750 mmol/1 de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 2 a cerca de 18 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 0 a cerca de 80 °C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos de temperatura adicionais, em cada caso durante cerca de 0,5 a cerca de 10 min, para uma temperatura de cerca de 85 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de 40 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ temperatura para uma temperatura de cerca de 8 5 a cerca de 100°C.

De acordo com uma concretização preferida, o tratamento compreendendo uma utilização de um reagente de bissulfito compreende adicionalmente: misturar cerca de 10 a cerca de 250 μΐ de uma solução compreendendo ADN com cerca de 45 a cerca de 750 μΐ de solução de bissulfito, tendo a solução de bissulfito um pH na gama de cerca de 5,45 a cerca de 5,50 compreendendo cerca de 4,83 a cerca de 4,93 mol/1 de hidrogenossulfito; adicionar cerca de 5 a cerca de 500 μΐ de uma solução orgânica de agente de captura radicalar, compreendendo a solução orgânica de agente de captura radicalar um solvente orgânico e cerca de 10 a cerca de 750 mmol/1 de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 2 a cerca de 18 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 0 a cerca de 80°C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos adicionais de temperatura, em cada caso durante cerca de 0,5 a cerca de 10 min, até uma temperatura de cerca de 85 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura até uma temperatura de cerca de 85 a cerca de 100°C.

Numa concretização preferida particular, o método do invento é um método em que tratar o ADN com um reagente de bissulfito compreende: misturar cerca de 50 a cerca de 150 μΐ de solução compreendendo ADN com cerca de 177 a cerca de 531 μΐ da solução de bissulfito; adicionar cerca de 73 a cerca de 219 μΐ de solução de dioxano, compreendendo a solução de dioxano cerca de 157 mmol/1 de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico dissolvido em 1,4-dioxano; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 3 a cerca de 16 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 57 a cerca de 65°C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos adicionais de temperatura, em cada caso durante cerca de 3 a cerca de 5 min, para uma temperatura de cerca de 41 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 94 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C.

De acordo com uma concretização preferida particular, o tratamento de ADN com bissulfito compreende: misturar cerca de 50 a cerca de 150 μΐ de solução compreendendo ADN com cerca de 177 a cerca de 531 μΐ da solução de bissulfito; adicionar cerca de 73 a cerca de 219 μΐ de solução de dioxano, compreendendo a solução de dioxano cerca de 157 minol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico dissolvido em 1,4-dioxano; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 3 a cerca de 16 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 57 a cerca de 65°C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos adicionais de temperatura, em cada caso durante cerca de 3 a cerca de 5 min, para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C.

Numa concretização preferida particular, o método do invento é um método em que tratar o ADN com um reagente de bissulfito compreende: misturar cerca de 50 a cerca de 150 μΐ de uma solução contendo ADN com cerca de 95 a cerca de 285 μΐ da solução de bissulfito; adicionar cerca de 15 a cerca de 45 μΐ de solução de DME, compreendendo a solução de DME cerca de 500 mmol/1 de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico dissolvido em dietilenoglicoldimetiléter; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 3 a cerca de 16 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 57 a cerca de 65°C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos adicionais de temperatura, em cada caso durante cerca de 3 a cerca de 5 min, para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C. 42 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida particular, o tratamento de ADN com bissulfito compreende: misturar cerca de 50 a cerca de 150 μΐ de uma solução contendo o ADN com cerca de 95 a cerca de 285 μΐ da solução de bissulfito; adicionar cerca de 15 a cerca de 45 μΐ de solução de DME, compreendendo a solução de DME cerca de 500 mmol/1 de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico dissolvido em dietilenoglicoldimetiléter; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 3 a cerca de 16 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 57 a cerca de 65 °C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos adicionais de temperatura, em cada caso durante cerca de 3 a cerca de 5 min, para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura para uma temperatura de cerca de 94 a cerca de 100°C.

De acordo com uma concretização, o método do invento é um método em que ADN tratado com bissulfito é submetido directamente a métodos para análise de metilação. Tal é especialmente preferido tendo em conta evitar contaminações cruzadas em métodos baseados em PCR. Esta concretização é basicamente efectuada tal como descrito em US 11/248 721. De acordo com tal, proporcionam-se ADN descontaminados que são adequados para análise de metilação de ADN. Esta concretização caracteriza-se em que o ADN é incubado com uma solução compreendendo reagente de bissulfito tal como anteriormente descrito. Tal leva a uma sulfonação, uma desaminação ou ambas de citosina não metilada. A desaminação é um processo espontâneo numa solução aquosa e leva a ADN compreendendo uracilo sulfonado. Ainda não ocorreu dessulfonação.

Numa etapa independente, põe-se o ADN compreendendo uracilo sulfonado em contacto e incuba-se com uma enzima que degrada especificamente ácidos nucleicos contendo uracilo não sulfonado. Tal enzima é por exemplo Uracil-ADN-glicosilase (UNG). 43 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Numa concretização preferida para proporcionar um ADN molde descontaminado para reacções de amplificação baseadas em polimerase, misturam-se os ADN moldes sulfonado e/ou desaminado com uma actividade UNG e componentes necessárias para uma reacção de amplificação baseada numa polimerase ou um ensaio de detecção baseado em amplificação. Após degradação de ácidos nucleicos contendo uracilo não sulfonado por utilização de UNG, termina-se a actividade UNG e faz-se dessulfonação do ADN molde por aumento de temperatura. Subsequentemente o ADN molde está pronto a ser amplificado.

Numa concretização preferida, a degradação, terminação, dessulfonação e amplificação ocorrem num único tubo durante a reacção de amplificação baseada em polimerase e/ou ensaio baseado em amplificação. Preferentemente efectua-se tal amplificação na presença de dUTP em vez de dTTP. 0 ADN após tratamento com bissulfito, sulfonado e parcial ou completamente desaminado, é submetido directamente a reacção de amplificação baseada em polimerase e/ou ensaio baseado em amplificação sem qualquer dessulfonação prévia. A dessulfonação ocorre durante o aumento inicial de temperatura da reacção de amplificação.

Estas concretizações particulares têm a vantagem comparativamente a métodos conhecidos de tratamento com bissulfito, da etapa de purificação após tratamento com bissulfito se tornar dispensável. Tal é uma simplificação que resulta na redução de custos e esforços de manipulação, minimiza perda de ADN tratado com bissulfito e também poupa tempo.

Numa concretização, o método do invento é um método em que tratar ADN com um reagente de bissulfito permitindo diferenciação do estado de metilação compreende purificar o ADN tratado.

De acordo com uma concretização, o tratamento que leva a uma conversão de citosina não metilada a uracilo enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas compreende a purificação do ADN tratado com bissulfito. 44 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Numa concretização preferida, o método do invento é um método em que purificar o ADN tratado compreende a utilização de pelo menos um seleccionado do grupo compreendendo: ultrafiltração, dispositivo de filtração Microcon, dispositivo de filtração, etanol, propanol, superfície de silica, membrana de silica, partícula magnética, partícula de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp ADN Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico vírico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®. Um perito na especialidade sabe seleccionar outros dispositivos ou kits adequados considerando as especificações anteriores os kits anteriormente denominados. Os referidos kits são bem conhecidos na especialidade. É favor procurar anteriormente o nome dos fabricantes correspondentes. Claro que se podem utilizar outros dispositivos ou kits desde que se baseiem nos referidos dispositivos ou kits iguais caso estejam disponíveis na altura em que o invento foi feito ou no futuro.

De acordo com uma concretização, a purificação de ADN tratado com bissulfito compreende a utilização de pelo menos um dos seguintes ou suas combinações: ultrafiltração, dispositivo de filtração Microcon, dispositivo de filtração, etanol, propanol, superfície de sílica, membrana de sílica, partícula magnética, partícula de polistirol, superfície carregada positivamente e membrana carregada positivamente, membrana carregada, superfície carregada, membrana interruptora carregada, superfície interruptora carregada, coluna do kit ZR DNA Clean e Concentrator-5, coluna do kit de purificação de ADN genómico Wizard, coluna do kit QIAamp ADN Micro, uma componente do kit de isolamento de ácido nucleico 45 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

MagNA Pure Compact (I) para volumes grandes, uma componente do kit QIAamp UltraSens Virus, uma componente do kit RTP DNA/RNA Virus Supersense, uma componente do kit especial chemagic Virai DNA/RNA, uma componente do kit especial de sangue chemagic DNA, uma componente do kit de ácido nucleico virico High Pure, uma componente do kit de isolamento Puregene DNA, uma componente do kit de purificação de ADN e de ARN MasterPure™ Complete ou uma componente do kit de isolamento NucliSens®.

De acordo com uma concretização preferida utilizam-se dispositivos de ultrafiltração, nomeadamente dispositivos de filtração Microron para purificação, dessulfonação ou purificação e dessulfonação de ADN tratado com bissulfito porque têm o rendimento mais elevado de ADN tratado com bissulfito e permitem uma recuperação de fragmentos pequenos tratados com bissulfito assim como de fragmentos longos tratados com bissulfito conforme estejam presentes na amostra após tratamento com bissulfito.

Numa concretização preferida particular o método do invento é um método em que purificar o ADN tratado compreende: adição de cerca de 50 a cerca de 1000 μΐ de água à amostra após reacção de bissulfito; aplicação da mistura num dispositivo de filtração Microcon centrifugando subsequentemente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 10 a cerca de 30 min; lavagem com cerca de 100 a cerca de 800 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,2 mol/1 e centrifugação subsequente entre cerca de 10 00 0 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; aplicação de cerca de 100 a cerca de 800 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,1 mol/1 e centrifugação subsequente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; aplicação, em 1 a cerca de 8 repetições do seguinte: aplicação de cerca de 100 a cerca de 400 μΐ de água ou tampão TE e centrifugação subsequente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; e 46 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ eluição por aplicação de cerca de 25 a cerca de 200 μΐ de tampão TE pré-aquecido entre cerca de 15 a cerca de 65°C, incubação durante cerca de 1 a cerca de 30 min a uma temperatura de cerca de 15 a cerca de 65 °C e inversão subsequente do dispositivo de filtração Microcon e centrifugação entre cerca de 500 a cerca de 5 000 x g durante cerca de 0,5 a cerca de 30 min.

De acordo com uma concretização preferida, a purificação e dessulfonação de ADN tratado com bissulfito compreende: adição de cerca de 50 a cerca de 1000 μΐ de áqua à amostra após reacção do bissulfito; aplicação da mistura num dispositivo de filtração Microcon centrifuqando subsequentemente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x q durante cerca de 10 a cerca de 30 min; lavaqem com cerca de 100 a cerca de 800 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,2 mol/1 e centrifugação subsequente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; aplicação de cerca de 100 a cerca de 800 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,1 mol/1 e centrifugação subsequente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; aplicação, em 1 a cerca de 8 repetições do seguinte: aplicação de cerca de 100 a cerca de 400 μΐ de água ou tampão TE e centrifugação subsequente entre cerca de 10 000 e cerca de 18 000 x g durante cerca de 6 a cerca de 25 min; e eluição por aplicação de cerca de 25 a cerca de 200 μΐ de tampão TE pré-aquecido entre cerca de 15 a cerca de 65°C, incubação durante cerca de 1 a cerca de 30 min a uma temperatura de cerca de 15 a cerca de 65°C e inversão subsequente do dispositivo de filtração Microcon e centrifugação entre cerca de 500 a cerca de 5 000 x g durante cerca de 0,5 a cerca de 30 min.

Numa concretização preferida particular, o método do invento é um método em que purificar o ADN tratado compreende: a) adição de cerca de 200 μΐ de água à amostra após reacção de bissulfito, 47 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ b) aplicação da mistura num dispositivo de filtração Microcon centrifugando subsequentemente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 20 min, c) lavagem com cerca de 400 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,2 mol/1 e centrifugação subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 10 a cerca de 14 min, d) aplicação de cerca de 400 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,1 mol/1 e centrifugação subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 10 a cerca de 14 min, e) aplicação, em 1 a cerca de 4 repetições do seguinte: aplicação de cerca de 400 μΐ de água ou tampão TE e centrifugação subsequente entre cerca de 14 000 x g durante cerca de 12 min; e f) eluição por aplicação de cerca de 45 a cerca de 70 μΐ de tampão TE pré-aquecido a cerca de 50°C, incubação durante cerca de 10 min a uma temperatura de cerca de 50°C e inversão subsequente do dispositivo de filtração Microcon e centrifugação a cerca de 1 000 x g durante cerca de 7 min.

De acordo com uma concretização preferida particular, a purificação e dessulfonação de ADN tratado com bissulfito compreende: a) adição de cerca de 200 μΐ de água à amostra após reacção de bissulfito, b) aplicação da mistura num dispositivo de filtração Microcon centrifugando subsequentemente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 20 min, c) lavagem com cerca de 400 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,2 mol/1 e centrifugação subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 10 a cerca de 14 min, d) aplicação de cerca de 400 μΐ de hidróxido de sódio a cerca de 0,1 mol/1 e centrifugação subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 10 a cerca de 14 min, e) aplicação, em 1 a cerca de 4 repetições do seguinte: aplicação de cerca de 400 μΐ de água ou tampão TE e centrifugação subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 12 min; e 48 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ f) eluição por aplicação de cerca de 45 a cerca de 70 μΐ de tampão TE pré-aquecido a cerca de 50°C, incubação durante cerca de 10 min a uma temperatura de cerca de 50 °C e inversão subsequente do dispositivo de filtração Microcon e centrifugação a cerca de 1 000 x g durante cerca de 7 min.

Numa concretização preferida particular, o método do invento é um método em que purificar o ADN tratado compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: na etapa b, aplicar a mistura em porções no dispositivo de filtração Microcon na etapa b, subsequentemente à etapa b, aplicar cerca de 400 μΐ de tampão TE, contendo o tampão TE pH 8 tris-hidroximetilaminometano a cerca de 10 mmol/1 e EDTA a cerca de 0,1 mmol/1, centrifugando subsequente a cerca de 14 000 x g durante cerca de 12 min, na etapa c, incubar com hidróxido de sódio a cerca de 0,2 mol/1 durante cerca de 10 min à temperatura ambiente, na etapa d, incubar com hidróxido de sódio a cerca de 0,1 mol/1 durante cerca de 10 min à temperatura ambiente,

De acordo com uma concretização preferida, submete-se o ADN tratado com bissulfito ou o ADN tratado com bissulfito e purificado a uma amplificação de genoma completo antes de qualquer análise adicional.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método para amplificação de pelo menos um ácido nucleico, compreendendo: proporcionar a amostra de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico, tratar pelo menos uma molécula de ácido nucleico derivada da referida amostra com um reagente de bissulfito que diferencia entre bases metiladas no interior da referida molécula de ácido nucleico e bases não metiladas no interior da referida molécula de ácido nucleico, estender pelo menos uma cadeia de pelo menos uma molécula de ácido nucleico derivada da referida amostra em pelo menos um nucleótido ou monómero de PNA, e 49 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ amplificar a pelo menos uma molécula de ácido nucleico estendida. Desse modo as etapas de tratar pelo menos uma molécula de ácido nucleico derivada da referida amostra e a etapa de estender pelo menos uma cadeia de pelo menos uma molécula de ácido nucleico derivada da referida amostra podem ser efectuadas com ordem arbitrária.

De acordo com uma concretização preferida amplifica-se pelo menos um ácido nucleico. A amplificação compreende desse modo as seguintes etapas que podem ser efectuadas em qualquer ordem arbitrária: proporcionar pelo menos uma molécula de ácido nucleico proporcionando uma amostra de ácido nucleico. Estender pelo menos uma cadeia de pelo menos uma molécula de ácido nucleico em pelo menos um nucleótido ou monómero de PNA. Tratar pelo menos uma molécula de ácido nucleico com um reagente de bissulfito que diferencia bases metiladas no interior da referida molécula de ácido nucleico e bases não metiladas no interior da referida molécula de ácido nucleico. Amplificar pelo menos uma molécula de ácido nucleico. Desse modo, de preferência, utilizam-se as porções estendidas ou as porções tratadas e estendidas de pelo menos uma molécula de ácido nucleico para amplificação da referida pelo menos uma molécula de ácido nucleico.

Numa concretização preferida, a extensão caracteriza-se em que pelo menos uma cadeia de pelo menos um ácido nucleico é estendida em um ou mais nucleótidos únicos ou monómeros de PNA, em um ou mais oligonucleótidos ou oligómeros de PNA, em um segundo ácido nucleico derivado da amostra de ácido nucleico proporcionada, ou pelas suas combinações.

De acordo com uma concretização preferida, a referida pelo menos uma cadeia é alongada por um ou mais nucleótidos únicos ou monómeros de PNA, por um ou mais oligonucleótidos ou oligómeros de PNA, por um segundo ácido nucleico de preferência derivado da mesma amostra de ácido nucleico proporcionada tal como anteriormente especificado ou por suas combinações. Os nucleótidos, oligonucleótidos ou segundo ácido nucleico podem ser qualquer tipo de nucleótidos ou análogos de 50 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ nucleótidos adequados para alongamento e tal como conhecido pelos peritos na especialidade. Preferentemente, entre outros, os nucleótidos são desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, ribonucleótidos bloqueados ou monómeros de PNA. Preferentemente, entre outros, os oligonucleótidos são oligodesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos ou oligómeros de PNA, com maior preferência os oligómeros de PNA são oligómeros quiméricos arbitrários de nucleótidos e monómeros de PNA, em que pelo menos um nucleótido se localiza na extremidade 5' ou na extremidade 3' do oligómero quimérico. 0 referido segundo ácido nucleico pode ser qualquer ácido nucleico quer compreendido na amostra proporcionada quer adicionado durante o método do invento. Este segundo ácido nucleico pode ter sequência conhecida ou desconhecida. Pode ser endógeno ou artificial. Preferentemente, o segundo ácido nucleico é um ácido nucleico endógeno tratado com bissulfito proporcionado com a amostra de ácido nucleico.

Numa concretização preferida a extensão é catalisada independentemente num molde.

De acordo com uma concretização preferida não se utiliza molde para a extensão. Tal significa que a extensão ocorre aleatoriamente ou tal como especificado por uma ou mais enzimas utilizadas ou adicionalmente pelas condições reaccionais (e.g. entre outros, pelos nucleótidos proporcionados).

Numa concretização preferida, a extensão é catalisada através de pelo menos uma enzima seleccionada do grupo compreendendo: uma transferase, uma transferase que transfere grupos contendo fósforo, uma nucleotidiltransferase, uma ADN nucleotidilexotransferase, deoxinucleotidilo terminal transferase (TdT), uma enzima com actividade de ribonucleótido transferase, uma polirribonucleótido nucleotidiltransferase, uma ARNt nucleotidiltransferase, ARN uridililtransferase, uma ligase, uma ligase que forma ligações de éster fosfórico, uma ADN ligase, uma ADN ligase dependente de ATP, uma ADN ligase de cadeia simples, uma ADN ligase de cadeia simples dependente de ATP que catalisa circularização intramolecular, CircLigase ADN em cadeia simples Ligase. 51 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida, a reacção de extensão é catalisada através de pelo menos uma enzima. A(s) referida (s) enzima(s) com pelo menos uma actividade seleccionada do grupo compreendendo: uma actividade de transferase, uma actividade de transferase que transfere grupos contendo fósforo, uma actividade nucleotidiltransferase, uma actividade ADN nucleotidilexotransferase, actividade deoxinucleotidilo terminal transferase (TdT), uma enzima com actividade ribonucleótido transferase, uma actividade polirribonucleótido nucleotidiltransferase, uma actividade ARNt nucleotidiltransferase, actividade ARN uridililtransferase, uma actividade ligase, uma actividade de uma ligase que forma ligações de éster fosfórico, uma actividade ADN ligase, uma actividade ADN ligase dependente de ATP, uma actividade ADN ligase de cadeia simples, uma actividade ADN ligase de cadeia simples dependente de ATP que catalisa circularização intramolecular, actividade CircLigase ADN de cadeia simples Ligase. As enzimas adequadas são do conhecimento dos peritos na especialidade. De acordo com uma concretização preferida particular, a enzima catalisadora é Terminal Transferase TdT (New England Biolabs n° Cat. M0252S/L). De acordo com outra concretização preferida particular, a enzima catalisadora é CircLigase™ ADN em cadeia simples Ligase (Epicentre Biotechnologies n° Cat. CL4111K / CL4115K).

Descrevem-se anteriormente reagentes adequados assim como métodos adequados para diferenciação. Um perito na especialidade sabe como ajustar uma utilização dos referidos reagentes ou como ajustar os referidos métodos para a amplificação do ADN tratado com bissulfito, conforme o caso.

Numa concretização preferida o ácido nucleico proporcionado é pelo menos em partes ADN, ARN ou PNA.

