WO2005108574A1 - Ｇｍ１プロモーター及びその利用 - Google Patents

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WO2005108574A1
WO2005108574A1 PCT/JP2005/005077 JP2005005077W WO2005108574A1 WO 2005108574 A1 WO2005108574 A1 WO 2005108574A1 JP 2005005077 W JP2005005077 W JP 2005005077W WO 2005108574 A1 WO2005108574 A1 WO 2005108574A1
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gml
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protein
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PCT/JP2005/005077
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Yasuhiko Takahashi
Kenji Oeda
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Sumitomo Chemical Company, Limited
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Definitions

  • the present invention relates to the promotion of the gene encoding the trimeric G protein subunit Gml and its use.
  • the G protein is a seven-transmembrane receptor, a G protein-coupled receptor (hereinafter sometimes referred to as GPCR; G-protein in coupled recep tor). Acts as a transmitter to carry into.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the G protein consists of ⁇ 3 subunits. In an inactive G protein with GDP bound to the ⁇ subunit, when receptor agonists such as hormones and neurotransmitters bind to the GPCR, GDP is released from the subunit and GTP binds instead.
  • the activated G protein in which GTP is bound to the ⁇ subunit separates from the GPCR and dissociates into the GTP-bound subunit and 3) subunit.
  • G protein regulates various cell functions by promoting or inhibiting target effectors such as adenylate cyclase, Ca 2+ channel, K + channel, and phospholipase C] 3.
  • GTP bound to the ⁇ subunit of the activated G protein becomes GDP by the action of the GTPase of the ⁇ subunit and returns to the inactive form.
  • target effectors such as adenylate cyclase, Ca 2+ channel, K + channel, and phospholipase C] 3.
  • GTP bound to the ⁇ subunit of the activated G protein becomes GDP by the action of the GTPase of the ⁇ subunit and returns to the inactive form.
  • G proteins have been identified in mammalian cells. Each of these G proteins has a unique tissue distribution. For example, G proteins distributed in nerve cells, olfactory cells, visual cells, taste cells, lung cells, kidney cells, hepatocytes and the like are known. The G protein plays an important role in hormone reception, neurotransmission,
  • G protein ⁇ -subunit Gs causes pituitary tumor, thyroid tumor or McCune-Albright syndrome. Diseases such as herd are induced.
  • loss of the function of G protein ⁇ subunit Gs induces pseudohypoparathyroidism.
  • the constant activation of G protein ⁇ -subunit Gi 2 induces pituitary tumor, adrenal cortex tumor or uterine tumor (for example, G protein mutations in endocrine diseases, European Journal of Endocrinology). (2001) vol.145, 545-559). Disclosure of the invention
  • the present invention provides a polynucleotide having a nucleotide sequence capable of controlling transcription of a gene encoding a trimeric G protein subunit Gml.
  • the polynucleotide is used for the treatment / improvement / prevention of diseases caused by abnormal expression of trimeric G protein ⁇ -subunit Gml or abnormal signal transduction via the promoter of the gene encoding the subunit. It can be used in a method for searching for a compound as an active ingredient of a drug (ie, a therapeutic drug, an improving drug or a prophylactic drug). More specifically, the present invention provides
  • a polynucleotide characterized by having a base sequence of a promoter region of a gene encoding a trimeric G protein ⁇ -subunit Gml hereinafter, sometimes referred to as the polynucleotide of the present invention
  • a gene comprising a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of (1) or (2), and which encodes a trimeric G protein subunit Gml; A nucleotide sequence capable of controlling transcription; and
  • a plasmid containing the polynucleotide according to the above 1 or 2 (hereinafter sometimes referred to as the plasmid of the present invention);
  • a plasmid comprising the polynucleotide according to 1 or 2 above and further comprising, downstream of the polynucleotide (3 'side), a polynucleotide whose transcription is controlled by the polynucleotide;
  • a plasmid comprising the polynucleotide according to 1 or 2 above and further comprising, downstream of the polynucleotide (3 'side), a reporter gene whose transcription is regulated by the polynucleotide. ;
  • a transformed cell into which the plasmid described in the preceding item 5 has been introduced (hereinafter sometimes referred to as the transformed cell of the present invention collectively as the transformed cells described in the preceding items 5 and 6);
  • a method for evaluating the ability of a substance to regulate signal transduction via a promoter of a gene encoding a trimeric G protein subunit Gml (1) the first step of bringing a test substance into contact with the transformed cells according to item 8;
  • a third step of evaluating the ability to regulate the evaluation method (hereinafter sometimes referred to as the present invention evaluation method);
  • FIG. 1 is a diagram showing that the Gml promoter of the present invention has transcription activation ability.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression of trimeric G protein ⁇ subunit Gml in brain tissue (cerebral cortex, hippocampus, cerebellum).
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of the trimeric G protein ⁇ -subunit Gm1 in brain tissue of a psychiatric patient.
  • the genetic engineering techniques used in the present invention include, for example, ⁇ Mo ecu 1 ar CI on i ng: AL abo ratory Manu al 2nd edit on j (1989), Cold Spring Harbor Borratory Press and DNA cloning (DNA C onion) by D., M., G. Lover, published by IRL, 1985, etc.
  • Trimer G protein The ⁇ subunit Gml is highly expressed in neurons in the cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum, For example, in the brain of patients with neurological and psychiatric disorders (schizophrenia, manic depression, depression and anxiety), Decreased expression Decreased expression level of G protein causes a decrease in the function of transmitting extracellular signals into cells, which indicates that decreased expression level of Gml is associated with these neurological and psychiatric disorders ( Schizophrenia, manic depression, depression and anxiety) It is suggested to be involved in the symptoms.
