JP6924335B2 - 食道癌を検出するための組成物及びその使用 - Google Patents
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Description
1. 食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
MT1A遺伝子及びEPO遺伝子のうちの1種又は2種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸を含む組成物。
2. 前記MT1A遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 1に示される、項1に記載の組成物。
3. 前記EPO遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 3に示される、項1に記載の組成物。
4. 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子的ターゲット配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む、項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
5. 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む、項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
6. 標的遺伝子のターゲット配列の5位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
7. 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
8. 前記少なくとも9個のヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列、若しくはSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列であり、
前記少なくとも15個のヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO: 7の配列又はSEQ ID NO: 11の配列であり、
ブロッカーは、SEQ ID NO: 8の配列又はSEQ ID NO: 12の配列である、項7に記載の組成物。
9. 食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片を含むオリゴヌクレオチド。
10. 中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片をさらに含む、項9に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項10に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
SEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列を含むオリゴヌクレオチド。
13. SEQ ID NO: 7の配列をさらに含む、項12に記載のオリゴヌクレオチド。
14. SEQ ID NO: 8の配列をさらに含む、項13に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
SEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列を含むオリゴヌクレオチド。
16. SEQ ID NO: 11の配列をさらに含む、項15に記載のオリゴヌクレオチド。
17. SEQ ID NO: 12の配列をさらに含む、項16に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるMT1A遺伝子の使用。
19. 食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるEPO遺伝子の使用。
20. 項1〜8のいずれか1項に記載の組成物又は項9〜17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
21. 別の成分としてヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ及び前記DNAポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも1種をさらに含む、項20に記載のキット。
22. プロトコルをさらに含む、項20又は21に記載のキット。
23. 食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、項1〜8のいずれか1項に記載の組成物又は項9〜項17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
24. 前記食道癌をインビトロで検出するためのキットは、
1)標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むDNAサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップと、
2)前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
3)前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む方法により食道癌を検出する、項18、19及び23のいずれか1項に記載の使用。
25. 前記方法は、
検出対象生体サンプルのゲノムDNAを抽出するステップと、
抽出したゲノムDNAを試薬で処理して、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したDNAサンプルをDNAポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、DNA重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む、項24に記載の使用。
26. 前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項25に記載の使用。
27. 食道癌の検出方法であって、
標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むDNAサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む食道癌の検出方法。
28. 食道癌の検出方法であって、
検出対象生体サンプルのゲノムDNAを抽出するステップと、
抽出したゲノムDNAを試薬で処理して、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したDNAサンプルをDNAポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、DNA重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
29. 前記標的遺伝子はMT1A遺伝子及びEPO遺伝子のうちの1種又は2種である、項27又は28に記載の方法。