De acordo com uma concretização preferida, o ácido nucleico proporcionado com a amostra de ácido nucleico é ácido desoxirribonucleico (ADN), um ácido ribonucleico (ARN), um ácido nucleico peptídico (PNA) ou suas modificações, por exemplo entre outros, ácido nucleico bloqueado (LNA). Claro que o ácido nucleico proporcionado pode também ser uma combinação dos referidos tipos de ácidos nucleicos. 52 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Numa concretização preferida, a obtenção de uma amostra de ácido nucleico compreende pelo menos uma das seguintes: fragmentação, fragmentação aleatória, fragmentação por tensão mecânica, fragmentação através de um reagente, fragmentação através de uma enzima, fragmentação através de uma nuclease, fragmentação através de uma endonuclease de restrição.

De acordo com uma concretização preferida, a obtenção de uma amostra de ácido nucleico compreende também uma fragmentação dos ácidos nucleicos nela compreendidos. Os peritos na especialidade conhecem métodos para fragmentação. Preferentemente, os métodos de fragmentação caracterizam-se por um ou mais dos seguintes: fragmentação aleatória, fragmentação por tensão mecânica, fragmentação através de um reagente, fragmentação através de uma enzima, fragmentação através de uma nuclease, fragmentação através de uma enzima de restrição.

Numa concretização preferida, a amplificação de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estendida compreende pelo menos uma das seguintes: uma polimerase, uma polimerase termoestável, um nucleótido, oligonucleótido, uma ligase, uma transcritase reversa, uma ARN polimerase, uma ARNase.

De acordo com uma concretização preferida, o ácido nucleico estendido é amplificado através de uma ou mais enzimas ou reagentes seleccionados do grupo compreendendo: uma polimerase, uma polimerase termoestável, um nucleótido, oligonucleótido, uma ligase, uma transcritase reversa, uma ARN polimerase, uma ARNase.

Numa concretização preferida, a amplificação de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estendida compreende utilização de pelo menos um método seleccionado do grupo compreendendo: método de amplificação, método de PCR, método de LCR ou suas combinações.

De acordo com uma concretização preferida, o ácido nucleico estendido é amplificado de acordo com um método de amplificação, um método de PCR, um método de RACE PCR, um método de LCR ou suas combinações. Já são aqui descritos 53 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ métodos adequados para amplificação com excepção do método RACE PCR. Um perito na especialidade saberá como ajustar os referidos métodos adequados para a amplificação de ADN tratado com bissulfito, conforme o caso.

Numa concretização preferida, a metilação da molécula de ácido nucleico proporcionada é analisada por pelo menos um método seleccionado do grupo compreendendo: método de amplificação, método de PCR, método de LCR, método de amplificação especifica de metilação, método MSP (PCR especifico de metilação), método de MSP em ninho, método HeavyMethyl™, método de detecção, método de detecção especifico de metilação, método de sequenciação de bissulfito, detecção através de matrizes de ADN, detecção através de micromatrizes de oligonucleótido, detecção através de micromatrizes de ilhas CpG, detecção através de enzimas de restrição, método de amplificação e detecção simultânea especifico de metilação, método COBRA, PCR em tempo real, método de PCR em tempo real HeavyMethyl™, método MSP MethyLight™, método MethyLight™, método MethyLight™ Algo™, método QM, método Headloop MethyLight™, método HeavyMethyl™ MethyLight™, método HeavyMethyl™ Scorpion™, método MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão de iniciador sensível a metilação e método Ms-SNuPE (extensão de iniciador de nucleótido único sensível a metilação) ou suas combinações.

De acordo com uma concretização preferida, analisa-se a molécula de ácido nucleico proporcionado relativamente à sua metilação. De preferência relativamente à sua metilação de citosina. Os métodos adequados são por exemplo, entre outros, método de amplificação, método de PCR, método de LCR, método de amplificação específica de metilação, método MSP (PCR específico de metilação) , método de MSP em ninho, método HeavyMethyl™, método de detecção, método de detecção específico de metilação, método de sequenciação de bissulfito, detecção através de matrizes de ADN, detecção através de micromatrizes de oligonucleótido, detecção através de micromatrizes de ilhas CpG, detecção através de enzimas de restrição, método de amplificação e detecção simultânea específico de metilação, método COBRA, PCR em tempo real, método de PCR em tempo real HeavyMethyl™, método MSP MethyLight™, método MethyLight™, método MethyLight™ Algo™, 54 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ método QM, método Headloop MethyLight™, método HeavyMethyl™ MethyLight™, método HeavyMethyl™ Scorpion™, método MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão de iniciador sensível a metilação e método Ms-SNuPE (extensão de iniciador de nucleótido simples sensivel a metilação) ou suas combinações. Os referidos métodos são descritos detalhadamente em seguida.

Uma concretização preferida particular compreende proporcionar uma amostra de ADN compreendendo pelo menos uma molécula de ADN, estender pelo menos uma cadeia da referida pelo menos uma molécula de ADN proporcionada através de pelo menos um único nucleótido ou monómero de PNA, tratar a pelo menos uma cadeia de ADN estendida com um reagente de bissulfito que diferencia entre citosina metilada no interior da referida molécula de ADN e citosina não metilada no interior da referida molécula de ADN, e amplificar pelo menos uma molécula de ADN tratada compreendendo pelo menos uma cadeia estendida.

De acordo com uma concretização preferida particular, as referidas etapas compreendidas para amplificação de tratadas com bissulfito são efectuadas na ordem seguinte: i) proporcionar uma amostra de ADN compreendendo pelo menos uma molécula de ADN; ii) estender pelo menos uma cadeia da referida pelo menos uma molécula de ADN proporcionada através de pelo menos um nucleótido único ou monómero de PNA; iii) tratar a pelo menos uma cadeia de ADN estendida com um reagente de bissulfito que diferencia citosina metilada no interior da referida molécula de ADN e citosina não metilada no interior da referida molécula de ADN; e iv) amplificar pelo menos uma molécula de ADN tratada compreendendo pelo menos uma cadeia estendida. Claro que podem também ser incluídas etapas adicionais antes, entre ou após as referidas etapas.

Numa concretização preferida particular, a extensão de pelo menos uma cadeia da pelo menos uma molécula de ADN proporcionada compreende deoxinucleotidilo terminal transferase e um ou mais nucleótidos. 55 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida particular, pelo menos uma cadeia da molécula de ADN proporcionada é estendida através de uma deoxinucleotidilo terminal transferase, de preferência através da deoxinucleotidilo terminal transferase TdT (New England Biolabs n° Cat M0252S/L) . Além disso, a extensão é efectuada na presença de ribonucleótidos, de preferência na presença de apenas adenosina-trifosfato; na presença de apenas timidina-trifosfato; na presença de apenas guanosina-trifosfato; na presença de apenas citidina-trifosfato; ou na presença de apenas uracilotrifosfato. Com maior preferência a extensão é efectuada na presença de deosoxinucleótidos, de preferência na presença de apenas presença de apenas presença de apenas presença de apenas presença de apenas

desoxiadenosina-trifosfato; na desoxitimidina-trifosfato; na desoxiguanosina-trifosfato; na desoxicitidina-trifosfato; desoxiuracilotrifosfato. A na ou

TdT catalisa o alongamento da referida pelo menos uma cadeia simples por polimerização dos respectivos nucleótidos em cima do grupo hidroxilo 3' do nucleósido terminal da cadeia simples. A TdT adiciona 300-400 nucleótidos no período de 30 min para adição de uma cauda dA ou para adição de uma cauda dT e cerca de 10-100 nucleótidos para uma adição de cauda dG ou de cauda dC.

Numa concretização preferida particular, a amplificação da molécula de ADN tratada caracteriza-se em que o oligonucleótido ou oligómero é pelo menos parcialmente hibridado com a parte estendida da referida molécula de ADN.

De acordo com uma concretização preferida particular, amplifica-se uma molécula de ADN de cadeia simples tratada com bissulfito e estendida através de pelo menos um oligonucleótido ou oligómero de PNA. Desse modo o referido oligonucleótido ou oligómero híbrida completa ou parcialmente com a parte estendida da molécula de ADN de cadeia simples tratada com bissulfito e estendida. De acordo com uma concretização preferida particular, o oligonucleótido ou oligómero híbrida completamente com a parte estendida. Desse modo obtém-se uma amplificação do genoma completo proporcionado com a amostra de ácido nucleico. Além disso, esta concretização caracteriza-se em que uma amplificação representativa do genoma completo proporcionado na amostra de 56 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ ácido nucleico é amplificada em larga escala. De acordo com outra concretização preferida particular, o oligonucleótido ou oligómero hibrida apenas em partes com a porção estendida. Desse modo obtém-se uma amplificação especifica de regiões de interesse.

De acordo com uma concretização preferida, o pelo menos um oligonucleótido ou oligómero para amplificação hibrida completamente com a cadeia de ADN tratada. Esta concretização preferida é já parte de outra concretização na qual a etapa de extensão é dispensável. De acordo com esta concretização, proporciona-se pelo menos um ácido nucleico sob a forma de uma amostra de ácido nucleico, sendo a amostra de ácido nucleico proporcionado tratada com um reagente de bissulfito que diferencia entre bases metiladas e não metiladas no interior do referido ácido nucleico proporcionado e o ácido nucleico tratado é amplificado através de pelo menos um oligonucleótido ou oligómero de PNA que hibrida com o referido ácido nucleico tratado. Numa concretização preferida, o referido pelo menos um oligonucleótido ou oligómero de PNA é pobre em guanina e rico em adenina, timina e citosina.

Outra concretização preferida particular compreende proporcionar uma amostra de ADN compreendendo pelo menos uma molécula de ADN em cadeia dupla ou pelo menos duas moléculas de ADN em cadeia simples, tratar o ADN proporcionado com um reagente de bissulfito que diferencia entre citosina metilada no interior do referido ADN e citosina não metilada no interior do referido ADN, em que se proporcionam as moléculas de ADN em cadeia simples tratadas, estender pelo menos um das referidas moléculas de ADN em cadeia simples tratadas através de pelo menos um oligonucleótido ou oligómero de PNA ou através de pelo menos uma molécula de ADN em cadeia simples tratada adicional, e amplificar pelo menos uma molécula de ADN em cadeia simples após tratamento e extensão.

De acordo com uma concretização preferida particular, as referidas etapas compreendidas para amplificação de tratadas com bissulfito são efectuadas na seguinte ordem: i) proporcionar uma amostra de ADN compreendendo pelo menos 57 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ uma molécula de ADN; ii) tratar o ADN proporcionado com um reagente de bissulfito que diferencia entre citosina metilada no interior da referida molécula de ADN e citosina não metilada no interior da referida molécula de ADN; iii) estender pelo menos uma cadeia do ADN proporcionado e tratado através de pelo menos um nucleótido único ou monómero de PNA; e iv) amplificar pelo menos uma molécula de ADN tratada compreendendo pelo menos uma cadeia estendida. Claro que podem também ser incluídas etapas adicionais antes, entre ou após as referidas etapas.

De acordo com uma concretização preferida particular, a pelo menos uma cadeia de ADN tratado é estendida por ligação de um oligonucleótido ou um oligómero quimérico. 0 oligómero quimérico caracteriza-se por compreender nucleótidos e monómeros de PNA, em que pelo menos um nucleótido se localiza na extremidade 5' ou 3' do oligómero quimérico.

De acordo com uma concretização preferida particular, estende-se a pelo menos uma cadeia de ADN tratado por ligação de uma segunda cadeia de ADN. Esta segunda cadeia de ADN pode ser derivada pela amostra proporcionada ou pode ser adicionada durante o método do invento. Esta segunda cadeia de ADN pode ter sequência conhecida ou desconhecida. Pode adicionalmente ser endógena (sequência de um genoma por exemplo, entre outros, o genoma humano) ou pode ser artificial. Preferentemente, a referida segunda cadeia de ADN é uma cadeia simples de ADN tratada com bissulfito derivada do mesmo modo que a primeira cadeia simples de ADN tratada com bissulfito da amostra de ácido nucleico proporcionada.

Numa concretização preferida, a extensão de pelo menos uma molécula de ADN em cadeia simples tratada compreende uma ADN ligase em cadeia simples.

De acordo com uma concretização preferida, efectua-se a reacção de extensão por utilização de uma ADN ligase em cadeia simples. Tal é especialmente preferido no caso da reacção de extensão ser uma reacção de ligação na extremidade de uma cadeia simples tratada com bissulfito com outra extremidade. Preferentemente, a ADN ligase em cadeia simples é CircLigase™ ADN em cadeia simples ligase (Epicentre Biotechnologies). Mas 58 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ evidentemente que se podem utilizar outras ligases de acordo com o invento desde que sejam capazes de ligar ADN tratado com bissulfito.

Numa concretização preferida, a amplificação da referida molécula de ADN caracteriza-se em que pelo menos um oligonucleótido ou oligómero é pelo menos parcialmente hibridado na parte estendida da molécula de ADN em cadeia simples tratada.

De acordo com uma concretização preferida particular, amplifica-se uma molécula de ADN tratada com bissulfito em cadeia simples estendida através de pelo menos um oligonucleótido ou oligómero de PNA. Desse modo o referido oligonucleótido ou oligómero híbrida completamente ou em partes com a parte estendida da molécula de ADN tratada com bissulfito em cadeia simples estendida. De acordo com uma concretização preferida particular, o oligonucleótido ou oligómero híbrida completamente com a parte estendida. Desse modo obtém-se uma amplificação do genoma completo proporcionado com a amostra de ácido nucleico. De acordo com outra concretização preferida particular, o oligonucleótido ou oligómero híbrida apenas em partes com a parte estendida. Desse modo obtém-se uma amplificação específica de regiões de interesse. Determina-se então a especificidade pela utilização de uma sequência de oligonucleótidos ou oligómeros e da condição de amplificação.

De acordo com uma concretização preferida, o pelo menos um oligonucleótido ou oligómero para amplificação híbrida completamente com o ADN em cadeia simples tratado com bissulfito. Tal é particularmente preferido para uma concretização na qual a extremidade 5' do ADN em cadeia simples tratado com bissulfito se liga à sua extremidade 3' resultando numa circularização intramolecular. A hibridação do oligonucleótido ou oligómero pode desse modo ocorrer em qualquer local no interior do ADN em cadeia simples circularizado tratado com bissulfito.

Numa concretização preferida, a molécula de ADN em cadeia simples tratada é ligada intramolecularmente durante a etapa de extensão e a amplificação caracteriza-se em que pelo menos 59 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ um oligonucleótido ou oligómero híbrida no local arbitrário da molécula de ADN em cadeia simples circularizada tratada. Esta concretização caracteriza-se em que uma amplificação representativa do genoma completo proporcionado na amostra de ácido nucleico é amplificada em grandes quantidades.

Podem recolher-se informações sobre amplificação de genoma completo em Hawkins et al. : Whole genome amplification applications and advances. Curr Opin Biotechnol. Fevereiro de 2002; 13(1):65-7,-. De acordo com esses métodos, amplificam-se fragmentos através de uma ADN polimerase e de iniciadores. Os iniciadores podem ser iniciadores específicos de ligando, iniciadores aleatórios ou iniciadores degenerados. Até ao momento estão descritos diferentes métodos WGA. Na denominada extensão de iniciador pré-amplificação (PEP), efectua-se a amplificação através de uma mistura aleatória de oligonucleótidos iniciadores com um comprimento aproximado de 15 nucleótidos (Zhang et al.: Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sei USA 89:5847-51, 1992). Em DOP-PCR (reacção de polimerização em cadeia iniciada com oligonucleótidos degenerados) contudo, apenas se utiliza um iniciador degenerado (Telenius et al.: Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer; Genomics 13: 718-25, 1992). Outro método WGA é o denominado PCR de ligante/adaptador. Nele, ligam-se ligantes a fragmentos. Na amplificação subsequente, utilizam-se iniciadores que se ligam especificamente aos ligantes (revisto em: Cheung e Nelson: Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA. Proc Natl Acad Sei USA. 93:14676-9, 1996) . Os métodos WGA anteriormente descritos baseados em PCR têm contudo vários inconvenientes. Por exemplo, pode ocorrer geração de artefactos de amplificação inespecíficos. Além disso, muitas vezes ocorrerá uma cobertura apenas incompleta de todas as regiões do genoma. Além disso, são parcialmente gerados fragmentos de ADN curtos com comprimentos inferiores a 1 kB. (Dean et al. : Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc Natl Acad Sei USA. 99:5261-6, 2002). O método mais poderoso para uma amplificação de genoma completo é assim presentemente o método 60 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ isotérmico de "amplificação por deslocamento múltiplo" (MDA, Dean et al. 2002 como anteriormente; Patente U.S. 6 124 120). Faz-se reagir o ADN com iniciadores aleatórios e uma ADN polimerase. Utilizam-se aqui polimerases que são capazes de deslocar a cadeia sem molde do ADN em cadeia dupla durante a amplificação (e.g. uma 29 polimerase). Por sua vez, as cadeias deslocadas servem como matriz para a extensão de iniciadores adicionais. Utilizando este método é possível uma amplificação em mais de 5 000. O comprimento médio do produto é superior a 10 kB e a amplificação está distribuída de forma bastante uniforme ao longo do conjunto total de fragmentos. Estão neste momento disponíveis de dois fornecedores kits comerciais para MDA ("GenomiPhi" de Amersham Biosciences, www4.amershambiosciences.com; "Repli-g" de Molecular Staging, www.molecularstaging.com).

De acordo com uma concretização preferida particular, obtém-se a amplificação de genoma completo através de PCR de ligante/adaptador. De acordo com outra concretização preferida particular, obtém-se a amplificação de genoma completo através de amplificação por deslocamento múltiplo.

As concretizações aqui especificadas têm a vantagem de permitir a amplificação de genoma completo de ADN após tratamento com bissulfito. 0 problema subjacente é que o tratamento com bissulfito, mesmo um tratamento suave, tem um efeito negativo na integridade do ADN tratado. Por outras palavras, a molécula de ADN tratada com bissulfito é fragmentada em subfragmentos. Estes subfragmentos são difíceis de amplificar devido ao tamanho pequeno e à propriedade dos iniciadores aleatórios (oligonucleótidos ou oligómeros) habitualmente utilizados para amplificação de genoma completo se ligarem ao ADN genómico apenas em grandes distâncias. Obtém-se uma amplificação de genoma completo ainda melhor caracterizada como sendo mais representativa e resultando em maiores quantidades de ADN amplificado, em duas concretizações preferidas particulares. De acordo com a primeira concretização preferida particular, adicionam-se nucleótidos a uma ou ambas as cadeias simples de uma molécula de ADN em cadeia dupla antes de tratamento com bissulfito, de preferência através de actividade de deoxinucleotidilo terminal transferase (TdT). Após tratamento com bissulfito, 61 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ amplifica-se ο ADN utilizando iniciadores que são específicos para os nucleótidos adicionados. Por exemplo no caso da adição de uma cauda poli dA, utilizam-se iniciadores poli dT. De acordo com a segunda concretização particular, proporciona-se uma molécula de ADN em cadeia simples convertida com bissulfito por tratamento com bissulfito de uma molécula de ADN em cadeia dupla. Esta cadeia simples de ADN é então a) ligada intermolecularmente a outra (pelo menos uma) cadeia de ADN em cadeia simples tratada com bissulfito proporcionada do mesmo modo, resultando numa cadeia simples de ADN estendida; b) ligada intramolecularmente por ligação da sua extremidade 5' com a sua extremidade 3' , resultando numa molécula de ADN em cadeia simples circularizada; ou

c) combinações de a) e b) em que a cadeia simples de ADN estendida é circularizada. Após ligação amplifica-se o ADN em cadeia simples através de iniciadores aleatórios. Devido ao alongamento das moléculas de ADN em cadeia simples, a polimerase já não pode ligar e amplificar o ADN tratado com bissulfito. Por outras palavras, a polimerase tem uma taxa de processamento mais elevada comparativamente com apenas ADN não estendido tratado com bissulfito. Além da ligação a cadeias intermoleculares tem também a vantagem dos fragmentos serem eficazmente amplificados quando hibridam apenas alguns ou mesmo nenhuns iniciadores aleatórios.

De acordo com uma concretização, utiliza-se pelo menos uma das concretizações anteriormente especificadas para determinar o estado de metilação de pelo menos uma posição CpG no ADN da amostra remota, um padrão de metilação no interior do ADN da amostra remota ou ambos, compreendendo adicionalmente pelo menos um dos seguintes: determinar o estado de metilação de pelo menos uma posição CpG no ADN da amostra remota localizando-se cada posição CpG numa posição definida, determinar um padrão de metilação no interior do ADN da amostra remota.