  • the polynucleotide of the present invention encodes a trimeric G protein subunit Gml. It is a polynucleotide having a base sequence of a region (about 3.8 kb) located upstream of the coding region in a gene, and is a kind of a regulatory gene called a promoter.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is, for example, a site at which RNA polymerase having a sigma factor binds to initiate transcription of the operon, and includes a nucleotide sequence necessary for promoting transcription.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide may be induced by, for example, a promoter element sequence under cell type-specific or tissue-specific control, or an exogenous signal or factor (eg, a transcriptional activator protein).
  • Promoter-dependent gene expression may be sufficient to cause expression of the promoter-dependent gene.
  • a transformed cell containing the polynucleotide of the present invention and a plasmid containing a reporter gene whose transcription is controlled by the polynucleotide downstream (3 'side) of the polynucleotide is introduced into mammalian cells.
  • the expression level of the reporter gene is higher than that of a transformed cell into which a plasmid containing the reporter gene and not containing the polynucleotide is introduced.
  • the polynucleotide of the present invention has the ability to regulate the transcription of a gene downstream thereof, for example, in a mammalian cell, and thus, the polynucleotide encoding the trimeric G protein subunit Gml It is a polynucleotide having a base sequence capable of controlling transcription.
  • Specific examples of the polynucleotide of the present invention include a polynucleotide having a base sequence described in any one of the following (1) to (4).
  • a nucleotide sequence having the ability to control the transcription of the gene encoding Gml (hereinafter, this ability may be referred to as the present transcription control ability).
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (1) or (2) and a stringent A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide that hybridizes under simple conditions and capable of controlling the transcription of a gene encoding a trimeric G protein ⁇ subunit Gm1.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide can be obtained by deleting a part of the nucleotides of the polynucleotide of the present invention while maintaining the ability to control the transcription of the gene encoding the trimeric G protein and the subunit Gml.
  • the base sequence of the polynucleotide (for example, prepared by cutting out with an appropriate restriction enzyme) can also be used.
  • Nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 200 to 3871, nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 300 to 3871 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, represented by SEQ ID NO: 1 The base sequence represented by base numbers 400 to 3871 in the base sequence shown, the base sequence represented by base numbers 500 to 3871 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, etc. I can give it.
  • a gene consisting of a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in any of the above base sequences, and encoding a trimer G protein ⁇ -subunit Gml A nucleotide sequence that has the ability to control the transcription of a nucleotide sequence, or a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of any of the above nucleotide sequences, and that is complementary to the trimeric G protein. Base sequences having the ability to control the transcription of the gene encoding the subunit Gml can also be mentioned.
  • such a polynucleotide of the present invention can be produced by a conventional genetic engineering method, for example, “Takaaki Tamura (published by Yodosha), New Transcription Control Mechanism (2000)”, pp. 33-40. It can be prepared according to the method described in Shintaro Nomura and Toshiki Watanabe (published by Shujunsha), Deisotope Experiment Protocol (1998), and the like. The ability of the prepared polynucleotide to control the transcription of the gene encoding the trimer G protein ⁇ subunit Gm1 is determined by the method described below, for example, by containing the polynucleotide and preparing the polynucleotide.
  • the “polynucleotide” (including an oligonucleotide) also includes a polynucleotide having a base sequence complementary to a base sequence of a polynucleotide.
  • the term “polynucleotide” includes both DNA and RNA unless otherwise specified.
  • DNA includes, in addition to single-stranded DNA having the base sequence, single-stranded DNA and double-stranded DNA complementary thereto. Furthermore, “DNA” includes cDNA, genomic DNA and synthetic DNA unless otherwise specified. “RNA” includes total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA unless otherwise specified.
  • the “modification that does not cause loss of transcription activity” can be performed, for example, on a portion having low homology to various transcription regulatory sequences already identified (that is, nucleotide sequences capable of controlling transcription). It means modification or the like.
  • the “base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added” including such a modification the ability to control the transcription of the gene encoding the trimer G protein ⁇ subunit Gml is impaired.
  • An index of how many bases can be deleted, substituted or added without being evaluated can be evaluated and confirmed by the method described later.
  • Such a modification may be made by artificially introducing a mutation. Specifically, for example, it can be obtained by randomly introducing a mutation using a method described in A. Greener, M. Callahan, Strategies (1 994) 7, 32-34, etc. , W. Kramer, et 1., Nucleic Acids Research (1 1984) 12, 9441, or W. Kramer, H. J. Frits, Methodsin Enz ymo lo gy (1 98 7) gapped dup 1 ex method described in 154, 350, etc., or TA Knoke Proc. of Natl. Ac ad. Sci.
  • a polynucleotide or the like comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, one or several partial nucleotide sequences are obtained by preparing a chimeric DNA in which a part of the polynucleotide of another promoter is replaced. For example, it is described in S. Henikoff, eta 1., Gene (1984) 28, 351, C. Yan isch-Perr on, et al., Gene (1985) 33, 103, etc.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to the following polynucleotides. That is, (1) under high ion concentration [for example, 6XSSC (containing 90 OmM sodium chloride and 90 mM sodium citrate)]. Then, hybridization was carried out at a temperature of 65 ° C. to form a polynucleotide-polynucleotide hybrid. (2) Under a low ion concentration [for example, 0.2 IX SSC (15 mM sodium chloride and 1. Containing 5 mM sodium citrate). A polynucleotide capable of maintaining the hybrid even after washing at a temperature of 65 for 30 minutes.
  • 6XSSC containing 90 OmM sodium chloride and 90 mM sodium citrate
  • the base sequence of such a polynucleotide includes a base sequence derived from another species (eg, human and rat) corresponding to the base sequence derived from mouse.
  • a base sequence can be selected, for example, by NCBI blast search (ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
  • NCBI blast search using the nucleotide sequence near the translation initiation codon of the Gml gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a target sequence, it is highly homologous from the genome sequence database of other species.
  • the base sequence can be searched.
