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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert
sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Die Vervollständigung der Sequenzierung des
menschlichen Genoms hat den Bedarf hervorgehoben, die Regulation
und Kontrolle von Genen weiter zu verstehen. Die Zelle übt viele
Niveaus an Kontrolle auf die Gene aus, jedoch ist für die Hauptzahl
von Genen der wichtigste regulatorische Mechanismus die transkriptionelle
Kontrolle.
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Es gibt viele Mechanismen der Genregulation,
die verschiedene Familien von Proteinen, Genen und regulatorischen
Sequenzen einschließen.
Die Transkription von eukaryontischen Genen durch Polymerasen erfordert
die vorangehende Zusammensetzung von Transkriptionsfaktoren an der
Promotorregion des Gens. Dieser Faktoren binden in einer spezifischen
Reihenfolge, beginnend mit der Bindung von TFIID an die TATA-Box.
Dieses stellt mehrere Phasen zur Verfügung, an denen eine Genregulation
stattfinden kann und von vielen eukaryontischen Gen-Regulationsmechanismen
wird geglaubt, daß sie
durch Ausüben
von positiver oder negativer Kontrolle auf diese Prozesse funktionieren.
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Gen-regulatorische Proteine erkennen
kurze Abschnitte von doppelsträngiger
DNA. Hunderte solcher Sequenzen wurden über das Genom hinweg identifiziert,
zum Beispiel Sp1, das die Sequenz GGGCGG (in doppelsträngiger Form)
erkennt, GATA-1 das die Sequenz TGATAG (in doppelsträngiger Form)
erkennt und Oct-1 das ATGCAAAT (in doppelsträngiger Form) erkennt. Gen-regulatorische
Proteine enthalten strukturelle Motive, die in der Lage sind, die
regulatorischen Sequenzen zu erkennen, unter der Verwendung der
einmaligen Muster von Wasserstoffbrücken Donoren, Wasserstoffbrücken Akzeptoren
und hydrophoben Bereichen in der großen und kleinen Grube der DNA.
Mehrere Familien von strukturellen Motiven sind bekannt, einschließlich des
Helix-Turn-Helix-Motivs, das aus Aminosäuren zusammengesetzt ist, das
Zinkfingermotiv, das eine oder mehrere Moleküle von Zink als die strukturelle
Komponente verwendet, den Leucin "Zipper" und das Helix-Loop-Helix-Motiv.
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Andere Mechanismen der Genregulation
schließen
die Chromatin-Verpackung ein. Chromatin, das stark kompaktiert ist,
ist nicht zur Transkription in der Lage und in einer weniger kompensierten
Form ist die DNA immer noch auf Nucleosomen gepackt. Nucleosomen,
die am Standpunkt der Transkriptionsstelle positioniert sind, blockieren
die Zusammensetzung von Transkriptionsfaktoren, und diese müssen entfernt
werden. Zusätzlich
erfordert die Gen-Transkription
eine extensive Windung und Entwindung der supercoiled DNA. Obwohl
die genauen Mechanismen der DNA Verpackung nicht vollständig verstanden
sind schließen
Sie die Verwendung einer Vielzahl von Helikasen, Gyrasen und Topoisomerasen
ein. Eine weitere Diskussion der Genregulation kann in Standard-molekularbiologischen
Lehrbüchern,
zum Beispiel Alberts et. al. 'Molecular
Biology of the cell' Garland
Publishing gefunden werden.
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Unterbrechungen von Gen-Regulationswegen
wurden mit einer großen
Vielzahl von Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich, jedoch
nicht begrenzt auf:
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- Schwere kombinierte Immundefizienz-Erkrankung: Misaki et.
al. 'Gene-Transferred
Oligoclonal T Cells Predominantly Persist in Peripheral Blood from
an Adenosine Deaminase-Deficient
Patient during Gene Therapy.' Mol
Ther 2001 Jan;3(1):24-27.
- Cardiale Beschädigung:
Pieper et. al. 'Myocardial
postischemic injury is reduced by polyADPripose polymerase-1 gene
disruption.' Mol
Med 2000 Apr;6(4):271-82
- Entzündungsantwort:
Lekstrom-Himes J, Xanthopoulos KG 'CCAAT/enhancer binding protein epsilon
is critical for effective neutrophil-mediated response to inflammatory
challenge.' Blood
1999 May 1;93(9):3096-105.
- Hämophilie
B: Crossley M, Brownlee GG 'Disruption
of a C/EBP binding site in the factor IX promoter is associated
with haemophilia B.' Nature
1990 May 31;345(6274):444-6.
- Werner Syndrom: Li B, Comai L 'Requirements for the nucleoytic processing
of DNA ends by the Werner syndrome protein:Ku70/80 complex.' J Biol Chem 2001
Jan 4.
- Asthma: Nakamura et. al. 'Gene
expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic
asthma.' J Allergy
Clin Immunol 1999 Feb;103(2 Pt 1):215-22.