Numa concretização, o método do invento é um método para determinar um estado de metilação, um padrão de metilação ou ambos, em que determinar o estado de metilação, o padrão de metilação ou ambos compreende uma utilização de pelo menos um 62 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ método seleccionado do grupo compreendendo: método de amplificação, método de PCR, método de LCR, método de amplificação específico de metilação, método MSP (PCR específico de metilação), método de MSP em ninho, método HeavyMethyl™, método de detecção, gel de agarose, coloração de um gel de agarose, método de detecção específico de metilação, método de sequenciação com bissulfito, detecção através de matrizes de ADN, detecção através de micromatrizes de oligonucleótido, detecção através de micromatrizes de ilhas CpG, detecção através de enzimas de restrição, método de amplificação e detecção simultânea específico de metilação, método COBRA, PCR em tempo real, método de PCR em tempo real HeavyMethyl™, método MSP MethyLight™, método MethyLight™, método MethyLight™ Algo™, método QM, método Headloop

MethyLight™, método HeavyMethyl™ MethyLight™, método HeavyMethyl™ Scorpion™, método MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão de iniciador sensível a metilação e método Ms-SNuPE (extensão de iniciador de nucleótido único sensível a metilação).

De acordo com uma concretização, a determinação de um estado de metilação de pelo menos uma posição CpG, determinação de pelo menos um padrão de metilação ou ambos compreende uma utilização de pelo menos um dos seguintes métodos ou suas combinações: método de amplificação, método de PCR, método de LCR, método de amplificação especifico de metilação, método MSP (PCR especifico de metilação), método de MSP em ninho, método HeavyMethyl™, método de detecção, gel de agarose, coloração de um gel de agarose, método de detecção especifico de metilação, método de sequenciação com bissulfito, detecção através de matrizes de ADN, detecção através de micromatrizes de oligonucleótido, detecção através de micromatrizes de ilhas CpG, detecção através de enzimas de restrição, método de amplificação e detecção simultânea específico de metilação, método COBRA, PCR em tempo real, método de PCR em tempo real HeavyMethyl™, método MSP MethyLight™, método MethyLight™, método MethyLight™ Algo™, método QM, método Headloop MethyLight™, método HeavyMethyl™ MethyLight™, método HeavyMethyl™ Scorpion™, método MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão de iniciador sensível a metilação e método Ms-SNuPE (extensão de iniciador de nucleótido único sensível a metilação). 63 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Um perito na especialidade conhece métodos de amplificação adequados. De acordo com uma concretização preferida o método de amplificação é um método de PCR. Um perito na especialidade conhece métodos de PCR adequados que podem ser utilizados de acordo com o invento. São bem conhecidos na especialidade métodos de amplificação adequados para utilização de acordo com o invento. De acordo com uma concretização preferida, o método de amplificação é um método de reacção de ligase em cadeia. De um modo geral, estes são métodos de amplificação que se baseiam na utilização de uma ligase. Um perito na especialidade conhece LCR adequado que pode ser utilizado de acordo com o invento.

De acordo com uma concretização, o método de amplificação é uma amplificação especifica de metilação. Os métodos de amplificação especificos de metilação são conhecidos pelos peritos na especialidade. De acordo com uma concretização preferida, o método de amplificação especifico de metilação é o método de PCR especifico de metilação (MSP). 0 método MSP permite a avaliação do estado de metilação de virtualmente qualquer grupo de locais CpG no interior de uma ilha CpG, independentemente de uma utilização de enzimas de restrição sensíveis a metilação (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:9821-9826, 1996/ patente US n° 5 786 146). Sucintamente modifica-se ADN por conversão com bissulfito de sódio que converte todas as citosinas não metiladas, mas não as citosinas metiladas, para uracilo e subsequentemente amplifica-se com iniciadores específicos para ADN metilado contra ADN não metilado. Os pares de iniciadores MSP contêm pelo menos um iniciador que híbrida com um dinucleótido CpG tratado com bissulfito. Assim, a sequência dos referidos iniciadores compreende pelo menos um dinucleótido CpG. Os iniciadores MSP específicos para ADN não metilado contêm um "T" na posição 3' da posição C em CpG. Preferentemente, em consequência, requer-se que a sequência de bases dos referidos iniciadores compreenda uma sequência com um comprimento de pelo menos 9 nucleótidos que híbrida com a sequência de ácido nucleico convertida com bissulfito em que a sequência de bases dos referidos oligómeros compreende pelo menos um dinucleótido CpG. A MSP necessita apenas de pequenas quantidades de ADN e é sensível a alelos com metilação a 0,1% de um determinado local 64 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de ilha CpG. Os tratamentos com bissulfito e o método de amplificação aqui descrito podem utilizar-se em combinação com este método de detecção.

De acordo com uma concretização preferida, a amplificação é um método MSP em ninho. 0 método MSP em ninho é essencialmente efectuado tal como descrito em WO 02/18649 e US 20040038245. Este método MSP considera o conflito aparente entre ser necessária especificidade elevada do iniciador MSP para diferenciar suficientemente entre as posições CG e TG e permitir um não emparelhamento de modo a criar um local de restrição único.

Compreende a expansão do número de cópias da região genética de interesse. Assim utiliza-se uma reacção de polimerização em cadeia para amplificar uma parte da região referida na qual reside a metilação de interesse. Desse modo gera-se um produto de amplificação. Usa-se então uma aliquota do referido produto numa segunda reacção de polimerização em cadeia, especifica de metilação, para detectar a presença de metilação. Por outras palavras, efectua-se uma PCR não especifica para metilação antes da PCR especifica para metilação.

De acordo com uma concretização preferida, o método de amplificação é o método HeavyMethyl™. O método HeavyMethyl™ é essencialmente efectuado tal como descrito em WO 02/072880 e Cottrell SE et al. Nucleic Acids Res. 13 de Janeiro de 2004;32 (1) : elO. Este método compreende uma utilização de oligonucleótidos de sonda bloqueadora que podem hibridar com o ácido nucleico molde tratado com bissulfito em simultâneo com os iniciadores de PCR. Preferentemente, os oligonucleótidos bloqueadores caracterizam-se por as suas sequências de bases compreenderem uma sequência com um comprimento de pelo menos 9 nucleótidos que hibrida com a sequência de ácido nucleico tratada quimicamente. Desse modo a sequência de bases dos referidos oligonucleótidos iniciadores compreende pelo menos um dinucleótido CpG, TpG ou CpA. A amplificação do ácido nucleico molde é suprimida no caso da sequência complementar à sonda bloqueadora estar presente no molde. Nesse caso a amplificação termina na posição 5' da sonda bloqueadora. A sonda bloqueadora pode ser concebida para hibridar com o ácido 65 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ nucleico tratado com bissulfito de um modo especifico do estado de metilação. Por exemplo, podem detectar-se ácidos nucleicos metilados no interior de uma população de ácidos nucleicos não metilados por supressão da amplificação de ácidos nucleicos que não estão metilados numa posição em questão. Assim uma sonda bloqueadora compreenderia um 'CpA' ou 'TpA' na posição em questão, por oposição a um 'CpG' caso se pretenda a supressão de amplificação dos ácidos nucleicos metilados. A utilização de oligonucleótidos bloqueadores requer uma destruição eficaz da amplificação mediada por polimerase porque os oligonucleótidos bloqueadores não podem ser alongados pela polimerase. De acordo com o método HeavyMethyl™, tal obtém-se através da utilização de bloqueadores que são 3'-desoxioligonucleótidos ou oligonucleótidos derivatizados na posição 3' com um grupo diferente de um grupo hidroxilo "livre". Por exemplo, entre outros, os 3'-O-acetiloligonucleótidos são representativos de uma classe preferida de moléculas bloqueadoras.

Adicionalmente deve excluir-se a degradação mediada por polimerase dos oligonucleótidos bloqueadores. Preferentemente, tal exclusão compreende i) a utilização de uma polimerase isenta de actividade de 5'-3' exonuclease ou ii) a utilização de oligonucleótidos bloqueadores modificados. Estes oligonucleótidos bloqueadores modificados caracterizam-se como tendo, por exemplo, pontes tiolato nas extremidades 5' . Tal torna a molécula bloqueadora resistente a nuclease. Aplicações especificas podem não necessitar de tais modificações a 5' do oligonucleótido bloqueador. Por exemplo, a degradação do oligonucleótido bloqueador será substancialmente evitada se os locais de ligação de bloqueador e de iniciador se sobrepuserem. Desse modo a ligação do iniciador é evitada (e.g., no caso de excesso de oligonucleótido bloqueador). Assim a polimerase não se pode ligar ao iniciador e alongá-lo. Devido a nenhuma polimerase estender o iniciador, o oligonucleótido bloqueador não será degradado. Uma concretização especialmente preferida do método HeavyMethyl™, para os objectivos do presente invento e tal como aqui implementado, compreende uma utilização de oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) como oligonucleótidos bloqueadores. Tais oligómeros bloqueadores de PNA são idealmente adequados porque não são degradados nem estendidos pela polimerase. 66 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização, o método de detecção pode ser qualquer tipo de método de detecção. Um perito na especialidade conhece métodos de detecção adequados. Preferentemente, um método de detecção pode ser qualquer tipo de método de detecção que compreenda a utilização de um corante fluorescente, um corante não fluorescente, um marcador de massa, uma separação por tamanho ou uma separação por peso. Por exemplo, entre outros, o método de detecção é uma separação por tamanho num gel de agarose seguido por uma coloração de ADN através de um corante fluorescente. De acordo com uma concretização preferida, o método de detecção é uma detecção especifica de metilação. Um perito na especialidade conhece métodos de detecção específicos de metilação adequados. De acordo com uma concretização preferida, o método de detecção especifico de metilação é um método de sequenciação de bissulfito. 0 método de sequenciação de bissulfito é essencialmente efectuado tal como descrito em Frommer et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1827-1831, 1992. 0 método de sequenciação de bissulfito é um método em que se efectua a sequenciação de um fragmento previamente amplificado de ADN genómico tratado com bissulfito. Como o ADN tratado com bissulfito é amplificado antes da sequenciação, pode utilizar-se um método de amplificação tal como aqui descrito em combinação com este método de detecção. É adicionalmente especialmente preferido que os resultados de uma sequenciação de bissulfito sejam essencialmente analisados tal como descrito em EP 02090203.7. Sucintamente, de acordo com este método determina-se o grau de metilação de uma citosina através de um electroferograma de uma ou mais bases. Desse modo calcula-se a área sob o electroferograma de uma base detectada. Deduz-se então o grau de metilação por comparação deste valor para uma posição de citosina a analisar com o valor obtido para uma citosina não metilada. Para melhores resultados, é favorável a determinação e a consideração da velocidade de conversão de citosina a uracilo do tratamento com bissulfito e/ou uma padronização dos sinais de electroferogramas.

De acordo com uma concretização preferida, o método de detecção é um método de detecção através de uma matriz de ADN. Um perito na especialidade conhece várias matrizes de ADN 67 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ adequadas. Preferentemente, uma matriz de ADN compreende moléculas de ADN que estão liqadas ou associadas de outro modo com uma fase sólida. A matriz pode ser caracterizada, por exemplo entre outros, em que as moléculas de ADN estão orqanizadas na fase sólida na forma de uma rede rectangular ou hexagonal. Desse modo a fase sólida é pelo menos uma fase seleccionada do grupo compreendendo: silicio, vidro, poliestireno, aluminio, aço, ferro, cobre, niquel, prata, ouro, nitrocelulose ou plásticos tais como, entre outros nylon. Mas também se considera combinações dos referidos materiais. Para detecção, marca-se o ADN hibridado na matriz, de preferência com um corante fluorescente. Tal marcação é por exemplo, entre outros, uma simples ligação de corantes Cy3 e Cy5 ao 5'-OH do fragmento de ADN. A detecção de fluorescência do ADN hibridado pode ser efectuada, por exemplo, entre outros, através de um microscópio confocal.

De acordo com uma concretização preferida particular, o método de detecção é um método de detecção através de uma micromatriz de oligonucleótidos. Pode obter-se uma revisão da especialidade prévia sobre fabricação de matrizes de oligómeros a partir de uma edição especial de Nature Genetics (suplemento de Nature Genetics, Volume 21, Janeiro de 1999 e a partir da literatura ai citada).

De acordo com uma concretização preferida particular, o método de detecção é um método of detecção através de uma micromatriz de ilhas CpG. Desse modo o ADN imobilizado ou associado da matriz compreende sequências que foram derivadas de ilhas CpG.

De acordo com uma concretização preferida particular, o método de detecção é um método de detecção através de uma matriz de ADN tal como essencialmente descrito em WO 99/28498, WO 01/38565 ou em WO 02/18632.

De acordo com uma concretização preferida, o método de detecção é um método de detecção através de enzimas de restrição. Um perito na especialidade tem conhecimento de métodos adequados. 68 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida, amplificação e detecção especificas de metilação são efectuadas simultaneamente. Os peritos na especialidade conhecem métodos adequados. De acordo com uma concretização preferida particular, o método para amplificação e detecção simultânea especifico de metilação é o método COBRA. 0 método COBRA é um método de metilação quantitativa útil para determinar niveis de metilação de ADN em locais genéticos específicos em pequenas quantidades de ADN genómico (Xiong e Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). De acordo com o método COBRA, utiliza-se digestão com enzima de restrição para divulgar diferenças de sequência dependentes de metilação em produtos de PCR de ADN tratado com bissulfito. As diferenças de sequência dependentes de metilação são primeiramente introduzidas no ADN genómico por tratamento com bissulfito. Efectua-se então a amplificação por PCR do ADN convertido por bissulfito usando iniciadores não específicos de metilação seguido de digestão com endonuclease de restrição, electroforese em gel e detecção utilizando sondas de hibridação marcadas especificas. Os niveis de metilação na amostra de ADN original representam-se pelas quantidades relativas de produto de PCR digerido e não digerido de um modo quantitativo linear ao longo de um vasto espectro de niveis de metilação de ADN. Adicionalmente utiliza-se também a digestão com enzimas de restrição dos produtos de PCR amplificados a partir do ADN convertido com bissulfito, no método descrito por Sadri e Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996).

Podem usar-se tratamentos com bissulfito e os métodos de amplificação aqui descritos em combinação com este método de detecção.

De acordo com uma concretização preferida particular, o método para amplificação e detecção simultânea especifico de metilação é um método de PCR em tempo real. Um perito na especialidade conhece métodos de PCR em tempo real adequados. De acordo com uma concretização preferida particular, método de PCR em tempo real é um método HeavyMethyl™. O método

HeavyMethyl™ é desse modo efectuado tal como descrito anteriormente através de uma máquina de PCR em tempo real.

De acordo com uma concretização preferida particular, o método de PCR em tempo real é um método MethyLight™. O método 69 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

MethyLight™ é um método quantitativo de alto rendimento de metilação que utiliza PCR em tempo real baseado em tecnologia de fluorescência (TaqMan™) que não necessita de quaisquer manipulações adicionais após a etapa de PCR (Eads et al., Câncer Res. 59:2302-2306, 1999). Sucintamente, o processo MethyLight™ inicia-se com uma amostra mista de ADN genómico que é convertida, numa reacção de bissulfito, num conjunto misto de diferenças de sequência dependentes de metilação de acordo com procedimentos padrão. Efectua-se então PCR baseada em fluorescência quer numa reacção de PCR "não condicionada" (com iniciadores que não se sobrepõem com locais conhecidos de metilação CpG) ou numa reacção "condicionada" (com iniciadores de PCR que se sobrepõem com dinucleótidos CpG conhecidos). A discriminação de sequência pode ocorrer quer ao nivel do processo de amplificação quer ao nivel do processo de detecção de fluorescência ou ambos.

Pode utilizar-se o método MethyLight™ como um ensaio quantitativo para padrões de metilação na amostra de ADN genómico, em que a discriminação de sequência ocorre ao nivel da hibridação da sonda. Nesta versão quantitativa, a reacção de PCR proporciona amplificação não condicionada na presença de uma sonda fluorescente que se sobrepõe a um possivel local de metilação especifico. Proporciona-se um controlo não condicionado para a quantidade de ADN de entrada através de uma reacção na qual nem os iniciadores nem a sonda se sobrepõem a quaisquer dinucleótidos CpG. Alternativamente obtém-se um ensaio qualitativo para metilação genómica por sondagem do conjunto de PCR condicionado com qualquer dos oligonucleótidos de controlo que não "abrangem" locais de metilação conhecidos (uma versão baseada em fluorescência da técnica "MSP" também denominado método MSP methylight™) ou com oligonucleótidos que abrangem locais de metilação potenciais.

Pode utilizar-se o processo MethyLight™ com uma sonda "TaqMan®" no processo de amplificação. Por exemplo, trata-se ADN genómico em cadeia dupla com bissulfito e sujeita-se a um de dois conjuntos de reacções de PCR utilizando sondas TaqMan®; e.g., com iniciadores condicionados e sonda TaqMan® ou iniciadores não condicionados e sonda TaqMan®. A sonda TaqMan® é duplamente marcada com moléculas fluorescentes "repórter" e "atenuadora" e é concebida para ser especifica 70 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ para uma região de conteúdo em GC relativamente elevado de modo a fundir a uma temperatura cerca de 10 °C superior no ciclo de PCR relativamente aos iniciadores directo e inverso. Tal permite que a sonda TaqMan® permaneça completamente hibridada durante a etapa de PCR de hibridação/extensão. À medida que a polimerase Taq sintetiza enzimaticamente uma nova cadeia durante PCR esta atingirá eventualmente a sonda TaqMan® hibridada. A actividade de endonuclease 5' para 3' da Taq polimerase deslocará então a sonda TaqMan® digerindo-a para libertar a molécula repórter fluorescente para detecção quantitativa do seu sinal agora não atenuado utilizando um sistema de detecção de fluorescência em tempo real.

As variações na tecnologia de detecção TaqMan® que também são adequadas incluem uma utilização de tecnologia de sonda dupla (LightCycler™), iniciadores de amplificação fluorescentes (tecnologia Sunrise™), sondas de faróis moleculares (Tyagi S. e Kramer F.R., Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996), iniciadores Sorpion (Whitcombe et ai., Nature and Biotechnology, 17, 804-807, 1999) ou LNA (ácido nucleico bloqueado), sondas de oligonucleótido com corante duplo (Exiqon A/S) . Todas estas técnicas podem ser adaptadas de forma adequada para utilização com ADN tratado com bissulfito e além disso para análise de metilação no interior de dinucleótidos CpG.

Os tratamentos com bissulfito e os métodos de amplificação aqui descritos podem ser utilizados em combinação com o método MethyLight™ ou suas variantes.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método de PCR em tempo real é o método MethyLight™ ALGO™. O método MethyLight™ ALGO™ é um método melhorado do método MethyLight™ tal como essencialmente descrito em EP 04090255.3. De acordo com este método melhorado, o grau de metilação é calculado a partir das intensidades do sinal das sondas utilizando algoritmos diferentes.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método de PCR em tempo real é o ensaio QM (metilação quantitativa). Este ensaio é uma metilação não especifica e assim uma amplificação de PCR em tempo real não condicionada. 71 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ É acompanhada pela utilização de duas sondas especificas de metilação (MethyLight™) uma para o amplificado metilado e uma segunda para o amplificado não metilado. Desta forma, geram-se dois sinais que podem ser utilizados a) para determinar a razão de ácidos nucleicos metilados (CG) e não metilados e ao mesmo tempo b) para determinar a quantidade absoluta de ácidos nucleicos metilados. Para este último fim é necessário um ensaio de calibração com uma quantidade conhecida de ADN de controlo.

De acordo com uma concretização preferida, o método para amplificação e detecção simultânea especifica de metilação é um método de PCR Headloop. 0 método de PCR Headloop é um método de PCR de supressão. É efectuado essencialmente como descrito em Rand K.N., et al., Nucleic Acid Research, 33(14), el27. É um método de PCR para distinguir sequências relacionadas nas quais a selectividade de amplificação é dependente da sequência de amplicão. Inclui-se uma extensão a 5' num dos iniciadores (ou em ambos) que corresponde a sequências no interior de um dos amplicões relacionados. Após cópia e incorporação no amplificado, esta sequência é então capaz de tornar a entrar no ciclo, hibridar com as sequências internas e iniciar para formar uma estrutura em gancho de cabelo. Esta estrutura evita então amplificação adicional. Assim, a amplificação de sequências contendo um emparelhamento perfeito com a extensão a 5' é suprimido, enquanto a amplificação de sequências contendo erros de emparelhamento ou sem a sequência não é afectada.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método para amplificação e detecção simultânea especifica de metilação é uma combinação do método de PCR Headloop e do método MethyLight™, também denominado método Headloop MethyLight™.