  • polynucleotide consisting of the base sequence upstream of the translation start point of the base sequence selected by the search it is possible to select a polynucleotide consisting of the base sequence containing the promoter region of the corresponding other species. it can. Selected poly
  • the ability of nucleotides to control transcription of the gene encoding the trimeric G protein subunit Gm1 can be confirmed by the method described below. Examples of the method for preparing the polynucleotide of the present invention include a chemical synthesis method, PCR, and a hybridization method.
  • an automatic DNA synthesizer such as a DNA synthesizer model 380A (manufactured by ABI) can be used.
  • a method for preparing the polynucleotide of the present invention using PCR will be described.
  • genomic library is described in, for example, "Mocular Cloning: A Labratory Manu al 2nd edition J (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.” It can be prepared from mammalian tissues such as human, mouse, rat, etc.
  • commercially available genomic DNA such as human genome DNA (manufactured by Clontech), and human genome war kit ( A commercially available genomic library such as Clontech Co., Ltd. can be used.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence of base numbers 1 to 20 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the primers of base numbers 3851 to 3871 in SEQ ID NO: 1 PCR is performed using a primer consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, and the primer can be appropriately designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • 'A terminal may be added with a restriction enzyme recognition sequence, etc.
  • the DNA amplified as described above may be obtained from "Molecular C 1 oning: A Laboratory Manual 2nd edition” (1989), Co. ld Sp ri ng Harbor Labo ratory Press, “Curent Protocols In Molecular Biol ogy” (1987), John Wiley & Sons, Inc. I SBN 0—471—50338 _ Vector according to the usual method described in X etc. Can be cloned. Specifically, for example, cloning can be performed using a plasmid vector contained in a cloning kit manufactured by Invit 1 "03 611 or a plasmid vector such as pBluescriptll manufactured by Stratage.
  • the nucleotide sequence of the cloned polynucleotide can be found in F. Sanger, S. Nicklen, AR Cou ls on, Proceeding ng sof Na ti al al Ad emy of Science USA (1977), 74, 5463-5467, etc., and can be analyzed by the dideoxy mineralization method, etc. Next, a method for preparing the polynucleotide of the present invention using the hybridization method will be described.
  • the DNA used for the probe is labeled.
  • a polynucleotide having at least a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention to be prepared for example, a nucleotide represented by nucleotides 603 to 3871 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Polynucleotides comprising a lost, substituted or added nucleotide sequence, polynucleotides which hybridize with the above-mentioned polynucleotides under stringent conditions, and the like can be mentioned.
  • DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 100 to 3871 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and represented by base numbers 200 to 3871 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA consisting of the base sequence, DNA consisting of the base sequence Nos. 300 to 3871 in the base sequence shown in SEQ ID No. 1, and showing the base sequence Nos. 400 to 3871 in the base sequence shown in SEQ ID No. 1
  • the DNA used for the probe is, for example, a chemical synthesis method, PCR, hybridization, or the like.
  • the polynucleotide can be obtained by the usual method for preparing a polynucleotide described above as the “method for preparing the polynucleotide of the present invention” such as the Chillon method.
  • labeling can also be performed by performing a PCR reaction using the DNA used in the probe as a ⁇ type.
  • a fluorescent dye or an enzyme for example, EC FD irect Nucleic Acid Label and Detection System (Amersh Am Pharmacia Biotech) or A1 kphos Direct DNA labeling and detection kit (Amersh Am Pharmacia Biotech) or the like can be used.
  • a genomic DNA library derived from an animal such as a rodent such as a mouse or a rat or a primate such as a human can be used.
  • DNA library a commercially available genomic DNA library can be used, or “Mocular C 1 oning: A Laboratory Manua 1 2nd edition” (1989), Cold Spring Harbor L abo ratory Press ⁇ “Cu rrent Protocols In Molecular Biolgy” (1987), John Wi 1ey & Sons, Inc.I SBN0—471—50338—X, etc.
  • ⁇ vectors such as ⁇ FIXII, ⁇ EMBL 3> ⁇ EMBL4, ⁇ DASH II manufactured by Stratage ne, and Gig ap ackpackaging Extracts
  • S A genomic DNA library can be prepared using in vitro packaging (tratagene) or the like and used.
  • the hybridization method includes a colony hybridization primer. Hybridization can be mentioned, and it is preferable to select a method according to the type of vector used for preparing the library. For example, if the library to be used is a library constructed with plasmid vectors, colony hybridization can be performed.
  • transformed cells are obtained by introducing the library DNA into a host microorganism, and the resulting transformed cells are diluted and plated on an agar medium, and incubated at 37 ° C until colonies appear. Perform culture.
  • the library to be used is a library constructed with a fuzz vector
  • plaque hybridization can be performed. Specifically, first, the host microorganism and the phage of the library are mixed under conditions that allow infection, and then mixed with a soft agar medium, and spread on an agar medium. Then culture at 37 ° C until plaques appear. More specifically, for example, Molecular Cloning 2nd edition (J. Sam Rook, EF Frisch, T. Maniatis, Cold Spring Laboratory Press 1989) 2.
  • a membrane filter is placed on the surface of the agar medium on which the above-mentioned culture has been performed, and the transformed cells or phage carrying the plasmid are transferred to the membrane filter. .
  • the membrane filter is subjected to an alkali treatment, a neutralization treatment, and a treatment for fixing DNA to the filter.
  • a nitrocellulose filter or a nylon filter such as Hybond-N + (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) is placed on the agar medium and allowed to stand for about 1 minute to remove phage particles. Adsorb the membrane fill at night. Next, the filter is soaked in an alkaline solution (1.5M sodium chloride, 0.5N sodium hydroxide) for about 3 minutes.
  • a neutral solution 1.5 M sodium chloride, 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5
  • a washing solution (30 OmM sodium chloride, 3 OmM sodium citrate, 200 mM Tris-HCl) for about 5 minutes, for example, by baking at about 80 ° C for about 90 minutes
  • the phage DN Fix A to Phil Yuichi. Hybridization is performed using the thus prepared filter and the probe.
