JP2002034575A - ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途 - Google Patents
ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子の発現
を調節するための手段の提供。 【解決手段】 ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子の
プロモーター遺伝子領域を含むＤＮＡ分子およびその改
変体、ならびにこれらを使用するＩＩ型５α−レダクタ
ーゼの転写調節物質のスクリーニング方法。
を調節するための手段の提供。 【解決手段】 ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子の
プロモーター遺伝子領域を含むＤＮＡ分子およびその改
変体、ならびにこれらを使用するＩＩ型５α−レダクタ
ーゼの転写調節物質のスクリーニング方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩＩ型５α−レダ
クターゼ遺伝子のプロモーターとして作用することので
き、場合によって適当なレポーター遺伝子が操作可能に
連結されていてもよいＤＮＡ分子、ならびにその組換え
発現ベクターおよび該ベクターを含む大腸菌または哺乳
動物細胞に関する。また、本発明は、これらのＤＮＡ分
子および細胞の用途にも関する。
クターゼ遺伝子のプロモーターとして作用することので
き、場合によって適当なレポーター遺伝子が操作可能に
連結されていてもよいＤＮＡ分子、ならびにその組換え
発現ベクターおよび該ベクターを含む大腸菌または哺乳
動物細胞に関する。また、本発明は、これらのＤＮＡ分
子および細胞の用途にも関する。
【０００２】
【従来の技術】５α−レダクターゼはテストステロン、
４−アンドロステンジオン、プロゲステロンなどの４−
エン−３−ケト−ステロイドの５α位還元を触媒する酵
素である。その代表的な役割はテストステロンを最も強
力な男性ホルモンである５α−ジヒドロテストステロン
（ＤＨＴ）に代謝することである。ＤＨＴは胎生期にお
ける前立腺を含む男性外性器の分化や思春期における第
二次性徴の出現など、特に男性において重要な生理機能
を担っているが、前立腺肥大症や前立腺癌、あるいは皮
膚科領域における男性型脱毛、多毛症、脂漏性皮膚炎、
尋常性ざ瘡などの男性ホルモン依存性疾患に関与するこ
とも明らかになっている。これらの疾患の予防あるいは
治療には、標的細胞におけるＤＨＴ産生を抑制すること
が有効であると考えられ、その手段として種々の５α−
レダクターゼ活性阻害物質の探索が進められている。
４−アンドロステンジオン、プロゲステロンなどの４−
エン−３−ケト−ステロイドの５α位還元を触媒する酵
素である。その代表的な役割はテストステロンを最も強
力な男性ホルモンである５α−ジヒドロテストステロン
（ＤＨＴ）に代謝することである。ＤＨＴは胎生期にお
ける前立腺を含む男性外性器の分化や思春期における第
二次性徴の出現など、特に男性において重要な生理機能
を担っているが、前立腺肥大症や前立腺癌、あるいは皮
膚科領域における男性型脱毛、多毛症、脂漏性皮膚炎、
尋常性ざ瘡などの男性ホルモン依存性疾患に関与するこ
とも明らかになっている。これらの疾患の予防あるいは
治療には、標的細胞におけるＤＨＴ産生を抑制すること
が有効であると考えられ、その手段として種々の５α−
レダクターゼ活性阻害物質の探索が進められている。
【０００３】５α−レダクターゼにはＩ型およびＩＩ型
の２種類のアイソザイムが存在することが明らかになっ
ており、それぞれのｃＤＮＡもクローニングされている
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3640-3644, 1990、
Nature 354: 159-161, 1991）。
の２種類のアイソザイムが存在することが明らかになっ
ており、それぞれのｃＤＮＡもクローニングされている
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3640-3644, 1990、
Nature 354: 159-161, 1991）。
【０００４】成人男性においてＩ型は皮膚および肝臓に
おいて比較的強い発現を示す一方で、身体の各部位にお
いては弱い活性が広く存在している。一方、ＩＩ型は前
立腺、副睾丸、精嚢などの男性ホルモン標的組織に局在
している（J. Clin. Invest.92: 903-910, 1993）。前
立腺の発達は５α−レダクターゼにより産生されるＤＨ
Ｔによりコントロールされているが、前立腺肥大症や前
立腺癌における５α−レダクターゼ活性の上昇も報告さ
れている（J. Clin. Endocrinol. Metab. 67:806-816,
1988）。近年、種々の５α−レダクターゼ活性阻害剤が
開発されてきており、特に、ＩＩ型５α−レダクターゼ
の特異的活性阻害剤であるフィナステリド（Finasterid
e）がこれらの疾患に対して優れた治療効果を示すこと
が知られている。また、Finasterideは男性型脱毛や多
毛症にも治療効果を示す（Biomed & Pharmacother 49:
319-324, 1995）。
おいて比較的強い発現を示す一方で、身体の各部位にお
いては弱い活性が広く存在している。一方、ＩＩ型は前
立腺、副睾丸、精嚢などの男性ホルモン標的組織に局在
している（J. Clin. Invest.92: 903-910, 1993）。前
立腺の発達は５α−レダクターゼにより産生されるＤＨ
Ｔによりコントロールされているが、前立腺肥大症や前
立腺癌における５α−レダクターゼ活性の上昇も報告さ
れている（J. Clin. Endocrinol. Metab. 67:806-816,
1988）。近年、種々の５α−レダクターゼ活性阻害剤が
開発されてきており、特に、ＩＩ型５α−レダクターゼ
の特異的活性阻害剤であるフィナステリド（Finasterid
e）がこれらの疾患に対して優れた治療効果を示すこと
が知られている。また、Finasterideは男性型脱毛や多
毛症にも治療効果を示す（Biomed & Pharmacother 49:
319-324, 1995）。
【０００５】
【発明の構成】上述のとおり、ＩＩ型５α−レダクター
ゼ活性阻止剤は、一定の男性ホルモン依存性疾患に有効
であり、それらの一部は、５α−レダクターゼに対する
阻害活性を評価することにより開発されたものもある。
しかし、５α−レダクターゼ活性阻害剤とは異なる作用
点をもつ多様な薬物を提供することも望まれるであろ
う。
ゼ活性阻止剤は、一定の男性ホルモン依存性疾患に有効
であり、それらの一部は、５α−レダクターゼに対する
阻害活性を評価することにより開発されたものもある。
しかし、５α−レダクターゼ活性阻害剤とは異なる作用
点をもつ多様な薬物を提供することも望まれるであろ
う。
【０００６】本発明者らは、かような要望に応えるた
め、ＩＩ型５α−レダクターゼそのものの生体内での産
生を調節しうる評価系を確立すべく検討してきた。その
結果、本発明者らは、ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ遺
伝子の転写開始点については明らかにされているものの
（Endocrinology 131：1571-1573、1992）、今まだ、該
転写開始点を包含する領域については十分な解析がなさ
れていない、特定領域のポリヌクレオチドおよびその一
定の改変体が該５α−レダクターゼ遺伝子の転写調節に
強く関与することを見出した。
め、ＩＩ型５α−レダクターゼそのものの生体内での産
生を調節しうる評価系を確立すべく検討してきた。その
結果、本発明者らは、ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ遺
伝子の転写開始点については明らかにされているものの
（Endocrinology 131：1571-1573、1992）、今まだ、該
転写開始点を包含する領域については十分な解析がなさ
れていない、特定領域のポリヌクレオチドおよびその一
定の改変体が該５α−レダクターゼ遺伝子の転写調節に
強く関与することを見出した。
【０００７】本発明は、このような知見に基いて完成さ
れたものである。
れたものである。
【０００８】したがって、本発明の１の態様は、ヒトに
由来するＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子のプロモータ
ーとして作用しうる単離されたＤＮＡ分子であって、
（ａ）配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌ
クレオチドにおいて、位置１〜６０２２番目の連続した
ＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）（ａ）の
ポリヌクレオチドのフラグメントであって、位置５９５
２番目（Ｔ）の転写開始点を含む少なくとも約５０の連
続したＤＮＡ配列からなるフラグメント、ならびに
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列におい
て、１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失およ
び／または付加することにより改変されており、そして
位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含む少なくとも
約５０の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド
を包含するポリヌクレオチド、からなる群より選ばれる
ＤＮＡ分子に関する。
由来するＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子のプロモータ
ーとして作用しうる単離されたＤＮＡ分子であって、
（ａ）配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌ
クレオチドにおいて、位置１〜６０２２番目の連続した
ＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）（ａ）の
ポリヌクレオチドのフラグメントであって、位置５９５
２番目（Ｔ）の転写開始点を含む少なくとも約５０の連
続したＤＮＡ配列からなるフラグメント、ならびに
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列におい
て、１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失およ
び／または付加することにより改変されており、そして
位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含む少なくとも
約５０の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド
を包含するポリヌクレオチド、からなる群より選ばれる