De acordo com uma concretização preferida, o método para amplificação e detecção simultânea especifica de metilação é um método Scorpion™. Este método foi primeiramente descrito por Whitcombe et al.: Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol. 1999; 17(8):804-7/ Thelwell et al.: Mode of action and application of Scorpion™ primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 72 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 1 de Outubro de 2000; 28(19):3752-61; US 6 326 145; US 6 365 729; US 20030087240 AI. São conhecidas dos peritos na especialidade várias concretizações deste método. Todos estes métodos têm em comum a sondagem intramolecular. De acordo com a variante denominada Hairloop, os iniciadores Scorpion™ contêm uma sequência de sonda especifica na sua extremidade 5' . Esta sequência encontra-se presente numa configuração do tipo gancho de cabelo. Um corante fluorescente e um agente de extinção de fluorescência encontram-se localizados em proximidade espacial na extremidade da sequência de sonda. Após desnaturação subsequente a um ciclo de amplificação, a sonda híbrida intramolecularmente com a sequência de iniciador alongada da mesma cadeia. Assim, abre-se o gancho de cabelo, o corante e o agente de extinção de fluorescência separam-se e assim pode detectar-se o sinal do corante.

Outras variantes do método Scorpion™ são por exemplo a variante Duplex (Solinas et al. : Duplex Scorpion™ primers in SNP analysis and FRET applications. Nucleic Acids Res. 15 de Outubro de 2001; 29(20):E96), ou as variantes tais como descritas em US 6 326 145 e US 20030087240.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método Scorpion™ é um método tal como essencialmente descrito em WO 05/024056.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método para amplificação e detecção simultânea específica de metilação é uma combinação do método HeavyMethyl™ e do método Scorpion™, também denominado método HeavyMethyl™ Scorpion™.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método para amplificação e detecção simultânea específica de metilação é uma combinação do método HeavyMethyl™ e do método MethyLight™, também denominado método HeavyMethyl™ MethyLight™.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método para amplificação e detecção simultânea específica de metilação é uma combinação do método MSP e do método Scorpion™, também denominado método MSP Scorpion™. 73 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método para amplificação e detecção simultânea especifica de metilação é uma combinação do método Headloop e do método Scorpion™, também denominado método Headloop Scorpion™.

De acordo com uma concretização preferida, o método para amplificação e detecção simultânea especifica de metilação é um método de extensão de iniciador especifica de metilação. Um perito na especialidade conhece vários métodos que podem ser utilizados de acordo com o invento.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método de extensão de iniciador especifica de metilação é o método Ms-SNuPE (extensão de iniciador de nucleótido único sensivel a metilação). 0 método Ms-SNuPE é um método efectuado tal como essencialmente descrito em Gonzalgo et al., Nucleic Acids Research 25(12), 2529-2531, 1997 e patente US 6 251 594) . De acordo com o método Ms-SNuPE, amplificam-se regiões de interesse por PCR de ADN tratado com bissulfito. Após purificação dos produtos de PCR, os iniciadores são hibridados em proximidade na frente da posição a ser analisada. 0 iniciador é então alongado com um único nucleótido quer com dCTP marcado ou com dTTP marcado diferentemente. No caso da citosina no ADN original estar metilada, então dCTP será incorporado porque as citosinas metiladas permanecem inalteradas durante o tratamento com bissulfito. No outro caso, a citosina no ADN original não estava metilada, pelo que será incorporado dTTP porque a citosina não metilada é convertida a uracilo por tratamento com bissulfito e o PCR subsequente substituirá uracilo por timina. Por detecção dos diferentes marcadores, pode distinguir-se se uma citosina de uma posição CpG estava metilada ou não metilada. 0 método MS-SNuPE pode também ser efectuado de uma forma quantitativa.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o método de extensão de iniciador especifica de metilação é um método tal como essencialmente descrito em WO 01/062960, WO 01/062064 ou WO 01/62961. Todos estes métodos podem ser efectuados de uma forma quantitativa. De acordo com WO 01/062960, o iniciador a ser estendido híbrida com o seu 74 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ terminal 3' completa ou apenas parcialmente nas posições de interesse. Ocorre uma extensão de pelo menos um nucleótido apenas se o iniciador hibridar completamente. WO 01/062064 divulga um método no qual o iniciador a ser estendido híbrida numa posição adjacente próxima ou a uma distância até dez bases da posição a ser analisada. O iniciador é então estendido em pelo menos um nucleótido. O terceiro método é descrito em WO 01/62961. De acordo com este método, hibridam-se dois conjuntos de oligonucleótidos com o ADN amplificado após tratamento com bissulfito. O primeiro tipo de oligonucleótido híbrida a 5' em posição adjacente próxima ou a uma distância até 10 bases da posição a ser analisada. O segundo tipo de oligonucleótido hibrida no ADN amplificado de modo que o seu terminal 5' hibrida a 3' em posição adjacente próxima da referida posição a ser analisada. Através de tal, os dois oligonucleótidos separam-se um do outro por um intervalo na gama de 1 a 10 nucleótidos. O primeiro tipo de oligonucleótido é seguidamente estendido através de uma polimerase, em que se adiciona não mais do que o número de nucleótidos existentes entre os dois oligonucleótidos. Assim utilizam-se nucleótidos que compreendem dCTP e/ou dTTP marcados diferencialmente. Os dois oligonucleótidos são então ligados entre si através de uma enzima ligase. No caso da citosina no ADN original estar metilada, então será incorporado dCTP. No caso da citosina no ADN original não estar metilada, então incorporar-se-á dTTP.

Com certeza que são utilizáveis de acordo com o invento outros métodos semelhantes, que são métodos desenvolvidos adicionalmente dos métodos referidos ou suas combinações.

Numa concretização, o método do invento é método tal como especificado anteriormente para identificação de um marcador, compreendendo adicionalmente: identificação de pelo menos um padrão de metilação compreendendo o estado de metilação de pelo menos duas posições CpG, em que as referidas posições CpG são compreendidas por um fragmento de ADN e estão localizadas em cis e em que o padrão de metilação difere entre ADN derivado de uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo caracterizado por uma condição A e ADN derivado de uma célula, 75 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo caracterizado por uma condição B; e selecção de um valor de corte para a percentagem de fragmentos de ADN caracterizado por um padrão de metilação identificado dentro de uma mistura de fragmentos de ADN, em que um valor de percentagem igual ou superior ao valor de corte é indicativo da condição A e um valor de percentagem inferior ao valor de corte é indicativo da condição B, ou em que um valor de percentagem inferior ao valor de corte é indicativo da condição A e um valor de percentagem igual ou superior ao valor de corte é indicativo da condição B.

De acordo com uma concretização, identifica-se um marcador, que compreende pelo menos uma das concretizações aqui descritas. A identificação do marcador compreende adicionalmente pelo menos as seguintes etapas adicionais: i) identificar pelo menos um padrão de metilação e ii) seleccionar um valor limite da fracção de fragmentos de ADN compreendendo o referido pelo menos um padrão de metilação em comparação com todos os fragmentos de ADN no interior de um grupo de fragmentos de ADN. Assim a etapa i) é caracterizada nos dois aspectos. Primeiro, o padrão de metilação compreende pelo menos o estado de metilação de duas posições CpG, em que as referidas posições CpG são constituídas por um fragmento de ADN e estão localizados em cis. Tal como conhecido por um perito na especialidade, uma localização em cis significa que os dinucleótidos CG correspondentes têm a mesma orientação na mesma cadeia de ADN. 0 segundo aspecto refere-se ao referido pelo menos um padrão de metilação no ADN obtido de uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo caracterizado pela condição A que pode ser distinguido de ADN obtido de uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo caracterizado por uma condição B por um dos referidos padrões de metilação ou uma sua combinação.

De acordo com uma concretização preferida, a etapa i) é caracterizada pelo marcador num padrão de metilação pré-identifiçado. Assim pode saber-se que o referido padrão é indicativo de uma condição que é semelhante à condição de interesse. 76 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida, realiza-se a etapa ii) em que a) um valor que representa a fracção de fragmentos de ADN compreendendo o referido pelo menos um padrão de metilação em comparação com todos os fragmentos de ADN dentro de um grupo de fragmentos de ADN ser igual ou superior ao valor limiar é indicativo da condição A e b) um valor que representa a referida fracção de fragmentos de ADN ser inferior ao valor limiar é indicativo da condição B.

De acordo com uma concretização preferida, realiza-se uma etapa ii) em que a) um valor que representa a fracção de fragmentos de ADN compreendendo o referido pelo menos um padrão de metilação em comparação com todos os fragmentos de ADN dentro de um grupo de fragmentos de ADN ser superior ao valor limiar é indicativo da condição A e b) um valor representando a referida fracção de fragmentos de ADN ser igual ou menor ao valor limiar é indicativo da condição B.

De acordo com uma concretização preferida, realiza-se a etapa ii) em que a) um valor representando a fracção de fragmentos de ADN compreendendo o referido pelo menos um padrão de metilação em comparação com todos os fragmentos de ADN dentro de um grupo de fragmentos de ADN ser inferior ao valor limiar é indicativo de uma condição A e b) um valor representando a referida fracção de fragmentos de ADN ser igual ou superior ao valor limiar é indicativo da condição B.

De acordo com uma concretização preferida, realiza-se uma etapa ii) em que a) um valor representando a fracção de fragmentos de ADN compreendendo o referido pelo menos um padrão de metilação em comparação com todos os fragmentos de ADN no interior de um grupo de fragmentos de ADN ser igual ou inferior ao valor limiar é indicativo de uma condição A e b) um valor representando a referida fracção de fragmentos ADN ser superior ao valor limiar é indicativo da condição B.

De acordo com estas concretizações da etapa ii), a condição A, condição B, ou ambas podem ser qualquer condição tal como aqui descrito.

De acordo com uma concretização preferida, as concretizações aqui descritas para identificar um marcador são 77 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ caracterizadas por permitirem a identificação de um marcador com pelo menos um critério seleccionado do grupo compreendendo: mais do que cerca de 20% de sensibilidade, mais do que cerca de 30% de sensibilidade, mais do que cerca de 35% de sensibilidade, mais do que cerca de 40% de sensibilidade, mais do que cerca de 50% de sensibilidade, mais do que cerca de 60% de sensibilidade, mais do que cerca de 70% de sensibilidade, mais do que cerca de 80% de sensibilidade, mais do que cerca de 90% de sensibilidade, mais do que cerca de 95% de sensibilidade, mais do que cerca de 99% de sensibilidade, mais do que cerca de 40% de especificidade, mais do que cerca de 50% de especificidade, mais do que cerca de 60% de especificidade, mais do que cerca de 70% de especificidade, mais do que cerca de 80% de especificidade, mais do que cerca de 85% de especificidade, mais do que cerca de 90% de especificidade, mais do que cerca de 95% de especificidade ou mais do que cerca de 99% de especificidade.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método para identificar um marcador, em que a identificação de marcador é permitida com pelo menos um dos seguintes: uma sensibilidade superior a cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; uma especificidade superior a cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%. A referida concretização particularmente preferida foi aplicada pelo requerente em vários estudos para identificar um marcador. Um destes estudos levou à identificação de um marcador de cancro de cólon, que se tornou a matéria objecto de US 60/672 242; US 60/676 997; US 60/697 521 e US 60/723 602. O referido marcador é especificado por uma sensibilidade de 57% e uma especificidade de 96% num conjunto de 233 amostras obtidas a partir de indivíduos saudáveis e 127 amostras obtidas de doentes de cancro colorrectal ou por uma sensibilidade de 50% e uma especificidade de 95% num conjunto de 83 amostras obtidas de indivíduos saudáveis e 209 amostras obtidas de doentes de cancro colorrectal. Faz-se referência explícita a US 60/723 602. Em US 60/723 602 78 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ demonstra-se que a referida concretização particularmente preferida do invento permite a identificação de um marcador com pelo menos uma sensibilidade superior a cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; uma especificidade superior a cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; ou ambas. Tal como conhecido pelos peritos na especialidade, os valores de sensibilidade e especificidade são específicos de um estudo efectuado. Além disso, dependem um do outro e é possível aumentar o valor de um deles por diminuição do valor do outro.

De acordo com uma concretização preferida, o método do invento é um método para identificar um marcador, em que a identificação do marcador é permitida com uma sensibilidade superior a cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; e uma especificidade superior a cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

De acordo com uma concretização preferida, as concretizações aqui descritas para identificar um marcador caracterizam-se por permitirem a identificação de um marcador com uma sensibilidade superior a cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% a uma especificidade superior a cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

Numa concretização particularmente preferida, o método do invento é um método para identificação um marcador, em que se identifica um marcador para cancro do cólon caracterizado pelo menos por um dos sequintes: uma sensibilidade de pelo menos cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca 79 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; e uma especificidade de pelo menos cerca de 65%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

De acordo com uma concretização preferida, identifica-se um marcador de cancro do cólon, em que o marcador tem pelo menos uma das seguintes caracteristicas: uma sensibilidade de pelo menos cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; e uma especificidade de pelo menos cerca de 65%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

Numa concretização particularmente preferida, o método do invento é um método para identificação de um marcador, em que se identifica um marcador de cancro de cólon caracterizado por uma sensibilidade de pelo menos cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%; e uma especificidade de pelo menos cerca de 65%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

De acordo com uma concretização preferida, identifica-se um marcador de cancro de cólon, em que o marcador tem uma sensibilidade de pelo menos cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% a uma especificidade de pelo menos cerca de 65%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método para identificação de um marcador caracterizado por selecção de um valor limiar, em que o valor limiar é 80 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ seleccionado de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: uma sensibilidade superior a cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%; e uma especificidade superior a cerca de 20%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

De acordo com uma concretização preferida, identifica-se um marcador por selecção de um valor limiar de acordo com pelo menos um dos seguintes: uma sensibilidade superior a cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%; e uma especificidade superior a cerca de 20%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

De acordo com uma concretização preferida, identifica-se um marcador por selecção de um valor limiar de acordo com uma sensibilidade superior a cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% a uma especificidade superior a cerca de 20%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65- %, cerca de 7 0 o o / cerca de 75 %, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método para identificação de um marcador para pelo menos um dos seguintes: diagnóstico de uma condição, proporcionar um prognóstico de uma condição, prever a resposta a tratamento de uma condição, determinar uma predisposição para uma condição, prever uma predisposição para uma condição, determinar uma progressão de uma condição, prever uma progressão de uma condição, determinar a gravidade de uma condição, determinar o 81

ΕΡ 1 871 912/PT estágio de uma condição, classificar uma condição, caracterizar uma condição ou suas combinações, em que a condição é uma condição saudável ou um evento adverso, em que uma das referidas é deduzida a partir do valor da percentagem de fragmentos de ADN caracterizados por um padrão de metilação pré-identifiçado dentro de uma mistura de fragmentos de ADN e em que o estado de metilação correspondente das posições CpG é medido de acordo com uma concretização aqui descrita, compreendendo adicionalmente pelo menos um dos seguintes: deduzir um dos referidos para uma condição A no caso do valor de percentagem ser igual ou superior ao valor limiar seleccionado; deduzir um dos referidos para a condição B no caso do valor de percentagem ser inferior ao valor de limiar seleccionado; deduzir um dos referidos para a condição B no caso do valor de percentagem ser superior ao valor de limiar seleccionado; e deduzir um dos referidos para a condição A no caso do valor de percentagem ser igual ou inferior ao valor de limiar seleccionado.

De acordo com uma concretização preferida, identifica-se um marcador para pelo menos uma aplicação ou utilização seleccionada do grupo compreendendo: diagnosticar uma condição, proporcionar um prognóstico de uma condição, prever a resposta a tratamento de uma condição, determinar uma predisposição para uma condição, prever uma predisposição para uma condição, determinar uma progressão de uma condição, prever uma progressão de uma condição, determinar a gravidade de uma condição, determinar o estágio de uma condição, classificação de uma condição, caracterização de uma condição ou suas combinações. Esta concretização é caracterizada por i) a condição é uma condição saudável ou um evento adverso; ii) o estado de metilação das posições CpG de pelo menos um padrão de metilação pré-identifiçado é determinado por uma amostra de ADN derivado de um indivíduo, pelo que a determinação é efectuada de preferência de acordo com uma concretização aqui descrita; 82 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ iii) determinar a proporção de fragmentos de ADN, em que os fragmentos são caracterizados por compreenderem o padrão de metilação pré-identifiçado; e iv) diagnosticar uma condição, proporcionar um prognóstico de uma condição, prever resposta a tratamento de uma condição, determinar uma predisposição para uma condição, prever uma predisposição para uma condição, determinar uma progressão de uma condição, prever uma progressão de uma condição, determinar a gravidade de uma condição, determinar o estágio de uma condição, classificação de uma condição, caracterização de uma condição ou suas combinações por comparação da proporção determinada de fragmentos de ADN com um valor limiar pré-seleccionado. De acordo com uma concretização particularmente preferida, o diagnóstico de uma condição, o proporcionar um prognóstico de uma condição, a previsão de resposta a tratamento de uma condição, a determinação de uma predisposição para uma condição, a previsão de uma predisposição para uma condição, a determinação de uma progressão de uma condição, a previsão de uma progressão de uma condição, a determinação da gravidade de uma condição, a determinação do estágio de uma condição, a classificação de uma condição, a caracterização de uma condição ou suas combinações é feita pela determinação da referida proporção de fragmentos de ADN ser superior, superior ou igual, igual, igual ou inferior, ou inferior ao valor limiar pré-seleccionado.

Numa concretização preferida, o método do invento é um método para identificação de um marcador, em que a condição A, a condição B, ou ambas são uma condição saudável ou pelo menos um evento adverso, em que o evento adverso compreende pelo menos uma categoria seleccionada do grupo compreendendo: interacções medicamentosas indesejáveis; doenças de cancro, doenças proliferativas ou doenças com estas associadas; disfunção do SNC; danificação ou doença; sintomas de agressão ou perturbações comportamentais; consequências clinicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; perturbações psicóticas e doenças de personalidade; demência e/ou sindromes associados; doença cardiovascular do tracto gastrointestinal; disfunção, danificação ou doença do sistema respiratório; lesão, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; 83 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ disfunção, danificação ou doença do corpo como uma anomalia do processo de desenvolvimento; disfunção, danificação ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danificação ou doença endócrina e metabólica; e enxaquecas ou distúrbios sexuais.

De acordo com uma concretização preferida para identificação de um marcador, uma condição A, uma condição B, ou ambas ou em geral uma condição é uma condição saudável ou pelo menos um evento adverso. Assim, o evento adverso compreende pelo menos uma categoria seleccionada do grupo compreendendo: interacções medicamentosas indesejáveis; doenças de cancro, doenças proliferativas ou doenças com elas associadas; disfunção do SNC; danificação ou doença; sintomas de agressão ou perturbações comportamentais; consequências clinicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; perturbações psicóticas e doenças de personalidade; demência e/ou sindromes associados; doença cardiovascular do tracto gastrointestinal; disfunção, danificação ou doença do sistema respiratório; lesão, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danificação ou doença do corpo como uma anomalia do processo de desenvolvimento; disfunção, danificação ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danificação ou doença endócrina e metabólica; e enxaquecas ou distúrbios sexuais.

De acordo com uma concretização preferida, o método do invento compreende controlos.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, a recolha de uma amostra remota compreende a selecção e predeterminação de critérios de controlo. De preferência, pelo menos um dos critérios de controlo é: 1. Critérios de selecção de amostra: Amostras seleccionadas de doentes com uma doença definida, amostras seleccionadas de indivíduos saudáveis, amostras seleccionadas de doentes com uma doença semelhante à doença definida e amostras seleccionadas de doentes com uma doença não semelhante à doença definida. 84 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 2. Critérios que especificam adicionalmente amostras derivadas do doente com a doença definida. Tais critérios são por exemplo, entre outros, estágio, grau, classe, classificação, caracteristicas, sintomas, tratamento médico anterior, presença ou ausência de história de doença, disponibilidade de análise histológica. 3. Critérios gerais: a) Excluem-se amostras caso as amostras sejam derivadas de doentes ou indivíduos que se sabe que têm uma doença infecciosa, por exemplo, entre outros, VIH (vírus da imunodeficiência humana), HBV (vírus de hepatite B) ou HCV (vírus de hepatite C). B) Só se incluem amostras caso: - sejam derivadas de um indivíduo com uma idade mínima pré-definida, - sejam derivadas de um doente que tenha registos médicos disponíveis, - ou ambos. 4. Critérios que especificam adicionalmente amostras derivadas de um indivíduo saudável: Só se incluem amostras que são derivadas de indivíduos - sem anomalias histológicas no órgão que a doença definida usualmente afecta, - sem história relativa à doença definida dentro de um intervalo de tempo a ser determinado. 5. Critérios que especificam adicionalmente amostras seleccionadas de doentes com uma doença semelhante à doença definida: Aqui é necessário pré-determinar o que é uma doença semelhante. Só se incluem amostras de doentes que são caracterizados por critérios pré-definidos, por exemplo, entre outros, estágio, grau, classe, classificação, caracteristicas, sintomas, tratamento médico anterior, presença ou ausência de história de doença, disponibilidade de análise histológica. 6. Critérios que especificam adicionalmente amostras seleccionadas de doentes com uma doença não semelhante à doença definida: Apenas de incluem amostras de doentes - cuja doença esteja activa quando se faz a análise, 85 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ - que não têm história da doença definida num intervalo de tempo pré-definido. Caso a doença não semelhante esteja a afectar o mesmo tecido ou órgão que a doença definida é preferível uma selecção adicional de amostras de acordo com critérios pré-definidos, por exemplo, entre outros, estágio, grau, classe, classificação, características, sintomas, tratamento médico anterior, presença ou ausência de história de doença, disponibilidade de análise histológica.

