EP1294951A2 - Diagnose von mit dem immunsystem assoziierten krankheiten - Google Patents

Diagnose von mit dem immunsystem assoziierten krankheiten

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EP1294951A2
EP1294951A2 EP01967115A EP01967115A EP1294951A2 EP 1294951 A2 EP1294951 A2 EP 1294951A2 EP 01967115 A EP01967115 A EP 01967115A EP 01967115 A EP01967115 A EP 01967115A EP 1294951 A2 EP1294951 A2 EP 1294951A2
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EP
European Patent Office
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dna
seq
immune system
genes
sequences
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01967115A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Olek
Christian Piepenbrock
Kurt Berlin
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Publication date
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Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Priority to DE20121966U priority Critical patent/DE20121966U1/de
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA oligomers and a method for the diagnosis and / or therapy of diseases which are related to the genetic and / or epigenetic parameters of genes associated with the immune system and in particular their methylation status.
  • the immune system recognizes microorganisms (bacteria, viruses, fungi) that have entered the body and makes them harmless.
  • the so-called non-specific, humoral defense system is generally directed against invading pathogens and tries to kill them regardless of the type of pathogen and the triggering disease.
  • the second system is the specific, cellular defense system. It works much more specifically against pathogens by forming antibodies according to the structure of the respective pathogen, with the help of which the disease is overcome. Certain pathogens are recognized when they reappear and eliminated more quickly; in some cases the organism is immune for life.
  • Immune diseases do not only refer to diseases that are caused by pathogens and that a healthy immune system can usually successfully combat. In many chronic diseases such as rheumatism or asthma, a so-called immunodeficiency is significantly involved in the disease process. Last but not least, stress and other psychological stresses have a negative impact on the immune system. Diseases that are caused by incorrect or overreactions of an intact immune system are called allergies, such as. B. Asthma (Kuo ML, Huang JL, Yeh KW, Li PS, Hsieh KH. Evaluation of Thl / Th2 ratio and cytokine production profile during acute exacerbation and convalescence in asthmatic children. Ann Allergy Asthma Immunol.
  • autoimmune diseases such as B. Artheriosklerose (Gordon PA, George J, Khamashta MA, Harats D, Hughes G, Shoenfeld Y. Atherosclerosis and autoimmunity. Lupus. 2001; 10 (4): 249-52), systemic lupus erythematosus (Lorenz HM , Herrmann M, Winkler T, Gaipl U, Kalden JR. Role of apoptosis in autoimmunity. Apoptosis.
  • Type I Diabetes mellitus (Not T, Tommasini A, Tonini G, Buratti E , Pocecco M, Tortul C, Valussi M, Crichiutti G, Berti I, Trevisiol C, Azzoni E, Neri E, Torre G, Martelossi S, Soban M, Lenhardt A, Cattin L, Ventura A. Undiagnosed celiac disease and risk of autoimmune disorders in subjects with Type I diabetes mellitus. Dia- betologia. 2001 Feb; 44 (2): 151-5). Also between the immune system and cancers such as anemia (Bron D, Meuleman N, Mascaux C. Biological basis of anemia. Semin Oncol.
  • pancreatic cancer Shiura T, Tsutsumi S , Hosouchi Y, Kojima T, Kon Y, Yonezu M, Kuwano H. Clinical significance of soluble form of HLA class I molecule in Japanese patients with pancreatic cancer. Hum Immunol. 2001 Jun; 62 (6): 615-9), chronic myeloid leukemia (Jahagirdar BN, Miller JS, Shet A, Versaillie CM. Novel therapies for chronic myelogenous leukemia. Exp Hematol. 2001 May; 29 (5): 543-56), acute lymphoblastic leukemia (Velders MP, ter Horst SA , KITA WM.
  • Cancer cells show changed properties compared to normal body cells and often also form other proteins that play a crucial role in the recognition of 'self' and 'foreign' in the immune system. They are presented in the body to the T-killer cells, bound to MHC molecules on the outside of cells. The T-killer cells control whether the peptides come from normal proteins. If a peptide is not from a normal, When the body's own protein is cut out, the T cells initiate the destruction of the cell, which displays the modified or foreign peptide.
  • Alzheimer's disease Smits HA, van Beelen AJ, de Vos NM, Rijsmus A, van der Bruggen T, Verhoef J, van Muiswinkel FL, Nottet HS.Activation of human macrophages by amyloid - beta is attenuated by astrocytes J Immunol. 2001 Jun l; 166 (ll): 6869-76), acquired immune deficiency syndrome (Aids) (McGrath KM, Hoffman NG, Resch W, Nelson JA, Swanstrom R. Using HIV-1 sequence variability to explore virus biology. Virus Res.
  • progressive focal epilpsy Panomareva EN, Khmara ME, Nedz'ved 'MK, Drakina SA, Kolomiets AG, Protas II [The clinical characteristics of progressive focal epilepsy with a herpetic etiology].
  • Lik Sprava. 2000 Jul-Aug; (5): 106-10 primarily sclerosing cholangitis 1: Bo X, Broome U, Remberger M, Sumitran-Holgersson S. Tumor necrosis factor alpha impairs function of liver derived T lymphocytes and natural killer cells in patients with primary sclerosing cholangitis. Good.