ＤＮＡ分子に関する。
【０００９】また本発明は、このようなＤＮＡ分子の用
途にも関し、該ＤＮＡ分子を担持する組換え発現ベクタ
ー、ならびに該ＤＮＡ分子または該組換え発現ベクター
を含む大腸菌または哺乳動物細胞に関する。なお、該Ｄ
ＮＡ分子は、操作可能に連結されたレポーター遺伝子を
さらに含んでいてもよい。このような、レポーター遺伝
子をさらに含む場合の哺乳動物細胞を使用して各種被検
体のヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節能を評価し
うる系を提供できる。各種被検体としては、天然有機化
合物、化学合成化合物をはじめとするあらゆる化合物が
包含される。かような評価系は例えば、ヒトＩＩ型５α
−レダクターゼ転写調節能を有する薬物のスクリーニン
グ法に適用することもできる。
途にも関し、該ＤＮＡ分子を担持する組換え発現ベクタ
ー、ならびに該ＤＮＡ分子または該組換え発現ベクター
を含む大腸菌または哺乳動物細胞に関する。なお、該Ｄ
ＮＡ分子は、操作可能に連結されたレポーター遺伝子を
さらに含んでいてもよい。このような、レポーター遺伝
子をさらに含む場合の哺乳動物細胞を使用して各種被検
体のヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節能を評価し
うる系を提供できる。各種被検体としては、天然有機化
合物、化学合成化合物をはじめとするあらゆる化合物が
包含される。かような評価系は例えば、ヒトＩＩ型５α
−レダクターゼ転写調節能を有する薬物のスクリーニン
グ法に適用することもできる。
【００１０】こうして本発明によれば、ヒトＩＩ型５α
−レダクターゼ遺伝子の発現調節機構を解明するのに役
立つ手段とともに、該発現いかんに関連する疾患の診断
および予防・治療にも役立つばかりでなく、種々の細胞
に対して優れたＩＩ型５α−レダクターゼの産生能亢進
（または上記転写の活性化）あるいは抑制作用（または
上記転写の不活性化）を示す薬剤のスクリーニングなど
に利用できる可能性もある。
−レダクターゼ遺伝子の発現調節機構を解明するのに役
立つ手段とともに、該発現いかんに関連する疾患の診断
および予防・治療にも役立つばかりでなく、種々の細胞
に対して優れたＩＩ型５α−レダクターゼの産生能亢進
（または上記転写の活性化）あるいは抑制作用（または
上記転写の不活性化）を示す薬剤のスクリーニングなど
に利用できる可能性もある。
【００１１】
【発明の好適な形態】本明細書で使用するところの「プ
ロモーター」の語は、転写開始反応の効率に関与するＤ
ＮＡ側の領域を意味する。したがって、「プロモーター
として作用しうる」とは、転写調節能を有すると互換可
能に使用されており、究極的には、ヒトＩＩ型５α−レ
ダクターゼの発現を正または負に調節する、転写活性化
作用および転写不活性化作用を有することを意味する。
本発明では、限定されるものでないが、転写不活性化作
用により重点が置かれている。
ロモーター」の語は、転写開始反応の効率に関与するＤ
ＮＡ側の領域を意味する。したがって、「プロモーター
として作用しうる」とは、転写調節能を有すると互換可
能に使用されており、究極的には、ヒトＩＩ型５α−レ
ダクターゼの発現を正または負に調節する、転写活性化
作用および転写不活性化作用を有することを意味する。
本発明では、限定されるものでないが、転写不活性化作
用により重点が置かれている。
【００１２】まず、本明細書で使用するところの「操作
可能に連結された」とは、プロモーターまたは転写調節
領域（もしくは転写調節能を有する領域）に連結された
目的とするポリヌクレオチド（例えば、レポーター遺伝
子）が一定の宿主細胞内で発現しうるような形態で連結
されていることを意味する。一般に、ポリヌクレオチド
は転写調節領域の下流に連結され、この連結に際して
は、転写調節領域と目的とするポリヌクレオチドとの間
に該ポリヌクレオチドの発現に悪影響を及ぼさないポリ
（もしくはオリゴ）ヌクレオチドが介在してもよい。
可能に連結された」とは、プロモーターまたは転写調節
領域（もしくは転写調節能を有する領域）に連結された
目的とするポリヌクレオチド（例えば、レポーター遺伝
子）が一定の宿主細胞内で発現しうるような形態で連結
されていることを意味する。一般に、ポリヌクレオチド
は転写調節領域の下流に連結され、この連結に際して
は、転写調節領域と目的とするポリヌクレオチドとの間
に該ポリヌクレオチドの発現に悪影響を及ぼさないポリ
（もしくはオリゴ）ヌクレオチドが介在してもよい。
【００１３】本発明に従う単離されたＤＮＡ分子は、配
列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチ
ドにおいて、位置１〜６０２２番目の連続したＤＮＡ配
列からなるポリヌクレオチドである。このようなポリヌ
クレオチドは、例えば、まず、配列番号２および３で表
されるプライマーおよびヒトゲノムＤＮＡを用いたそれ
自体公知のＰＣＲ法によりヒトＩＩ型５α−レダクター
ゼ転写開始点に近い領域のＤＮＡフラグメントを取得
し、これをジゴキシゲニン標識したものをプローブとし
てヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行
なう。次いで、陽性プラークよりファージＤＮＡを調製
し、これを適当な制限酵素で消化し、上記プローブを用
いたサザンブロッティングにより目的ＤＮＡフラグメン
トを同定する。このＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ベクターにサブクローニングするこ
とにより調製できる。
列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチ
ドにおいて、位置１〜６０２２番目の連続したＤＮＡ配
列からなるポリヌクレオチドである。このようなポリヌ
クレオチドは、例えば、まず、配列番号２および３で表
されるプライマーおよびヒトゲノムＤＮＡを用いたそれ
自体公知のＰＣＲ法によりヒトＩＩ型５α−レダクター
ゼ転写開始点に近い領域のＤＮＡフラグメントを取得
し、これをジゴキシゲニン標識したものをプローブとし
てヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行
なう。次いで、陽性プラークよりファージＤＮＡを調製
し、これを適当な制限酵素で消化し、上記プローブを用
いたサザンブロッティングにより目的ＤＮＡフラグメン
トを同定する。このＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ベクターにサブクローニングするこ
とにより調製できる。
【００１４】また、本発明に従う、別の単離されたＤＮ
Ａ分子は、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであっ
て、配列番号１の配列中の位置５９５２番目（Ｔ）の転
写開始点を含む少なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列
からなるフラグメントを挙げることができる。これらの
フラグメントは、さらに、ヒトに由来するＩＩ型５α−
レダクターゼ遺伝子のプロモーターとして作用しうるも
のであらねばならない。これらのフラグメントは、上記
要件を満たすものであればいずれのＤＮＡ分子であって
もよく、また、それらの調製は、後述する実施例２に記
載の方法に従って、上記転写開始点が残存するように適
当な制限酵素を使用して、配列表１で表されるＤＮＡ配
列からなるポリヌクレオチドを消化して取得することが
できる。
Ａ分子は、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであっ
て、配列番号１の配列中の位置５９５２番目（Ｔ）の転
写開始点を含む少なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列
からなるフラグメントを挙げることができる。これらの
フラグメントは、さらに、ヒトに由来するＩＩ型５α−
レダクターゼ遺伝子のプロモーターとして作用しうるも
のであらねばならない。これらのフラグメントは、上記
要件を満たすものであればいずれのＤＮＡ分子であって
もよく、また、それらの調製は、後述する実施例２に記
載の方法に従って、上記転写開始点が残存するように適
当な制限酵素を使用して、配列表１で表されるＤＮＡ配
列からなるポリヌクレオチドを消化して取得することが
できる。
【００１５】さらなる本発明に従う、単離されたＤＮＡ
分子として、上記位置１〜６０２２番目の連続したＤＮ
Ａ配列からなるポリヌクレオチドの基準となるＤＮＡ配
列において、１個または複数個のヌクレオチドが置換、
欠失および／または付加することにより改変されてお
り、そして位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含む
少なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌ
クレオチドを包含するポリヌクレオチドを挙げることが
できる。また、これらのポリヌクレオチドも、ヒトに由
来するＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子のプロモーター
として作用しうるものであらねばならない。さらに、欠
失することにより改変されたポリヌクレオチドとして
は、上記のフラグメントと重複するものが除外できるよ
うに、基準となるＤＮＡ配列が中断されるように、好ま
しくは１個または数個のヌクレオチドが欠失されている
配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
欠失する箇所は、上記の要件、すなわち転写開始点が残
存し、かつ、プロモーターとして作用しうるものであれ
ば、その場所および数を問わないが、通常、後述する複
数存在する転写因子結合モチーフの１個また２個以上が
それらの機能を失う（すなわち、対応する転写因子が結
合できなくなる）ような位置であることが好ましい。
分子として、上記位置１〜６０２２番目の連続したＤＮ
Ａ配列からなるポリヌクレオチドの基準となるＤＮＡ配
列において、１個または複数個のヌクレオチドが置換、
欠失および／または付加することにより改変されてお
り、そして位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含む
少なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌ
クレオチドを包含するポリヌクレオチドを挙げることが
できる。また、これらのポリヌクレオチドも、ヒトに由
来するＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子のプロモーター
として作用しうるものであらねばならない。さらに、欠
失することにより改変されたポリヌクレオチドとして
は、上記のフラグメントと重複するものが除外できるよ
うに、基準となるＤＮＡ配列が中断されるように、好ま
しくは１個または数個のヌクレオチドが欠失されている