  • containing 450-90 OmM sodium chloride, 45-90 mM sodium citrate and containing sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration of 0.1-1.0% (W / V) Contains non-specific DNA at a concentration of 0 to 200 ⁇ g / mL, and may optionally contain albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. at a concentration of 0 to 0.2% (W / V).
  • Prehybridization solution preferably 90 OmM sodium chloride, 9 OmM sodium citrate, 1% (W / V) SDS and 100 g / mL denatured C a 1 f — t hymu s DNA
  • a pre-hybridization solution containing the solution is prepared at a rate of 50 to 200 L per 1 cm 2 of the filter prepared as described above, and the filter is immersed in the solution to obtain a solution at 42 to 68 ° C. Incubate for ⁇ 4 hours, preferably at 45 ° C for 2 hours.
  • a hybridization solution containing a concentration of 0 to 200 gZmL and optionally containing albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. at a concentration of 0 to 0.2% (W / V) Preferably, a hybridization solution containing 90 OmM sodium chloride, 9 OmM sodium citrate, 1% (WZV) SDS and 100 gZmL of denatured C a1 f-thymus DNA, and the method described above.
  • a solution obtained by mixing a probe obtained by the above procedure (for example, a 32 P-labeled probe with an equivalent amount of 1.0 ⁇ 10 4 to 2.0 ⁇ 10 6 cpm / cm 2 filter) is used.
  • the filter Incubate at 45 ° C for 16 hours to perform the hybridization reaction. After the hybridization reaction, the filter is taken out and contains 15 to 30 OmM sodium chloride, 1.5 to 3 OmM sodium citrate, and 0.1 to 1.0% (W / V) SDS etc. Filter for 10-60 minutes with a wash solution at 68 ° C, preferably a wash solution at 55 ° C containing 30 OmM sodium chloride, 30 mM sodium citrate, and 1% (W / V) SDS Wash one to four times, preferably twice for 15 minutes. In addition, lightly rinse the filter with 2 XS SC solution (containing 30 OmM sodium chloride and 30 mM sodium citrate) and dry.
  • 2 XS SC solution containing 30 OmM sodium chloride and 30 mM sodium citrate
  • This filter is subjected to, for example, autoradiography to detect the position of the probe on the filter, thereby detecting the position of the DNA that hybridizes with the used probe on the filter.
  • autoradiography By specifying a clone corresponding to the position of the detected DNA on the filter on the original agar medium and picking it, a clone having the DNA can be isolated.
  • the filter is exposed to an imaging plate (Fuji Film) for 4 hours, and the plate is then exposed to an imaging analyzer B A
  • a phage clone containing a DNA comprising a base sequence that hybridizes with the probe used can be obtained.
  • the DNA possessed by the clone obtained by performing the screening by hybridization as described above is a plasmid vector that can be easily prepared and analyzed, for example, commercially available pUC 18, pUC 19, pBLUESCR I PT KS 10, pBL Plasmid DNA was prepared by subcloning into UESCR I PT KS-, etc., and written by F. Sanger, S.
  • the plasmid into which the polynucleotide of the present invention (here, the polynucleotide of the present invention means DNA) may be inserted as long as it is a plasmid capable of functioning in a desired cell.
  • a marker gene for example, a kanamycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, etc. for selecting cells into which the plasmid has been introduced.
  • a gene insertion site is further provided at a position where the polynucleotide of the present invention and a desired gene are operably linked on a plasmid, for example, downstream of a site where the polynucleotide of the present invention is inserted.
  • the gene insertion site is, for example, a nucleotide sequence that can be specifically recognized and cleaved by a restriction enzyme generally used in gene engineering techniques, and is a kind of a type that is present only on a plasmid having the polynucleotide of the present invention.
  • Restriction enzyme recognition sequences are preferred.
  • Escherichia coli is used as a host
  • PUC-based plasmids such as PBR322 (manufactured by Boehringer Mannheim), pUC12, pUC118, and pUC119 (manufactured by Takara Shuzo), and Bacillus bacteria such as pBluescript are used as hosts.
  • PBR322 manufactured by Boehringer Mannheim
  • pUC12, pUC118, and pUC119 manufactured by Takara Shuzo
  • Bacillus bacteria such as pBluescript
  • pUBl10, pC194 and the like can be mentioned.
  • yeast When yeast is used as a host, Yip5, Yep24 and the like can be mentioned.
  • insect cells are used as a host, AcNPV and the like can be mentioned.
  • pUC18, PUC19 and the like can be mentioned.
  • Insertion of the polynucleotide of the present invention into the above-mentioned plasmid can be carried out by a conventional method, for example, as described in "Molecular C 1 oning: AL aboratory Manu al 2 ndediti onj (1989), Cold Spring, Harbor L aboratory P. ress, "Curent Protocols In Molecular Biology” (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471_50338-X It can be carried out.
  • the plasmid to be introduced into the transformed cell used in the search method of the present invention includes, for example, a polynucleotide whose transcription is controlled by the polynucleotide downstream (3 'side) of the polynucleotide of the present invention.
  • the plasmid of the present invention containing the luciferase gene under the control of the polynucleotide of the present invention is capable of controlling the transcription of the present invention contained in the plasmid. It can be preferably used when measuring.
  • a plasmid should be prepared using a commercially available plasmid containing the luciferase gene, for example, a plasmid such as PGL 3_basic (produced by Romega) or PicaGeneBasic Vector (produced by Toyo Ink). Can be.
  • a polynucleotide containing the luciferase gene under the control of the polynucleotide of the present invention is inserted into the pGL3-basic gene insertion site in a functional manner by a conventional method.
  • Inventive plasmids can be made.
  • the method for preparing the transformed cell of the present invention ie, the transformed cell into which the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention has been introduced) will be described below.