  • Neurofibromatosis (Gerosa PL, Spinelli M, Giussani G, Vai C, Fontana A, Canepari C. Neurofibromatosis (NF1) and neuroleprosy: immunoreaction against pathologic Schwann-cells. Physiopathoge - netic observations.Minerva Med. 2001 A ⁇ r; 92 (2): 89-97).
  • Treatment methods for immune diseases focus primarily on allergies, autoimmune diseases and the development of vaccines in order to have stronger immune responses against pathogenic organisms and cancer (Driver AM, Bazan JF, Papathanasiou P, Nelms KA, Goodnow CC. A genomic view of immunology. Narure. 2001 Feb 15; 409 (6822): 836-8).
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of a PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • a relatively new and the most frequently used method for the investigation of DNA for 5-methylcytosine is based on the specific reaction of bisulfite with cytosine, which is converted into uracil after alkaline hydrolysis, which corresponds to the thymidine in its base pairing behavior.
  • 5-methylcytosine is not modified under these conditions.
  • the original DNA is thus converted in such a way that methylcytosine, which originally cannot be distinguished from the cytosine by its hybridization behavior, can now be detected by "normal" molecular biological techniques as the only remaining cytosine, for example by amplification and hybridization or sequencing.
  • the bisulfite technique has so far been used with a few exceptions (e.g. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5 (2): 94-8) used only in research. However, short, specific pieces of a known gene are always amplified after bisulfite treatment and either completely sequenced (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet.
  • Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5 'region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Genes. 1995 May 19; 157 (1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.
  • Fluorescence-labeled probes have been used in many cases for scanning an immobilized DNA array.
  • the simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5'-OH of the respective probe is particularly suitable for fluorescent labels.
  • the fluorescence of the hybridized probes is detected, for example, using a confocal microscope.
  • the dyes Cy3 and Cy5, among many others, are commercially available.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is one very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60 (20): 2299-301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • MALDI-TOF spectrometry is ideal for the analysis of peptides and proteins.
  • the analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57).
  • the sensitivity for nucleic acids is about 100 times worse than for peptides and decreases disproportionately with increasing fragment size. For nucleic acids that have a backbone that is often negatively charged, the ionization process through the matrix is much more inefficient.
  • MALDI-TOF spectrometry the choice of the matrix plays an eminently important role.
  • Genonic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • the present invention is intended to provide oligonucleotides and / or PNA oligomers for the detection of cytosine methylations and a method which is particularly suitable for the diagnosis and / or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with the immune system.
  • the invention is based on the finding that cytosine methylation patterns in particular are particularly suitable for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with the immune system.
  • the invention is based on the knowledge that genetic and epigenetic parameters and in particular the cytosine methylation pattern of genes associated with the immune system are particularly suitable for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with the immune system.
  • this object is achieved by a nucleic acid comprising an at least 18 base long sequence section of the chemically pretreated DNA of genes associated with the immune system according to one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.2420 and their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1 solved.
  • the database numbers accession numbers
  • GenBank was used as the underlying database, the Internet address of which is http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • the chemically modified nucleic acid has so far not been associated with the determination of genetic and epigenetic parameters.
  • the object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or Oligomer for the detection of the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, comprising at least one base sequence with a length of at least 13 nucleotides dissolved, which is linked to a chemically pretreated DNA of genes associated with the immune system according to one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.2420 and hybridized to their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1.
  • the oligomer probes according to the invention represent important and effective tools which make it possible to determine the genetic and epigenetic parameters of genes associated with the immune system.
  • the base sequence of the oligomers preferably comprises at least one CpG dinucleotide.
  • the probes can also be in the form of a PNA (Peptide Nucleic Acid), which has particularly preferred pairing properties.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • Particularly preferred are oligonucleotides according to the invention, in which the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide from the 5 'end of the 13 mer, in the case of PNA oligomers it is preferred that the cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th - 6. Nucleotide from the 5 'end of the 9 mer.
  • the oligomers according to the invention are normally used in so-called sets which contain one of the sequences of Seq for each of the CpG dinucleotides.
  • ID No.l to Seq. ID No.2420 and to their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1 comprise at least one oligomer.
  • a set is preferred which comprises at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq ID No. 1 to Seq ID No.2420 and to their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1.
  • the invention provides a set of at least two oligonucleotides which, as so-called primer oligonucleotides, for the amplification of DNA sequences of one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.2420 and their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1 or sections thereof can be used.
  • At least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
  • the present invention further relates to a set of at least 10 n (Oligonucleotides and / or PNA oligomers), which are used to detect the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No. 1 to Seq. ID No.2420 and their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA -Oligomers according to Table 1) are used. With these probes the diagnosis and / or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with the immune system is possible.
  • the set of oligomers can also be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the chemically pretreated DNA of genes associated with the immune system according to one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.2420 and their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1 can be used.
  • SNPs single nucleotide polymorphis
  • an arrangement made of different oligonucleotides and / or PNA oligomers (a so-called "array") provided by the invention is also bound to a solid phase.