配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
欠失する箇所は、上記の要件、すなわち転写開始点が残
存し、かつ、プロモーターとして作用しうるものであれ
ば、その場所および数を問わないが、通常、後述する複
数存在する転写因子結合モチーフの１個また２個以上が
それらの機能を失う（すなわち、対応する転写因子が結
合できなくなる）ような位置であることが好ましい。
【００１６】他方、置換は、上記要件を満たすものであ
れば、基準となるＤＮＡ配列中の１箇所または２箇所以
上の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）がいずれか他の塩基で置換
されていてもよく、また、これらの置換は２個以上の連
続する塩基の置換であってもよい。これらの置換も、上
記転写因子結合モチーフの１部が機能を失うように起こ
すことができる。さらに、付加は、５′末端もしくは
３′末端へのヌクレオチドまたはポリもしくはオリゴヌ
クレオチドの付加、ならびに基準となるＤＮＡ配列の途
中に上記ヌクレオチド等が割り込むように付加されてい
る場合を包含する。勿論のこと、上記要件を満たすこと
も求められる。
れば、基準となるＤＮＡ配列中の１箇所または２箇所以
上の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）がいずれか他の塩基で置換
されていてもよく、また、これらの置換は２個以上の連
続する塩基の置換であってもよい。これらの置換も、上
記転写因子結合モチーフの１部が機能を失うように起こ
すことができる。さらに、付加は、５′末端もしくは
３′末端へのヌクレオチドまたはポリもしくはオリゴヌ
クレオチドの付加、ならびに基準となるＤＮＡ配列の途
中に上記ヌクレオチド等が割り込むように付加されてい
る場合を包含する。勿論のこと、上記要件を満たすこと
も求められる。
【００１７】これらの置換、欠失および付加は、それら
の２種以上が同時に起こっていてもよく、制限酵素によ
る消化とリガーゼによる連結、部位特異的変異の導入、
ＰＣＲ等のそれら自体周知の技術によりもたらすことが
できる。
の２種以上が同時に起こっていてもよく、制限酵素によ
る消化とリガーゼによる連結、部位特異的変異の導入、
ＰＣＲ等のそれら自体周知の技術によりもたらすことが
できる。
【００１８】以上の単離されたＤＮＡ分子は、さらに操
作可能に連結されたレポーター遺伝子を含んでいてもよ
い。通常は、ＤＮＡ分子の下流にフレームを合わせた状
態でレポーター遺伝子が、場合によって該遺伝子の発現
に悪影響を及ぼさないヌクレオチド配列を介して、連結
される。レポーター遺伝子は、当該技術分野で公知のい
ずれであってもよいが、それらの発現を容易に検出でき
るものが好ましく、限定されるものでないが、ルシフェ
ラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挙げるこ
とができる。上記連結方法もそれ自体公知の方法を利用
できる。
作可能に連結されたレポーター遺伝子を含んでいてもよ
い。通常は、ＤＮＡ分子の下流にフレームを合わせた状
態でレポーター遺伝子が、場合によって該遺伝子の発現
に悪影響を及ぼさないヌクレオチド配列を介して、連結
される。レポーター遺伝子は、当該技術分野で公知のい
ずれであってもよいが、それらの発現を容易に検出でき
るものが好ましく、限定されるものでないが、ルシフェ
ラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挙げるこ
とができる。上記連結方法もそれ自体公知の方法を利用
できる。
【００１９】本発明に従えば、上記ＤＮＡ分子または該
ＤＮＡ分子が操作可能に連結されたレポーター遺伝子を
含む構造物を担持するベクター、好ましくは発現ベクタ
ーも提供される。このようなベクターの１種類はプラス
ミドであり、別の種類のベクターはウイルス由来のベク
ターであることができる。これらのベクターは、導入さ
れた宿主細胞内で自律複製できる。本明細書では、この
ようなベクターを発現ベクターまたは組換え発現ベクタ
ーと称している。
ＤＮＡ分子が操作可能に連結されたレポーター遺伝子を
含む構造物を担持するベクター、好ましくは発現ベクタ
ーも提供される。このようなベクターの１種類はプラス
ミドであり、別の種類のベクターはウイルス由来のベク
ターであることができる。これらのベクターは、導入さ
れた宿主細胞内で自律複製できる。本明細書では、この
ようなベクターを発現ベクターまたは組換え発現ベクタ
ーと称している。
【００２０】このような発現ベクターの構築に使用でき
るベクターとしては、その後トランスフェクションすべ
き宿主細胞に応じて、多種多様のベクターを使用できる
が、本発明の目的上、大腸菌を宿主として利用できる場
合には、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ストラ
タジーン社製）が、そして哺乳動物細胞を宿主として利
用する場合には、例えばｐＧＬ ３ ｂａｓｉｃベクタ
ー（プロメガ社製品）を都合よく使用することができ
る。かような発現ベクターの構築もそれ自体周知の方法
に準じて行なうことができる。
るベクターとしては、その後トランスフェクションすべ
き宿主細胞に応じて、多種多様のベクターを使用できる
が、本発明の目的上、大腸菌を宿主として利用できる場
合には、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ストラ
タジーン社製）が、そして哺乳動物細胞を宿主として利
用する場合には、例えばｐＧＬ ３ ｂａｓｉｃベクタ
ー（プロメガ社製品）を都合よく使用することができ
る。かような発現ベクターの構築もそれ自体周知の方法
に準じて行なうことができる。
【００２１】本発明に従えば、さらに、上記発現ベクタ
ーもしくは組換え発現ベクター、または上述のレポータ
ー遺伝子が操作可能に連結されていてもよいＤＮＡ分子
を含む大腸菌または哺乳動物細胞も提供される。発現ベ
クターやＤＮＡ分子からなる外来のＤＮＡ分子の宿主細
胞（大腸菌または哺乳動物細胞）への導入またはトラン
スフェクションもまた、それ自体公知の方法にしたがっ
て行うことができる。これらの方法には、リン酸カルシ
ウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン−媒介−トランスフェクション、リポフェクション
または電気穿孔を挙げることができる。宿主細胞の適当
な形質転換またはトランスフェクション法は、Sambrook
ら、（モレキュラークローニング：アラボラトリーマニ
ュアル。第２版、コールドスプリングハーバーラボラト
リー、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、
コールドスプリングハーバー、ＮＹ．１９８９）および
他のラボラトリーマニュアルに見いだすことができる。
ーもしくは組換え発現ベクター、または上述のレポータ
ー遺伝子が操作可能に連結されていてもよいＤＮＡ分子
を含む大腸菌または哺乳動物細胞も提供される。発現ベ
クターやＤＮＡ分子からなる外来のＤＮＡ分子の宿主細
胞（大腸菌または哺乳動物細胞）への導入またはトラン
スフェクションもまた、それ自体公知の方法にしたがっ
て行うことができる。これらの方法には、リン酸カルシ
ウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン−媒介−トランスフェクション、リポフェクション
または電気穿孔を挙げることができる。宿主細胞の適当
な形質転換またはトランスフェクション法は、Sambrook
ら、（モレキュラークローニング：アラボラトリーマニ
ュアル。第２版、コールドスプリングハーバーラボラト
リー、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、
コールドスプリングハーバー、ＮＹ．１９８９）および
他のラボラトリーマニュアルに見いだすことができる。
【００２２】上記外来のＤＮＡ分子が導入された大腸菌
（例えばＪＭ １０９株）は、該ＤＮＡ分子を増幅する
のに役立つ一方で、哺乳動物細胞は、後述するように、
被検体のヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節能の評
価方法に役立てることができる。このような目的を達成
するために使用できる哺乳動物細胞としては、ヒト前立
腺ストローマ細胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト毛乳頭細
胞などを挙げることができる。
（例えばＪＭ １０９株）は、該ＤＮＡ分子を増幅する
のに役立つ一方で、哺乳動物細胞は、後述するように、
被検体のヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節能の評
価方法に役立てることができる。このような目的を達成
するために使用できる哺乳動物細胞としては、ヒト前立
腺ストローマ細胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト毛乳頭細
胞などを挙げることができる。
【００２３】上記評価方法は、上記のＤＮＡ分子（特
に、レポーター遺伝子を含む）が導入された哺乳動物細
胞を、被検体の存在下で培養し、そして培養物における
レポーター遺伝子の発現の程度の多寡を被検体のヒトＩ
Ｉ型５α−レダクターゼ転写調節能の指標とすることに
よって行うことができる。レポーター遺伝子の発現の程
度は、使用するレポーター遺伝子に応じる適当な検出手
段で発現産物のレベルを測定し、そして、その発現の程
度の多寡は、例えば、被検体が存在しないことを除い
て、その他は同一の培養条件で培養を行って得られる培
養物（対照）におけるレポーター遺伝子の発現の程度と
比較することによって決定することができる。培養も、
使用する宿主細胞の種類に応じて、当該技術分野で公知
の条件下で行うことができる。
に、レポーター遺伝子を含む）が導入された哺乳動物細
胞を、被検体の存在下で培養し、そして培養物における
レポーター遺伝子の発現の程度の多寡を被検体のヒトＩ
Ｉ型５α−レダクターゼ転写調節能の指標とすることに
よって行うことができる。レポーター遺伝子の発現の程
度は、使用するレポーター遺伝子に応じる適当な検出手
段で発現産物のレベルを測定し、そして、その発現の程
度の多寡は、例えば、被検体が存在しないことを除い
て、その他は同一の培養条件で培養を行って得られる培
養物（対照）におけるレポーター遺伝子の発現の程度と
比較することによって決定することができる。培養も、
使用する宿主細胞の種類に応じて、当該技術分野で公知
の条件下で行うことができる。
【００２４】なお、上記の評価方法は、ハイスループッ
トスクリーニング（high through put screening、 Nat
ure、 384、 supp、 14-16、 1996）などを用いた化合
物ライブラリー、天然物からのＩＩ型５α−レダクター
ゼ転写調節物質スクリーニング法に向けることができ
る。この細胞を化合物で適当な時間処理し、レポーター