  • Examples of host cells into which the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention is introduced include bacteria such as Escherichia coli (for example, K12) and Bacillus bacteria (for example, MI114), yeast (for example, AH22), cells such as plant cells and animal cells. Any cell may be used as long as the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention is retained in the cell.
  • the host cell for preparing the transformed cell of the present invention used in the search method of the present invention is preferably an animal cell (eg, PC-12 cell, Neuro-2a cell, IMR-32 cell, C0S-7 cell, Vero Cell, CH0 cell, ES cell, etc.), and particularly preferably a nerve cell.
  • the transformed cell of the present invention in which the host cell is an ES cell is the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention. It includes a transformed cell into which the introduced ES cell has been differentiated, and a transformed cell into which the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention has been introduced into the cell after the ES cell has been differentiated.
  • the transformed cells of the present invention also include cells that exist in animal individuals (ie, transformed animals) produced by generating from these transformed cells.
  • a method for introducing the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention into host cells a method depending on the cell can be applied.
  • a method depending on the cell for example, calcium phosphate method, electrotransfer method, DEAE dextran method, micelle formation can be applied to animal cells. Laws and the like can be applied.
  • the calcium phosphate method the method described in Grimm, S. et 1., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 93, 10923-10927, etc. may be mentioned.
  • Examples of the electrophoresis method and the DEAE dextran method include the methods described in Ting, ATeta 1., EMBO J., 15, 6189-6196, and the micelle formation method. Hawkins, CJ et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 93, 13786-13790.
  • the micelle formation method for example, commercially available reagents such as Ribofectamine (manufactured by Gibeo BRL) and Fugen (manufactured by Boehringer Mannheim) can be used.
  • a cell to which the polynucleotide of the present invention or the plasmid of the present invention has been introduced may be, for example, a selectable marker gene introduced into a host cell simultaneously with the polynucleotide or the plasmid of the present invention, or a selectable marker contained in the plasmid of the present invention.
  • the transformed cells can be selected by using the gene or the like and culturing the cells in a culture medium under selection conditions according to the selection marker gene.
  • the present invention provides a method including a step of bringing a test substance into contact with the transformed cell of the present invention. That is, a method for searching for a signal transmission regulator via a promoter of a trimeric G protein ⁇ -subunit Gml,
  • test substance is introduced into a transformed cell containing the polynucleotide of the present invention and having a plasmid containing a repo overnight gene introduced downstream (3 ′ side) of the polynucleotide.
  • This search method is a method for searching for a substance having the ability to regulate signal transduction via a promoter of a gene encoding a trimeric G protein subunit Gml using a so-called repo overnight gene atsy.
  • the transformed cells of the present invention using mammalian cells as host cells are preferable.
  • mammalian cells for example, PC-12 cells, Neuro-2a cells, IMR-32 cells, Vero cells, Helo cells
  • the transformed cell of the present invention in which a known mammalian cell such as a cell, CV1 cell, C0S1 cell, CH0 cell, and ES cell is a host cell, is particularly preferred.
  • the transformed cells may be prepared as described above.
  • a test substance to be brought into contact with a transformed cell containing the polynucleotide of the present invention and having a plasmid containing a repo all-in-one gene downstream (3 'side) of the polynucleotide is introduced.
  • the concentration may be generally about 0.001 M to about 10; preferably about 0.01 M to about 10; more preferably about 0.1 M to about 10; uM.
  • the time for bringing the cells into contact with the test substance is usually about 1 hour to about 5 days, preferably several hours to about 4 days. Preferably, it is about 18 hours or more and about 60 hours, and more preferably about 24 hours to about 40 hours.
  • the contact between the cell and the test substance may be performed while culturing under conditions that allow the cell to grow.
  • D_MEM, OPTI-MEM, RPMI 1640 medium Gibco_BRL manufactured by Gibco_BRL
  • RPMI 1640 medium Gibco_BRL manufactured by Gibco_BRL
  • Can be cultured in a commercially available medium such as Culture is usually performed at about 30 ° C to about 40 ° C, about 2% (V / V) to: L 0% (V / V) in the presence of carbon dioxide. More preferably, it is carried out in the presence of about 4% (VZV) to about 6% (V / V) carbon dioxide.
  • the number of cells in contact with the test substance may be, for example, about 1 ⁇ 10 4 cells / to about 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ in a 96-well plate. 10 4 Z Ueru to about 8 X 10 4 Noueru are preferred.
  • the method of “monitoring the expression level of a reporter gene or an index value correlated therewith” includes a method of monitoring the expression level of the repo overnight gene in the transformed cells or the index value correlated therewith with time. Any method can be used as long as it can be measured continuously or discontinuously along the line.
  • a method for detecting the expression product of the reporter gene that is, mRNA corresponding to the gene or a protein encoded by the gene (specifically, Northern blotting, Western blotting, etc.) can be used.
  • a method for measuring the activity of the enzyme may be used.
  • the amount of mRNA corresponding to the reporter gene can be measured by, for example, Northern blotting using a polynucleotide containing a part of the reporter gene, RT_PCR, or the like.
  • the amount of the protein corresponding to the reporter gene can be measured using an antibody against the protein produced from the reporter gene.
  • reporter genes that can be used include, for example, luciferase gene, secreted alkaline phosphatase (SEAP) gene, chloramphenico-l-acetyltransferase. Preferred are those whose measurement of the activity of the expressed protein is easy, such as the lase gene and the i3 galactosidase gene.
  • the expression level of the luciferase gene can be determined by adding luciferin (for example, manufactured by Toyo Ink Co., Ltd.) as a luminescent substrate to the cell lysate and measuring the luminescence due to the decomposition of the substrate using a luminometer, liquid scintillation counter, or a top counter. What is necessary is just to measure.
  • the expression level of the alkaline phosphatase gene can be measured using, for example, Lumi-Phos530 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the expression level of the chloramphenico-lucacetyltransferase gene can be measured by using FAST CAT Chrola immediately henicol Acetyltransferase Assay Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the expression level of the 3-galactosidase gene can be measured using Aurora Gal-XE (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the protein encoded by the gene emits fluorescence, such as the GFP (Green Fluo rescent Protein) gene as a repo overnight gene, measure the amount of fluorescence emitted by the produced protein. do it.