30. 前記MT1A遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 1に示される、項29に記載の方法。
31. 前記EPO遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 3に示される、項29に記載の方法。
32. 前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項28に記載の方法。
33. 前記プライマーは、
前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片である、項28に記載の方法。
33. 前記ブロッカーは非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーである、項28に記載の方法。
34. 前記プローブは、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片である、項28に記載の方法。
35. 前記プライマーはSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列、若しくはSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列である、項33に記載の方法。
36. 前記ブロッカーはSEQ ID NO: 8の配列又はSEQ ID NO: 12の配列である、項33に記載の方法。
37. 前記プローブはSEQ ID NO: 7の配列又はSEQ ID NO: 11の配列である、項34に記載の方法。
38. 食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
MT1A遺伝子及びEPO遺伝子のうちの1種又は2種である標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸と、
SNCG、即ちγシヌクレイン(γ−synuclein)である標的タンパク質の濃度を検出するための抗体と、を含む組成物。
39. 前記MT1A遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 1に示される、項38に記載の組成物。
40. 前記EPO遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 3に示される、項38に記載の組成物。
41. 前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む、項38〜40のいずれか1項に記載の組成物。
42. 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片をさらに含み、
前記断片は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む、項38〜41のいずれか1項に記載の組成物。
43. 標的遺伝子のターゲット配列の5位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、項38〜42のいずれか1項に記載の組成物。
44. 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項38〜43のいずれか1項に記載の組成物。
45. 前記少なくとも9個のヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列、若しくはSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列であり、
前記少なくとも15個のヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO: 7の配列又はSEQ ID NO: 11の配列であり、
ブロッカーは、SEQ ID NO: 8の配列又はSEQ ID NO: 12の配列である、項44に記載の組成物。
46. 標的タンパク質の濃度を検出するための試薬をさらに含み、前記試薬は酵素結合免疫吸着アッセイ試薬であり、たとえば、前記試薬は、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、SNCGプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、項38〜45のいずれか1項に記載の組成物。
47. 項38〜46のいずれか1項に記載の組成物又は項9〜17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
48. 別の成分としてヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ及び前記DNAポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも1種、及び
標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、SNCGプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、項47に記載のキット。
49. プロトコルをさらに含む、項47又は48前記的キット。
50. 食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、項38〜46のいずれか1項に記載の組成物又は項9〜項17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
51. 前記食道癌をインビトロで検出するためのキットは、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ1)と、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップ2)と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ3)と、を含む方法により食道癌を検出する、項18、19及び50のいずれか1項に記載の使用。
52. 前記方法は、
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離DNAを抽出するステップと、
抽出した遊離DNAを試薬で処理して、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したDNAサンプルをDNAポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、DNA重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
SNCG抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のSNCGの濃度を決定するステップと、を含む、項51に記載の使用。
53. 前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項52に記載の使用。
54. 食道癌の検出方法であって、
被験者から生体サンプルを採取するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む食道癌の検出方法。
55. 食道癌の検出方法であって、
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離DNAを抽出するステップと、