活性を測定し、活性を上昇もしくは下降させる物質をス
クリーニングする。こうして得られた薬物は、例えばシ
スエレメントあるいは転写因子に作用して直接もしくは
シグナル伝達系の制御により間接的にヒトＩＩ型５α−
レダクターゼの発現を調節することができるであろう。
トスクリーニング（high through put screening、 Nat
ure、 384、 supp、 14-16、 1996）などを用いた化合
物ライブラリー、天然物からのＩＩ型５α−レダクター
ゼ転写調節物質スクリーニング法に向けることができ
る。この細胞を化合物で適当な時間処理し、レポーター
活性を測定し、活性を上昇もしくは下降させる物質をス
クリーニングする。こうして得られた薬物は、例えばシ
スエレメントあるいは転写因子に作用して直接もしくは
シグナル伝達系の制御により間接的にヒトＩＩ型５α−
レダクターゼの発現を調節することができるであろう。
【００２５】さらに、配列番号１に表されるＤＮＡ配列
について、例えばＴＲＡＮＳＦＡＣ等のデータベースを
基に転写因子結合モチーフの検索を行なうことにより、
ＩＩ型５α−レダクターゼの転写制御に関与する転写因
子を予測することができる。実際に配列番号１に表され
る全ＤＮＡ配列について検索を行なったところ、ＳＰ−
１、ＡＰ−１、ＣＲＥＢＰ１、Ｎｋｘ−２．５、ＳＯＸ
５などをはじめとする多数の転写因子結合モチーフの存
在を認めた。これらの転写因子はＩＩ型５α−レダクタ
ーゼ転写制御領域中のシスエレメントに作用してＩＩ型
５α−レダクターゼの転写を亢進または抑制するものと
考えられる。したがって、これらの転写因子の産生を制
御しうる物質、あるいは転写因子のシスエレメントへの
結合を阻害する物質もＩＩ型５α−レダクターゼ転写制
御物質として有用であろう。
について、例えばＴＲＡＮＳＦＡＣ等のデータベースを
基に転写因子結合モチーフの検索を行なうことにより、
ＩＩ型５α−レダクターゼの転写制御に関与する転写因
子を予測することができる。実際に配列番号１に表され
る全ＤＮＡ配列について検索を行なったところ、ＳＰ−
１、ＡＰ−１、ＣＲＥＢＰ１、Ｎｋｘ−２．５、ＳＯＸ
５などをはじめとする多数の転写因子結合モチーフの存
在を認めた。これらの転写因子はＩＩ型５α−レダクタ
ーゼ転写制御領域中のシスエレメントに作用してＩＩ型
５α−レダクターゼの転写を亢進または抑制するものと
考えられる。したがって、これらの転写因子の産生を制
御しうる物質、あるいは転写因子のシスエレメントへの
結合を阻害する物質もＩＩ型５α−レダクターゼ転写制
御物質として有用であろう。
【００２６】実際に、これらの転写因子がＩＩ型５α−
レダクターゼの発現を制御している例として、ＳＲＹ
（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ
Ｙ）によるＩＩ型５α−レダクターゼの発現亢進を挙げ
ることができる。具体的な結果を実施例５に示す。した
がって、ＳＲＹの産生阻害あるいはＳＲＹとシスエレメ
ントとの結合阻害を作用点とする物質はＩＩ型５α−レ
ダクターゼ転写抑制物質として有用であろう。
レダクターゼの発現を制御している例として、ＳＲＹ
（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ
Ｙ）によるＩＩ型５α−レダクターゼの発現亢進を挙げ
ることができる。具体的な結果を実施例５に示す。した
がって、ＳＲＹの産生阻害あるいはＳＲＹとシスエレメ
ントとの結合阻害を作用点とする物質はＩＩ型５α−レ
ダクターゼ転写抑制物質として有用であろう。
【００２７】したがって、本発明によれば、配列番号１
で表されるＤＮＡ配列中に存在する転写因子結合モチー
フに対する転写因子をコードする単離されたＤＮＡ分子
を含有する発現ベクターを、導入した哺乳動物細胞を培
養することによるヒトＩＩ型５α−レダクターゼの発現
の亢進および抑制方法ならびに該方法を被検体の存在下
で行い、該被検体の存在に起因して変化するヒトＩＩ型
５α−レダクターゼの発現量の多寡を該被検体のヒトＩ
Ｉ型５α−レダクターゼ転写調節能の指標とすることを
特徴とする被検体の該転写調節能の評価方法も提供され
る。この評価方法もまた、ＩＩ型５α−レダクターゼの
転写調節物質のスクリーニング方法に向けることもでき
る。 上記評価方法で転写因子結合モチーフに対する転
写因子をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクター
が導入される哺乳動物細胞としては、外来のＤＮＡ分子
として操作可能にレポーター遺伝子が連結した前記ＤＮ
Ａ分子を含んでいてもよい、ヒト前立腺ストローマ細
胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト毛乳頭細胞などを挙げる
ことができる。
で表されるＤＮＡ配列中に存在する転写因子結合モチー
フに対する転写因子をコードする単離されたＤＮＡ分子
を含有する発現ベクターを、導入した哺乳動物細胞を培
養することによるヒトＩＩ型５α−レダクターゼの発現
の亢進および抑制方法ならびに該方法を被検体の存在下
で行い、該被検体の存在に起因して変化するヒトＩＩ型
５α−レダクターゼの発現量の多寡を該被検体のヒトＩ
Ｉ型５α−レダクターゼ転写調節能の指標とすることを
特徴とする被検体の該転写調節能の評価方法も提供され
る。この評価方法もまた、ＩＩ型５α−レダクターゼの
転写調節物質のスクリーニング方法に向けることもでき
る。 上記評価方法で転写因子結合モチーフに対する転
写因子をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクター
が導入される哺乳動物細胞としては、外来のＤＮＡ分子
として操作可能にレポーター遺伝子が連結した前記ＤＮ
Ａ分子を含んでいてもよい、ヒト前立腺ストローマ細
胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト毛乳頭細胞などを挙げる
ことができる。
【００２８】本発明のスクリーニング方法で得られるＩ
Ｉ型５α−レダクターゼ転写抑制物質は、前立腺肥大や
前立腺癌、あるいは男性型脱毛症などの男性ホルモン依
存性疾患の予防および治療に有効であろう。
Ｉ型５α−レダクターゼ転写抑制物質は、前立腺肥大や
前立腺癌、あるいは男性型脱毛症などの男性ホルモン依
存性疾患の予防および治療に有効であろう。
【００２９】
【実施例】次に実施例を示して本発明を具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれによって限定されるものでは
ない。実施例１ ：ヒトＩＩ型５α−レダクターゼゲノムＤＮＡ
のクローニング 配列番号２および３で示されるプライマーおよびヒト胎
盤ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法により、配列番号４に
示すヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写開始点に近い領
域のＤＮＡフラグンメントの取得した。これをジゴキシ
ゲニン標識したものをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングを行なった。具体的には
クロンテック社製ヒトゲノムＤＮＡライブラリー（ベク
ター：ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７）を大腸菌Ｋ８０２株
に感染させた後、プラークを形成させ、これをナイロン
メンブランに転写し、上記プローブを用いてハイブリダ
イゼーションを行なった。検出にはアルカリフォスファ
ターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュ・ダイアグノ
スティックス社製）を用いた発色反応をおこなった。約
２００万個のプラークをスクリーニングした結果、＃１
および＃２の２個の陽性プラークを取得した。これらよ
りファージＤＮＡを調製し、これを種々の制限酵素で消
化した後、上記プローブを用いたサザンブロッティング
を行なった結果、複数のＤＮＡ断片が陽性を示した。こ
のうち＃１のファージＤＮＡをＢａｍＨＩで消化するこ
とにより得られた約８ｋｂのＤＮＡ断片が、ヒトＩＩ型
５α−レダクターゼ遺伝子の既知塩基配列および制限酵
素マップにより、転写開始点を含む５′上流域を最も長
くカバーしていることが確認されたので、以後の実験に
はこのＤＮＡ断片を用いた。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲ
Ｉ消化して得られた約６．２ｋｂの断片を同様にＢａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＩＩベクターにサブクローニングした。このプラス
ミドをｐ６．２ＢＳと命名した。約６．２ｋｂの挿入断
片の全塩基配列を配列番号１に、さらにその構造を図１
示した。実施例２ ：ヒトＩＩ型５α−レダクターゼプロモーター
とルシフェラーゼレポーター遺伝子を連結させたレポー
タープラスミドの構築 配列番号１に示すＤＮＡ断片はヒトＩＩ型５α−レダク
ターゼ遺伝子の５′上流領域に加え、翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）以降の構造遺伝子の一部（配列番号１に示さ
れる６０２３番から６２２４番）も含んでいるため、こ
のままルシフェラーゼ遺伝子を連結したのではフレーム
シフトによりルシフェラーゼの発現が期待できない。そ
こで、ｐ６．２ＢＳプラスミドよりＩＩ型５α−レダク
ターゼの構造遺伝子部分を除く操作を以下の通り行なっ
た。まず、ｐ６．２ＢＳプラスミドをＳａｃＩＩで消化
することにより、配列番号１に示される５８２３番のＳ
ａｃＩＩサイトからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ由来
のＳａｃＩＩサイトまでを除いた。一方、５′末端にＳ
ａｃＩＩ認識配列をつけた配列番号５および配列番号６
に示されるＰＣＲプライマーを用いてｐ６．２ＢＳプラ
スミドを鋳型としてＰＣＲ反応を行ない、配列番号１に
示される５８２０番の塩基「Ｃ」（ＳａｃＩＩサイトの
３塩基前）から翻訳開始点直前の６０２２番の塩基
「Ｇ」までのＤＮＡ断片を得た。この断片をＳａｃＩＩ
で消化した後、上記の通りＳａｃＩＩで消化したｐ６．
２ＢＳプラスミドにライゲーションした。挿入断片の方
向を確認し、配列番号１と同じクローンを選んだ。この
プラスミドをｐ６．０ＢＳと命名した。次に、ｐ６．０
ＢＳプラスミドをＢｓｓＨＩＩで消化して得られた約６
ｋｂのヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節領域のＤ
ＮＡ断片を、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した
ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターにサブクローニングし
た。こうして得られたプラスミドをｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕ
ｃと命名した。さらに、ｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃを制限酵
素消化することにより、挿入されているＩＩ型５α−レ
ダクターゼ転写調節領域ＤＮＡ中の切断点より５′側を
除いた後、セルフライゲーションさせたｐＲｅｄＩＩ−
Ｌｕｃの変異体を作製した。実際に作製した変異体プラ
スミドの名称と作製のために用いた制限酵素を表１に示
す。
るが、本発明の範囲はこれによって限定されるものでは
ない。実施例１ ：ヒトＩＩ型５α−レダクターゼゲノムＤＮＡ
のクローニング 配列番号２および３で示されるプライマーおよびヒト胎
盤ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法により、配列番号４に
示すヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写開始点に近い領
域のＤＮＡフラグンメントの取得した。これをジゴキシ
ゲニン標識したものをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングを行なった。具体的には
クロンテック社製ヒトゲノムＤＮＡライブラリー（ベク
ター：ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７）を大腸菌Ｋ８０２株
に感染させた後、プラークを形成させ、これをナイロン
メンブランに転写し、上記プローブを用いてハイブリダ
イゼーションを行なった。検出にはアルカリフォスファ
ターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュ・ダイアグノ
スティックス社製）を用いた発色反応をおこなった。約
２００万個のプラークをスクリーニングした結果、＃１
および＃２の２個の陽性プラークを取得した。これらよ
りファージＤＮＡを調製し、これを種々の制限酵素で消
化した後、上記プローブを用いたサザンブロッティング
を行なった結果、複数のＤＮＡ断片が陽性を示した。こ
のうち＃１のファージＤＮＡをＢａｍＨＩで消化するこ
とにより得られた約８ｋｂのＤＮＡ断片が、ヒトＩＩ型
５α−レダクターゼ遺伝子の既知塩基配列および制限酵
素マップにより、転写開始点を含む５′上流域を最も長
くカバーしていることが確認されたので、以後の実験に
はこのＤＮＡ断片を用いた。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲ
Ｉ消化して得られた約６．２ｋｂの断片を同様にＢａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＩＩベクターにサブクローニングした。このプラス
ミドをｐ６．２ＢＳと命名した。約６．２ｋｂの挿入断
片の全塩基配列を配列番号１に、さらにその構造を図１
示した。実施例２ ：ヒトＩＩ型５α−レダクターゼプロモーター
とルシフェラーゼレポーター遺伝子を連結させたレポー
タープラスミドの構築 配列番号１に示すＤＮＡ断片はヒトＩＩ型５α−レダク
ターゼ遺伝子の５′上流領域に加え、翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）以降の構造遺伝子の一部（配列番号１に示さ
れる６０２３番から６２２４番）も含んでいるため、こ
のままルシフェラーゼ遺伝子を連結したのではフレーム
シフトによりルシフェラーゼの発現が期待できない。そ
こで、ｐ６．２ＢＳプラスミドよりＩＩ型５α−レダク
ターゼの構造遺伝子部分を除く操作を以下の通り行なっ
た。まず、ｐ６．２ＢＳプラスミドをＳａｃＩＩで消化
することにより、配列番号１に示される５８２３番のＳ
ａｃＩＩサイトからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ由来
のＳａｃＩＩサイトまでを除いた。一方、５′末端にＳ
ａｃＩＩ認識配列をつけた配列番号５および配列番号６
に示されるＰＣＲプライマーを用いてｐ６．２ＢＳプラ
スミドを鋳型としてＰＣＲ反応を行ない、配列番号１に
示される５８２０番の塩基「Ｃ」（ＳａｃＩＩサイトの
３塩基前）から翻訳開始点直前の６０２２番の塩基
「Ｇ」までのＤＮＡ断片を得た。この断片をＳａｃＩＩ
で消化した後、上記の通りＳａｃＩＩで消化したｐ６．
２ＢＳプラスミドにライゲーションした。挿入断片の方
向を確認し、配列番号１と同じクローンを選んだ。この
プラスミドをｐ６．０ＢＳと命名した。次に、ｐ６．０
ＢＳプラスミドをＢｓｓＨＩＩで消化して得られた約６
ｋｂのヒトＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節領域のＤ
ＮＡ断片を、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した
ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターにサブクローニングし
た。こうして得られたプラスミドをｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕ
ｃと命名した。さらに、ｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃを制限酵
素消化することにより、挿入されているＩＩ型５α−レ
ダクターゼ転写調節領域ＤＮＡ中の切断点より５′側を
除いた後、セルフライゲーションさせたｐＲｅｄＩＩ−
Ｌｕｃの変異体を作製した。実際に作製した変異体プラ
スミドの名称と作製のために用いた制限酵素を表１に示
す。
【００３０】
【表１】
【００３１】実施例３：ヒトＩＩ型５α−レダクターゼ
プロモーター活性の測定 この実施例では、ヒト培養毛乳頭細胞にトランスフェク
ションした上記の各レポータープラスミドのプロモータ
ー活性を測定した。
プロモーター活性の測定 この実施例では、ヒト培養毛乳頭細胞にトランスフェク
ションした上記の各レポータープラスミドのプロモータ
ー活性を測定した。
【００３２】まず、トランスフェクション前日に細胞数
を一定にして２４穴プレートに播種した。翌日、各プラ
スミドおよび遺伝子の導入効率測定用の内部コントロー
ルとしてのβ−ガラクトシターゼ遺伝子を含んだｐＳＶ
−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ
Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をリポフェクトアミン
プラス試薬（ライフテックオリエンタル社製）と混合
し、細胞に添加し、遺伝子導入した。２４〜４８時間培
養した後、細胞を溶解しルシフェラーゼ活性およびβ−
ガラクトシターゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性
はピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いて、
β−ガラクトシターゼ活性は発色基質であるＣＰＲＧを
用いて測定した。その結果を表２に示す。プロモーター
活性は、ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシターゼ活
性で補正し、さらにｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃのプロモータ
ー活性に対する相対値としてあらわした。なお、転写開
始点を含め約−６０ｂｐ付近までのＤＮＡフラグメント
も、強いプロモーター活性を有することが確認されてい
る。
を一定にして２４穴プレートに播種した。翌日、各プラ
スミドおよび遺伝子の導入効率測定用の内部コントロー
ルとしてのβ−ガラクトシターゼ遺伝子を含んだｐＳＶ
−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ
Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をリポフェクトアミン
プラス試薬（ライフテックオリエンタル社製）と混合
し、細胞に添加し、遺伝子導入した。２４〜４８時間培
養した後、細胞を溶解しルシフェラーゼ活性およびβ−
ガラクトシターゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性
はピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いて、
β−ガラクトシターゼ活性は発色基質であるＣＰＲＧを
用いて測定した。その結果を表２に示す。プロモーター
活性は、ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシターゼ活
性で補正し、さらにｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃのプロモータ
ー活性に対する相対値としてあらわした。なお、転写開
始点を含め約−６０ｂｐ付近までのＤＮＡフラグメント
も、強いプロモーター活性を有することが確認されてい
る。
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例４：ＩＩ型５α−レダクターゼ転写
制御物質のスクリーニング 実施例３と同様に、毛乳頭細胞にｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃ
およびｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏ
ｎｔｏｒｏｌ Ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクションす
る。２４時間後に種々の物質を添加しさらに２４〜４８
時間培養する。その後、実施例３と同様の方法でプロモ
ーター活性を測定する。このようにしてＩＩ型５α−レ
ダクターゼ発現を亢進もしくは抑制させる種々の物質を
スクリーニングすることができる。実施例５ ：転写因子ＳＲＹ（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎＹ）によるＩＩ型５α−レダクタ
ーゼの転写亢進 ＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節領域ＤＮＡの塩基配
列についてＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースを基に転写因
子結合モチーフの検索を行なった結果、転写因子ＳＲＹ
の結合モチーフを認め、ＳＲＹによるＩＩ型５α−レダ
クターゼの転写調節の可能性が示唆された。そこでＳＲ
Ｙの過剰発現によるＩＩ型５α−レダクターゼの発現変
動を毛乳頭細胞を用いて検討した。具体的には、まず
５′末端にＥｃｏＲＩ認識配列をつけた配列番号７およ
び配列番号８に示されるＰＣＲプライマーを用いてヒト
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＲＹ構造遺伝子全長を取得
した。この断片をＥｃｏＲＩで消化した後、同様にＥｃ
