CN103667344B - 一种激活促红细胞生成素基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种激活促红细胞生成素基因表达的方法,为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素基因的表达,包括以下步骤:1)在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列,设计特异性识别TALE靶点序列的,由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块;2)靶点识别模块编码序列的构建;3)通过酶切连接的方法,将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接,获得重组质粒;4)将重组质粒转化目的细胞并培养。本发明利用TALE技术在自体骨髓间充质干细胞中激活促红细胞生成素基因的表达,为基因治疗提供了新的细胞来源,并能在组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种激活促红细胞生成素基因表达的方法。
背景技术
TALE(Transcription activator-effectors)技术是一种崭新的分子生物学工具。研究学者发现,来自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有着恒定的对应关系。利用TALE的序列模块,可组装成特异结合任何DNA序列的模块化蛋白,从而达到靶向操作内源性基因的目的(Li T,Huang S,Jiang W Z,et al.TAL nucleases(TALNs):hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39(1):359-372.)。
目前TALE技术主要有两种应用:1)TALEN(transcription activator-like(TAL)effector nucleases)的基因敲除;2)TALEA(transcription activator-like(TAL)effector activator)的转录激活。TALEA的转录激活是将识别特异DNA序列的TALE与转录激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA,将TALEA质粒转入细胞后,表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列,并通过VP64激活区域与PolII结合,激活目标基因的转录,从而提高了内源目标基因的表达(Zhang F,Cong L,Lodato S,et al.Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011;29(2):149-153.)。目前,TALEA已经成功运用到哺乳动物细胞中,Miller等利用人工设计的TALEA在人HEK293细胞中能够激活内源性NTF3基因的转录并使其表达水平增加了20倍(Miller JC,Tan S,Qiao G,et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011;29(2):143-148.)。因为TALE技术无基因、细胞、物种限制,实验设计简单,毒性低、脱靶情况少等优点,TALE技术在酵母、动植物细胞的基因组定点修饰、遗传疾病的基因疗法及基因的功能研究等方面都有广阔的应用前景。
骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的一类具有高度可塑性的细胞群体,是骨髓基质细胞的前体细胞。在特定的诱导条件下具有向骨、软骨、肌腱、心肌、神经、脂肪等基质细胞分化的能力(George J,Goldstein E,Abashidze A,etal.Erythropoietin promotes endothelial progenitor cell proliferative andadhesive properties in a PI3-kinase-dependent manner.Cardiovasc Res.2005;68(2):299-306.)。由于骨髓间充值干细胞具有采集方便、易于在体外培养、诱导和扩增以及免疫原性低等特性,被认为在细胞治疗、基因治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。近年来的许多动物实验和临床研究均证明,以干细胞为基础的细胞移植在心血管疾病中的治疗效果显著。但目前研究发现,移植细胞在心肌微环境下发生凋亡可能是影响心功能改善效率的重要原因之一(Lange C,Schroeder J,Stute N,et al.High-potential humanmesenchymal stem cells.Stem Cells Dev.2005;14(1):70-80.)。
促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是促进红细胞分化和生存的主要细胞因子,是细胞生长因子超家族成员之一。有实验表明,心血管组织可以表达EPO,表明EPO可能起到保护心肌细胞的作用,外源性EPO具有很好的治疗心血管疾病的作用(Van der MeerP,Lipsic E,Henning RH,et al.Erythropoietin improves left ventricular functionand coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusion injury.EurJ Heart Fail.2004;6(7):853)。已有文献报道,EPO治疗联合MSC较单独的MSC移植能进一步改善缺血下肢功能恢复和组织重塑,这可能与体内EPO增加,EPO能抑制MSC凋亡,促进MSC分泌VEGF以及EPO本身血管生成能力有关(Zhang D,Zhang F,Zhang Y,and etal.Erythropoietin enhances the angiogenic potency of autologous bone marrowstromal cells in a rat model of myocardial infarction.Cardiology.2007;108(4):228-36.)。然而传统的EPO注射易出现红细胞增多,多次注射有导致纯红细胞再生障碍等不良反应(Rossert J,Pure Red Cell Aplasia Global Scientific Advisory Board(GSAB).Erythropoietin-induced,antibody-mediated pure red cell aplasia.Eur JClin Invest.2005;35:95-99.)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种利用TALE技术在人自体骨髓间充质干细胞(MSC)中激活EPO(促红细胞生成素)基因表达的方法。本发明选用人EPO基因和人骨髓间充质干细胞作为靶基因和靶细胞,利用TALE技术在MSC细胞中激活EPO基因的表达,为基因治疗提供新了一种新的细胞来源,并将在组织工程和细胞治疗中发挥重要作用。