  • This array of different oligonucleotide and / or PNA oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the solid phase surface preferably consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • nitrocellulose and plastics such as nylon are also possible, which can be in the form of spheres or as resin matrices.
  • the invention therefore furthermore relates to a method for producing an array fixed on a carrier material for analysis in connection with diseases associated with the immune system, in which at least one oligomer according to the invention is coupled to a solid phase.
  • Methods for producing such arrays are known, for example, from US Pat. No. 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protective groups.
  • the invention further relates to a DNA chip for analysis in connection with diseases associated with the immune system, which comprises at least one nucleic acid according to the present invention.
  • DNA chips are known, for example, from US Pat. No. 5,837,832.
  • the present invention also relates to a kit which, for example, consists of a reagent containing bisulfite, a set of primer oligonucleotides comprising at least two oligonucleotides, the sequences of which each have at least an 18 base pair section of the base sequences listed in the appendix (Seq. ID No.
  • a kit in the sense of the invention can also contain only parts of the aforementioned components.
  • the invention furthermore provides a method for determining genetic and / or epigenetic parameters of genes associated with the immune system by analyzing cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, which comprises the following steps:
  • a genomic DNA sample is chemically treated in such a way that at the 5 'position unmethylated cytosine bases are converted into uracil, thymine or another base which is unlike cytosine in terms of hybridization behavior. This is understood below as chemical pretreatment.
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from the usual sources for DNA, such as cells or cell components, for example cell lines, biopsins, blood, sputum, stool, urine, brain-spinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from eyes, Gut, kidney, brain, heart, prostate, lung, chest or liver, histological slides or combinations thereof.
  • sources for DNA such as cells or cell components, for example cell lines, biopsins, blood, sputum, stool, urine, brain-spinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from eyes, Gut, kidney, brain, heart, prostate, lung, chest or liver, histological slides or combinations thereof.
  • the treatment of genomic DNA with bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which leads to a conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil or another base which is unlike the cytosine in base pairing behavior, is preferably used for this purpose.
  • Fragments are made from this chemically pretreated genomic DNA using sets of primer oligonucleotides according to the invention and one preferably heat-stable polymerase amplified. For statistical and practical considerations, more than ten different fragments that are 100-2000 base pairs long are preferably amplified.
  • the amplification of several DNA sections can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. The amplification is usually carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • the set of primer oligonucleotides comprises at least two oligonucleotides, the sequences of which are each reversely complementary or identical to a section of at least 18 base pairs in length in the appendix (Seq. ID No. 1 to Seq. ID No.2420 and their complementary ones Sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers are base sequences listed in Table 1).
  • the primer oligonucleotides are preferably characterized in that they contain no CpG dinucleotide.
  • At least one primer oligonucleotide is bound to a solid phase during the amplification.
  • the different oligonucleotides and / or PNA oligomer sequences can be arranged on a flat solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid, the solid phase surface preferably consisting of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold, other materials such as nitrocellulose or plastics can also be used.
  • the fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly detectable label. Markings in the form of fluorescent markings, radionuclides or detachable molecular fragments with typical mass, which can be detected in a mass spectrometer, are preferred, it being preferred that the fragments produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the detection can be carried out and visualized using matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or using electrospray mass spectrometry (ESI).
  • the amplificates obtained in the second process step are then added to a sentence of oligonucleotides and / or PNA probes which hybridize or to an array.
  • the hybridization is carried out in the manner given below.
  • the set used in the hybridization preferably consists of at least 10 oligonucleotide or PNA oligomer probes.
  • the amplificates serve as probes that hybridize to oligonucleotides previously bound to a solid phase. The non-hybridized fragments are then removed.
  • Said oligonucleotides comprise at least one base sequence with a length of 13 nucleotides, which is reverse complementary or identical to a section of the base sequences listed in the appendix, which contains at least one CpG dinucleotide.
  • the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide viewed from the 5 'end of the 13 mer.
  • Said PNA oligomers comprise at least one base sequence with a length of 9 nucleotides, which is reverse complementary or identical to a section of the base sequences listed in the appendix, which contains at least one CpG dinucleotide.
  • the cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th to 6th nucleotide as seen from the 5 'end of the 9 mer.
  • the non-hybridized amplificates are removed.
  • the hybridized amplificates are detected. It is preferred that labels attached to the amplificates can be identified at any position on the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • the labels of the amplified products are fluorescent labels, radionuclides or detachable molecular fragments with a typical mass, which can be detected in a mass spectrometer.
  • the detection of the amplified products, fragments of the amplified products or probes complementary to the amplified products in the mass spectrometer is preferred, the detection using matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or using electrospray mass spectrometry (ESI) can be carried out and visualized.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • ESI electrospray mass spectrometry
  • the fragments generated can have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the oligomers or arrays thereof according to the invention and a kit according to the invention are to be used for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with the immune system by analyzing methylation patterns of genes associated with the immune system. According to the invention, the use of the method for diagnosis and / or therapy of important genetic and / or epigenetic parameters within genes associated with the immune system is preferred.
  • the method according to the invention is used, for example, to diagnose and / or treat eye diseases, proliferative retinopathy, neovascular glaucoma, solid tumors, tissue inflammation, rheumatic arthritis, diabetic retinopathy, macular degeneration due to neovascularization, psoriasis, artheriosclerosis, inflammatory bowel disease, intestinal disorders, ulcerative bowel disease and cancer.