De acordo com uma concretização particularmente preferida, o isolamento de ADN, tratamento com bissulfito e análise de metilação de amostras remotas compreende a selecção e predeterminação de critérios de controlo. De preferência utiliza-se pelo menos um dos critérios de controlo como listado na tabela 1.

Tabela 1: Controlos adequados para o método do invento • Controlos positivos: Sujeita-se uma quantidade conhecida de ADN a concretizações do invento. Analisa-se a concentração do ADN obtido. Estes controlos são uma medida da variação entre lotes de amostras remotas. • Controlo para isolar ADN: Sujeita-se uma solução compreendendo ADN completamente metilado e BSA (albumina de soro bovino) a concretizações da etapa de isolamento de ADN. Este controlo proporciona uma medida da variação do isolamento de ADN entre lotes de amostras remotas. Adicionalmente, é um controlo para uma operação correcta da etapa de isolamento de ADN. 86 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ • Controlo para isolar ADN e para tratamento com bissulfito a) Sujeita-se uma solução compreendendo ADN completamente metilado e BSA a isolamento de ADN e tratamento com bissulfito. b) Uma solução compreendendo ADN completamente metilado e ADN genómico é introduzida na etapa de tratamento com bissulfito. Estes dois tipos de controlos proporcionam uma medida da variabilidade e da operação correcta da etapa de tratamento com bissulfito. • Execução de um estudo de calibração Calibração inicial por utilização apenas de controlos tal como anteriormente especificados para o isolamento de ADN e tratamento com bissulfito. Tal estudo de calibração proporciona uma gama da variabilidade do processo com o qual se calibra o estudo. • Controlos de inclusão de lote Excluem-se os conjuntos de amostras, caso os controlos (consultar acima) dentro do lote não estejam dentro da gama de variabilidade do processo de 3 vezes o desvio padrão (STDev) da média do processo de calibração. • Controlos negativos - Contaminação medida por PCR Isolamento de ADN: uma solução compreendendo BSA e sem ADN. Tratamento com bissulfito: uma solução compreendendo tampão de eluição e sem ADN. Análise de metilação: uma solução sem ADN, por exemplo, entre outras, água. • Controlo de contaminação ou manuseamento inadequado Caso um controlo negativo mencionado anteriormente seja positivo, excluir-se-ão os lotes de investigação adicional. Determina-se a taxa de contaminação ou manuseamento inadequado de amostra e é uma medida para a qualidade do método do invento. • Critérios prévios de inclusão no estudo Estabelece-se um conjunto de regras para inclusão ou exclusão de amostras com base no desempenho dos controlos de lote anteriores ao estudo. A expressão controlos de lote pode aqui referir-se a qualquer controlo tal como especificado na tabela 1 e que 87 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ esteja incluído num conjunto de amostras remotas, em que o referido conjunto de amostras seja processado em paralelo de acordo com o invento.

Um perito na especialidade saberá como aplicar os controlos especificados às concretizações anteriores.

Kit.

Também se divulga um kit, compreendendo pelo menos um dos seguintes: um recipiente; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher amostra compreendendo urina; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher amostra compreendendo plasma; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para isolamento de ADN; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para determinação do estado de metilação ou padrão de metilação; uma descrição para pôr em prática uma concretização do invento.

Um kit preferido compreende um recipiente; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para isolamento de ADN; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para determinação do estado de metilação ou padrão de metilação; uma descrição para pôr em prática uma concretização do invento. 88 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Um kit particularmente preferido compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: i) uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher amostra compreendendo urina; ii) uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher amostra compreendendo plasma; e iii) uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para amplificação de ADN convertido com bissulfito.

Um kit particularmente preferido compreende um recipiente; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher uma amostra compreendendo plasma ou urina; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para isolamento de ADN; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para amplificação de ADN convertido com bissulfito; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para determinação do estado de metilação ou padrão de metilação; e uma descrição para pôr em prática uma concretização do invento.

Outro kit particularmente preferido compreende um recipiente e uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para amplificação de ADN convertido com bissulfito. Assim, o ADN convertido com bissulfito pode ser apenas ADN tratado com bissulfito ou AND tratado com bissulfito e purificado (dessulfonado).

De acordo com os presentes kits especificados, uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para amplificação de ADN convertido com bissulfito compreendem i) uma actividade de ligase, uma actividade de transferase terminal, ou ambas; ii) uma actividade de polimerase; iii) pelo menos um iniciador; e iv) pelo menos um nucleótido, pelo menos um oligómero, ou ambos.

De preferência, de acordo com os kits aqui especificados i) a actividade de ligase é qualquer ligase tal como aqui especificada, em particular uma ligase de ADN em cadeia simples; ii) a actividade de transferase terminal é uma 89 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

actividade de transferase tal como aqui especificada em particular uma desoxinucleotidilo terminal transferase; iii) uma actividade de polimerase é uma enzima útil para amplificação, em particular é uma ADN polimerase, uma ADN polimerase termostável, uma ARN transcriptase, uma ARN transcriptase em combinação com uma ARNase como uma enzima adicional ou uma ligase; iv) o iniciador ou iniciadores são iniciadores tal como aqui especificados, em particular iniciadores aleatórios, iniciadores aleatórios pobres em guanina, iniciadores específicos, iniciadores específicos de gene ou iniciadores específicos de extensão; v) o oligómero é um oligómero tal como aqui especificado, em particular um oligonucleótido ou um oligómero quimérico de pelo menos um monómero de PNA e um nucleótido do terminal 5' ou 3' . 0 iniciador específico de gene é qualquer iniciador que é capaz de hibridar em condições rigorosas ou moderadamente rigorosas com uma molécula de ADN que foi derivada da amostra de ADN obtida inicialmente. Contrariamente, um iniciador específico de extensão é qualquer iniciador que é capaz de hibridar em condições rigorosas ou moderadamente rigorosas com uma parte estendida de uma molécula de ADN, em que a extensão é efectuada tal como aqui descrita. Obviamente também se incluem iniciadores que são em parte específicos para a parte estendida e em parte específicos para uma molécula de ADN proporcionada tratada com bissulfito. Obviamente, um kit preferido pode apenas compreender um ou mais, mas não todos os referidos componentes.

Num kit preferido a actividade de ligase é uma ligase de ADN em cadeia simples; a actividade de transferase terminal é uma desoxinucleotidilo terminal transferase; a actividade de polimerase é uma ADN polimerase, uma polimerase de ADN termostável, uma ARN transcriptase, uma ARN transcriptase em combinação com uma ARNase como uma enzima adicional ou uma ligase; o iniciador ou iniciadores são iniciadores aleatórios, iniciadores aleatórios pobres em guanina, iniciadores específicos, iniciadores específicos de genes ou iniciadores específicos de extensão; 90 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ ο oligómero é um oligonucleótido ou um oligómero quimérico de pelo menos um monómero de PNA e um nucleótido do terminal 5' ou 3'; ou suas combinações.

Um kit particularmente preferido também compreende uma descrição ou manual para pôr em prática uma amplificação de ADN tratado com bissulfito de acordo com um método aqui especificado.

Um kit preferido compreendendo um recipiente e uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para amplificação de ADN convertido com bissulfito compreendendo adicionalmente uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito. De preferência, tal também inclui uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para purificar, especialmente para dessulfonação de ADN tratado com bissulfito.

De acordo com um kit particularmente preferido, tais uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito compreendem um reagente de bissulfito tal como aqui especificado e um agente de captura de radicais ou solução de agente de captura de radicais tal como aqui especificado. De preferência, um kit particularmente preferido compreende adicionalmente um dispositivo de purificação, tal como aqui descrito, por exemplo um dispositivo de filtração Microcon™, um reagente básico ou solução tal como hidróxido de sódio, tal como aqui especificada, ou ambas.

Um kit preferido compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes: uma descrição para pôr em prática um método do invento para obter uma amostra de plasma; e uma descrição para pôr em prática um método do invento para obter uma amostra de urina.

Um kit preferido compreende uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher 91 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ uma amostra compreendendo plasma, compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: um recipiente compreendendo EDTA; um recipiente compreendendo pressão negativa; uma seringa; um ou mais recipientes adequados para centrifugação; uma ou mais pipetas; um ou mais recipientes adequados para arrefecimento, congelamento, armazenamento, transporte ou suas combinações, da amostra que compreende plasma; um formulário de relatório do caso; e uma lista de verificação do processo.

Um kit preferido do invento, que compreende uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher uma amostra compreendendo urina, compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: um copo de recolha de urina; uma pipeta; um ou mais recipientes compreendendo EDTA adequados para arrefecimento, congelamento, armazenamento, transporte ou suas combinações da amostra compreendendo urina; um formulário de relatório de caso; e uma lista de verificação do processo. É ainda um objecto do invento um kit tal como especificado anteriormente que pode compreender adicionalmente pelo menos um dos seguintes: uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para concentrar uma amostra remota ou pelo menos uma componente de uma amostra remota; uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para concentrar um ADN isolado de uma amostra remota; ou uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para purificar ADN tratado com bissulfito. 92 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Prefere-se um kit compreendendo um ou mais dos seguintes: A) um recipiente; B) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher uma amostra compreendendo urina tais como, entre outros, pelo menos um copo de recolha de urina, pelo menos uma pipeta, pelo menos um recipiente compreendendo EDTA adequado para arrefecimento, congelamento, armazenamento, transporte ou suas combinações, pelo menos um formulário de relatório de caso, pelo menos uma lista de verificação do processo; C) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para recolher uma amostra compreendendo plasma tais como, entre outros, pelo menos um recipiente compreendendo EDTA de preferência compreendendo pressão negativa ou a possibilidade de aplicar pressão negativa, por exemplo uma seringa, pelo menos um recipiente adequado para centrifugação, pelo menos uma pipeta, pelo menos um recipiente compreendendo EDTA adequado para arrefecimento, congelamento, armazenamento, transporte ou suas combinações, pelo menos um formulário de relatório de caso, pelo menos uma lista de verificação do processo; D) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para concentrar uma amostra remota ou pelo menos uma componente de uma amostra remota tal como aqui descrita; E) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para isolamento de ADN tal como aqui especificado r F) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para concentrar um ADN isolado de uma amostra remota tal como aqui descrita; G) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para tratamento de ADN com bissulfito, tal como aqui especificado; 93 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ Η) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para purificar ADN tratado com bissulfito. I) Uma ou mais soluções, substâncias, dispositivos ou suas combinações para determinação do estado de metilação ou padrão de metilação, tal como aqui especificado; J) Uma descrição para pôr em prática pelo menos uma concretização aqui descrita.

Utilização do método do invento.

Os métodos e kits aqui divulgados são utilizados para a análise de pelo menos um estado de metilação de ADN, pelo menos um nivel de metilação de ADN ou de pelo menos um padrão de metilação de ADN. Obviamente são também preferidas combinações dos referidos. 0 método do invento e os kits aqui descritos são utilizados para análise de metilação de ADN. Em particular tal análise compreende a detecção e quantificação da metilação ou da não metilação de pelo menos uma posição CpG. Adicionalmente compreende a identificação de pelo menos uma posição CpG, sendo a metilação da referida posição ou posições indicativa de uma condição aqui descrita. De preferência, tal análise compreende a identificação de um estado de metilação, um nivel de metilação ou de um padrão de metilação. Com particular preferência, tal análise compreende a identificação de pelo menos um padrão de metilação que é indicativo de uma condição aqui descrita. De preferência, tal análise compreende a determinação de um estado de metilação numa posição CpG, a determinação de um nivel de metilação numa posição CpG, a quantificação de um padrão de metilação ou suas combinações.

Com particular preferência, tal análise compreende a quantificação de um padrão de metilação.

Os métodos e kits de ensaio aqui divulgados são de preferência adicionalmente utilizados para identificar um alvo especifico de indicação, compreendendo a) detectar a percentagem de fragmentos de ADN caracterizado por um padrão de metilação definido dentro de uma mistura 94 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de fragmentos de ADN que são derivados de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão doentes; b) detectar a percentagem de fragmentos de ADN caracterizado por um padrão de metilação definido dentro de uma mistura de fragmentos de ADN que são derivadas de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão saudáveis; e c) definir um alvo especifico de indicação com base em diferenças das percentagens do ADN derivado da célula, grupo de células, tecido ou órgão doentes em comparação com o ADN derivado da célula, grupo de células, tecido ou órgão saudáveis.

De preferência, o método do invento e os kits aqui descritos são utilizados para a identificação de um alvo especifico de indicação. Esta concretização compreende a detecção e quantificação de uma fracção de fragmentos de ADN dentro de um grupo de fragmentos de ADN. 0 grupo de fragmentos de ADN é assim caracterizado por ser obtido de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão doentes. A fracção de fragmentos de ADN é assim caracterizada por cada fragmento de ADN compreender pelo menos um padrão de metilação que é especifico ou indicativo de uma doença associada com a célula, grupos de células, tecido ou órgão. Esta concretização compreende também uma segunda detecção e quantificação de uma fracção de fragmentos de ADN dentro de um grupo de fragmentos de ADN. 0 grupo de fragmentos de ADN é assim caracterizado por ser obtido de uma célula, grupo de células, tecido ou órgão saudáveis. A fracção de fragmentos de ADN é assim caracterizada por cada fragmento de ADN compreender pelo menos um padrão de metilação que é especifico ou indicativo da referida doença. Adicionalmente, esta concretização compreende a identificação de um alvo especifico de indicação. A identificação é assim determinada por diferenças quantitativas das referidas fracções de fragmentos de ADN obtido da célula, grupo de células, tecido ou órgão doentes e obtido da célula, grupo de células, tecido ou órgão saudáveis. A utilização dos métodos e kits aqui descritos é especialmente preferida para identificar um alvo especifico de indicação, em que o alvo especifico de indicação é uma secção 95 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ de ADN, uma molécula de ARN, uma proteína, um péptido ou composto metabólico. É particularmente preferida a utilização do método do invento e dos kits aqui descritos para a identificação de um alvo específico de indicação. De acordo com esta concretização, o alvo específico de indicação é uma secção de ADN, uma molécula de ARN, uma proteína, um péptido ou compostos metabólicos. A utilização do método do invento e dos kits aqui descritos é adicionalmente especialmente preferida quando se atribui um modulador conhecido por si próprio da referida secção de ADN, da referida molécula de ARN, da referida proteína, do referido péptido ou do referido composto metabólico à indicação específica da célula, grupo de células ou tecido doentes.

Em particular, a utilização do método do invento ou de um kit aqui descrita é preferida no caso de se atribuir um modulador conhecido por si próprio da referida secção de ADN, da referida molécula de ARN, da referida proteína, do referido péptido ou do referido composto metabólico à indicação específica da célula, grupo de células ou tecido doentes.

De preferência, prefere-se a utilização do referido modulador para preparar uma composição farmacêutica no caso de uma indicação específica ou de uma indicação de cancro específica. Tal é particularmente preferido caso a indicação seja uma indicação de cancro. A utilização dos métodos e kits aqui descritos é adicionalmente especialmente preferida para pelo menos um dos seguintes relativamente ao doente ou indivíduo: diagnóstico de uma condição, prognóstico de uma condição, prever uma resposta a tratamento, diagnóstico de uma predisposição para uma condição, diagnóstico da progressão de uma condição, determinar a gravidade de uma condição, determinar o estágio de uma condição, classificação de uma condição, caracterização de uma condição ou suas combinações, em que a condição é uma condição saudável ou um evento adverso, em que o evento adverso compreende pelo menos uma categoria seleccionada do grupo compreendendo: interacções medicamentosas indesejáveis; doenças de cancro, doenças 96 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ proliferativas ou doenças associadas com estas; disfunção do SNC; danificação ou doença; sintomas de agressão ou perturbações comportamentais; consequências clinicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; perturbações psicóticas e doenças de personalidade; demência e/ou sindromes associados; doença cardiovascular do tracto gastrointestinal; disfunção, danificação ou doença do sistema respiratório; lesão, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danificação ou doença do corpo como uma anomalia do processo de desenvolvimento; disfunção, danificação ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danificação ou doença endócrina e metabólica; e enxaquecas ou distúrbios sexuais. É particularmente preferida uma utilização do método do invento ou dos kits aqui divulgados para pelo menos uma das aplicações ou utilizações seleccionadas do grupo compreendendo: diagnóstico de uma condição, prognóstico de uma condição, prever uma resposta a tratamento, diagnóstico de uma predisposição para uma condição, diagnóstico de uma progressão de uma condição, determinar a gravidade de uma condição, determinar o estágio de uma condição, classificação de uma condição, caracterização de uma condição ou suas combinações. De acordo com esta concretização, a condição é uma condição saudável ou um evento adverso. 0 referido evento adverso compreende pelo menos uma categoria seleccionada do grupo compreendendo: interacções medicamentosas indesejáveis; doenças de cancro, doenças proliferativas ou doenças associadas a estas; disfunção do SNC; danificação ou doença; sintomas de agressão ou perturbações comportamentais; consequências clinicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; perturbações psicóticas e doenças de personalidade; demência e/ou sindromes associados; doença cardiovascular do tracto gastrointestinal; disfunção, danificação ou doença do sistema respiratório; lesão, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danificação ou doença do corpo como uma anomalia do processo de desenvolvimento; disfunção, danificação ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danificação ou doença endócrina e metabólica; e enxaquecas ou distúrbios sexuais. 97 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ A utilização dos métodos e kits aqui descritos é adicionalmente especialmente preferida para distinguir tipos de células ou tecido, ou para investigar diferenciação celular, em que a condição A e a condição B são diferentes condições celulares. 0 método do invento e os kits aqui divulgados são também utilizados de preferência para distinguir tipos de células, tecidos ou para investigar diferenciação celular. Tal serve numa maneira particularmente preferida para analisar a resposta de um doente a um tratamento com fármaco.

DEFINIÇÕES

Em aspectos particulares, a expressão "estado de metilação" refere-se, entre outros, à presença ou ausência de metilação de um único nucleótido numa única molécula de ADN, em que o referido nucleótido é capaz de ser metilado.

Em aspectos particulares, a expressão "nível de metilação" refere-se, entre outros, à ocupação de metilação média num único nucleótido numa variedade de moléculas de ADN, em que o referido nucleótido é capaz de ser metilado.

Em aspectos particulares, a expressão "padrão de metilação" refere-se, entre outros, ao estado de metilação de uma série de nucleótidos localizados em cis numa única molécula de ADN, em que os referidos nucleótidos são capazes de ser metilados.

Em aspectos particulares, a expressão "amostra remota" refere-se a uma amostra com ADN genómico, em que a amostra é obtida de sangue, plasma, soro ou urina.

Em aspectos particulares, a expressão tratamento também compreende, entre outros, a profilaxia e o tratamento de seguimento (e.g. de um tumor que já não é detectável ou de um tumor estável). A expressão profilaxia compreende conjuntamente com a detecção, também um exame médico. Em aspectos particulares, as expressões detecção ou diagnóstico e/ou tratamento ou terapia de uma doença de cancro compreendem 98 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ opcionalmente, entre outros, também a detecção e/ou tratamento de metástases dos tumores primários noutros tecidos.

Em aspectos particulares, a expressão prognóstico compreende, entre outros, as afirmações aqui sobre a probabilidade de sucesso de uma terapia ou de sucesso de tratamento e/ou afirmações sobre a agressividade de uma doença e/ou afirmações sobre o tempo de vida presumido sem a ocorrência de sintomas de doença adicionais ou metástases e/ou sobre a probabilidade da necessidade de um tratamento adicional e/ou sobre a compatibilidade de efeitos secundários indesej áveis.

Em aspectos particulares, uma micromatriz de ADN é, entre outros, uma construção arbitrária com um substrato ou transportador, no qual se arranjam diferentes espécies de ácido nucleico, tais como genes, fragmentos de gene ou outros oligonucleótidos ou polinucleótidos, respectivamente em locais definidos diferentes atribuídos às espécies de ácido nucleico respectivas. Arranja-se uma espécie de ácido nucleico num local respectivo, no entanto pode encontrar-se uma mistura definida de diferentes ácidos nucleicos também arranjada num local respectivo e portanto todos os locais contêm uma mistura diferente. Os ácidos nucleicos podem ser imobilizados, mas tal não é estritamente necessário, dependendo do substrato ou transportador utilizado. Constituem exemplos não limitativos de micromatrizes: micromatrizes de ácido nucleico, micromatrizes de genes, placas de microtitulação com soluções de ácido nucleico nos poços, estando os ácidos nucleicos imobilizados ou não imobilizados, membranas com ácidos nucleicos nelas imobilizados e matrizes, micromatrizes ou chips de oligonucleótidos, caracterizados por esses oligonucleótidos terem um comprimento inferior a 200 pb e estarem imobilizados numa superfície.