本发明首先公开了一种激活促红细胞生成素基因表达的方法,为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素(EPO)基因的表达,包括以下步骤:
1)在促红细胞生成素(EPO)基因启动子上游寻找TALE靶点序列,设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块;
2)靶点识别模块编码序列的构建:构建编码步骤1)所述靶点识别模块的双链DNA;
3)通过酶切连接的方法,将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接,获得重组质粒;
4)重组质粒转染目的细胞,及目的细胞的培养。
较优的,步骤1)所述TALE靶点序列为EPO(促红细胞生成素)基因启动子上游16~20个连续的碱基。
更优的,步骤1)所述TALE靶点序列为EPO基因启动子上游18个连续的碱基。
最优的,步骤1)所述TALE靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
较优的,步骤1)所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-HD-NI。
更进一步的,步骤1)所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQ ID NO:21所示。
靶点识别模块NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-HD-NI的氨基酸序列组成如SEQ ID NO:21所示。
本发明的靶点识别模块由NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元组成。所述TAL核酸识别单元为重复的34个恒定氨基酸序列,其中12、13位点双连氨基酸与A、T、G、C四种碱基有恒定的对应关系,即NI识别A,NG识别T,NN识别G,HD识别C。因此,本发明靶点识别模块中的NI、NG、NN、HD不指代具体的氨基酸,而是代表特异性识别A、T、G、C四种碱基的TAL核酸识别单元;根据TALE靶点序列的碱基组成,获得由对应TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块。
通过TALE技术,能够组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白(靶点识别模块),从而达到靶向操作内源性基因的目的。
NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元各自对应一个能够编码该识别单元的单体,所述单体为双链DNA。对照靶点识别模块的组成,对编码不同TAL核酸识别单元的单体进行串联组装,即可获得能够编码该靶点识别模块的双链DNA(靶点识别模块编码序列)。所述串联组装方式可以为在首尾相邻的单体之间设有相同的粘性末端,具体可通过在单体序列内TAL核酸识别单元编码序列两侧插入对应的酶切位点,通过多步酶切、连接的方法获得,或采用同序异尾限制性内切酶一步酶切法获得。
较优的,步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
A.构建单体库:所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库,每一个次库包括彼此分离设置的M个单体,并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列,所述单体为双链DNA,其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列,并且按照单体的排序,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补;
B.按照所述靶点识别模块的组成,由N端开始向C端方向,从前述单体库中依次选择对应的单体,通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。
本发明的连接末端是位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的双链DNA序列,连接末端含有酶切位点序列(包括限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶剪切序列),可以经限制性内切酶酶切获得特定的粘性末端。当某一单体下游的连接序列与另一单体的上游连接序列酶切后获得互补粘性末端的时候,该两个单体能够连接并且连接顺序是一定的,因此可以通过特定连接末端序列的设计,将多个单体按照特定顺序进行连接。
更优的,步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
a按照所述靶点识别模块的组成,将靶点识别模块由N端开始向C端方向,顺次按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式分组,构成个次模块;
b构建单体库:所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库,每一个次库包括彼此分离设置的M个单体,并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列,所述单体为双链DNA,其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列,并且按照单体的排序,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补;每一次库中的M个单体从排序第1的单体开始,顺次以每n个单体作为一个分组,共获得个分组,并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的;四个次库之间,排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体,其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同;