5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したDNAサンプルをDNAポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、DNA重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
SNCG抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のSNCGの濃度を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
56. 前記標的遺伝子はMT1A遺伝子及びEPO遺伝子のうちの1種又は2種であり、
前記標的タンパク質はSNCGである、項54又は55に記載の方法。
57. 前記MT1A遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 1に示される、項56に記載の方法。
58. 前記EPO遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 3に示される、項56に記載の方法。
59. 前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項55に記載の方法。
60.前記プライマーは、
前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列中の少なくとも9個のヌクレオチドの、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片である、項55に記載の方法。
61. 前記ブロッカーは非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーである、項55に記載の方法。
62. 前記プローブは、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 1又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片、及び/又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記SEQ ID NO: 3又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも15個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含む断片である、項55に記載の方法。
63. 前記プライマーはSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列、若しくはSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列である、項60に記載の方法。
64. 前記ブロッカーはSEQ ID NO: 8の配列又はSEQ ID NO: 12の配列である、項61に記載の方法。
65. 前記プローブはSEQ ID NO: 7の配列又はSEQ ID NO: 11の配列である、項62に記載の方法。
SEQ ID NO: 1
CACCCAGGGGAGCTCAGTGGACTGTGCGCCTTGCCTTTCTGCTGCGCAAAGCCCAGTCCAGGTCATCACCTCGGGCGGGGCGGACTCGGCTGGGCGGACTCAGCGGGGCGGGCGCAGGCGCAGGGCGGGTCCTTTGCGTCCGGCCCTCTTTCCCCTGACCATAAAAGCAGC
SEQ ID NO: 2
GCTGCTTTTATGGTCAGGGGAAAGAGGGCCGGACGCAAAGGACCCGCCCTGCGCCTGCGCCCGCCCCGCTGAGTCCGCCCAGCCGAGTCCGCCCCGCCCGAGGTGATGACCTGGACTGGGCTTTGCGCAGCAGAAAGGCAAGGCGCACAGTCCACTGAGCTCCCCTGGGTG
SEQ ID NO: 3
CGCGCACGCACACATGCAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGCAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCTGCGCTGCGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCGCTCTGCTCCGACACCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGGCCCCCGGTGTGGTCACCCGGCGCGCCCCAGGTCG
CGACCTGGGGCGCGCCGGGTGACCACACCGGGGGCCCTCATCCCGGGAAGCTCGGCGGTGCAGGGCCAGCCCCACGGGCCTGGAGGAGAGGGCGGCTGTCCAGGGGGCGCGGTGTCGGAGCAGAGCGGGCGCGGTGGCCCCGGTCCGGCTCCGGGAGGACAGCGCGGTGCGGCGCAGCGCAGCGAGCGGCCGGGGTGGCCCAGGGACTCTGCGGCTCTGGCCGGGGGTCGGGGCTGTTATCTGCATGTGTGCGTGCGCG
MT1Aプライマー F
SEQ ID NO: 5
CGGACGTAAAGGATTC
MT1Aプライマー R
SEQ ID NO: 6
GAAACGAACTCGACTAAACG
MT1Aプローブ
SEQ ID NO: 7
TGCGTTTGCGTTCGTTTCG
MT1Aブロッカー
SEQ ID NO: 8
CAAACTCAACTAAACAAACTCAACAAAACAAAC
EPOプライマー F
SEQ ID NO: 9
AGTCGTAGAGTTTTTGGGTT
EPOプライマー R
SEQ ID NO: 10
CAACGCGATACGACG
EPOプローブ
SEQ ID NO: 11
CGCAACGAACGACCGA
EPOブロッカー
SEQ ID NO: 12
GAGTTTTTGGGTTATTTTGGTTGTTTGTTG
MDVFKKGFSIAKEGVVGAVEKTKQGVTEAAEKTKEGVMYVGAKTKENVVQSVTSVAEKTKEQANAVSEAVVSSVNTVATKTVEEAENIAVTSGVVRKEDLRPSAPQQEGEASKEKEEVAEEAQSGGD
検出対象生体サンプル中の標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を分離するステップ1)と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ2)と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ3)と、を含む。
1)検出対象生体サンプルのゲノムDNAを抽出する。
2)ステップ1)で得たDNAサンプルを試薬で処理して、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の5位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が5位非メチル化シトシン塩基と異なり、且つ検出可能である。
3)ステップ2)で処理したDNAサンプルをDNAポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはDNA重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはDNA重合反応が生じないと、増幅させない。