  • fluorescence such as the GFP (Green Fluo rescent Protein) gene
  • the contact between the cell and a test substance and the measurement of the present transcription control ability of the polynucleotide of the present invention in the cell are performed, and an increase in the transcription control ability is detected as compared with a control (for example, when a change such as an increase of about 30%, preferably about 50%, and more preferably about 100% is observed, or when a decrease is detected (for example, about 30%, preferably about 50%, More preferably, when a change such as a decrease of about 100% is observed), the test substance acts on the promoter to regulate the transcription control ability, that is, the trimer G protein ⁇ subunit Gml Can be selected as a signal transduction regulator via the promoter of the gene encoding the gene.
  • the type of the test substance is not particularly limited. Examples include proteins, peptides, non-peptidic compounds (sugars, lipids, etc.), organic low molecular weight compounds, inorganic low molecular weight compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. .
  • the expression level of the reporter gene operably linked to the polynucleotide of the present invention in the cells after contacting with the test substance was determined as follows.
  • the transcription control ability of the test substance may be evaluated by comparing the expression level in the cell (hereinafter referred to as measured value 2).
  • the main transfer control capability may be obtained as a transfer control ratio using the above measured value according to the following equation.
  • Transfer control rate (%) ⁇ (measured value 1-measured value 2) Z measured value 2 ⁇ X I 0 0
  • a substance showing a statistically significant value in the transcription control rate representing the present transcription control ability of the test substance specifically, for example, a substance showing at least 30%, more preferably at least 50%
  • the substance is selected as a substance having the transcription control ability.
  • the main transcription of the substance based on the difference obtained by comparing the change in the expression level of the repo overnight gene in each of the plots in which two or more different substances as test substances were used independently was The control ability may be evaluated.
  • a substance having the main transfer control ability can be selected based on the main transfer control ability evaluated in this way.
  • at least one of the two or more different substances may be a substance not having the transcription control ability (eg, a solvent, a test system solution serving as a background, or the like).
  • the transcription control ability of the other test substance may be evaluated. Further, the transcription control ability of the other test substance may be evaluated based on the transcription control ability of at least one of the two or more different substances.
  • the kit of the present invention is a kit comprising a test cell holding a recombinant repo overnight vector having the polynucleotide of the present invention (here, DNA) and a reagent for measuring reporter activity.
  • the kit of the present invention may further include a control cell into which a plasmid having no polynucleotide of the present invention (here, DNA) is introduced. Such control cells can be used as a negative control.
  • the kit is based on the book It can be used for the invention search method.
  • the substance selected by the above-described search method can control the activity of the polynucleotide of the present invention
  • the expression of the gene under the control of the polynucleotide of the present invention in cells can be controlled. Therefore, the substance or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used as a transcription control agent characterized in that the substance or the pharmaceutically acceptable salt contains them as an active ingredient and is formulated into a pharmaceutically acceptable carrier. May be used.
  • the substance is useful, for example, as a medicament for a disease caused by overexpression or underexpression of a translation product of the gene.
  • the substance has an effect on nerve cells, such as a gene of interest linked under the control of the polynucleotide of the present invention, for example, a gene presumed to be associated with a neurological or psychiatric disorder, and the expression level of Gm1. It can also be used as a transcriptional regulator when examining the effects on diseases caused by abnormalities in chromosomes or signal transmission via the Gm1 gene promoter (particularly, neurological and psychiatric disorders).
  • the method for selecting a substance that binds to the polynucleotide of the present invention comprises a first step of bringing the polynucleotide of the present invention into contact with a test substance; A second step of examining the presence or absence of complex formation between the polynucleotide and the test substance after the step, and selecting a substance that binds to the polynucleotide based on the analysis result of the presence or absence of complex formation obtained in the second step Including the third step.
  • the polynucleotide used in the first step of bringing the polynucleotide of the present invention into contact with a test substance can be obtained by labeling the polynucleotide of the present invention with, for example, a commercially available DNA labeling kit using a radioisotope or a fluorescent dye compound. It is preferable in that it facilitates detection of the complex of the polynucleotide and the test substance.
  • a radioisotope for example, a commercially available R and om Lingling Kit or the like can be used.
  • the dCTP conventional PCR reactions in the composition in place in the shed one 32 P] dCTP, rows PC R The reaction was polynucleotides of the present invention to ⁇
  • the polynucleotide can be labeled.
  • a fluorescent dye for example, EC FD irect Nucleic Acid Labeling and Detection System can be used.
  • the polynucleotide of the present invention and a test substance are subjected to about 4 ° C to about 37 ° C, preferably about 2X to about 30 ° C, for about 5 minutes to about 60 minutes, preferably for about 10 minutes to about Contact for 30 minutes in a suitable buffer, for example in a buffer of Tris, Hepes, MES, etc., preferably in a Hepes buffer.
  • the concentration of the test substance may be generally about 0.1 ⁇ 1 to about 1,000, preferably 1 M to 100 M.
  • the amount of the polynucleotide may be generally about 1 fmo1 to about 10 fmo1, and preferably 2 fmo1 to 7 fmo1.
  • Examples of a method for examining the presence or absence of a complex between the polynucleotide of the present invention and a test substance include a gel shift method, a footprint method, and a BIACORE method.
  • a gel shift method, a footprint method, or the like may be used.
  • the BI ACORE method for example, "Real-time analysis and experiment method for biological material interaction, co-authored by Kazuhiro Nagata and Handa Hiroshi-Focusing on BI ACORE-Springer's Fairark Tokyo Co., Ltd.” The method described may be used.
  • a mixed solution of the polynucleotide of the present invention and a test substance is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis by an ordinary method.