c按照所述靶点识别模块的组成,由N端开始向C端方向,从前述单体库中依次选择对应的单体,按照每n个单体一组的方式连接,构成个编码对应次模块的n联单体,然后再将个n联单体连接,或者将个n联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接,获得靶点识别模块编码序列;其中,M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目,n为整数,并且n的取值范围为2~6。
本发明中为向上取整的符号,所述为取比[M/n]大的最小整数。为向下取整的符号,所述为取比小的最大整数。
本发明步骤a是指:由于靶点识别模块由M个TAL核酸识别单元组成,因此从靶点识别模块N端的第一个TAL核酸识别单元开始向靶点识别模块的C端,按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式,依次将靶点识别模块分为个次模块,为向上取整的符号,当M/n能够整除时,所述靶点识别模块分为个次模块,并且每个次模块内含有n个TAL核酸识别单元;当M/n不能整除时,所述靶点识别模块分为个次模块,前个次模块的每个次模块内含有n个TAL核酸识别单元,余下的第个次模块内包括个TAL核酸识别单元,并且的取值大于等于1,小于n。
步骤b中,由于每一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,但与该分组内其他单体酶切后的粘性末端是非互补的,因此能够将每一个分组内的多个单体片段按照其排次顺次的连接到一起。又由于每一次库中的单体,按照单体的排序,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,因此属于不同分组,但在次库中排序相邻的两个单体酶切后可以通过互补的粘性连接,将不同分组内的片段连接到一起。最后,由于四个次库之间,排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体,其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同,才可以保证按照模板识别序列的组成,从不同次库中选择对应TAL核酸识别单元的单体,与任意来源的前一单体连接。
步骤c为按照所述靶点识别模块的组成,从前述的单体库中选择对应的单体,通过酶切连接的方法获得多个2联单体、3联单体、4联单体、5联单体或6联单体。当M/n能够整除时,从单体库中依次选择对应的单体,获得个编码对应次模块的n联单体,然后再将个n联单体连接;当M/n不能整除时,先从单体库中选出n的倍个单体,分别连接获得个n联单体后,将个n联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他不足n个的单体连接,或者将剩余的不足n个的单体连成寡聚单体,与其他的n联单体连接,获得靶点识别模块编码序列。
最优的,每一所述分组内n个单体顺次排列,同一次库的每一分组内排次第2至第n-1的任一单体,与同一次库的其他分组内排次第2至第n-1的任一单体,排次相同的单体的序列完全相同。即每一分组含有n个单体,n个单体在分组内顺次排列,分别位于分组的第1至第n位,例如在编码NN这一TAL核酸识别单元的次库中,每一个分组内排次第2的单体,其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,下游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,TAL核酸识别单元编码序列相同;同理,同一次库不同分组间,排次第3、第4……第n-1位的单体,排次相同的单体的序列也相同。
同一次库内设有序列相同的单体,并将序列相同的单体放入不同分组的目的是为了减少实验所需要设计的粘性末端的数目,由于同一分组内的单体先彼此连接,因此不同分组内的单体即使能够酶切获得相同的粘性末端,也不会影响整个靶点识别模块编码序列的连接。
最优的,每一所述分组内,排次第1单体的上游连接序列的5’端外侧与排次最后一位单体的下游连接序列的3’端外侧还分别各设有一成环序列,同一分组内的两个成环序列酶切后,获得互补的粘性末端。
本发明所述成环序列是位于单体上/下游连接序列外侧的双链DNA序列,成环序列内含有酶切位点序列(包括限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶剪切序列),可以经限制性内切酶酶切获得互补的粘性末端;由于成环序列分别位于每一分组内排次第1的单体的5’端及排次第n位单体的3’端,因此,当该分组的n个单体连成n联单体后,可以将该n联单体进行酶切,环化,获得一个环状双链DAN。
进一步的,所述次库中的单体是通过PCR的方法,从含有NI、NG、NN或HD任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增获得。
更进一步的,所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-HD-NI,M为18,n取6,用于从含有NI、NG、NN或HD任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增单体片段的PCR方法的引物序列为SEQ ID NO:3、4;SEQ ID NO:5、6;SEQ ID NO:7、8;SEQ ID NO:9、10;SEQ ID NO:11、12;SEQ ID NO:13、14;SEQ ID NO:15、4;SEQ ID NO:13、16;SEQ ID NO:17、4;SEQ ID NO:13、18。
如下图所示,每一个次库中M个单体按照一定的次序顺次排列,因此每个单体在所属的次库中都有各自的排次,如1位、2位……M位。当n=4时,单体库的组成如下表所示,Ⅰ-1-NI-2或4’-NI-5-Ⅰ表示同一分组内,排序第1的单体上游连接序列的5’端与排序第4位单体的下游连接序列的3’端还分别设有一个成环序列,同一分组内的两个成环序列酶切后,获得互补的粘性末端,使n联单体环化为一双链环状DAN。每n个单体(n=4)作为一个分组,共获得个分组,并且每一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的,保证分组内的单体按排次顺次连接。同一次库中,顺次排列的单体之间,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,保证不同分组内排次相邻的单体能够彼此连接,获得靶点识别模块编码序列。四个次库之间,排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体,其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同,保证从不同次库中选择的单体能够与任意来源的前一单体连接。