ｏＲＩで消化した発現ベクターｐＶＰ２２／ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓ（インビトロジェン社製）にサブクローニングし
た。このプラスミドをｐＶＰ２２−ＳＲＹ／ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓと命名した。ｐＶＰ２２−ＳＲＹ／ｍｙｃ−Ｈｉｓ
およびネガティブコントロールとしてｐＶＰ２２／ｍｙ
ｃ−Ｈｉｓを実施例３と同様の方法でそれぞれ培養毛乳
頭細胞にトランスフェクションした。４８時間培養した
後、細胞を回収しＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によ
りＳＲＹおよびＩＩ型５α−レダクターゼのｍＲＮＡ発
現を検討した。その結果を図２に示す。ｐＶＰ２２−Ｓ
ＲＹ／ｍｙｃ−Ｈｉｓの導入によりＳＲＹは約１０倍
に、ＩＩ型５α−レダクターゼは約４倍に発現量が増大
した。この結果より、ＳＲＹはＩＩ型５α−レダクター
ゼの発現を亢進させることが明らかになった。
制御物質のスクリーニング 実施例３と同様に、毛乳頭細胞にｐＲｅｄＩＩ−Ｌｕｃ
およびｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏ
ｎｔｏｒｏｌ Ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクションす
る。２４時間後に種々の物質を添加しさらに２４〜４８
時間培養する。その後、実施例３と同様の方法でプロモ
ーター活性を測定する。このようにしてＩＩ型５α−レ
ダクターゼ発現を亢進もしくは抑制させる種々の物質を
スクリーニングすることができる。実施例５ ：転写因子ＳＲＹ（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎＹ）によるＩＩ型５α−レダクタ
ーゼの転写亢進 ＩＩ型５α−レダクターゼ転写調節領域ＤＮＡの塩基配
列についてＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースを基に転写因
子結合モチーフの検索を行なった結果、転写因子ＳＲＹ
の結合モチーフを認め、ＳＲＹによるＩＩ型５α−レダ
クターゼの転写調節の可能性が示唆された。そこでＳＲ
Ｙの過剰発現によるＩＩ型５α−レダクターゼの発現変
動を毛乳頭細胞を用いて検討した。具体的には、まず
５′末端にＥｃｏＲＩ認識配列をつけた配列番号７およ
び配列番号８に示されるＰＣＲプライマーを用いてヒト
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＲＹ構造遺伝子全長を取得
した。この断片をＥｃｏＲＩで消化した後、同様にＥｃ
ｏＲＩで消化した発現ベクターｐＶＰ２２／ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓ（インビトロジェン社製）にサブクローニングし
た。このプラスミドをｐＶＰ２２−ＳＲＹ／ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓと命名した。ｐＶＰ２２−ＳＲＹ／ｍｙｃ−Ｈｉｓ
およびネガティブコントロールとしてｐＶＰ２２／ｍｙ
ｃ−Ｈｉｓを実施例３と同様の方法でそれぞれ培養毛乳
頭細胞にトランスフェクションした。４８時間培養した
後、細胞を回収しＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によ
りＳＲＹおよびＩＩ型５α−レダクターゼのｍＲＮＡ発
現を検討した。その結果を図２に示す。ｐＶＰ２２−Ｓ
ＲＹ／ｍｙｃ−Ｈｉｓの導入によりＳＲＹは約１０倍
に、ＩＩ型５α−レダクターゼは約４倍に発現量が増大
した。この結果より、ＳＲＹはＩＩ型５α−レダクター
ゼの発現を亢進させることが明らかになった。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトＩＩ型５α−レダ
クターゼのプロモーターを含んだ５′上流遺伝子と適切
なレポーター遺伝子を連結させた組換え発現ベクターを
導入した動物細胞を用い、レポーター活性を指標にして
ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの発現を正または負に制
御する物質をスクリーニングすることができる。特に、
ＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子の発現を抑制する物質
は、前立腺肥大や前立腺癌、あるいは男性型脱毛症など
の男性ホルモン依存性疾患の予防および治療に効能を有
するであろう。
クターゼのプロモーターを含んだ５′上流遺伝子と適切
なレポーター遺伝子を連結させた組換え発現ベクターを
導入した動物細胞を用い、レポーター活性を指標にして
ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの発現を正または負に制
御する物質をスクリーニングすることができる。特に、
ＩＩ型５α−レダクターゼ遺伝子の発現を抑制する物質
は、前立腺肥大や前立腺癌、あるいは男性型脱毛症など
の男性ホルモン依存性疾患の予防および治療に効能を有
するであろう。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LIST <110> Shiseido Co., Ltd. <120> ヒトII型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途 <130> 200007102 <160> 8 <210> 1 <211> 6224 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaattctctg tctgaatggt cctatgtctt gtttctccag gattggtcca tggtgcctta 60 cttagttcat ttggtgaagt catgttttcc tggattatct tgatacttgt aaatgttctt 120 tggtgttagg atttattgta gtcttcactg tctgtgtttt tttgttcctg tcctccttgg 180 gatggatttt cagatatttg aaaagaccgg agtattttga tctatgctgt atctgcttta 240 gagggtacca caatcccagt aatgctatgg ttcttgcagt ttctagatgt actgctttga 300 tggtcttgga caagatccag gataattctc tggattacca ggcagatact cttattttct 360 ttccttactt tctcccaaac agagtccctc tgtcagttct gagacacctg aagctaggag 420 tggagtgaaa ccagcacccc ggaggacacc accactatga ctgtgctcag ccagacttga 480 agccagcaca acactgggtc ttccctgctg taaccactcc ctggccactg cctatgtttg 540 ctcaaggcct tggggctcta caataaacag gtggaaaagc catccaggtc tgtgcccttc 600 ccttcagggt ggcaagttcc cccaagcccc aggtgggtcc agagatgttg tctaggagtc 660 agggactaga gtaaaaaacc tttgaagtct acctggcatt ctattgtatt aaaattgagc 720 tgggggggac tcgggggaaa gtgtgggagg ggagtagggg ataaaagact acacattggg 780 tacggcgtac accgcttggg tgatgggcac caaaatctca gaaatcacca ctaagaactt 840 atctgtgtaa ccaaacacca cctgttcccc aaaaacctat tgaaataata ataataataa 900 ataataataa aatgaataaa caaaaacact gagctggcac tcaaaccaca aaacacagtc 960 tttcccactc tttcctcccc tgtccaaagg cagaggagcc tcactccaca gcccacaaga 1020 agtactgctg gattatcact ggtattcatt taaggcagaa aggctattaa gtcagctggt 1080 ggtgactgct gcctggcctg ggactcactc tttggggcag tgggcttccc tgttggccca 1140 ggaaaggtct agaaatgctg ttgaagagtc aactcttgga atcaagggcc cccaagagct 1200 tgcttggtgc tttacctccc tgtggctgag ccagtacctg aaaccagcta gtctcagagg 1260 ctcacccaag gcccttgatg tagtatctgg gtatcactgc tggttattca gagccaaagg 1320 gcttttcagc tagcaggtga tgaacgctgc catgactggg tctttccctt caaagcagtg 1380 ggttcccttc tggcccaggg tgtttctagg aatgtcacct ggaagctagg gcctggaaca 1440 gggacctcat tattctgact ggtgccatat ctgttgtggc tgagctggta tccaagatgc 1500 aaggcagagt ctcctcaact ctttcctctc ctcttctcaa gcagcaggaa ggggtctctt 1560 ttagagttgt gagttgtgca gcctgggatt ggggaggggt gatgccagca ctcccttggc 1620 tgccccagct gggtgtctca gtatattttg cacccctcag tccactgtct ctggccctag 1680 ttcagtacta ggacttgtct aagaattgca gttcttttgg cctaaactgc ctttcaggtt 1740 tagtcagaga tccagagcac ttcagccctc agtggtgagg tttgtgggaa ctgaaattct 1800 gactgctgga attagtgatt cccctttggc tgggactggt ttgaatgctc cctttatgtg 1860 tgggcatcag ctgaactttg tctggctttc ctttttgctg taacaggaca acactgagtt 1920 taatgcctca ccattgatgt gttctccctc acccagtgca cgaaaatgct ctttgcacca 1980 caccacagct gccagggtgt gatggagggg