  • the polyacrylamide gel after electrophoresis is dried, it is subjected to, for example, photoradiography to detect the position of the polynucleotide on the gel to determine whether the polynucleotide and the test substance are bound.
  • the dried gel is exposed to an imaging plate for about 1 hour to about 1 mm, more preferably 6 to 8 hours, and an image image is obtained with an imaging analyzer.
  • test substance in which the shift force of the band is detected can be selected as a substance that binds to the polynucleotide of the present invention. Since the binding substance thus selected can bind to the polynucleotide of the present invention, it can control the transcription control ability of the polynucleotide of the present invention. Furthermore, the expression of a gene under the control of the polynucleotide of the present invention in a cell can be controlled.
  • the substance or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used as a transcription control agent characterized by containing the active ingredient as an active ingredient and being formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. May be used.
  • the substance is useful as a medicament for diseases caused by overexpression or underexpression of the translation product of the gene.
  • the substance may be a desired gene linked under the control of the polynucleotide of the present invention, such as a gene that is presumed to be associated with a neurological or psychiatric disorder or a gene that is presumed to be associated with behavior or memory.
  • the purification method of the present invention comprises: a first step of bringing a polynucleotide of the present invention into contact with a sample to form a complex of the polynucleotide and a substance that binds to the polynucleotide contained in the sample; and After the first step, a second step of isolating the binding substance from the produced complex is included.
  • the polynucleotide of the present invention When the polynucleotide of the present invention is brought into contact with a sample, usually, when the polynucleotide is brought into contact with a sample in a form in which the polynucleotide is bound to a carrier, a complex of the polynucleotide or the polynucleotide and a binding substance is obtained. Is preferred because it can be easily recovered.
  • the type of carrier to which the polynucleotide is bound is not particularly limited. For example, a commercially available carrier for affinity mouth chromatography, preferably cyanogen bromide-activated Sepharose 4B (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like is used. can do.
  • the polynucleotide When binding the polynucleotide to a carrier, the polynucleotide There are a method in which the tide is directly bonded to the carrier and a method in which the tide is bonded via a spacer.
  • Conditions for binding include, for example, mixing the polynucleotide and cyanogen bromide-activated Sepharose 4B, stirring at about 4 ° C. to about 10 at 1 ⁇ 100 rpm, and mixing the polynucleotide. On the Sepharose. Then, in order to eliminate unreacted cyanogen bromide active groups, a buffer containing a compound having an amino group, for example, a sodium hydrogencarbonate solution containing 1 M glycine, for example, at about 4 ° C.
  • the obtained gel may be brought into contact with a sample by an ordinary batch method, and the gel is filled in a commercially available chromatographic tube to prepare an affinity column for a substance that binds to the polynucleotide of the present invention.
  • the sample may be brought into contact with the sample by ordinary column chromatography.
  • the sample is subjected to the above-described affinity column to form a complex of the polynucleotide of the present invention and the polynucleotide-binding substance, followed by washing of the carrier and removal of the binding substance.
  • the bound substance can be isolated.
  • a sample is first loaded on the affinity column described above, and then the column is washed with a buffer having the same composition as when loading, to remove components in the sample that did not form a complex. Thereafter, a substance that binds to the polynucleotide of the present invention is isolated by performing a gradient elution in which the salt concentration contained in the buffer is increased to elute the substance that has bound to the polynucleotide of the present invention from the column.
  • the salt used for elution include sodium chloride, potassium chloride, ammonium sulfate and the like.
  • a substance that is selected by the above-described selection method for a substance that controls the present transcription control ability of the polynucleotide of the present invention or a substance that binds to the polynucleotide of the present invention by the purification method of the present invention is selected by the above-described selection method.
  • a transcription control agent comprising a substance selected by the method of the present invention or the method of the present invention for searching for a binding substance or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient can be administered orally or parenterally to humans or the like. It can be administered to mammals.
  • the present transcription controlling agent can be used in a usual form such as a tablet, a capsule, a syrup, a suspension and the like.
  • the present transcription control agent When administered parenterally, can be used in the form of ordinary liquid preparations such as solutions, emulsions and suspensions.
  • a method for parenterally administering the present transcription control agent in the above-mentioned form include a method for injection and a method for administration to the rectum in the form of a suppository.
  • the above-mentioned appropriate dosage form is to mix a substance selected by the present search method or a pharmaceutically acceptable salt thereof with an acceptable ordinary carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent, etc. Can be manufactured.
  • an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
  • the dosage varies depending on the age, sex, weight, degree of disease, type of the transcription control agent, dosage form, etc., of the mammal to be administered.
  • the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
  • Diseases to which the present transcription regulator can be applied include diseases caused by abnormal signal transduction through the promoter of the G protein gene (particularly, neurological and psychiatric disorders). Neurological and psychiatric disorders such as schizophrenia, manic depression, depression and anxiety.
  • the transcription control agent may be used to treat, improve, and prevent these diseases.
  • Example 1 (Cloning of Polynucleotide Containing Mouse Gml Promoter One Region)
  • a polynucleotide containing the mouse Gml promoter region was isolated as follows.
  • a probe DNA containing the 5 'upstream region of the mouse Gm1 gene was prepared by the following procedure.
  • an IOM feed primer mGmg-1 (5'tgttctcccgacccttcagggatcttcttt; SEQ ID NO: 4), and a linear primer of ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Amplified DNA was obtained by PCR using Limer mGmg_2 (5, 1 acctatgagcagcaatggatagagtctat; rooster column number 5) and TAKARATaq polymerase (TAKARALATaq with GC Buffer, manufactured by Takara Shuzo).
  • the PCR conditions were 95 cycles of 95 seconds for 30 seconds, then 60 t for 30 seconds, and then 72 cycles of 2 minutes for 35 cycles.
  • the DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, the DNA was purified using QIAquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAGEN) and collected. The recovered DNA was used as type II DNA for probe in the following experiments.