x-NI-y等均代表不同的单体,例如1-NI-2表示两端设有不同连接序列的单体,并且该单体编码TAL核酸识别单元NI;
1、2、2’、3……Ⅰ、Ⅹ…表示连接序列,并且字符相同代表酶切后粘性末端相同,字符不同代表酶切后粘性末端不同,字符相同但符号不同(例如2、2’;Ⅰ、Ⅰ’)代表酶切后粘性末端互补。
通过PCR引物中酶切位点的设计,分别从含有NI、NG、NN、HD任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增获得四个次库,每个次库含有编码一种TAL核酸识别单元的多个两端含不同连接序列的单体片段。本发明引物的设计,使四个次库中顺次排列的单体之间,前一单体的下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体的上游连接序列酶切后的粘性末端互补;并且四个次库之间,排次的编码不同TAL核酸识别单元的单体,其两端连接序列酶切后的粘性末端分别相同,使属于不同次库的单体能够通过互补的粘性末端连接,从而使四个次库中的单体能够对应靶点识别模块的组成以一定的顺序进行组装。
较优的,步骤3)所述骨架载体中含有转录因子VP64激活区域的编码序列,所述重组质粒为能编码靶点识别模块及VP64激活区域的融合蛋白的重组质粒。
更优的,靶点识别模块位于转录因子VP64激活区域的N末端。
较优的,步骤4)所述目的细胞为人自体骨髓间充质干细胞。
本发明第二方面公开了一种高效表达促红细胞生成素(EPO)的人自体骨髓间充质干细胞,采用本发明所述方法制备获得。
较优的,所述人自体骨髓间充质干细胞中含有能编码靶点识别模块及VP64激活区域的融合蛋白的重组质粒。
更优的,所述编码靶点识别模块的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
本发明第三方面公开了前述高效表达促红细胞生成素(EPO)的人自体骨髓间充质干细胞在制备心血管疾病治疗试剂中的应用。
本发明选择人EPO基因和人骨髓间充质干细胞(MSC)作为靶基因和靶细胞,利用TALE技术在MSC细胞中激活EPO基因的表达,能够发挥EPO基因治疗和MSC细胞治疗相结合的双重作用,且不会出现红细胞增多和纯红细胞再生障碍等不良反应,为基因治疗提供了新的细胞来源,并在组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用。
附图说明
图1:单体的引物扩增示意图
图2:TALE-TF单体96孔板子集
图3:琼脂糖凝胶电泳检测3个六联单体的PCR扩增条带图
图4:TALE-TF_v2(HD)载体骨架示意图
图5:转染TALE-TF-EPO质粒后稳定表达eGFP的MSC细胞(a、白光图片b、荧光图片)
图6:RT-PCR方法检测EPO基因表达水平
图7:Western blot方法检测EPO蛋白表达水平
图8:六联单体PCR扩增示意图
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件,如[美]Sambrook.J等著;黄培堂等译。分子克隆试验指南,第三版。北京:科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1能够激活EPO基因表达的重组质粒的构建
1.EPO基因启动子上游靶点序列的确定
通过NCBI数据库分析找到EPO基因上游启动子区的序列(EPO基因的序列号为:NM_000799.2,EPO基因上游启动子区的序列如SEQ ID NO:1所示),将其导入https://boglab.plp.iastate.edu/分析。
得到EPO基因的TAL effector的靶点序列为:ACCCCTGGCGACCCCTCA(SEQ ID NO:2),该靶点序列对应的靶点识别模块为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-HD-NI;其氨基酸序列组成如SEQ ID NO:21所示。
按照靶点识别模块的组成,将EPO基因的靶点识别模块由氨基端开始向羧基端方向,顺次按照每六个TAL核酸识别单元一组的方式分组,构成三个次模块(M1、M2、M3),获得TALE-TF组合:NI-HD-HD-HD-HD-NG,NN-NN-HD-NN-NI-HD,HD-HD-HD-NG-ND-NI。
2.TALEs单体库的构建
利用特异性设计的引物从含NI、HD、NG、NN任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒(pNI_v2,pNG_v2,pNN_v2,pHD_v2,购自Addgene公司)中分别扩增带两端设有不同连接序列和/或成环序列的单体。特异性设计的引物序列如下表:
表1引物序列
本发明靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目M为18,n取6,分组数为3。单体的PCR扩增以及目的单体片段的TALEs单体库如图1-2所示:图1为采用上表的引物,针对含任一种TAL核酸识别单元编码序列的质粒,扩增其对应次库,并且该次库包括3个分组。图2所示已经构建好的单体库,该单体库包括分别编码识别A、G、C、T四种碱基的TAL核酸识别单元的四个次库,每个次库中含有18个单体。每一个次库中的单体利用QiAquick96PCRpurification kit纯化后将单体片段置于-20℃备用。
3.构建TALEs模块
根据已知的EPO基因的TAL effector的靶点序列(SEQ ID NO:2)及靶点识别模块的组成,对应TALE-TF组合,在图2所示的单体库中挑取与TAL核酸识别单元对应的单体,利用Golden Gate digestion-ligation技术(参考文献Engler,C.,Gruetzner,R.,Kandzia,R.&Marillonnet,S.Golden gate shuffling:a one-pot DNA shuffling method basedon type IIs restriction enzymes.2009。该方法所使用试剂的供应厂家及货号为:Esp3I,Fermentas公司,ER0452;BsaI-HF,New England Biolabs公司R3535S;T7DNALigase,Enzymatics公司L6020L;Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnase,Epicentre公司E3101K)形成3个六联单体。