- HDR Syndrom: Van Esch et. al. 'GATA3 haplo-insufficiency causes human
HDR syndrome.' Nature
2000 Jul 27;406(6794):419-22.
- Congenitale Herzdefekte: Srivastava D 'HAND proteins: molecular mediators of
cardiac development and congenital heart disease.' Trends Cardiovasc
Med 1999 Jan-Feb;9(1-2):11-8.
- Saethre-Chotzen Syndrom: El Ghouzzi et. al. 'Mutations within or upstream of the
basic helix-loop-helix domain of the TWIST gene are specific to
Saethre-Chotzen syndrome.' Eur
J Hum Genet 1999 Jan;7(1):27-33.
- Nierenerkrankung: Morello et. al. 'Regulation of glomerular basement membrane
collagen expression by LMX1B contributes to renal disease in nail
patella syndrome.' Nat
Genet. 2001 Feb;27(2):205-208.
- Präeklampsie:
Rajakumar et. al. 'Selective
Overexpression of the Hypoxia-Inducible Transcription Factor, HIF-2alpha,
in Placentas from Women with Preeclampsia.' Biol Reprod. 2001 Feb;64(2):499-506.
- Ogata et. al. 'Inducible
expression of basic transcription factor-binding protein 2 (BTEB2),
a member of zinc finger family of transcription factors, in cardiac
allograft vascular disease.' Transplantation.
2000 Dec 15;70(11):1653-6.
- Colorectaler Krebs: Rask et. al. 'Increased expression of the transcription
factors CCAAT-enhancer
binding protein-beta (C/EBBeta) and C/EBzeta (CHOP)correlate with
invasiveness of human colorectal cancer.' Int J Cancer. 2000 May 1;86(3):337-43.
- Schilddrüsenkrebs:
Kebebew et. al. 'The
helix-loop-helix transcription factor, Id-1, is overexpressed in
medullary thyroid cancer' Surgery.
2000 Dec;128(6):952-7.
- Speiseröhrenkrebs:
Saeki et. al. 'Expression
of ets-1 transcription factor is correlated with penetrating tumor progression
in patients with squamous cell carcinoma of the esophagus' Cancer. 2000 Oct
15;89(8):1670-6.
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Die Vielfalt von Mechanismen, die
an der Regulation von Genen beteiligt sind, stellt ein alternatives Niveau
zur Verfügung,
auf das Therapien und Diagnosen für Erkrankungen abzielen sollte.
Insbesondere kann dies für
Erkrankungen relevant sein, bei denen augenblickliche Therapien
unerwünschte
Nebenwirkungen aufweisen können
oder dabei versagen, eine effektive Behandlung zur Verfügung zu
stellen. Für
Krebspatienten stellen solche Verfahren einen beträchtlichen
Vorteil über
herkömmliche
Verfahren dar, wie zum Beispiel Chemotherapie mit ihrem massiven
Nebenwirkungen, die manchmal zu nicht akzeptabler Morbidität führen oder zum
Tode des Patienten führen.
In der Praxis begrenzen diese unerwünschten Nebenwirkungen, die
mit Krebstherapien assoziiert sind, häufig die Behandlung, die einem
Patienten helfen könnte.
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Eine globale Analyse des Status der
Gen-regulatorischen Mechanismen würde eine Basis für die Entwicklung
von geeigneten und spezifischen Therapien für die vielen Erkrankungen zur
Verfügung
stellen, die mit der Genregulation assoziiert sind. Solche Analyse
kann auf eine Gen-spezifische Weise durchgeführt werden, basierend auf den
Ergebnissen von Geneexpression, zum Beispiel der DNA Microarray
Analyse von mRNA Expression oder proteomischer Analyse. Der nächste Schritt
wäre es
dann, auf die kausalen Faktoren zu schauen, die an früheren Phasen
in den regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die DNA Methylierung stellt
ein neues Niveau an Information zur Verfügung, auf dem das Genom analysiert
werden kann.
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung
identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber
hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, voll-ständig
verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA
in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur
an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V,
Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates
a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995
May 19;157(1-2):261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Aufgabe der
Erfindung
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Im Hinblick auf das oben Gesagte
ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte
DNA von Genen zur Verfügung
zu stellen, die mit der Genregulation assoziiert sind, sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches
sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, besonders
eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass genetische
und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, zur Diagnose
und/oder der Therapie von mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen besonders
eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert
sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der
Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene enthält, gelöst. In der Tabelle sind nach
den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen
die jeweiligen Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die
die dazugehörigen
Gensequenzen als einmalig definieren. GenBank am National Institute
of Health wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet
Adresse www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
der Genregulation assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz
der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch
in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des
13-mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren
ist es bevorzugt, daß das
Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt
ist ein Set, das für
jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 224 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und
dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene oder Abschnitten davon eingesetzt werden
können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 224 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene) dienen. Mit diesen Sonden ist die
Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen,
die mit der Genregulation assoziiert sind möglich. Das Set von Oligomeren
kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs)
in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von
der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase
gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein,
dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit der Genregulation
assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit der Genregulation
assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der
Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle
1 aufgelisteten Gene), Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren
sowie einer Anleitung zur Durchführung
und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit
im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind durch Analyse
von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen
zur Verfügung,
das folgende Schritte umfaßt:
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In einem ersten Verfahrensschritt
wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, daß an der
5'-Position unmethylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien,
Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch
zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der
Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene) aufgelisteten Basensequenzen sind.