tggcttcagt gcttcaagac tccttctgca 2040 accttttcag tgcctttttc agcaacacaa agttaaaagc aggtactgca agtgctcact 2100 tgagttttgg ttcttgtgaa ggagctttgc ttgcacagat agttgttaaa ttggtgtcct 2160 tgttggggaa acaatcagtg gagccttcta ttccaccatc ttgctccacc tcccatagta 2220 ctatacatct cttcttttgg ctagttctgt ttggatattt ttgctataat aaaactgtag 2280 ttgtaagtat agtgctttcc agagttcttt aatttttttt agtgaattat caagcttgaa 2340 gggttagtgg ggattcctaa atatggtagc cagctgttta gaagtatagg tagcttacgt 2400 aaccttgaac ttgcagctga tgtctgaagt aaggacagtg ttatggagga ccatgtcctt 2460 aacttttgaa gtttggctca actctagtag ttgttgtcaa aagttgatgt aacatgccta 2520 gtaattttag gaatgctgga tattgtaaag gctatattct tacttgtctg gatttaattg 2580 acttccttta aacagtgttg gactgtgtta ggttacttgt gagtcatctt gatcctttgg 2640 ggggattgat tttatgtttt gttaagaaga tagcttttat tctacctaat tccaatactc 2700 tgtagatcat ttctactact aaaccatggg cttctgggat ctcccagcta gctgtttcct 2760 ggagattata aatgactcta acacatcttt catatgcaaa ccaactaatt cagggctcat 2820 acgttcccca accacttcct ttatcaggac tctacaccct gggccactat tctcctgccc 2880 taatcagcca ggtccaggta acagaaaagt aaagacagcc gctgtacccc agagcctgct 2940 aaaagtattc aaacgagcta atcctaagcc tgattacctt gtcatgccca ctctttcctg 3000 cagaaactac agtaaaggct cttgcccacc ttgacccctc actccggctg cctcctaaca 3060 ctggtgcttc tccatgtggg cttgggtggt gtgctgtgtc ttctgtttgt agggatctgt 3120 cgatataaac cttttccttc acgatagtca tttctgtgtc tgcatatgtt accacattga 3180 ttaaaaagag taagtactgt atgattccac ttacccgaaa ttcaaaagca gacaaaatta 3240 acttatggtg ttagaagtca gggtagtggt gttttttttt tttgcttttt tttttttttt 3300 ttttttcctg gaaggaggat gtaaggaggc aggagcacag atcctgatat gctgataatc 3360 tgtatcttga cctaggtgca gcttgcaaga gggtgttcag tttgtgcaaa tcaaccaagc 3420 tgtatattta taattgggca ctttcttctt gcatgtaata cagaccagtt gcattattgg 3480 ttccaatttt ctacctccca ctatatccct gccctttacc atgtaacttt acaaatagtc 3540 tctcactttg gctctagaat ccaccatatg acttgatttg gccaatacaa taaataggaa 3600 gtaagggtgt gcttgttctt ggcctgagcc tgaagaggcc ttgtgtgttt cttctactct 3660 cgtacttttg ttattaacat tatatagaca tggtggagct agctcactca tcccaggatg 3720 agagcctcag ctaagtttct ccatccaaac acagcctgga gctgggctct aacttgttac 3780 acagatgaat gagtgaatat tgttaagata agtcaagccc agcccagatt tctgacccac 3840 agccaaccca cagatgcata agctgaagat gactggtttt atcaagctaa ttgttataat 3900 agtggagaaa agatcatgag gacaaaaagt gggcagagtc ggaagaaaag agaggaagaa 3960 attgagacag aagacatttc atttaaaaaa aatattccat tgagctgggt ttgaaatagt 4020 gcactgcctg ttctcctaat gctgtatggt gtcatgaaat ctattgttta ctgagtctat 4080 gagccagctt cctagggagg ctatggcaat tgaggacagg gaagaggtaa cactcaggaa 4140 catagaagga gaatttgggt ccaagtgggt ggagggaaaa ataactgggt ttagttttgg 4200 gtagggctgg ttttgaggtc tctgaaggac atgtaagtgg agttttccag cagggagaaa 4260 acgcagagct aaagctcata tctttgctgg caatctagat ttgggcatct tcaacaagca 4320 ggttgtagct gaggaagctg ggactggact tgtactctaa agccagtgca aaaaaagctt 4380 gaaacggcta tgatggctaa gacctggctt ttccatgaaa aatgcttcgg tcagtatgag 4440 tgattccaaa gtggtgatca attaaaaact gaagtatgat tagcattaat tataacccaa 4500 tgggaatatg ataaacgact cttggtcagc aagcagaggg tgccctgtag tgctaaagca 4560 tcaccatata ccatgtgtgc caagaatcag gagacacccc aaacgggagc agatgagggg 4620 ttgtgtctgt cattggacca gctggcctga tccagcagaa gtggatggag atacactgaa 4680 tggggctcct gggaggcgtg agttgaaggg gaaggaagag aagagacctc caaagtaagg 4740 gaagagtgaa aaatgagaag gactggggtg gagccccaag tagggaccag aggagaaaac 4800 agggataaag taatcaaggg agatgggaca ggaagatgaa agaatgaggt aaacagcagg 4860 tgggaagagg aggtcaacct aaaggagaaa gccgggtcga agaaagaagg aagagaagaa 4920 aagaagggtt gggaaacaga ggaggaggca gccaagaaag cctggaagct gaatcataga 4980 acggaagagg tagaagacgg aggggctgga ggataacata aaggtgggaa acggaagaga 5040 gaaagaaccg cgtctgcgtg tatgacggct agacaggagt tcagagaaca gcggggtcgc 5100 caggccacca cctgatgggc cacggctcat tggctctagg agctgggaaa gggcatccca 5160 ggaaagaagc cctagacttt agcctgagtc tgggccactc taggggaccg ggagtggggt 5220 ggcgggagag gacgcgcaga atctcgactt ctggccccaa tctgtgcatg atcacccgag 5280 ctcagcggac gctcctctct gacccaggca ggcggctcag ggacgcgtgc ggggatgcag 5340 agagaaaccg ctgaggaatt agggccggga gagactggta cctgccgggg gcgtgtggtg 5400 gggcagagct ggcactgatg ctgagagtgg ctaaggagcg cggcgcccca gagcagaagg 5460 gctggcagac gctcagagag ccaggatggt tcagggtcca aggaaggtcc tatgttgggt 5520 gggagctgtg agggagtgaa agtgcatgag gaaccggagg agatggaaag accttggctt 5580 gggtgttcga gggtgggact gcgtggtgac cgacggcaca gagggtgtgt gttggggcgg 5640 aagaaccacc ccagctgaat cgtccccgtg gggttttctt cccgtgtctt agttccagaa 5700 gttgccgcat cagacgctaa tagttgagga acaagtcatg gaaggacagc ctaagcggga 5760 ggtgaatgta aagccgtgga gagggcgggc gaactaagaa ggccttcgtt ctcctccggc 5820 caccgcggct gcatccttga gaaaggggta ttgctgcgaa gccgcgccag ggctggacgc 5880 ggcgaggtgg gaggcaggat ggaggggcgg gagccaaggc cgagggggcg gacacgggtg 5940 gcgtctggcg ctccataaag cggttgcggg ggccgcgctc tcttctggga gggcagcggc 6000 caccggcgag gaacacggcg cg atg cag gtt cag tgc cag cag agc cca gtg 6052 Met Gln Val Gln Cys Gln Gln Ser Pro Val 1 5 10 ctg gca ggc agc gcc act ttg gtc gcc ctt ggg gca ctg gcc ttg tac 6100 Leu Ala Gly Ser Ala Thr Leu Val Ala