Em aspectos particulares, um modulador de um alvo é, entre outros, um composto ou substância, que inibe ou induz a geração do alvo ou reduz ou aumenta a actividade do alvo gerado, relativamente à actividade in vitro ou in vivo na ausência da substância. Deste modo, um modulador pode ser por um lado uma substância que afecta moduladamente a cascata de desenvolvimento do alvo. Por outro lado, um modulador pode ser 99 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ uma substância que forma uma ligação com o alvo gerado e de tal modo que as interacções fisiológicas adicionais com substâncias endógenas são pelo menos reduzidas ou aumentadas. Os moduladores podem também ser moléculas que afectam e inibem ou activam a transcrição do gene alvo. Tais moléculas podem por exemplo ser poliamidas ou proteínas de dedo de zinco, que evitam a transcrição por ligação a regiões de ADN da maquinaria de transcrição de base. A transcrição pode também ocorrer indirectamente pela inibição de factores de transcrição, que são essenciais para a transcrição do gene alvo. A inibição de tais factores de transcrição pode ser garantida pela ligação dos denominados aptâmeros a armadilhas. Os moduladores podem ser moléculas naturais ou sintéticas que se ligam especificamente a um alvo ou percursor de alvo ou sucessor de alvo. Podem também ser anticorpos específicos de alvo, por exemplo anticorpos monoclonais ou policlonais humanos, humanizados e não humanizados. A expressão anticorpos inclui adicionalmente anticorpos de disposição de fagos, anticorpos de apresentação de ribozima (fusão covalente entre ARN e proteína) e anticorpos de apresentação de ARN (produzidos in vitro). A expressão também inclui anticorpos que são modificados por quimerização, humanização ou desimunização e fragmentos específicos da cadeia leve e/ou pesada da região variável de anticorpos básicos do tipo anterior. A produção ou extracção de tais anticorpos com determinados imunogenes é bem conhecida dos peritos da especialidade e não é necessário explicá-la detalhadamente. Incluem-se adicionalmente anticorpos biespecíficos, que por um lado se ligam a uma molécula desencadeadora de uma célula efectora imunitária (e.g. CD3, CD16, CD64) e por outro lado a um antigénio da célula alvo de tumor. Tal causará, no caso de uma ligação, que por exemplo uma célula de tumor seja morta. Os moduladores podem por exemplo também ser anticalinas e aficorpos adequados específicos de alvo que mimetizam um anticorpo.

Em aspectos particulares, uma doença de cancro é entre outros, uma doença de cancro específica de órgão, tal como cancro de pulmão, cancro de ovários, cancro do escroto, cancro da próstata, cancro do pâncreas, cancro da mama, cancro de um órgão do tracto digestivo, etc. Descrevem-se sequências adequadas relativamente a todos os aspectos do presente 100 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ invento por exemplo nos documentos DE 20121979 Ul, DE 20121978 Ul DE 20121977 ui, DE 20121975 UI. DE 20121974 ui, DE 20121973 Ul DE 20121972 ui, DE 20121971 ui, DE 20121970 Ul, DE 20121969 Ul DE 20121968 ui, DE 20121967 ui, DE 20121966 Ul. DE 20121965 Ul DE 20121964 ui, DE 20121963 ui, DE 20121961 Ul, DE 20121960 Ul DE 10019173 Al, DE 10019058 Al, DE 10013847 Al, DE 10032529 Al DE 10054974 Al, DE 10043826 Al, DE 10054972 Al, DE 10037769 Al DE 10061338 Al, DE 10245779 Al, DE 10164501 Al, DE 10161625 Al DE 10230692 , DE 10255104, EP 1268855, EP 1283905, EP 1268857 EP 1294947, EP 1370685, EP > 1395686, EP 1421220, EP 1451354 EP 1458893, EP 1340818, EP 1399589, EP 1478784, WO 2004/035803 e WO 2005/001141, aos quais se faz aqui explicitamente referência.

Em aspectos particulares, a composição farmacêutica de acordo com o invento pode ser preparada, entre outras, da forma habitual. Por exemplo, como contra-iões para compostos iónicos podem utilizar-se Na+, K+, Li+ ou ciclo-hexilamónio. As formas de preparação galénica sólidas ou liquidas adequadas são por exemplo granulados, pós, drageias, pastilhas, (micro) cápsulas, supositórios, xaropes, sumos, suspensões, emulsões, gotas ou soluções injectáveis (IV, IP, IM, SC) ou dispersões finas (aerossóis), sistemas transdérmicos e preparações com libertação prolongada da substância activa, para a produção das quais se utilizam os meios habituais, tais como substâncias transportadoras, agentes explosivos, aglutinantes, de revestimento, agentes expansores, agentes de deslizamento ou lubrificantes, agentes aromatizantes, edulcorantes e mediadores de solução. Como substâncias auxiliares nomeiam-se no presente documento carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manite e outros açúcares, pó de talco, proteína de leite, gelatina, amido, celulose e derivados, óleos animais e vegetais, tais como óleo de fígado de bacalhau, óleo de girassol, óleo de amendoim ou óleo de sésamo, poletilenoglicóis e solventes, tal como água estéril e álcoois monovalentes ou multivalentes, por exemplo glicerina. Pode produzir-se uma composição farmacêutica de acordo com o invento por mistura de pelo menos um modulador utilizado de acordo com o invento numa dose definida com um transportador adequado farmaceuticamente e bem tolerado fisiologicamente e possivelmente substâncias activas, adicionais ou auxiliares 101 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ adequadas com uma dose de inibidor definida e prepara-se na forma de administração desejada.

Em aspectos particulares, os marcadores de resposta são, entre outros, proteínas ou moléculas de ARN ou modificações de um ácido nucleico (tal como SNP ou metilação) , que estão correlacionados com a resposta celular de uma célula a uma substância exógena, em particular uma substância terapêutica. Os diferentes doentes reagem de formas diferentes a uma terapia específica. Tal baseia-se nas respostas celulares do doente individual a uma substância terapêutica. Através de uma análise diferencial de tecidos idênticos de diferentes pessoas, as pessoas que sofrem da mesma doença e que são tratadas com a mesma terapia, mas que reagem de formas diferentes à terapia (e.g. por processos de cura com diferentes velocidades ou diferentes efeitos desvantajosos, tais como efeitos secundários), podem identificar-se tais marcadores de resposta e por um lado a existência (diferencial) de uma proteína ou enzima ou uma modificação do ácido nucleico, mas também a sua ausência, qualificá-la-ia como um marcador de resposta.

Em aspectos particulares, a expressão "intervalo de confiança" refere-se, entre outros, a quantificação de incerteza na medida. É usualmente relatado como uma percentagem de intervalo de confiança, que é a gama de valores dentro da qual se pode estar seguro com uma percentagem de probabilidade que estará o valor verdadeiro para toda a população. EXEMPLOS.

Exemplo 1. Recolha de amostras

Exemplo la. Recolha de amostras de plasma

Recolheram-se amostras de plasma de vários dadores localizados nos EUA, Rússia, Hungria e Alemanha de acordo com as seguintes especificações: 102 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Recolheram-se amostras de plasma de doentes nos estágios I-III (AJCC) de cancro colorrectal e vários controlos de acordo com os seguintes grupos: • Grupo CRC: Doentes com cancro colorrectal (confirmado patologicamente) • Controlos saudáveis: Doentes sem resultados patológicos em colonoscopia e sem sinais de doença aguda ou crónica exacerbada • Controlos de cancro: Doentes com carcinomas diferentes de cancro colorrectal, e.g. carcinoma da mama ou da próstata • Controlos não cancro: Doentes com doenças não cancerosas

As tabelas 2 e 3 apresentam uma visão global dos dois conjuntos de amostras recolhidas:

Grupo de diagnóstico Volume de amostra Número de amostras Observações Cancro colorrectal 16 ml de plasma 175 Estágio I, II, III independentemente dos sintomas Controlos de não cancro 175 Doentes sintomáticos com condições não agudas Controlos de cancro 50 Predominantemente cancro da próstata e da mama

Tabela 2 Visão global de um conjunto de amostras.

Grupo de diagnóstico Volume de amostra Número de amostras Observações Cancro colorrectal 200 Estágio I, II, III e sem sintomas específicos de CRC Controlos saudáveis 16 ml de plasma 125 Doentes assintomáticos Controlos não cancro 175 Doentes sintomáticos com condições não agudas Controlos de cancro 50 Predominantemente cancro da próstata e da mama

Tabela 3 Visão global de um segundo conjunto de amostras. 103 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Critérios de inclusão/exclusão para as amostras:

Recolheram-se um número equivalente de amostras no mínimo de 30 amostras para cada grupo. Para integrar o conjunto de amostras remotas de plasma devem ser cumpridos os seguintes critérios (Tabelas 4-8):

Critérios gerais - aplicados a todas as amostras Consentimento Formulário de consentimento explicativo e assinado pelo doente (~45 ml de sangue) Infeccioso Doente não sabe que tem VIH, HBV ou HCV Idade 0 doente tinha de preferência 50 anos ou mais (no mínimo 40 anos) Registo médico Registos médicos disponíveis Admissão Grupo da doença ainda elegível para admissão ao estudo

Tabela 4: Critérios gerais para integração de amostra de plasma.

Grupo CRC - Amostras derivadas de doentes com cancro colorrectal (CRC) Tempo 0 doente ainda está em pré-tratamento, i.e. ainda não recebeu qualquer tratamento incluindo neoadjuvante e remoção de tumor por colonoscopia Patologia Tipo histológico: adenocarcinoma Estágio Estágio I-III de acordo com AJCC História 0 doente não tem história de cancro de cólon Colonoscopia Existe relatório incluindo análise histológica. A colonoscopia não foi realizada nos últimos 7 dias ou há mais de 6 meses

Tabela 5: Critérios para admissão de amostras de plasma no grupo de cancro colorrectal 104 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Controlos de cancro - amostras derivadas de doentes com, por exemplo, cancro da mama ou da próstata Tempo Doente ainda em pré-tratamento, i.e. antes de qualquer terapia relacionada com cancro História 0 doente não tem história de cancro de cólon Patologia Diagnóstico histológico disponível Informação de estágio Dados de classificação TNM Sintomas Os doentes que não sofreram colonoscopia para qualquer dos seguintes sintomas específicos para CRC foram a população alvo preferida para este grupo: • hemorragia ano-rectal (hematoquézia) • hábitos intestinais alterados • anemia óbvia/conhecida com hemoglobina < 10 g/dl • Perda de peso inexplicada (10% do peso em 6 meses) • sinais de obstrução intestinal (alteração da forma das fezes) • Hábitos intestinais alterados

Tabela 6 Critérios para admissão de amostras de plasma no grupo de controlo de cancro.

Controlos saudáveis - sem sinal de doença aguda Tempo Doente em situação "normal" (e.g. sem anestesia geral, cirurgia, etc.) Patologia Tipo histológico: mucosa normal, sem inflamação ou outros sinais História Sem história de cancro nos últimos 5 anos (além de célula basal de pele) Colonoscopia Existência de relatório incluindo análise histológica de colonoscopia Colonoscopia não efectuada nos últimos 7 dias ou há mais de 6 meses Sintomas Sem sinais ou sintomas de doença aguda. Sem alterações nos sintomas da doença crónica existente (exacerbação)

Tabela 7 Critérios para admissão de amostras de plasma no grupo de controlo saudável. 105 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Controlos não cancro - doença infecciosa, inflamatória sistémica aguda Tempo A doença está actualmente activa História Sem história de cancro nos últimos 5 anos (além de célula basal da pele) Colonoscopia Colonoscopia apenas caso a doença estivesse localizada no cólon, e.g. diverticulite Colonoscopia não efectuada nos últimos 7 dias ou há mais de 6 meses

Tabela 8 Critérios para admissão de amostras de plasma no grupo de controlo não cancro.

Cada investigador principal forneceu informação clínica do doente, tal como especificado pelo formulário de relatório de caso incluído no kit de recolha de amostra fornecido para cada doente. Tal inclui, entre outros: • Dados gerais do doente: idade, sexo, raça • Sintomas • Informação sobre diagnóstico: doenças actuais incluindo detalhes do relatório de patologia • Informação sobre o tratamento protocolo e kits de do mesmo plasma e

Além disso, forneceu-se a cada investigador um de estudo com uma descrição do processo de recolha recolha de amostra para assegurar a utilização material para recolha de sangue, extracção de armazenamento de amostras.

Para cada doente, utilizou-se um kit de recolha de amostra com tubos pré-etiquetados e formulários impressos. Um saco grande contém o formulário de relatório de caso (CRF) para a informação clínica e uma lista de verificação de processo para registar as etapas de processamento. O material necessário para recolha de sangue (agulhas e recipiente para sangue), extracção de plasma (tubos Falcon e pipetas) e armazenamento da amostra (frasquinhos de crioconservação) encontra-se armazenado em sacos mais pequenos.

Após o investigador principal decidir admitir um doente, recolheu-se sangue e completou-se o CRF. É necessário recolher 106 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ sangue acima da marca impressa na etiqueta dos tubos para assegurar uma concentração de EDTA correcta na amostra.

Os tubos de sangue foram processados imediatamente ou mantidos em embalagens frias até três horas, caso seja necessário o envio para o laboratório.

Extraiu-se o plasma do sangue recolhido através de um processo de centrifugação em duas etapas. Ambas as etapas foram efectuadas a 1500 x g a 4 graus Celsius. Utilizaram-se os recipientes de sangue para a primeira centrifugação. Pipetou-se então cuidadosamente o sobrenadante dos 4-5 tubos de recolha de sangue para dois tubos Falcon de 15 ml parando 5 mm acima da camada leuco-plaquetária.

Após a segunda centrifugação, transferiu-se o plasma dos dois tubos Falcon pequenos para um tubo Falcon grande de 50 ml para mistura antes de se separarem em 4-5 aliquotas em frasquinhos de crioconservação de 4,5 ml. Nesta etapa, permaneceu um volume residual de 0,5 a 1 ml em cada um dos tubos Falcon pequenos para assegurar uma separação óptima dos leucócitos do sobrenadante.

Congelaram-se os frasquinhos de crioconservação na vertical imediatamente e não mais do que 4 horas depois da recolha do sangue. O congelamento e armazenamento foram a -70 a -80 graus Celsius.

Cada etapa foi registada na lista de verificação de processo fornecida com o kit de recolha.

As amostras foram enviadas a pedido em gelo seco.

Introduziu-se a informação registada numa folha de cálculo electrónica e forneceram-se com os CRF e as listas de verificação de processo para análise subsequente das amostras de plasma. Os dados clinicos proporcionados na folha de cálculo electrónica foram revistos para assegurar: • Plausibilidade • Integralidade • Pseudonimização e • Conformidade com os critérios de inclusão e exclusão. 107 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Exemplo lb. Recolha de amostras de urina:

As amostras de urina foram recolhidas por vários fornecedores localizados nos EUA e na Alemanha.

Proporcionou-se a cada fornecedor um protocolo de estudo com uma descrição do processo de recolha e kits de recolha de amostras para assegurar a utilização do mesmo material para recolha de urina e armazenamento das amostras.

Antes de iniciar a recolha, determinaram-se os critérios de inclusão/exclusão.

Para cada doente, utilizou-se um kit de recolha de amostra com tubos pré-etiquetados e formulários impressos. Um saco grande contém o formulário de relatório de caso (CRF) para a informação clinica e uma lista de verificação de processo para registar as etapas de processamento. O material necessário para a recolha de urina (recipientes para urina, pipeta) e armazenamento de amostras (frasquinhos de crioconservação) encontra-se em sacos mais pequenos.

Após o investigador principal decidir admitir um doente, massajou-se a próstata do doente e recolheram-se os primeiros 20 ml de urina e completou-se o CRF. Foi necessário encher o copo de recolha de urina até à marca no recipiente de recolha para assegurar uma concentração de EDTA correcta na amostra.

Pipetou-se urina para dois frasquinhos de crioconservação de 10 ml e congelaram-se a -70 a -80 graus Celsius no intervalo de uma hora após recolha.

Registou-se cada etapa na lista de verificação de processo fornecida com o kit de recolha.

As amostras foram enviadas a pedido em gelo seco.

Introduziu-se a informação registada numa folha de cálculo electrónica e forneceu-se com os CRF e as listas de verificação de processo para análise subsequente de amostras de urina. 108 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Exemplo 2. Controlos de processo.

Prepararam-se os seguintes controlos de processo e utilizaram-se.

Controlo negativo para MagNA Pure: BSA a 5% (Albumina sérica bovina fracção V (Roche Cat N° 03 117 375 001) diluida em lx solução salina tamponada de fosfato (10X tampão PBS pH 7,4 (Ambion Inc. Cat N° 9625). Controlo positivo para MagNA Pure: ADN metilado (Chemicon Cat N° S7821) adicionado a solução de BSA a 5%, a uma concentração final de 25 ng/ml.

Prepararam-se os controlos referidos em lote antes de cada estudo e armazenaram-se em aliquotas de 4 ml que é um volume suficiente para uma experiência no instrumento de LC MagNA Pure (Roche).

Exemplo 3. Isolamento de ADN de amostras de plasma. O isolamento de ADN de 895 amostras de plasma foi efectuado utilizando o kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) de grande volume (Roche).

Descongelaram-se as amostras de plasma. Extraiu-se o ADN em paralelo de oito aliquotas de 1 ml de cada amostra de plasma. Colocaram-se as amostras e controlos numa placa de microtitulação, manusearam-se e recolheram-se conjuntamente de acordo com a figura 2. Cada experiência no instrumento de LC MagNA Pure inclui três amostras cada de 8 ml divididas em aliquotas de 1 ml; um controlo negativo de 4 ml dividido em aliquotas de 1 ml; e um controlo positivo de 4 ml dividido em aliquotas de 1 ml. A posição na placa de microtitulação dos controlos negativo e positivo foi atribuída aleatoriamente para cada experiência no início do estudo. Seleccionou-se um volume de eluição de 100 μΐ por poço. Utilizando 4 instrumentos de LC MagNA Pure, estabeleceram-se experiências e completaram-se em pares. O ADN proporcionado no tampão de eluição foi então sujeito a recolha conjunta e à etapa de concentração. 109 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Exemplo 4. Recolha conjunta e concentração. O objectivo desta etapa é recolher conjuntamente as 8 extracções de ADN efectuadas em paralelo para cada amostra remota e para concentrar os 800 μΐ de eluato até um volume de 100 μΐ (consultar figura 2) . De acordo com o protocolo de extracção MagNA Pure obteve-se 100 μΐ de eluato para cada alíquota de 1 ml. Utilizaram-se duas colunas Microcon YM-30 (Millipore) por amostra remota. Por outras palavras, juntaram-se em cada filtro 4 eluatos resultando num volume de 400 μΐ. Subsequentemente centrifugaram-se os filtros com uma microcentrifuga até ao volume de 50 μΐ. Juntaram-se os dois concentrados de 50 μΐ para obter uma amostra de 100 μΐ compreendendo o ADN extraido dos 8 ml da amostra de plasma.

Utilizou-se uma única coluna Microcon YM-30 (Millipore) para os controlos positivo e negativo. Os 50 μΐ resultantes do controlo respectivo foram diluídos até 100 μΐ por adição de tampão de eluição MagNA Pure fornecido no kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) de grande volume.

Exemplo 5. Controlo de qualidade para extracção de ADN.

Removeram-se 5 μΐ de cada 100 μΐ de amostra concentrada, controlo positivo e controlo negativo e diluíram-se em 45 μΐ de tampão de eluição MagNA Pure fornecido no kit de isolamento de ácido nucleico MagNA Pure Compact (I) de grande volume. Sujeitou-se 12,5 μΐ de ADN diluído ao ensaio de ADN genómico CFF1 para determinação da concentração do ADN total. A concentração do ADN recuperado nas amostras do controlo positivo foi utilizada como medida de controlo de qualidade para calibrar a etapa de extracção de ADN. A mediana de recuperação de ADN para os controlos positivos foi de 2,8 ng/ml. A mediana de recuperação de ADN das 895 amostras de plasma foi de 3,86 ng/ml, com uma gama de 0 a 1086 ng/ml.