4)プローブを用いて増幅産物を検出する。
5)前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ1)と、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップ2)と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ3)と、を含む。
1)被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離する。
2)血漿又は血清中の遊離DNAを抽出する。
3)ステップ2)で得た遊離DNAを試薬で処理して、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の5位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が5位非メチル化シトシン塩基と異なり、検出可能である。
4)ステップ3)で処理した遊離DNAをDNAポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはDNA重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはDNA重合反応が生じないと、増幅させない。
5)プローブを用いて増幅産物を検出する。
6)前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
7)SNCG抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のSNCGの濃度を決定する。
MT1Aプライマー F
SEQ ID NO: 5
CGGACGTAAAGGATTC
MT1Aプライマー R
SEQ ID NO: 6
GAAACGAACTCGACTAAACG
MT1Aプローブ
SEQ ID NO: 7
TGCGTTTGCGTTCGTTTCG
MT1Aブロッカー
SEQ ID NO: 8
CAAACTCAACTAAACAAACTCAACAAAACAAAC
EPOプライマー F
SEQ ID NO: 9
AGTCGTAGAGTTTTTGGGTT
EPOプライマー R
SEQ ID NO: 10
CAACGCGATACGACG
EPOプローブ
SEQ ID NO: 11
CGCAACGAACGACCGA
EPOブロッカー
SEQ ID NO: 12
GAGTTTTTGGGTTATTTTGGTTGTTTGTTG
1)SNCGモノクローナル抗体(マウス)で96ウェルプレートをコーティングする。
2)10倍希釈された臨床血清サンプル又は血漿サンプルと階段希釈されたヒトSNCGタンパク質溶液を加える。
3)ホースラディッシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRP)標識マウス抗ヒトSNCGのポリクローナル抗体(IgG)を各ウェルに加える。
4)上記混合物を含む免疫反応プレートを、振盪条件下、室温でインキュベートし、洗浄液で反応ウェルを洗浄した後、発色基質を加える。
5)停止液を加えて発色反応を停止させた後、プレートリーダーを使用して各反応ウェルのスペクトルを検出する。
6)階段希釈されたヒトSNCGタンパク質溶液の検出値を使用して標準曲線を確立し、標準曲線に基づいて臨床血清サンプルを定量化する。
食道癌組織233例と正常な食道組織171例の全ゲノムのメチル化チップ(Illumina社製のHumanMethylation450kチップ)のデータを分析したことにより、本発明者は、食道癌組織におけるMT1A遺伝子及びEPO遺伝子のメチル化レベルが正常な食道組織(分析結果は図1に示される)のそれよりも有意に高いことを見出した。さらに、本発明者は、全ゲノムメチル化チップ上のMT1A遺伝子及びEPO遺伝子のプローブ配列及び対応するメチル化率のデータを分析したことにより、食道癌組織及び正常な食道組織でメチル化の差異が最も明らかなこれらの2つの標的遺伝子の配列断片を見つけ、この配列断片を、これら2つの標的遺伝子のターゲット配列として決定した。
SEQ ID NO: 1
CACCCAGGGGAGCTCAGTGGACTGTGCGCCTTGCCTTTCTGCTGCGCAAAGCCCAGTCCAGGTCATCACCTCGGGCGGGGCGGACTCGGCTGGGCGGACTCAGCGGGGCGGGCGCAGGCGCAGGGCGGGTCCTTTGCGTCCGGCCCTCTTTCCCCTGACCATAAAAGCAGC
SEQ ID NO: 2
GCTGCTTTTATGGTCAGGGGAAAGAGGGCCGGACGCAAAGGACCCGCCCTGCGCCTGCGCCCGCCCCGCTGAGTCCGCCCAGCCGAGTCCGCCCCGCCCGAGGTGATGACCTGGACTGGGCTTTGCGCAGCAGAAAGGCAAGGCGCACAGTCCACTGAGCTCCCCTGGGTG
SEQ ID NO: 3
CGCGCACGCACACATGCAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGCAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCTGCGCTGCGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCGCTCTGCTCCGACACCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGGCCCCCGGTGTGGTCACCCGGCGCGCCCCAGGTCG
SEQ ID NO:4
CGACCTGGGGCGCGCCGGGTGACCACACCGGGGGCCCTCATCCCGGGAAGCTCGGCGGTGCAGGGCCAGCCCCACGGGCCTGGAGGAGAGGGCGGCTGTCCAGGGGGCGCGGTGTCGGAGCAGAGCGGGCGCGGTGGCCCCGGTCCGGCTCCGGGAGGACAGCGCGGTGCGGCGCAGCGCAGCGAGCGGCCGGGGTGGCCCAGGGACTCTGCGGCTCTGGCCGGGGGTCGGGGCTGTTATCTGCATGTGTGCGTGCGCG
ステップ1:分析対象となる生体サンプルのDNAを得た。この供給源は、細胞株、組織学的切片、生検組織、パラフィン包埋組織、体液、糞便、尿、血漿、血清、全血、分離された血液細胞、血液から分離された細胞、及びこれらのすべての可能な組み合わせなど、任意の適切な由来であってもよい。次に、従来技術における任意の標準的な手段によってDNAをサンプルから単離した。簡単に言えば、DNAが細胞膜に封入されたとき、この生体サンプルは、破壊されて、酵素的、化学的、又は機械的手段によって分解される必要がある。その後、タンパク質及び他の汚染物質をたとえば、プロテインキナーゼKによる消化により除去した。次に、DNAを溶液から回収した。これは、塩析、有機抽出やDNAの固体支持体への結合など、さまざまな方法で実現できる。方法の選択は、時間、コスト、必要なDNAの量など、さまざまな要因の影響を受ける。前記サンプルDNAが細胞膜に封入されていない場合(たとえば、血液サンプルからの循環DNA)、従来技術におけるDNAを分離及び/又は精製するための標準的な方法を使用することができる。これらの方法には、塩酸グアニジン又は尿素などのカオトロピック塩などのタンパク質分解剤;又はドデシルスルホン酸ナトリウム(SDS)、臭化シアンなどの洗剤の使用が含まれる。他の方法には、エタノール沈殿又はプロパノール沈殿、遠心分離による真空濃縮などが含まれるが、これらに限定されない。当業者はまた、限外濾過装置、シリコン表面又は膜、磁性ビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレン表面、正に帯電した表面及び正に帯電した膜、帯電膜、帯電表面、帯電変換フィルム、帯電変換面などのデバイスを使用することもできる。核酸が抽出されると、DNAは分析に使用される。