Leu Gly Ala Leu Ala Leu Tyr 15 20 25 gtc gcg aag ccc tcc ggc tac ggg aag cac acg gag agc ctg aag ccg 6148 Val Ala Lys Pro Ser Gly Tyr Gly Lys His Thr Glu Ser Leu Lys Pro 30 35 40 gcg gct acc cgc ctg cca gcc cgc gcc gcc tgg ttc ctg cag gag ctg 6196 Ala Ala Thr Arg Leu Pro Ala Arg Ala Ala Trp Phe Leu Gln Glu Leu 45 50 55 cct tcc ttc gcg gtg ccc gcg ggg atc c 6224 Pro Ser Phe Ala Val Pro Ala Gly Ile 60 65 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの転写開始点付近の配列を参考にして合成 <400> 2 gaaaccgctg aggaattagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの転写開始点付近の配列を参考にして合成 <400> 3 ttcgcagcaa tacccctttc 20 <210> 4 <211> 517 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaaaccgctg aggaattagg gccgggagag actggtacct gccgggggcg tgtggtgggg 60 cagagctggc actgatgctg agagtggcta aggagcgcgg cgccccagag cagaagggct 120 ggcagacgct cagagagcca ggatggttca gggtccaagg aaggtcctat gttgggtggg 180 agctgtgagg gagtgaaagt gcatgaggaa ccggaggaga tggaaagacc ttggcttggg 240 tgttcgaggg tgggactgcg tggtgaccga cggcacagag ggtgtgtgtt ggggcggaag 300 aaccacccca gctgaatcgt ccccgtgggg ttttcttccc gtgtcttagt tccagaagtt 360 gccgcatcag acgctaatag ttgaggaaca agtcatggaa ggacagccta agcgggaggt 420 gaatgtaaag ccgtggagag ggcgggcgaa ctaagaaggc cttcgttctc ctccggccac 480 cgcggctgca tccttgagaa aggggtattg ctgcgaa 517 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの転写開始点付近の配列を参考にして合成 <400> 5 ccaccgcggc tgcatccttg agaaaggggt attgc 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＩＩ型５α−レダクターゼの転写開始点付近の配列を参考にして合成 <400> 6 tttccgcggc gcgccgtgtt cctcgccggt ggccg 35 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＳＲＹのｃＤＮＡ塩基配列（翻訳開始点付近）を参考にして合成 <400> 7 ggaattctat gcaatcatat gcttctgcta 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＳＲＹのｃＤＮＡ塩基配列（ストップコドン付近）を参考にして合成 <400> 8 agaattcagc tttgtccagt ggctgtagcg 30
【図１】配列番号１に示すヒトＩＩ型５α−レダクター
ゼ遺伝子５′上流領域の構造を示す、プローブはヒトゲ
ノムライブラリーのスクリーニングに用いたものであ
る。
ゼ遺伝子５′上流領域の構造を示す、プローブはヒトゲ
ノムライブラリーのスクリーニングに用いたものであ
る。
【図２】実施例５に示す、培養ヒト毛乳頭細胞における
ＳＲＹ過剰発現実験の結果である。
ＳＲＹ過剰発現実験の結果である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR60 QR77 QR80 QX01 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 CA46
Claims (8)
- 【請求項１】 ヒトに由来するＩＩ型５α−レダクター
ゼ遺伝子のプロモーターとして作用しうる単離されたＤ
ＮＡ分子であって、（ａ）配列番号１で表されるＤＮＡ
配列からなるポリヌクレオチドにおいて、位置１〜６０
２２番目の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチ
ド、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントで
あって、位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含む少
なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列からなるフラグメ
ント、ならびに（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドのＤＮ
Ａ配列において、１個または複数個のヌクレオチドが置
換、欠失および／または付加することにより改変されて
おり、そして位置５９５２番目（Ｔ）の転写開始点を含
む少なくとも約５０の連続したＤＮＡ配列からなるポリ
ヌクレオチドを包含するポリヌクレオチド、からなる群
より選ばれるＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ分子を担持する
組換え発現ベクター。 - 【請求項３】 該ＤＮＡ分子に操作可能に連結されたレ
ポーター遺伝子をさらに担持する請求項２記載の発現ベ
クター。 - 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡ分子または請求
項２に記載の発現ベクターを含む大腸菌または哺乳動物
細胞。 - 【請求項５】 該ＤＮＡ分子に操作可能に連結されてレ
ポーター遺伝子をさらに含む請求項４記載の大腸菌また
は哺乳動物細胞。 - 【請求項６】 請求項５に記載の哺乳動物細胞を被検体
の存在下で培養し、そして培養物におけるレポーター遺
伝子の発現の程度の多寡を被検体のヒトＩＩ型５α−レ
ダクターゼ転写調節能の指標とすることを特徴とする被
検体の該転写調節能の評価方法。 - 【請求項７】 配列番号１で表されるＤＮＡ配列中に存
在する転写因子結合モチーフに対する転写因子をコード
する単離されたＤＮＡ分子を含有する発現ベクターを、
導入した哺乳動物細胞を培養することによるヒトＩＩ型
５α−レダクターゼの発現の亢進または抑制方法。 - 【請求項８】 請求項７記載の方法を被検体の存在下で
行い、該被検体の存在に起因して変化するヒトＩＩ型５
α−レダクターゼの発現量の多寡を該被検体のヒトＩＩ
型５α−レダクターゼ転写調節能の指標とすることを特
徴とする被検体の該転写調節能の評価方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2000228757A JP2002034575A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途 |
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| EP01943855A EP1306432A4 (en) | 2000-07-28 | 2001-06-28 | HUMAN GENES OF THE 5-ALPHA REDUCTASE PROMOTOR OF TYPE II AND THEIR APPLICATIONS |
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| JP2000228757A JP2002034575A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途 |
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| EP (1) | EP1306432A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002034575A (ja) |
| WO (1) | WO2002010376A1 (ja) |
Cited By (2)
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| JP2005296003A (ja) * | 2004-03-15 | 2005-10-27 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 三量体Ｇタンパク質αサブユニットＧｍ１のプロモーター及びその利用 |
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|---|---|---|---|---|
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- 2000-07-28 JP JP2000228757A patent/JP2002034575A/ja not_active Withdrawn
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- 2001-06-28 US US10/333,961 patent/US20030157536A1/en not_active Abandoned
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- 2001-06-28 EP EP01943855A patent/EP1306432A4/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005296003A (ja) * | 2004-03-15 | 2005-10-27 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 三量体Ｇタンパク質αサブユニットＧｍ１のプロモーター及びその利用 |
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Also Published As
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