  • nucleic acids of Seq. ID No.l to Seq. ID No.2420 and their complementary sequences and / or oligonucleotide and / or PNA oligomers according to Table 1 can be used for the diagnosis and / or therapy of genetic and / or epigenetic parameters of genes associated with the immune system.
  • the present invention further relates to a method for producing a diagnostic and / or therapeutic for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with the immune system by analyzing methylation patterns of genes associated with the immune system, the diagnostic and / or therapeutic being characterized in that at least one nucleic acid, according to the present invention, optionally used together with suitable additives and auxiliaries for its production.
  • the present invention further relates to a diagnostic and / or therapeutic agent for diseases associated with the immune system by analyzing methylation patterns of genes associated with the immune system, which comprises at least one nucleic acid according to the invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries.
  • the present invention further relates to the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, in which the significant genetic and / or epigenetic parameters obtained by the invention are compared within genes associated with the immune system with another set of genetic and / or epigenetic parameters and the differences thus obtained serve as the basis for a diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals.
  • hybridization in the sense of the present invention is to be understood as binding to form a duplex structure of an oligonucleotide to a completely complementary sequence in the sense of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA.
  • Stringent hybridization conditions are to be understood as those conditions in which hybridization takes place at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C. in a lower buffer concentration and remains stable.
  • the term “functional variants” denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, which hybridize with the reference sequence under stringent conditions and which have an activity similar to the corresponding polypeptide according to the invention.
  • Genetic parameters in the sense of this invention are mutations and polymorphisms of genes associated with the immune system and sequences that are still required for its regulation.
  • insertions, deletions, point mutations, inversions and polymorphisms and particularly preferably SNPs (single nucleotide polymorphisms) are to be referred to as mutations.
  • Polymorphisms can also be insertions, deletions or inversions.
  • Epigenetic parameters in the sense of this invention are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of genes associated with the immune system and sequences further necessary for their regulation. Further epigenetic parameters are, for example, the acetylation of histones, which, however, cannot be analyzed directly with the method described, but again correlated with DNA methylation.
  • Sequences with odd sequence numbers each show different sequences of the chemically pretreated genomic DNAs from genes associated with the immune system.
  • Sequences with even sequence numbers eg Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) each show the sequences that are complementary to the different sequences (eg the sequence that is complementary to Seq. ID No. 1 is Seq. ID No.2 , to Seq. ID No.3 the complementary sequence Seq. ID No.4 etc.) of the chemically pretreated genomic DNAs of genes associated with the immune system.
  • Seq ID No. 2421 to Seq ID No. 2424 show sequences of oligonucleotides contained in the
  • Example 1 Performance of the methylation analysis in the gene associated with the immune system ESR1 (estrogen receptor)
  • the following example relates to a fragment of the ESR1 gene in which a specific CG position is to be examined for methylation.
  • a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a way that all of the cytosines that are not methylated at the 5-position of the base are changed in such a way that a base which is different with regard to the base pairing behavior is formed, while the base in the 5-position methylated cytosines remain unchanged.
  • bisulfite is used in the concentration range for the reaction, an addition takes place on the unmethylated cytosine bases.
  • a denaturing reagent or solvent and a radical scavenger must be present. Subsequent alkaline hydrolysis then leads to the conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil.
  • This converted DNA is used to detect methylated cytosines. Diluted in the second process step the treated DNA sample with water or an aqueous solution. Desulfonation of the DNA is then preferably carried out.
  • the DNA sample is amplified in a polymerase chain reaction, preferably with a heat-resistant DNA polymerase.
  • cytosines of the ESR1 gene are examined.
  • the specific primer oligonucleotides AGGGGGAATTAAATAGAAAGAG SEQ ID NO: 2421
  • CAATAAAACCATCCCAAATACT (SEQ ID NO: 2422) amplified a defined fragment with a length of 662 bp.
  • This amplificate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bound to a solid phase to form a duplex structure, for example TTTAATTTCGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2423) for detection of a methylated state and TTTAATTTTGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2424) for detection of not -methylated state, where the cytosine to be detected is at position 527 of the amplificate.
  • the detection of the hybridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescence-labeled primer oligonucleotides that were used for the amplification.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide occurs only if a methylated cytosine was present at this point in the bisulfite-treated DNA.
  • the methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product.
  • FIG. 1 a non-methylated status is shown for the oligomers in Figure A and a partially methylated status for the oligomers in Figure B.
  • methylation pattern In order to relate the methylation pattern to one of the diseases associated with the immune system, it is first necessary to examine the DNA methylation pattern of a group of sick and a group of healthy patients. These tests are carried out, for example, analogously to Example 1. The results thus obtained are stored in a database and the CpG dinucleotides, which are methylated differently between the two groups, by z. B. identified probes. Simultaneous analysis of the entire methylation status is also possible, and the patterns can e.g. by means of clustering analyzes, e.g. can be carried out by a computer.