Die Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet,
daß sie
kein CpG Dinukleotid enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der
Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, daß die
erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer
eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der
Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
und visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der
Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens
10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers aus betrachtet.
Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere
umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen
der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Ver fahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben
sowie ein erfindungsgemäßes Kit
sollen zur Diagnose und/oder Therapie einer mit der Genregulation
assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern von
Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt
ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie
bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel
der Diagnose und/oder der Therapie von HIV-Infektion, neurodegenerativer
Erkrankungen, Graft-versus-host Erkrankung, Alterung, Glomerularen
Erkrankungen, Lewis-Körper
Erkrankung, Arthritis, Arteriosklerose, festen Tumoren und Krebsarten.
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Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementäre Sequenzen
und/oder die chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene können für die Diagnose
und/oder der Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet
werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums zur Diagnose und/oder der Therapie von Krankheiten,
die mit der Genregulation assoziiert sind durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, wobei das
Diagnostikum und/oder das Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist,
daß mindestens
eine Nukleinsäure,
gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
zu dessen Herstellung verwendet wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit der Genregulation assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, wobei das
Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist,
das es mindestens eine Nu kleinsäure
gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit der Genregulation assoziiert sind mit einem anderen Satz
genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden
können
und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Unter "stringenten
Hybridisierungsbedingungen" sind
solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei
60°C in
2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer
geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit
der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden
erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit der Genregulation assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin
erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Invertionen,
Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders
bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche
Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die
Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren
nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung
korreliert.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezug auf die beigefügte Figur
weiter verdeutlicht werden, ohne hierauf eingeschränkt zu werden.
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1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächengebundenes
Oligonukleotid. Probe I stammt von pilocytischem Astrocytom (Hirntumor)-Gewebe
und Probe II stammt von Grad II Astrocytom (Hirntumor)-Gewebe. Die
Fluoreszenz an einem Punkt zeigt die Hybridisierung des Amplifikats
an. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt an, daß die Methylierung
an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung an ein
TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine
Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird.
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Sequenz ID No. 1 bis Sequenz
ID No. 224
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Die Sequenz ID Nos. 1 bis 224 zeigen
Sequenzen von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind,
gemäß der Erfindung.
Sequenzen, die ungerade Sequenznummern haben (z.B., Seq. ID No.
1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten
genomischen DNAs von verschiedenen Genen, die mit der Genregulation
assoziiert sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern aufweisen
(z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der
chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit der Genregulation assoziiert sind, die komplementär zu den
voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
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Sequence ID Nos. 225 to
228
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Seq. ID No. 225 bis Seq. ID No. 228
zeigen spezifische Oligonukleotid-Sequenzen, wie in Beispiel 1 verwendet.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
in dem mit der Genregulation assoziierten Gen p53
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment eines Gens, das mit der Genregulation assoziiert ist, in
diesem Fall p53, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, daß alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden,
daß eine
hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht,
während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA (Seq ID No. 221) dient dann
dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt
verdünnt
man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen
Lösung.
Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30
min, 90-100 °C)
bei alkalischem pH-Wert durchgeführt.
Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe
in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.
Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens p53 analysiert. Dazu
wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GTGATAAGGGTTGTGAAGGA
(Seq. ID No. 225) und CAAAAACTTACCCAATCCAA (Seq. ID No. 226) ein
definiertes Fragment der Länge
595 by amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein
vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung
einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise AACCCCTACGAAACTCCT
(Seq. ID No. 227), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position
401 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts
beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden,
die für
die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA
an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfaßt
das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base
d.h. die Sequenz AACCCCTACAAAACTCCT (Seq. ID No. 228). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Die Analyse wurde an zwei Gewebeproben
durchgeführt,
Probe 1 aus pilocytischem Astrocytom (Hirntumor) Gewebe und Probe
2 aus Grad II Astrocytom (Hirntumor) Gewebe. Aus den Ergebnissen
(1) kann gesehen werden,
daß Probe
eines an Position 401 des Amplifikat methyliert war, wohingegen
Probe 2 ein Gemisch von sowohl methylierten als auch nicht methylierten
Zellen an derselben Position aufwies.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen herzustellen,
bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster
einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen.
Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die
so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert
und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden
Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung
einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch
Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist.
Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist
möglich,
und die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für die folgenden
Erkrankungen durchgeführt
werden: Schwere kombinierte Immundefizienz-Erkrankung, kardiale
Erkrankungen, Entzündungsantwort,
Hämophilie,
Werner Syndrom, Asthma, HDR Syndrom, Saethre-Chotzen Syndrom, renale
Erkrankung, Präeclampsie,
Graft-versus-Host Erkrankung, solide Tumore und Krebsarten.
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Tabelle 1
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Auflistung von besonders bevorzugten
Genen der vorliegenden Erfindung, die mit der Genregulation assoziiert
sind.
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