Ensaio de ADN genómico CFF1 iniciador directo CFF1 SEQ ID NO:l 5'TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG3' iniciador inverso CFF1 SEQ ID NO:2 5'CCTCCCATCTCCCTTCC3' 110 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ CFF1 sonda TaqMan SEQ ID NO:3 5'- 6 FAM-AT GGAT GAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ-1-3'

As seguintes soluções foram pipetadas conjuntamente e misturadas de acordo com Tabela 9. solução Concentração da solução-mãe Volume Concentração final Hybprobe Master Mix lOx 2 μΐ lx MgCl2 25 mmol/1 1,2 μΐ 2,500 mmol/1 Mistura de iniciador 10 pmol/l 1,25 μΐ 0,625 μπιοΐ/ΐ (cada) (cada) Sonda TaqMan 10 pmol/l 0,4 μΐ 0,200 μπιοΐ/ΐ (cada) Água -- 2,65 μΐ -- ADN diluído — 12,5 μΐ -- Volume total da 20 μΐ reacção

Tabela 9: Preparação da mistura de PCR para o ensaio de ADN genómico CFF1. (Hybprobe Master Mix são as sondas de hibridação de LightCycler FastStart ADN Master (Roche Cat N° 2 239 272) . )

Efectuou-se PCR numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche) de acordo com as condições especificadas na Tabela 10. 1 Activação 95 ° C 10 min 2 Desnaturação 95 ° C 15 s 3 Hibridação/extensão e detecção 58 °C 60 s 5 Ciclos As etapas 2 e 3 foram repetidas 45 vezes 4 Arrefecimento O 0 O 30 s

Tabela 10: Condições dos ciclos de PCR para o ensaio de ADN genómico CFF1 numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche).

Exemplo 6. Tratamento com bissulfito e purificação de ADN tratado com bissulfito.

Prepararam-se os seguintes dispositivos: banho de água a 50 °C, termomisturadores a 60 °C, banho de água em ebulição. 111 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Prepararam-se os seguintes reagentes: Antes do início do estudo pesaram-se o bissulfito seco e o reagente de captura de radicais e separaram-se em alíquotas em cada caso para 75 tubos para obter 75 conjuntos de tratamento com reagente de tratamento com bissulfito separado em alíquotas. Utiliza-se cada um dos 75 conjuntos para um lote de tratamento com bissulfito. A solução de bissulfito, bem como a solução de agente de captura de radicais em dioxano, foram preparadas imediatamente antes de cada procedimento. Para a solução de bissulfito dissolveram-se 10,36 g de bissulfito de sódio e 2,49 g de sulfito de sódio por adição de 22 ml de água isenta de nuclease. A solução foi misturada rigorosamente repetidamente e incubada a 50°C até dissolução de todas as partículas de bissulfito. Para a solução do agente de captura de radicais em dioxano, dissolveu-se 323 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico (agente de captura de radicais) por adição de 8,2 ml de 1,4-dioxano. A solução foi misturada rigorosamente até dissolução de todas as partículas. Adicionalmente, preparou-se 500 ml de solução de tris-(hidroximetil)-aminometano 0,1 mmol/1, EDTA 0,1 mol/1, 50 ml de uma solução de NaOH 0,2 mol/1 e 50 ml de NaOH 0,1 mol/1.

Armazenamento de amostras: Todas as amostras foram armazenadas a 4°C.

Materiais e equipamento utilizados:

Termomisturador de Eppendorf 5355 (Brinkmann N° 022670107)

Termomisturador de Eppendorf de bloco de 2,0 ml (Brinkmann N° 022670549)

Banho de água VWR 1225 (VWR N° 13309-375)

Placa de aquecimento com agitação VWR 620, 1" x 7" (VWR N° 12365-382)

Microcentrífuga Eppendorf 5417C Balança analítica Mettler-Toledo AG64

Dispositivos de filtração Millipore Y-30 Microcon (Millipore N° 42411)

Copo de vidro de 4 L Corning (Corning N° 1003-4L) 112 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Proveta graduada de 500 ml Nalgene (NNI N° 3663-0500)

Unidade de filtração estéril de 0,2 μΜ Nalgene, 500ml (Nalgene N° 166-0020)

Suporte flutuante de microtubos de 16 posições Nalgene (VWR N° 60986-098)

Suporte flutuante de microtubos de 8 posições Nalgene (VWR N° 60986-099)

Tubo cónico de 50 ml Falcon (Falcon 352070)

Tubo cónico de 15 ml Falcon (Falcon 352096) Água isenta de nuclease (Ambion N° 9932)

Bissulfito de sódio (Sigma N° S-9000)

Sulfito de sódio (Sigma N° 4672) 1,4-Dioxano estabilizado (Sigma N° 33147)

Agente de captura de radicais - ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico (Sigma N° 238813-5G) EDTA 0,5 mol/1 (Ambion N° 9260G)

NaOH 0,2 mol/1 (Fisher N° AC349685000)

Tris-(hidroximetil)-aminometano 1 mol/1 (Ambion N° 9855G)

Fechos de segurança para tubos (ISC Bioexpress N° C-3271-2)

Tubos de 2,0 ml de fecho seguro Eppendorf (Eppendorf N° 22 60 004-4)

Tubo de recolha de coluna (Millipore N° 1065601)

Mincentrífuga Quik-Spin (ISC Bioexpress N° C-1301-P)

Enchedor de pipetas portátil (Drummond N° 4-000-100)

Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml de baixa retenção (ISC Bioexpress N° C-3228-1)

Tubos de microcentrífuga de 0,65 ml de baixa retenção (ISC Bioexpress N° C-3226-1) a) Tratamento de ADN isolado com bissulfito

Preparação da amostra: Removeram-se os tubos de 2 ml contendo a solução de ADN isolado do exemplo 4 do frio de 4°C. Incluíram-se conjuntamente com 20 amostras de ADN isolado e controlos de processo, um controlo positivo e um controlo 113 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ negativo, para ο tratamento com bissulfito em cada lote de tratamento com bissulfito. 0 controlo negativo de bissulfito foi tampão de eluição MagNA Pure, enquanto o controlo positivo de bissulfito continha 0,1 yg de ADN metilado Chemicon e 0,9 yg de ADN genómico humano Roche por 1 ml de tampão de eluição MagNA Pure.

Centrifugaram-se brevemente os tubos a 6000 rpm. Adicionou-se 354 yl de solução de bissulfito e 146 yl de solução de dioxano a cada tubo consecutivamente. Misturaram-se os tubos rigorosamente durante 10 s e centrifugou-se brevemente a 6000 rpm.

Reacção com bissulfito:

Fecharam-se os tubos e colocaram-se num banho de água em ebulição durante 3 minutos para desnaturar o ADN. Seguidamente transferiram-se os tubos para o termomisturador pré-aquecido e incubaram-se a 60 °C mexendo simultaneamente a 1000 rpm durante 30 min. Seguidamente colocaram-se os tubos novamente no banho de água em ebulição durante 3 min, antes de os incubar novamente no termomisturador durante 1,5 h a 60 °C e 1000 rpm. Subsequentemente colocaram-se os tubos novamente no banho de água em ebulição durante 3 min e incubaram-se novamente no termomisturador durante 3 h a 60 °C e 1000 rpm.

Dessalinização da mistura reaccional de bissulfito:

Misturaram-se os tubos da reacção de bissulfito e centrifugaram-se brevemente a 6000 rpm. Dissolveram-se os precipitados formados durante o aquecimento por mistura repetida e pela adição de 200 yl de água. Subsequentemente centrifugaram-se brevemente os tubos durante 10 s. Removeram-se 400 yl de solução de cada tubo e transferiram-se para a coluna Microcon Micron YM-30 correspondente adequadamente etiquetada. Utilizou-se uma coluna para cada amostra remota original, que foi colocada num tubo de recolha. As montagens de coluna foram centrifugadas durante 20 min a 14000 x g. Após centrifugação, transferiu-se a coluna para um novo tubo de recolha e transferiu-se os restantes cerca de 400 yl de reacção de bissulfito para a coluna Microcon Micron YM-30 correspondente. As montagens de colunas foram novamente 114 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ centrifugadas durante 20 min a 14000 x g e transferiu-se a coluna para um novo tubo. Após esta segunda centrifugação, a membrana de filtro das colunas deve parecer húmida mas não deve ser visível nenhum volume de fluido. As colunas que permaneceram com líquido foram centrifugadas repetidamente durante 5 min a 14000 x g até que o filtro fique apenas húmido. Finalmente, as colunas foram transferidas para um novo tubo. b) Purificação de ADN tratado com bissulfito

Lavagem e dessulfonação de ADN tratado com bissulfito:

Transferiram-se 400 μΐ de NaOH 0,2 mol/1 para cada coluna Microcon YM-30 ligeiramente húmida compreendendo um ADN tratado com bissulfito. Centrifugaram-se as colunas a 14000 x g durante 12 min e seguidamente colocaram-se num novo tubo. Transferiram-se 400 μΐ de NaOH 0,1 mol/1 para cada coluna e centrifugaram-se novamente a 14000 x g durante 12 min. Após esta segunda centrifugação, a membrana de filtro das colunas deve parecer húmida mas não deve ser visível nenhum volume de fluido. As colunas que permaneceram com líquido foram centrifugadas repetidamente durante 5 min a 14000 x g até que o filtro fique apenas húmido. Finalmente as colunas foram transferidas para um novo tubo. Após esta etapa de dessulfonação, lavaram-se as colunas duas vezes com 400 μΐ de água e subsequente centrifugação a 14000 x g durante 12 min. Utilizou-se um novo tubo de recolha de eluído para a segunda etapa de lavagem. Após a segunda lavagem, a membrana de filtro da coluna deve parecer húmida, mas não deve ser visível qualquer volume de fluido. As colunas que permaneceram com líquido foram centrifugadas repetidamente durante 5 min a 14000 x g até que o filtro fique apenas húmido. As colunas que estavam apenas húmidas foram colocadas num novo tubo para eluição.

Eluição de ADN tratado com bissulfito:

Transferiram-se 50 a 65 μΐ de Tris 0,1 mol/1, EDTA 0,1 mmol/1 pré-aquecido a 50 °C para cada coluna compreendendo o ADN dessulfonado. Subsequentemente, a montagem de coluna foi colocada no termomisturador e incubada a 50 °C durante 10 min com agitação a 1000 rpm. Seguidamente inverteram-se as colunas 115 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ e colocaram-se num novo tubo etiquetado. 0 ADN foi eluído da coluna respectiva por centrifugação a 1000 x g durante 7 min. Ajustaram-se as amostras de ADN eluido tratado com bissulfito com um volume inferior a 50 μΐ até 50 μΐ por adição da quantidade adequada de Tris 0,1 mol/1, EDTA 0,1 mmol/1.

Para objectivos de controlo, diluiu-se 5 μΐ dos 50 μΐ de ADN eluido com 45 μΐ de água. Seguidamente sujeitou-se 12,5 μΐ ao ensaio HB14 para determinação da quantidade de ADN convertido com bissulfito e 20 μΐ para análise de sulfito. A mediana da recuperação de ADN para 887 amostras de plasma foi de 3,32 ng/ml na gama de 0 a 1109 ng/ml.

Ensaio HB14 (determinação da quantidade de ADN convertido com bissulfito): HB14 iniciador directo SEQ ID NO:4 5'-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3' HB14 iniciador inverso SEQ ID NO:5 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3' HB14 sonda TaqMan SEQ ID NO:6 5'-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1a-3'

Pipetaram-se as seguintes soluções conjuntamente e misturaram-se de acordo com a tabela 11.

Solução Concentração de Volume Concentração final solução-mãe Hybprobe Master Mix lOx 2 μΐ lx MgCl2 25 mmol/1 1,6 μΐ 3,000 mmol/1 Mistura de iniciadores 10 μιηοΐ/ΐ (cada) 1,8 μΐ 0,900 μιηοΐ/ΐ (cada) Sonda TaqMan 10 μπιοΐ/ΐ 0,6 μΐ 0,300 μιηοΐ/ΐ (cada) Água 1,5 μΐ — ADN convertido com bissulfito 12,5 μΐ -- Volume total de reacção 20 μΐ

Tabela 11: Preparação da mistura de PCR para o ensaio HB14. (Hybprobe Master Mix significa as sondas de hibridação principais de ADN para LightCycler FastStart (Roche Cat N° 2 239 272).) 116 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Efectuou-se PCR numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche) de acordo com as condições especificadas na tabela 12. 1 Activação 95 ° C 10 min 2 Desnaturação 95°C 15 s 3 Hibridação/extensão e detecção O o O 45 s 5 Ciclos Repetiram-se 45 vezes as etapas 2 a 3 4 Arrefecimento O 0 n 30 s

Tabela 12: Condições dos ciclos de PCR para o ensaio HB14 numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche).

Análise de sulfito:

Mediu-se o sulfito residual em amostras diluidas de ADN convertido com bissulfito utilizando o ensaio de célula de sulfito (Merck Cat N° 1.14394.0001). Preparou-se uma curva padrão de sulfito na gama de 100 mg/1 a 0,78 mg/1 de sulfito de sódio anidro (Na2S03, M = 126, 04 g/mol) em Tris 0,1 mol/1, EDTA 0,1 mmol/1. Preparou-se o agente de detecção colocando uma micro-espátula de nivel cinza (na tampa do frasco de S03-1K) de reagente numa célula reaccional, fechou-se cuidadosamente e agitou-se vigorosamente (ou agitou-se suavemente com vortex 3 vezes durante 5 s) até o reagente estar completamente dissolvido.

As medições de sulfito foram efectuadas numa placa de 96 poços. O volume final foi de 100 μΐ. Adicionou-se, a 30 μΐ de água em poços de uma placa de fundo transparente, 20 μΐ da aliquota diluida de ADN convertido com bissulfito. Para os padrões, pipetaram-se 50 μΐ dos padrões de sulfito para a placa de fundo transparente. Seguidamente adicionou-se 50 μΐ de reagente de sulfito Merck a cada poço. Para as amostras em branco, adicionou-se 50 μΐ de água a 50 μΐ do reagente de sulfito Merck. Leu-se a placa a 412 nm num leitor de placas Spectramax Plus (Molecular Devices). Os dados foram analisados com o utilitário SOFTMax PRO 4.0. 117 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Exemplo 7. Amplificação do genoma completo de ADN com bissulfito

Exemplo 7a. Amplificação do genoma completo de ADN com bissulfito por utilização de ligase de ADN em cadeia simples CircLigase.

Misturou-se 15 μΐ do ADN tratado com bissulfito e purificado do exemplo 6 com 2 μΐ de tampão de reacção de CircLigase lOx (Epicenter® Biotechnologies), 1 μΐ de solução de ATP 1 mmol/1 e 2 μΐ de ligase de ADN em cadeia simples CircLigase 5 U/μΙ (Epicenter® Biotechnologies). Incubou-se a mistura de ligação durante lha 60°C, antes de aquecer a 80°C durante 10 min para inactivar a enzima ligase. Após aquecimento a 95°C durante 3 min, armazena-se em gelo.

Para amplificação, adiciona-se 10 μΐ de tampão de amostra do kit de amplificação de molde de sequenciação de ADN TempliPhi™/7cit de amplificação TempliPhi™ 100/500 (GE Healthcare) e uma mistura preparada de fresco de 18 μΐ de tampão de reacção do kit TempliPhi™ e 2 μΐ de ADN polimerase Phi29 do kit TempliPhi™ a 10 μΐ da mistura de ligação. Após incubação durante 16 h a 30°C, inactiva-se a ADN polimerase Phi29 por aquecimento durante 10 min a 65°C. A quantidade de ADN convertido com bissulfito amplificado pode ser determinada de acordo com o ensaio HB14 tal como descrito no exemplo 6b. Seguidamente misturou-se 10 μΐ da mistura reaccional de amplificação inactivada com 2,5 μΐ de água. Esta mistura é então aplicada no ensaio HB14. A eficácia da amplificação do genoma completo de ADN tratado com bissulfito pode ser determinada por cálculo da razão entre a concentração determinada de ADN convertido com bissulfito após amplificação de genoma completo e 15 vezes a concentração determinada de ADN convertido com bissulfito antes de amplificação de genoma completo (consultar o exemplo 6b) . O factor 15 é assim determinado pela quantidade equivalente de ADN convertido com bissulfito eluido aplicado ao ensaio HB14 antes de amplificação do genoma completo e a quantidade equivalente de ADN convertido com bissulfito eluido aplicado ao ensaio HB14 após amplificação de genoma completo. Caso se 118 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ utilizem outros volumes, um perito na especialidade sabe como calcular o factor correspondente. A quantidade de ADN total é determinada conformemente. Em vez do ensaio HB14 utiliza-se o ensaio de ADN genómico CFF1 do exemplo 5. Um perito na especialidade sabe como ajustar o procedimento para determinação do ADN convertido com bissulfito para o ensaio de ADN genómico CFF1.

Para verificar se a razão original entre ADN metilado e não metilado não mudou, efectua-se um ensaio que é especifico para um determinado padrão de metilação. Tal ensaio é por exemplo o ensaio HM 17378.71LC no exemplo 8. Assim, sujeitam-se quantidades equivalentes de ADN convertido com bissulfito antes e após amplificação ao referido ensaio. Uma vez mais, um perito na especialidade sabe como ajustar convenientemente o procedimento especificado anteriormente para a determinação da razão de ADN convertido com bissulfito antes e após amplificação, para determinar a razão de ADN que representa um determinado padrão de metilação antes e após amplificação de genoma completo.

Exemplo 7b. Amplificação de genoma completo de ADN com bissulfito por utilização de nucleotidilo terminal transferase.

Generalidades:

Para amplificação de genoma completo de ADN convertido com bissulfito efectuaram-se as seguintes etapas: 1. Fragmentação do ADN humano utilizando enzimas de restrição de ADN. 2. Adição de uma cauda (adição de uma sequência poli-dA) às extremidades 3' dos fragmentos de ADN com nucleotidilo terminal transferase (TdT). 3. Conversão de todas as citosinas não metiladas a uracilos por tratamento com bissulfito e subsequente purificação (incluindo dessulfonação). 4. Amplificação linear do ADN convertido com bissulfito através de uma reacção de extensão de iniciador com 119 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ iniciadores complementares à cauda ligada (iniciadores poli-dT) 5. Quantificação da quantidade de ADN resultante através de PCR em tempo real (quantidade total de ADN pelo ensaio CFF1, quantidade de ADN convertido com bissulfito pelo ensaio HB14)

Realização: 0 planeamento experimental detalhado apresenta-se na tabela 13. Efectuaram-se seis reacções diferentes compreendendo a utilização das duas diferentes endonucleases de restrição de ADN Stu I e .BseRI, bem como dos respectivos controlos. "^'^'•^..Ileacção n° Etapa " — I II III IV V VI Fragmentação StuI StuI BseRI BseRI X X Inserção de cauda TdT + dATP dATP TdT + dATP dATP TdT + dATP dATP Conversão de ADN Tratamento com bissulfito e purificação Amplificação Reacção de extensão de iniciador Quantificação Quantificação por PCR em tempo real

Tabela 13: Condições experimentais

As etapas individuais são efectuadas de acordo com as seguintes condições: 1. Fragmentação: A restrição enzimática do ADN genómico humano (Roche) é efectuada num volume total de 40 μΐ que consiste de 1 pg ADN, 4 μΐ de lOx tampão NE 2 (New England Biolabs) e 5 unidades das enzimas de restrição StuI ou BseRI, respectivamente. Os controlos negativos (reacções V e VI) não contêm qualquer enzima de restrição. As reacções foram incubadas durante 2 horas a 37°C. 2. Adição de cauda: A adição de cauda ao ADN fragmentado com uma sequência poli-dA é efectuada utilizando nucleotidilo terminal 120 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ transferase (TdT, New England Biolabs) na presença de dATP. Os controlo negativos não foram tratados com TdT. A reacção é efectuada num volume de 50 μΐ que consiste de 40 μΐ da reacção de fragmentação, 1 μΐ lOx tampão NE 4 (New England Biolabs) , C0CI2 0,25 mmol/1, dATP 50 pmol/l (Fermentas) e 2 unidades de TdT (omitido nos controlos negativos respectivos (reacções II, IV e VI)) . As misturas foram incubadas 30 min a 37°C e finalmente inactivadas por aquecimento a 70°C durante 10 min. 3. Conversão de ADN com bissulfito:

Converteram-se as citosinas não metiladas a uracilos de acordo com concretizações e métodos aqui descritos. Sujeitam-se as misturas reaccionais completas (cada com 50 μΐ) da reacção de adição de cauda ao tratamento com bissulfito e purificação (incluindo dessulfonação). Após conversão com bissulfito, recupera-se o ADN num volume de 50 μΐ. 4. Amplificação linear: A amplificação de genoma completo do ADN de bissulfito através de uma reacção de extensão de iniciador é efectuada num volume de 50 μΐ contendo 25 μΐ do ADN convertido com bissulfito (tal como descrito na etapa 3.), 2 U de Taq polimerase Hotstar (Qiagen), 25 pmol de iniciador (dT2s) , lx tampão de PCR (Qiagen), cada dNTP 0,2 mmol/1 (Fermentas) . Os ciclos efectuam-se utilizando um Mastercycler (Eppendorf) com as seguintes condições: 15 min a 95°C e 15 ciclos a 96°C durante 1 min, 45°C durante 1 min e 72°C durante 5 min. 5. Quantificação por PCR em tempo real: O ADN convertido com bissulfito amplificado (1 μΐ de cada) é sujeito a PCR em tempo real quantitativo (ensaio génico GSTP1) utilizando uma máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche). As reacções efectuam-se num volume de 20 μΐ utilizando o kit de hibridação LightCycler FastStart DNA Master (Roche) contendo MgCl2 4 mmol/1, 0,15 pmol/l de cada sonda de detecção (SEQ ID NO: 7 5'-GTTTAAGGTTAAGTTTGGGTGTTTGTA-Fluo-3' e SEQ ID NO: 8 5'-Red64 0-TTTTGTTTTGTGTTAGGTTGTTTTTTAGG-fosfato-3' e 0,3 pmol/l de cada iniciador (iniciador directo SEQ ID NO: 9 5' -GGAGTGGAGGAAATTGAGAT-3', iniciador inverso SEQ ID NO:10 121 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 5'-CCACACAACAAATACTCAAAAC-3'). Efectuam-se 40 ciclos a 95°C durante 10 s, 56°C durante 30 s e 72°C durante 10 s após uma incubação inicial durante 10 min a 95°C. A quantificação é feita em triplicado.