MT1Aプライマー F
SEQ ID NO: 5
CGGACGTAAAGGATTC
MT1Aプライマー R
SEQ ID NO: 6
GAAACGAACTCGACTAAACG
MT1Aプローブ
SEQ ID NO: 7
TGCGTTTGCGTTCGTTTCG
MT1Aブロッカー
SEQ ID NO: 8
CAAACTCAACTAAACAAACTCAACAAAACAAAC
EPOプライマー F
SEQ ID NO: 9
AGTCGTAGAGTTTTTGGGTT
EPOプライマー R
SEQ ID NO: 10
CAACGCGATACGACG
EPOプローブ
SEQ ID NO: 11
CGCAACGAACGACCGA
EPOブロッカー
SEQ ID NO: 12
GAGTTTTTGGGTTATTTTGGTTGTTTGTTG
本出願の具体的な実施形態によれば、特定の数の食道癌サンプル及び正常サンプルの検出結果の平均Ct値に基づいて、食道癌を正常な標的遺伝子から効果的に区別できるCt値、すなわち臨界値を決定した。標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ct値によって決定され、検出対象となるサンプルのCt値を予め設定された閾値と比較することにより、標的遺伝子に基づく解析結果が陰性(正常)か陽性(食道癌)かを決定する。
まず、食道癌患者20例と健常者22例の血漿サンプルを採取した。すべてのサンプルはBioChain社から入手される。次に、検出対象サンプルの末梢血の遊離DNAを抽出し、前記DNAサンプルに対して前処理を行い、5位非メチル化シトシン塩基をウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換した。本実施例では、当該前処理は亜硫酸水素塩試薬処理によって達成された。前記DNAの抽出及び処理は、従来技術の任意の標準的な手段によって実行することができ、具体的には、本実施例では、すべてのサンプルDNA抽出及び亜硫酸水素塩によるDNA修飾は、BioChain社製の血漿処理キットを用いて行われた。
次に、また食道癌被験者63例の血漿サンプルを得た。次に、血漿中の遊離DNAを抽出し、ゲノムDNAサンプルに対して前処理を行い、5’位非メチル化シトシン塩基をウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換した。本実施例では、当該前処理は亜硫酸水素塩試薬処理によって達成される。前記DNAの抽出及び処理は、従来技術における任意の標準的な手段によって実行することができ、具体的には、本実施例では、すべてのサンプルのDNA抽出及び亜硫酸水素塩によるDNA修飾は、BioChain社製の血漿処理キットを用いて行われた。次に、処理した上記食道癌被験者63例のDNAサンプルに、上記MT1A及びEPO遺伝子プライマーとプローブの組み合わせ、及び内部参照遺伝子ACTB遺伝子プライマーとプローブの組み合わせを加え、PCRによりMT1A及びEPO遺伝子のメチル化状態を検出した。ここで、本実験例で採用されたPCR増幅条件は次のとおりであった。リアルタイムPCRはLife Technologies機器(7500)で実行された。PCR反応混合物は、亜硫酸水素塩で変換されたDNAテンプレート35ng、450nM プライマー、225nM プローブ、1UTaq ポリメラーゼ、200uμm 各dNTP、4.5mM MgCl2及び2XPCRバッファーからなり、最終体積は30μlであった。94℃で20分持続したことによりプレサイクルでサンプルを増幅し、続いて62℃で5秒間のアニーリングを45サイクル行い、55.5℃で35秒間アニーリングし、93℃で30秒間変性させた。
Claims (10)
- 食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
MT1A遺伝子及びEPO遺伝子のうちの1種又は2種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸、
標的遺伝子のターゲット配列の5位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬、及び
SNCG、即ちγシヌクレイン(γ−synuclein)である標的タンパク質の濃度を検出するための抗体
を含む、組成物。 - 前記MT1A遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 1に示され、
前記EPO遺伝子のターゲット配列はSEQ ID NO: 3に示される、
請求項1に記載の組成物。 - 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸が、
SEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6の配列、若しくはSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO:10の配列を含む、
請求項1又は2に記載の組成物。 - 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸が、
SEQ ID NO: 7の配列又はSEQ ID NO: 11の配列を含む、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記ブロッカーは、SEQ ID NO: 8の配列又はSEQ ID NO: 12の配列である、請求項5に記載の組成物。
- 標的タンパク質の濃度を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ試薬をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記酵素結合免疫吸着アッセイ試薬が、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、SNCGプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、請求項7に記載の組成物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物を含むキット。
- 別の成分として、ヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ及び前記DNAポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも1種を含み、
前記酵素結合免疫吸着アッセイ試薬が、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、SNCGプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液から選ばれる少なくとも1種を含む、請求項7に記載の組成物と、プロトコルとをさらに含む、キット。
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