  • Example 2 can be carried out, for example, for the following diseases: asthma, atherosclerosis, anemia, pancreatic carcinoma, acute myeloid leukemia, Alzheimer's disease, AIDS, epilepsy, neurofibromatosis.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenzen von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes von mit dem Immunsystem assoziierten Genen sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen.

Description

Diagnose von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten
Gebiet der Erfindung
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit den genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang stehen.
Stand der Technik
Sehr viele menschliche Erkrankungen stehen in. Zusammenhang mit dem Immunsystem. Das Immunsystem erkennt in den Körper eingerungene Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Pilze) und macht diese unschädlich. Man unterscheidet dabei zwei Systeme, die eng zusammenwirken. Das sogenannte unspezifische, humorale Abwehrsystem richtet sich ganz allgemein gegen eingedrungene Krankheitserreger und versucht - unabhängig von der Art der Erreger und der auslösenden Erkrankung - sie abzutöten. Das zweite System ist das spezifische, zelluläre Abwehrsystem. Es geht viel gezielter gegen Krankheitserreger vor, indem es, entsprechend dem Aufbau des jeweiligen Erregers, Antikörper bildet, mit deren Hilfe die Krankheit überwunden wird. Bestimmte Erreger werden bei erneutem Auftreten wiedererkannt und rascher beseitigt; in manchen Fällen ist der Organismus lebenslang immun. Immunerkrankungen beziehen sich jedoch nicht nur auf Krankheitsbilder, die von Erregern hervorgerufen werden und die ein gesundes Immunsystem in der Regel erfolgreich bekämpfen kann. Bei vielen chronischen Erkrankungen wie Rheuma oder Asthma ist ein sogenannter Immundefekt wesentlich am Krankheitsgeschehen beteiligt. Nicht zuletzt haben Streß und andere psychische Belastungen einen negativen Einfluß auf das Immunsystem. Krankheiten, die durch Fehl- oder Überreaktionen eines an sich intakten Immunsystems verursacht werden, werden unter den Überbegriffen Allergien, wie z. B. Asthma (Kuo ML, Huang JL, Yeh KW, Li PS, Hsieh KH. Evaluation of Thl/Th2 ratio and cytokine production profile during acute exacerbation and convalescence in asthmatic children. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001 Mar;86(3):272-6) und Autoimmunkrankheiten wie z. B. Artherioskle- rose (Gordon PA, George J, Khamashta MA, Harats D, Hughes G, Shoenfeld Y. Atheroscle- rosis and autoimmunity. Lupus. 2001;10(4):249-52), systemic lupus erythematosus (Lorenz HM, Herrmann M, Winkler T, Gaipl U, Kalden JR. Role of apoptosis in autoimmunity. Apoptosis. 2000 Nov;5(5):443-9) oder Typ I Diabetes mellitus (Not T, Tommasini A, Tonini G, Buratti E, Pocecco M, Tortul C, Valussi M, Crichiutti G, Berti I, Trevisiol C, Azzoni E, Neri E, Torre G, Martelossi S, Soban M, Lenhardt A, Cattin L, Ventura A. Undiagnosed coe- liac disease and risk of autoimmune disorders in subjects with Type I diabetes mellitus. Dia- betologia. 2001 Feb;44(2):151-5) zusammengefasst. Auch zwischen dem Immunsystem und Krebserkrankungen wie Anämie (Bron D, Meuleman N, Mascaux C. Biological basis of ane- mia. Semin Oncol. 2001 Apr;28(2 Suppl 8):l-6), Pankreaskarzinom (Shimura T, Tsutsumi S, Hosouchi Y, Kojima T, Kon Y, Yonezu M, Kuwano H. Clinical significance of soluble form of HLA class I molecule in Japanese patients with pancreatic cancer. Hum Immunol. 2001 Jun;62(6):615-9), chronische myeloische Leukämie (Jahagirdar BN, Miller JS, Shet A, Ver- faillie CM. Novel therapies for chronic myelogenous leukemia. Exp Hematol. 2001 May;29(5):543-56), akute lymphoblastische Leukämie (Velders MP, ter Horst SA, Käst WM. Prospect for immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2001 May;15(5):701-6) oder akute myeloische Leukämie (Harrison BD, Adams JA, Briggs M, Bre- reton ML, Yin JA. Stimulation of autologous proliferative and cytotoxic T-cell responses by "leukemic dendritic cells" derived from blast cells in acute myeloid leukemia. Blood. 2001 May 1;97(9):2764-71) bestehen zahlreiche Zusammenhänge. Die Zellen des menschlichen Immunsystems erkennen viele Tumorzellen als fremdartig und versuchen, sie anzugreifen. Dennoch ist bei Krebskranken die Körperabwehr nicht in der Lage, den Tumor zu zerstören. Krebszellen zeigen gegenüber normalen Körperzellen veränderte Eigenschaften und bilden häufig auch andere Eiweiße, die bei der Erkennung von 'Selbst' und 'Fremd' im Immunsystem eine entscheidende Rolle spielen. Sie werden im Körper den T-Killerzellen, gebunden an MHC-Moleküle an der Außenseite von Zellen, präsentiert. Die T-Killerzellen kontrollieren, ob die Peptide von normalen Eiweißen stammen. Ist ein Peptid nicht aus einem normalen, körpereigenen Eiweiß herausgeschnitten, leiten die T-Zellen die Vernichtung der Zelle ein, die das veränderte oder fremde Peptid zur Schau stellt.