此反应中酶切和连接同时进行,其反应体系如表2所示,反应条件如表3所示。并且,通过PlasmidSafe DNAse处理未连接环化的DNA片段,反应体系如表4所示。PlasmidSafeDNAse处理后70℃孵育30min灭活。利用Hex-F和Hex-R引物(引物序列见表1)分别对3个六联单体体连接产物进行PCR扩增,反应体系如表5所示,反应示意图见图8(图8中每个分组内位于第1位单体上游连接序列5’端外侧的成环序列和第6位单体下游连接序列3’端外侧的成环序列可以通过酶切,连接,获得由6个单体组成的多聚单体)。PCR反应结束后,PCR产物跑2%的胶,回收得到3个700bp左右的片段(如图3所示)。
表2
表3
表4
表5
4.TALEs模块连接入载体获得重组载体
选择TALE-TF_v2(HD)为载体骨架(如图4所示,购自Addgene公司,产品序列号为92560)公司),通过Golden Gate digestion-ligation技术将上一步骤回收得到的3个六联单体(每个约700bp)同时与载体相连,反应体系见表6,反应条件如表3所示。
酶切连接反应结束后80℃,20min灭活,回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考:分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下,溶于10μl LB培养基,混匀取1μl作为模板;在以TALE-TF_v2(HD)载体中靶点识别域的上下游,设计通用PCR引物,通用PCR引物的上游引物序列为:5’-CCAGTTGCTGAAGATCGCGAAGC-3’(SEQ ID NO:22);下游引物序列为:5’-TGCCACTCGATGTGATGTCCTC-3’(SEQ ID NO:23),进行PCR鉴定实验。PCR反应体系见表7,反应条件见表8。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的重组载体,命名为TALE-TF-EPO。
阴性对照质粒的制备:阴性对照质粒的构建过程与TALE-TF-EPO的过程类似,以ddH2O替代3个六聚体模块,最终获得阴性对照质粒MOCK-TALE-TF。
表6连接反应体系
表7PCR反应体系
表8PCR反应体系程序设定
实施例2:将构建好的TALE-TF-EPO质粒转染人MSC细胞
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取重组质粒TALE-TF-EPO,阴性对照质粒MOCK-TALE-TF,配制成100ng/μl储存液。转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的人MSC细胞,以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml,接种于6孔板,37℃,5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。采用脂质体介导转染方法将TALE-TF-EPO质粒和阴性对照MOCK-TALE-TF质粒分别转染人MSC细胞,具体操作过程按照Lipofectam TM 2000试剂说明书进行,转染6小时后换新鲜培养基,继续培养至72小时,转染24-72小时后于荧光显微镜下观察细胞转染效率,收集转染后的细胞进行流式细胞分选,获得高表达eEGP的MSC细胞(如图5所示)。
实施例3:转染MSC细胞后的EPO基因表达的半定量RT-PCR方法检测
分别取转染阴性对照MOCK-TALE-TF质粒的MSC细胞和转染TALE-TF-EPO质粒的MSC细胞,根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书,抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书,将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表9,42℃反应1h,然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)提取细胞总RNA后,用RT-PCR方法检测EPO基因的mRNA水平的表达。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。EPO基因的引物如下:上游引物5’-CGCTAGCGGATGGGGGTGCACGAATGT-3’(SEQ ID NO:24)和下游引物5’-CGCTAGCGGATGGGGGTGCACGAATGT-3’(SEQ ID NO:25)。以管家基因GAPDH为内参,引物序列如下:上游引物5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’(SEQ ID NO:26)和下游引物5’-TGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’(SEQ ID NO:27)。按表10中的比例配置反应体系。
表9逆转录反应体系
表10Real-time PCR反应体系
设定程序为两步法Real-time PCR:预变性95℃,15s;之后每一步变性95℃,5s;退火延伸60℃,30s;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后,95℃变性1min,然后冷却至55℃,使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持4s,同时读取吸光值,制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了EPO mRNA的表达丰度。实验结果表明,与转染MOCK-TALE-TF质粒的对照组相比,转染TALE-TF-EPO质粒的MSC细胞中EPO表达水平提高了22.6倍(结果见图6)。
实施例4:EPO蛋白表达的Western blot检测
分别取转染阴性对照MOCK-TALE-TF质粒的MSC细胞和转染TALE-TF-EPO质粒的MSC细胞,用放射性免疫沉淀裂解缓冲液(RIPA)裂解,用BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度,分别取50ug蛋白质上样进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),半干式电转方法转至PVDF膜,5%的脱脂奶粉室温封闭2小时后,用TBST洗膜,加入鼠抗人EPO抗体,4℃孵育过夜。次日,TBST洗膜后再加入HRP标记的二抗室温赋育1小时,经TBST洗膜后用化学发光试剂于暗室自显影,以GAPDH作为内参。结果显示,与对照组相比,转染TALE-TF-EPO质粒的人MSC细胞中,EPO蛋白的表达量明显增强,结果如图7所示。