Resultados:

Espera-se que nenhuma das reacções sem TdT (reacções II, IV e VI) apresente amplificação significativa de ADN convertido com bissulfito devido à ausência da cauda que actua como o local de ligação de iniciador. Devido à perda de aproximadamente 20% durante o tratamento com bissulfito e subsequente purificação, estas reacções proporcionam 0,8 yg de ADN convertido com bissulfito. Espera-se uma pequena amplificação na mistura reaccional V que não compreende qualquer endonuclease de restrição mas sim a transferase terminal. Tal é devido a fragmentação aleatória de um ADN genómico humano utilizado. Estes fragmentos também actuam como moldes para a TdT e podem subsequentemente ser amplificados. Assumindo uma perda de 20% durante a conversão com bissulfito e 90% de eficácia da amplificação linear em cada ciclo de amplificação, espera-se que as misturas reaccionais I e III proporcionem 10,8 yg de ADN convertido com bissulfito amplificado.

Discussão:

Espera-se que o método para amplificação de genoma completo através de uma transferase terminal seja útil para amplificar ADN convertido com bissulfito até aproximadamente 10 vezes. Pode conseguir-se uma amplificação maior por aumento do número de ciclos de amplificação durante as reacções de extensão de iniciador. Utilizando iniciadores poli-dT, tal é limitado devido à presença de vários locais poli-dA e poli-dT dentro do genoma de bissulfito humano. Estes locais podem ser amplificados de uma forma exponencial (PCR), prejudicando assim a amplificação linear. Esta limitação pode ser evitada por aplicação de dCTP metilado em 5' (d5meCTP) na reacção de inserção de cauda e um iniciador poli-G na reacção de amplificação. Dado que as caudas poli-5meC resultantes não são afectadas pela reacção com bissulfito, estas caudas representam os únicos locais possíveis de ligação de iniciador 122 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ para iniciadores poli-G no genoma de bissulfito humano. Assim pode evitar-se uma amplificação de PCR. Pode conseguir-se outro melhoramento deste método utilizando um iniciador compreendendo as bases residuais do local de reconhecimento da endonuclease de restrição. Tal leva a uma especificidade do iniciador aumentada evitando mais uma vez uma amplificação de PCR não desejada.

Exemplo 8. Quantificação do padrão de metilação definido pelo ensaio HM 17378.71LC.

Para a quantificação de um determinado padrão de metilação utilizou-se um ensaio adequado para medição do referido padrão de metilação. Por exemplo, tal ensaio é o ensaio HM 17378.71LC.

Assim, sujeitaram-se 12,5 μΐ do ADN convertido com bissulfito eluído do exemplo 6 ao ensaio HM 17378.71LC. Os 12,5 μΐ de ADN eluído do exemplo 6 correspondem ao equivalente de 1,9 ml da amostra remota original, tal como sujeita ao exemplo 2. Alternativamente, também se pode utilizar uma quantidade equivalente de ADN amplificado convertido com bissulfito do exemplo 7. 0 ensaio foi efectuado em triplicado.

Ensaio HM 17378.71LC

Sonda HM 17378.71LC TaqMan Flour LC SEQ ID NO:11 5'- GTtCGAAATGATtttATttAGtTGC-FL -3'

Sonda HM 17378.71LC TaqMan LC 640 Red SEQ ID NO:12 5'- LCred640-CGTTGAtCGCGGGGTtC-PH -3'

Iniciador directo HM 17378.71LC SEQ ID NO:13 5'-GtAGtAGttAGtttAGtAtttAttTT -3'

Iniciador inverso HM 17378.71LC SEQ ID NO:14 5'- CCCACCAaCCATCATaT -3'

Oligonucleótido bloqueador HM 17378.71LC SEQ ID NO:15 5' C AT C AT a T C Aa AC C C C AC Aa T C AAC AC AC AaC -1NV - 3' (INV representa uma extremidade 3' invertida) 123 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Uma letra maiúscula pequena representa uma citosina convertida com bissulfito na sequência dos iniciadores, sondas e oligonucleótido bloqueador citados.

Pipetaram-se conjuntamente e misturaram-se as seguintes soluções de acordo com a tabela 14.

Solução concentração de solução-mãe Volume concentração final Hybprobe Master Mix lOx 2 μΐ lx MgCl2 Mistura de iniciadores 25 mmol/1 10 pmol/l (cada) 2 μΐ 0,6 μΐ 3,50 mmol/1 0,30 pmol/l (cada) Oligonucleótido bloqueador 100 pmol/l 0, 8 μΐ 4,00 pmol/l mistura de sondas de detecção 10 pmol/l (cada) 0,3 μΐ 0,15 μσιοΐ/ΐ (cada) água -- 1,8 μΐ -- ADN convertido com bissulfito 12,5 μΐ Volume reaccional total 20 μΐ Tabela 14: Preparação da mistura de PCR para o ensaio HM 17378.71LC. (Hybprobe Master Mix significa as sondas de hibridação para o LightCycler FastStart DNA Master (Roche Cat N° 2 239 272).)

Efectuou-se PCR numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche) de acordo com as condições especificadas na tabela 15. 1 Activação 95°C 10 min 2 Desnaturação 95°C 10 s 3 Hibridação e detecção 56°C 30 s 4 Extensão 72 °C 10 s 5 Ciclos Repetiram-se 50 vezes as etapas 2 a 4 6 Arrefecimento 4^ O o O 30 s

Tabela 15: Condições dos ciclos de PCR para o ensaio HM 17378.71LC numa máquina de PCR LightCycler 2.0 (Roche). 124 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Exemplo 9. Realização de um estudo Generalidades:

Recolheram-se 895 amostras de plasma de acordo com o exemplo la e analisaram-se de acordo com o seguinte: Efectuou-se um fluxograma dos exemplos 2 a 6 e 8 em dois estudos. Isolou-se ADN de amostras de plasma, juntaram-se e concentraram-se antes de se tratar com bissulfito e purificar. Subsequentemente quantificou-se o ADN convertido com bissulfito de acordo com o ensaio HB14 descrito no exemplo 6. Quantificou-se o padrão de metilação definido pelo ensaio HM17378.71LC (consultar exemplo 7). Estimou-se um limite de detecção a 90% do ensaio HM17278.71LC de 21 pg por uma diluição em série de ADN metilado (tratado SSS1) numa matriz de base de 50 ng de ADN de sangue (ADN genómico humano Roche). No primeiro estudo adicionou-se 1,6 ml de plasma equivalente de ADN por reacção de PCR e estudou-se cada amostra de plasma em duplicado. No segundo estudo, adicionou-se 1,9 ml de plasma equivalente de ADN por reacção de PCR e estudou-se em triplicado. Efectuou-se o fluxograma completo em formato de lote em paralelo. Estudaram-se amostras de controlo positivo e negativo em cada etapa do processo para determinar as flutuações por lote de processo. Com base numa fase de calibração de processo, calibraram-se as etapas de extracção MagNaPure e de tratamento com bissulfito e excluiram-se de análise os lotes nos quais as concentrações de ADN de controlo estavam fora da gama de 3 desvios padrão.

Realização:

Cada amostra remota foi processada no intervalo de três dias. No primeiro dia isolou-se ADN e concentrou-se. No segundo dia, tratou-se o ADN com bissulfito e purificou-se. Finalmente, no terceiro dia efectuou-se um ensaio HM 17378.71LC em triplicado, um ensaio CFF1 de ADN genómico e um ensaio HB14 para uma determinada amostra. Todos os dias i) efectuaram-se 12 experiências com o instrumento MagNA Pure LC com 4 instrumentos que funcionaram três vezes em paralelo e concentraram-se as placas com ADN eluido em pares; ii) sujeitaram-se três lotes de amostras a tratamento com bissulfito e purificação após tratamento com bissulfito, em 125 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ que cada lote compreende 20 amostras do ADN isolado com MagNA Pure com um controlo positivo adicional e um controlo negativo adicional (num total de 66 amostras incluindo os controlos); e iii) efectuaram-se cinco conjuntos de experiências de PCR em tempo real em PCR LightCycler (1 conjunto de ensaio CFF1 de ADN genómico, 1 conjunto de ensaio HB14 e 3 conjuntos de ensaio HM 17378.71LC).

Análise estatística:

Como exemplo do primeiro estudo, a mediana de recuperação de ADN para os controlos positivos foi de 2,8 ng/ml para isolamento de ADN. A mediana de recuperação de ADN correspondente para 895 amostras de plasma foi de 3,86 ng/ml, numa gama de 0 a 1086 ng/ml. Para tratamento com bissulfito e purificação, a mediana de recuperação de ADN para 887 amostras de plasma foi de 3,32 ng/ml na gama de 0 a 1109 ng/ml. O primeiro estudo foi concebido para determinar o método óptimo de replicar a agregação e o valor limiar (valor de corte) para classificação positivo/negativo. O segundo estudo foi concebido para validar o ensaio e a regra de classificação utilizando um conjunto de amostras independentes. Os números de amostras foram pré-determinados para proporcionaram intervalos de confiança aceitáveis. No primeiro estudo, efectuou-se uma análise em duplicado do padrão de metilação definido pelo ensaio HM17378.71LC em cada amostra de plasma. Considerou-se uma amostra positiva se ambas as réplicas fossem positivas. Calculou-se a sensibilidade e especificidade com os dados derivados do segundo estudo por aplicação de um valor limiar (valor de corte) determinado no primeiro estudo. Devido à elevada especificidade do marcador (valor limiar ou de corte para o ensaio HM17378.71LC) determinada no primeiro estudo, determinou-se um limiar qualitativo de 0 pg de ADN compreendendo o padrão de metilação definido pelo ensaio HM17378.71LC. No segundo estudo, efectuou-se uma análise em triplicado em cada amostra de plasma de doente. Considerou-se que uma amostra foi positiva se pelo menos 2 das 3 réplicas fossem positivas. As curvas de amplificação foram analisadas automaticamente e por dois revisores independentes para validar curvas verdadeiras. As discrepâncias foram resolvidas por um terceiro revisor independente. 126 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Resultados : A sensibilidade foi primeiramente determinada no primeiro estudo e seguidamente no segundo estudo. Os resultados dos dois estudos encontram-se resumidos nas tabelas 16 e 17. A sensibilidade em ambos os estudos estava na gama de 50 a 57% para detecção de cancro colorrectal. Estes resultados indicam que o marcador definido pelo ensaio HM17378.71LC e o valor limiar (valor de corte) seleccionado é também altamente especifico (94-95%) em indivíduos assintomáticos com mais de 50 anos de idade. A especificidade foi também elevada (92%) quando se incluíram doentes com condições tais como gastrite, artrite, infecção respiratória e cancros em etapas iniciais diferentes de cancro colorrectal. Demonstrou-se que o marcador detecta cancro colorrectal com sensibilidade semelhante independentemente do estágio de progressão ou localização da lesão no cólon, contrariamente a ensaios fecais, tais como FOBT e iFOBT que demonstraram diminuição da sensibilidade para cancro colorrectal proximal e cancros em estágio inicial. A adesão dos doentes ao tratamento e o desempenho das actuais estratégias de rastreio limitam a eficácia dos ensaios actualmente disponíveis no mercado. Um ensaio baseado em sangue de fácil execução para a detecção precoce de cancro colorrectal seguido por colonoscopia para indivíduos positivos tem o potencial de ser uma ferramenta muito eficaz para reduzir a mortalidade desta doença.

Grupo Positivos/ Total ensaiado % [IC a 95%] CRC 72/127 57 [47, 66] CRC de estágio I 3/11 27 [6,61] CRC de estágio II 4/15 27 [8,55] CRC de estágio III 35/59 59 [46, 77] CRC de estágio IV 27/36 75 [58,88] Saudáveis 10/233 4 [2,8] Todos os controlos 28/365 8 [ - ]

Tabela 16: Resultados do primeiro estudo. 127 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

Grupo N° positivos/total ensaiado % [IC a 95%] CRC 104/209 50 [43,57] CRC de estágio I 24/51 47 [33, 62] CRC de estágio II 29/65 45 [32,57] CRC de estágio III 30/52 58 [43,71] CRC de estágio IV 14/26 54 [33,73] Saudáveis 5/83 6 [2,14] Todos os controlos 19/239 8 [5,12]

Tabela 17: Resultados do segundo estudo.

Listagem de sequências <110> Epigenomics AG; Ballhause, Matthias; Berlin, Kurt; devos, Theo; Dietrich, Dimo; Liebenberg, Volker; Lofton-Day cathy; Lograsso, Joe; Maas, Jennifer; Model, Fabian; Schuster, Matthias; Sledziewski, Andrew; Tetzner, Reimo

<120> MÉTODO PARA PROPORCIONAR FRAGMENTOS DE ADN DERIVADOS DE UMA AMOSTRA REMOTA <130> 47675-184 <140> <141> 2006.04.17 <150> US 60/672 242 <151> 2005.04.15 <150> US 60/676 997 <151> 2005.05.02 <150> US 60/697 521 <151> 2005.07.08 <150> US 60/723 602 <151> 2005.10.04 <150> US 60/780 248 <151> 2006.03.08 <160> 15 128 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 1 taagagtaat aatggatgga tgatg <210> 2 <211> 17 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 2 cctcccatct cccttcc 17 <210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atggatgaag aaagaaagga tgagt <210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 4 tggtgatgga ggaggtttag taagt <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 5 aaccaataaa acctactcct <210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 25 25 25 30 accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 27 129 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ

<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 7 gtttaaggtt aagtttgggt gtttgta 27

<210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 8 ttttgttttg tgttaggttg ttttttagg 29

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 9 ggagtggagg aaattgagat 20

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 10 ccacacaaca aatactcaaa ac 22

<210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 11 gttcgaaatg attttattta gttgc 25

<210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 12 17 cgttgatcgc ggggttc 130 ΕΡ 1 871 912/ΡΤ <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0> 13 gtagtagtta gtttagtatt tatttt 26 <210> 14 <211> 17 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0> 14 cccaccaacc atcatat 17 <210 > 15 <211> 32 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0> 15 catcatatca aaccccacaa tcaacacaca

Lisboa, 2012-05-15

Claims (11)

1. ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar o estado de metilação de pelo menos uma citosina, um padrão de metilação, ou ambos no ADN de uma amostra de sangue, uma amostra de plasma, uma amostra de soro ou uma amostra de urina de um indivíduo, compreendendo: (a) proporcionar a referida amostra compreendendo ADN (b) isolar ADN da referida amostra; (c) tratar o ADN isolado com um reagente de bissulfito na presença de um agente de captura de radicais; (d) determinar o estado de metilação de pelo menos uma citosina no ADN da referida amostra, em que cada citosina se localiza numa posição definida e/ou de um padrão de metilação no ADN da referido amostra com uma polimerase com base numa reacção de amplificação e/ou um ensaio baseado em amplificação, em que o referido ADN tratado com bissulfito da etapa (c) é sujeito directamente à etapa (d) sem qualquer dessulfonação anterior e em que a dessulfonação ocorre durante o aumento de temperatura inicial da reacção de amplificação.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o ADN da referida amostra é caracterizado em que menos do que 5%, menos do que 3%, menos do que 1% ou menos do que 0,1% do ADN é derivado de um cancro da próstata ou um cancro de um órgão do tracto digestivo.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é caracterizada por compreender menos de 60 ng de ADN em 1 ml de amostra ou menos de 10 ng de ADN em 1 ml de amostra.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a perda de ADN é minimizada através de pelo menos um método seleccionado do grupo que consiste de: um método de isolamento de ADN caracterizado por elevado rendimento de ADN; elevada precisão de pipetagem; reutilização do dispositivo de pipetagem; e reutilização do dispositivo que entrou em contacto com o ADN. ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 2/4
5. 5. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é plasma e a obtenção da amostra de plasma compreende um ou mais dos seguintes: (a) obter sangue de um indivíduo; (b) adicionar EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ao sangue compreendendo mistura suave; (d) transferir o plasma para um novo recipiente; (e) centrifugar o plasma; (f) transferir o plasma re-centrifugado para um novo recipiente; (g) arrefecer a amostra compreendendo plasma; (h) congelar, armazenar ou transportar uma amostra compreendendo plasma; e (i) efectuar o proporcionamento da referida amostra de sangue obtido de um indivíduo a congelamento do plasma recentrifugado correspondente no intervalo de cerca de 8 horas.
6. 6. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é urina e o proporcionar da amostra de urina compreende um ou mais dos seguintes: (a) efectuar palpação da próstata, massagem da próstata ou ambas desde o centro da próstata até ao lado esquerdo da próstata, até ao lado direito da próstata ou ambos; (b) recolher a urina esvaziada; (c) adicionar EDTA à urina; em que o EDTA tem um pH de cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 7,5, cerca de 8,0, cerca de 8,5, cerca de 9,0, ou cerca de 10; (d) arrefecer a amostra compreendendo urina; (e) congelar, armazenar ou transportar a amostra compreendendo urina; e (f) efectuar o proporcionamento da amostra de urina por colheita da urina esvaziada até congelamento da mistura correspondente de urina-EDTA no intervalo de cerca de 120 min. ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 3/4
7. 7. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é dividida em diferentes subamostras subsequentemente a proporcionar a referida amostra e/ou em que a referida amostra ou pelo menos uma componente da referida amostra é concentrada após proporcionar a referida amostra.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que a concentração compreende ultrafiltração, redução de volume ou ambas.
9. 9. Método da reivindicação 1, em que o isolamento de ADN compreende um ou mais dos seguintes: tratar a referida amostra com uma protease; tratar a referida amostra com pelo menos um reagente ou solução de degradação de proteína; pôr o ADN da referida amostra em contacto com um dispositivo de purificação de ADN; lavar o ADN no dispositivo de purificação de ADN; e recuperar o ADN do dispositivo de purificação de ADN.
10. 10. Método da reivindicação 1, em que tratar ADN com um reagente de bissulfito compreende: misturar cerca de 10 a cerca de 250 μΐ de uma solução compreendendo ADN com cerca de 45 a cerca de 750 μΐ de solução de bissulfito, em que a solução de bissulfito tem um pH na gama de cerca de 5,45 a cerca de 5,50 compreendendo cerca de 4,83 a cerca de 4,93 mol/1 de hidrogenossulfito; adicionar cerca de 5 a cerca de 500 μΐ de uma solução orgânica de agente de captura de radicais, em que a solução orgânica de agente de captura de radicais compreende um solvente orgânico e cerca de 10 a cerca de 750 mmol/1 de ácido p-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico; e aplicar um protocolo de temperatura durante cerca de 2 a cerca de 18 h, em que a reacção é efectuada numa gama de temperatura de cerca de 0 a cerca de 80°C com cerca de 2 a cerca de 5 aumentos de temperatura adicionais, em cada caso durante cerca de 0,5 a cerca de 10 min, a uma temperatura de cerca de 85 a cerca de 100°C incluindo um aumento inicial de temperatura para uma temperatura de cerca de 85 a cerca de 100°C.
11. 11. Método da reivindicação 1, em que a determinação do estado de metilação de pelo menos uma citosina, um padrão de metilação, ou ambos permite o diagnóstico, proporcionar um prognóstico, prever resposta a tratamento, determinar uma predisposição, prever uma predisposição, determinar a ΕΡ 1 871 912/ΡΤ 4/4 progressão, prever a progressão, classificar a gravidade, determinar o estágio de uma condição, classificar uma condição, ou caracterizar uma doença proliferativa ou cancro de um órgão do tracto digestivo, de preferência de cancro colorrectal ou cancro da próstata. Lisboa, 2012-05-15