Weitere Erkrankungen, die mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen sind die Alzheimer Erkrankung (Smits HA, van Beelen AJ, de Vos NM, Rijsmus A, van der Bruggen T, Verhoef J, van Muiswinkel FL, Nottet HS. Activation of human macrophages by amyloid- beta is attenuated by astrocytes J Immunol. 2001 Jun l;166(ll):6869-76), acquired immune deficiency syndrome (Aids) (McGrath KM, Hoffman NG, Resch W, Nelson JA, Swanstrom R. Using HIV-1 sequence variability to explore virus biology. Virus Res. 2001 Aug;76(2):137-60.), progressive fokale Epilpsy (Ponomareva EN, Khmara ME, Nedz'ved' MK, Drakina SA, Kolomiets AG, Protas II [The clinical characteristics of progressive focal epilepsy with a herpetic etiology]. Lik Sprava. 2000 Jul-Aug;(5):106-10), primär sklerosie- rende Cholangitis 1: Bo X, Broome U, Remberger M, Sumitran-Holgersson S. Tumour necro- sis factor alpha impairs function of liver derived T lymphocytes and natural killer cells in pa- tients with primary sclerosing cholangitis. Gut. 2001 Jul;49(l):131-41) oder Neurofibromato- se (Gerosa PL, Spinelli M, Giussani G, Vai C, Fontana A, Canepari C. Neurofibromatosis (NF1) and neuroleprosy: immunoreaction against pathologic Schwann-cells. Physiopathoge- netic observations. Minerva Med. 2001 Aρr;92(2): 89-97).
Behandlungsmethoden bei Immunerkrankungen konzentrieren sich vor allem auf Allergien, Autoimmunerkrankungen sowie die Entwicklung von Vaccinen, um stärkere Immunantworten gegen pathogene Organismen und Krebs (Fahrer AM, Bazan JF, Papathanasiou P, Nelms KA, Goodnow CC. A genomic view of immunology. Narure. 2001 Feb 15;409(6822):836-8) zu stimulieren.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifϊkation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren. Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader- Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5- methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/ Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(l-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8): 1367-73). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genonische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung soll Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-Methylierungsmuster zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
Beschreibung
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin- Methylierungsmuster von mit dem Immunsystem assoziierten Genen zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 gelöst. In der Tabelle werden hinter den aufgeführten Genbezeichnungen jeweils die Datenbank-Nummern (Accession-Nummern) aufgeführt, welche die zugehörigen Gensequenzen als einzigartig definieren. Als zugrunde liegende Datenbank wurde GenBank verwendet, deren Internet-Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov lautet.
Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomeren gemäß Tabelle 1 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Parameter von mit dem Immunsystem assoziierten Genen erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. - 9. Nukleotid vom 5'- Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA- Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No.l bis Seq ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfasst.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA- Oligomere gemäß Tabelle 1 verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfasst:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5 '-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA- Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'- Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.
Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb von mit dem Immunsystem assoziierten Genen.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose und/oder Therapie von Augenerkrankungen, prolieferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren, Gewebsentzündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen, ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 können für die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Therapeutikums zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit dem Immunsystem assoziierten Gene, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikums dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikums zur von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von mit dem Immunsystem assoziierten Genen mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Mit dem Begriff ''funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.
"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymorphismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.
"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 2420
Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 1, 3, 5, ...) zeigen jeweils unterschiedliche Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit dem Immunsystem assoziierten Genen. Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) zeigen jeweils die zu den unterschiedlichen Sequenzen, komplementären Sequenzen (z.B ist die zu Seq. ID No.l komplementäre Sequenz Seq. ID No.2, zu Seq. ID No.3 die komplementäre Sequenz Seq. ID No.4 usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit dem Immunsystem assoziierten Genen.
Seq ID No. 2421 bis Seq ID No. 2424
Seq ID No. 2421 bis Seq ID No. 2424 zeigen Sequenzen von Oligonukleotiden, die in den
Beispielen verwendet wurden.
Beispiel 1: Durchführung der Methylierungsanalyse in dem mit dem Immunsystem assoziierten Gen ESR1 (Estrogen Receptor)
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens ESR1, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, daß alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, daß eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens ESR1 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden AGGGGGAATTAAATAGAAAGAG (SEQ ID NO: 2421) und
CAATAAAACCATCCCAAATACT (SEQ ID NO: 2422) ein definiertes Fragment der Länge 662 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TTTAATTTCGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2423) zum Nachweis für einen methylierten Zustand und TTTAATTTTGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2424) zum Nachweis für einen nicht-methylierten Zustand, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 527 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt. Im vorliegenden Fall (Figur 1) werden für die Oligomere in Abbildung A ein nicht methylierter Status und für die Oligomere in Abbildung B ein teilweise methylierter Status nachgewiesen.
Beispiel 2: Diagnose von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen
Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankung durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA- Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Patienten. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind, durch z. B. markierte Sonden identifiziert. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z.B. mittels Clustering- Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.
Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten gezielt zu mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
Das Beispiel 2 lässt sich zum Beispiel für die folgenden Erkrankungen ausführen: Asthm, Artheriosklerose, Anämie, Pankreaskarzinom, akute myeloische Leukämie, Alzheimer Erkrankung, Aids, Epilepsie, Neurofibromatose.
Tabelle 1
Liste der bevorzugten Gene, die mit dem Immunsystem assoziiert sind in bezug auf die Erfindung

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 und zu deren komplementären Sequenzen.
2. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Sequenzen der Gene A1BG (T80683), C4A (K02403), C4BPAL2 (X81360), CD1A (M27735), CD20 (L23418), CDR2 (M63256), CENPB (X05299), COL11A2 (U32169), CR1L (M31230), CYP2A (X06401), EBF (AA504812), ERCC2 (L47234), ESD (M13450), ETV4 (D12765), FCGR2C (M90737), FLG (M24355), FN1 (M10905), ITGA1 (X68742), ITGAD (U40274), KRT4 (X07695), KSR (U43586), LY9 (L42621), MEKK1 (U29671), MFAP4 (L38486), MMP18 (Y08622), MYCL1 (M19720), NOTCH1 (M73980), PDE7A (L12052), PIK3R1 (M61906), SLC9A1 (M81768), TCF3 (M31222), TCRA (M12959), TCRB (K02779), TCRG (M27331), TLR5 (U08888), TNFSF11 (AF013171), UBC (AB009010), ZNF121 (M99593), ZRK (L08961), ALPPL2 (NM_031313), AHSG (NM_001622), FCGR3A (NM_000569), FUT3 (NM_000149), IL1R2 (NM_004633), IL2RB (NM_ 000878), LHB (NM_000894), MDH2 (NM_005918), SLC11A2 (NM_000617), OMG (NM_002544), PIK3CA (NM_006218), TPM1 (NM_000366), TUB (NM_003320), ABAT (NM_000663), ACADL (NM_001608), ACO1 (NM_002197), ADAMIO (NM_001110), ADD1 (NM_014189), ADH4 (NM_000670), ADRA2C (NM_000683), AGA (NM_000027), AGTR2 (NM_000686), AKT1 (NM_005163), ALDH6 (NM_000693), AMPH (NM_001635), ANXA4 (NM_001153), APBA2 (NM_005503), APC (NM_000038), APOA2 (NM_001643), ARHGAP1 (NM_004308), ATOX1 (NM_004045), ATP2B2 (NM_001683), ATP4B (NM_000705), ATR (NM_001184), AUH (NM_001698), AXL (NM_001699), BCL2 (NM_000633), BENE (NM_005434), BID (NM_001196), BMI1 (NM_005180), BN51T (NM_001722), BUBI (NM_004336), C1R (NM_001733), C4BPB (NM_000716), C5R1 (NM_001736), CASP3 (NM_004346), CASP7 (NM_001227), CBFB (NM_001755), CCR4 (NM_005508), CD151 (NM_004357), CD36L1 (NM_005505), CD4 (NM_000616), CD81 (NM_004356), CDH12 (NM_004061), CDW52 (NM_001803), CEL (NM_001807), CES1 (NM_001266), CGA (NM_000735), CHS1 (NM_000081), CLDN3 (NM_001306), CNK (NM_004073), CSF2RA (NM_006140), CTSK (NM_000396), CX3CR1 (NM_001337), CYBB (NM_000397), CYP11A (NM_000781), DCC (NM_005215), DFFB (NM_004402), DOCK1 (NM M380), DPYD (NM_000110), ELAVL2 (NM_004432), ELAVL4 (NM_021952), EPB41 (NM_004437), EPHA3 (NM_005233), EPHX2 (NM_001979), EPS15 (NMJXH981), ETV6 (NM M987), F2 (NM_000506), F8A (NM H2151), FABP6 (NM_001445), FADD (NM_003824), FANGE (NM_021922), FCAR (NM_002000), FGA (NM_021871), FGB (NM_005141), FGFR3 (NM_000142), FGG (NM_000509), HFL3 (NM_005666), FOXO1A (NM_002015), ADAM2 (NM_001464), FUCA1 (NM_000147), FUT2 (NM_000511), FY (NM_002036), GABRA5 (NM_000810), GABRA6 (NM_000811), GAS (NM_000805), GAS6 (NM_000820), GBA (NM_000157), GFI1 (NM_005263), GH2 (NM_002059), GHR (NM_000163), GIF (NM_005142), GNAQ (NM_002072), GP9 (NM_000174), GPR15 (NM_005290), GPR30 (NM_001505), GRB14 (NM_004490), GRIK1 (NM_000830), GUCY2D (NM_000180), HADHA (NM_000182), NRG1 (NM_013964), HIVEP1 (NM_002114), HLALS (NM_001531), HLCS (NM_000411), HMX1 (NM_018942), HNRPD (NM_002138), HSA277165 (NM_018411), HRG (NM_000412), HSPG2 (NM_005529), HTN3 (NM_000200), HTR2A (NM_000621), HTR7 (NM_000872), IFNA1 (NM_024013), IL10RA (NM_001558), IL1A (NM_000575), IL1B (NM_000576), IL1R1 (NM_000877), IL3RA (NM_002183), IL9 (NM_000590), ILF1 (NM_004514), ILF2 (NM_004515), SCYB10 (NM_001565), INPP5D (NM_005541), ITGAX (NM_000887), ITGB1 (NM_002211), ITGB3 (NM_000212), ITGB5 (NM_002213), ITGB7 (NM_000889), ITK (NM_005546), KCNJ3 (NM_002239), KPNAl (NM_002264), LECT2 (NM_002302), LEPR (NM_002303), LPA (NM_005577), KCNH2 (NM_000238), LSP1 (NM_002339), LTF (NM_002343), MAB21L1 (NM_005584), MAL (NM_002371), MASP1 (NM_001879), MCF2 (NM_005369), MAP3K3 (NM_002401), MMP16 (NM_022564), MMP17 (NM_016155), MMP23A (NM_004659), MMP7 (NM_002423), MYC (NM_002467), NAGA (NM_000262), NAT2 (NM__000015)5 NDUFS2 (NM_004550), NEB (NM_004543), NEUl (NM_000434), NFATC4 (NM_004554), NFE2L2 (NM__006164), NFRKB (NM_006165), NGFB (NM_002506), NTF3 (NM_002527), NUMAl (NM_006185), TNRCll (NM_005120), SLC22A1L (NM_002555), DUSP2 (NM_004418), PAFAH2 (NM_000437), PAPPA (NM_002581), PCM1 (NM_006197), PCTK1 (NM_006201), PDE4A (NM_006202), PDE4B (NM_002600), PEX10 (NM_002617), SERPINB9 (NM_004155), PIGA (NM_002641), PLAGL1 (NM_002656), POU2AF1 (NM_006235), PRKG1 (NM_006258), MAPK10 (NM_002753), MAPK9 (NM_002752), PROP1 (NM_006261), PSD (NM_002779), PTK2B (NM_004103), PTN (NM_002825), PTPN13 (NM_006264), PTPN6 (NM_002831), PTPRD (NM_002839), PTPRG (NM_002841), QDPR (NM_000320), RAC3 (NM_005052), RELA (NM_021975), REQ (NM_006268), RMSA1 (NM_002932), RSN (NM_002956), S100A7 (NM_002963), S100A8 (NM )02964), IQGAP1 (NM_003870), SCN1B (NM_001037), SCN5A (NM_000335), SCNN1G (NM_001039), SCYA14 (NM_004166), SCYA7 (NM_006273), SDHC (NM_003001), SELPLG (NM_003006), SFTPA2 (NM_006926), SGSH (NM_000199), SHMT2 (NM_005412), MYH11 (NM_002474), SNRPN (NM_003097), SOAT1 (NM_003101), SORL1 (NM_003105), SPP1 (NM_000582), SSTR1 (NM_001049), STATI2 (NM_003877), STX1B (NM_003163), TCF8 (NM_030751), TCP1 (NM_030752), TF (NM_001063), TGFBI (NM_000358), TGFBR3 (NM_003243), TGM2 (NM_004613), TLR1 (NM_003263), TM4SF7 (NM_003271), TNFAIP6 (NM_007115), TNFRSF1A (NM_001065), TNFSF12 (NM_003809), TPH (NM_004179), TPI1 (NM__000365), TRAF2 (NM_021138), TRAF5 (NM_004619), TSTA3 (NM_003313), TTR (NM_000371), UBE1 (NM__003334), UBE2V2 (NM_003350), UMPK (NM_012474), UP (NM_003364), UPK1B (NM_006952), USP7 (NM_003470), VASP (NM_003370), VDR (NM_000376), NSEP1 (NM_004559), ZFP161 (NM_003409), AQP1 (NM_000385), BDKRB1 (NM_000710), F13A1 (NM_000129), und zu deren komplementären Sequenzen.
3. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 gemäß Anspruch 1 oder zu einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen hybridisiert.
4. Oligomer gemäß Anspruch 3, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst.
5. Oligomer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.
6. Ein Satz von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomeren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5.
7. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 6, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 gemäß Anspruch 1 oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen.
8. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 3, die als Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Sequenzen einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen oder Abschnitten davon.
9. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
10. Satz von Oligomersonden umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einer der Ansprüche 6 bis 9 zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß Anspruch 1 oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2.
11. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2, wobei mindestens ein Olignomer gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 an eine feste Phase gekoppelt wird.
12. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) nach Anspruch 11.
13. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
14. Array gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
15. DNA- und/oder PNA- Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.
16. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern zur Diagnose und/oder Therapie von bestehenden Erkrankungen oder der Prädisposition für bestimmte Erkrankungen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:
- in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;
- aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;
- Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden gemäß der Ansprüche 6 bis 7 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15; hybridisiert;
- die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und/oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.
29. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5.
30. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, eines Kits gemäß Anspruch 29, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, eines Satz von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Diagnose von Erkrankungen, die in Zusammenhang mit dem Immunsystem stehen.
31. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, eines Kits gemäß Anspruch 29, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, eines Satz von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Therapie von Erkrankungen, die in Zusammenhang mit dem Immunsystem stehen.
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