Claims (11)
1.一种激活促红细胞生成素基因表达的方法,其特征在于,为利用TALE技术在骨髓间充质干细胞中激活促红细胞生成素基因的表达,包括以下步骤:
1)在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列,设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块;所述TALE靶点序列如SEQ ID NO:2所示;
2)靶点识别模块编码序列的构建:构建编码步骤1)所述靶点识别模块的双链DNA;
3)通过酶切连接的方法,将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接,获得重组质粒;
4)重组质粒转染目的细胞,及目的细胞的培养。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQ IDNO:21所示。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的方法,其特征在于,步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
A.构建单体库:所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库,每一个次库包括彼此分离设置的M个单体,并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列,所述单体为双链DNA,其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列,并且按照单体的排序,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补;
B.按照所述靶点识别模块的组成,由N端开始向C端方向,从前述单体库中依次选择对应的单体,通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
a按照所述靶点识别模块的组成,将靶点识别模块由N端开始向C端方向,顺次按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式分组,构成个次模块;
b构建单体库:所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库,每一个次库包括彼此分离设置的M个单体,并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列,所述单体为双链DNA,其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列,并且按照单体的排序,前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补;每一次库中的M个单体从排序第1的单体开始,顺次以每n个单体作为一个分组,共获得个分组,并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补,但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的;四个次库之间,排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体,其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同,下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同;
c按照所述靶点识别模块的组成,由N端开始向C端方向,从前述单体库中依次选择对应的单体,按照每n个单体一组的方式连接,构成个编码对应次模块的n联单体,然后再将个n联单体连接,或者将个n联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接,获得靶点识别模块编码序列;其中,M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目,n为整数,并且n的取值范围为2~6。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,每一所述分组内n个单体顺次排列,同一次库的每一分组内排次第2至第n-1的任一单体,与同一次库的其他分组内排次第2至第n-1的任一单体,排次相同的单体的序列完全相同。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,每一所述分组内,排次第1单体的上游连接序列的5’端外侧与排次最后一位单体的下游连接序列的3’端外侧还分别各设有一成环序列,同一分组内的两个成环序列酶切后,获得互补的粘性末端。
8.如权利要求6或7任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述次库中的单体是通过PCR的方法,从含有NI、NG、NN或HD任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增获得。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI,M为18,n取6,用于从含有NI、NG、NN或HD任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增单体片段的PCR方法的引物序列为SEQ ID NO:3、4;SEQ ID NO:5、6;SEQ ID NO:7、8;SEQ ID NO:9、10;SEQ ID NO:11、12;SEQ ID NO:13、14;SEQ ID NO:15、4;SEQ ID NO:13、16;SEQ ID NO:17、4;SEQ ID NO:13、18。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述骨架载体中含有转录因子VP64激活区域的编码序列,所述重组质粒为能编码靶点识别模块及VP64激活区域的融合蛋白的重组质粒。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述目的细胞为人自体骨髓间充质干细胞。
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