  • mouse Gml promoter was isolated by the following procedure.
  • phages were inoculated on 20 15 cm NZY plates, and cultured at 37 ° C. for 8 hours to form plaques.
  • Nitrocellulose membrane is brought into contact with the plaque-formed plate to Transferred onto rocellulose membrane.
  • the nitrocellulose membrane and the probe DNA labeled with alkaline phosphatase were hybridized using an Alkphos Direct DNA labeling and detection kit (manufactured by Amersham Bioscience) according to the protocol attached to the kit. A trial was conducted. The detection of signals by hybridization was also performed using an Alkphos Direct DNA labeling and detection kit (manufactured by Amersham Bioscience) according to the protocol attached to the kit.
  • Example 2 (Construction of repo overnight vector containing mouse Gml promoter region)
  • the phage DNA containing the mouse Gm1 promoter region obtained in Example 1 was digested with Sacl.
  • the resulting digest was subjected to agarose gel electrophoresis, and then purified using a QIAquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAGEN) to recover DNA.
  • the recovered DNA was used as an insert DNA in the following experiments.
  • vector DNA was prepared by treatment with phospholipase. Then, 50 ng of the prepared vector DNA and 10 ng of the above-described insert DNA were ligated using a T4 ligase to prepare a Gml promoter overnight reporter vector-pGL-Gml / ScI.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the sequence corresponds to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 603 to 3871 in SEQ ID NO: 1) Inserted into the Sacl site of pGL3.
  • a phage DNA containing the mouse Gm1 promoter region obtained in Example 1. was digested with Nhel. The resulting digest was subjected to agarose gel electrophoresis, and then purified using a QIAquick Ge 1 Extraction kit (manufactured by QIAGEN) to recover DNA. The recovered DNA was used as an insert DNA in the following experiments.
  • pGL3 was digested with Nhel and treated with alkaline phosphatase to prepare vector-DNA.
  • the resulting Gml promoter repo overnight vector pGL_Gml / NheI was prepared by ligating 50 ng of the prepared vector DNA and the insert DNA10118 using a ligation probe.
  • pGL-Gm1ZSacI was double-digested with Ndel and Xhol, the resulting digest was subjected to agarose gel electrophoresis, and the 2 kb DNA was purified using QIAquick Ge1 Extraction kit (QIAGEN). , Collected. The recovered DNA was used as an insert DNA in the following experiments.
  • pGL—Gml / NheI was double digested with Ndel and Xhoi.
  • a Gml promoter-reporter vector pGL-Gml was prepared by ligating 50 ng of the obtained digest (vector-DNA) and 10 ng of insert DNA using T4 ligase.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is inserted between the Sacl site and the Nhel site of pGL3.
  • Example 3 Measurement of transcription activity of mouse Gm1 promoter
  • the transcription activation ability of the Gm1 promoter of the present invention obtained in Example 2 was measured as follows.
  • PC12 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a 96-well plate and cultured for about 24 hours.
  • the cultured cells were treated with the Gml promoter repo overnight obtained in Example 2 pGL-Gml (0.2 g) or pGL-GmlZSacI (0.2 g) by the lipofection method.
  • Test cells were prepared by transfection.
  • Control cells were prepared by transfection of the cells seeded in the same manner as described above with a repo overnight vector (pGL3; 0.2 g) containing no Gml promoter using the lipofection method. did.
  • the expression distribution of the trimeric G protein ⁇ -subunit Gm1 protein in the brain was analyzed by fluorescent tissue immunostaining using an anti-Gml antibody. That is, a mouse brain section (manufactured by Novagen) fixed with paraformaldehyde was deparaffinized, and then autoclaved (120, 15 minutes) in a 0.01M citric acid solution. Next, the brain slice was incubated at 4 ° C for 1 hour in an anti-Gml antibody (1/100 dilution) diluted using a blocking reagent included in TSA Kit # 12 (Morkyura Probe). .
  • the brain slice was washed twice with a PBS solution, and then incubated at 4: 1 for 1 hour in an HRP-labeled anti-heron IgG antibody attached to TSA kit # 12 (manufactured by Molecular Probes).
  • TSA kit # 12 manufactured by Molecular Probes
  • the brain section was washed twice with a PBS solution, and then using a tyramide signal amplification kit included in TSA kit # 12 (Molecular Probe) according to the protocol attached to the kit. Detection of the fluorescent signal was performed. The fluorescence signal was observed using a fluorescence microscope. The result is shown in figure 2.
  • Trimeric G protein ⁇ subunit Gml protein was found to be highly expressed in cerebral cortex, hippocampus, and cerebellar neurons.
  • Example 5 Immunostaining using anti-Gm1 antibody in brain tissue of a psychiatric patient
  • the expression of the trimeric G protein subunit Gml protein in the brain of a patient with a human psychiatric disorder was analyzed by a tissue immunostaining method using an anti-Gml antibody.
  • a human brain slice slide LandMark Low Density Neuropsychiatric Tissue MicroArrays (manufactured by Ambion Chito) fixed with paraformaldehyde was removed.
  • Raffin After the treatment, the slides were autoclaved in an MM citrate solution (120 ° C, 15 minutes), and the slides containing the brain sections (hereinafter abbreviated as “slides”) were washed with ultrapure water. After that, the slides were incubated in methanol containing 3% hydrogen peroxide for 10 minutes at room temperature, and the incubated slides were washed three times with a TN solution (0.1 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl).
  • a TN solution 0.1 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl
  • the slides were then incubated for 30 minutes at room temperature in the blocking reagent provided with the TS A Piotin System NEL 700 (Perkinelmer), and then slides were incubated with the TS A Piotin System NEL 700 (PerkinelEmer). After incubating for 1 hour at 4 in anti-Gml antibody (diluted 1: 100) diluted with the blocking reagent attached to the lmer (made by Lmer Inc.), this was added to a TN solution (0.1 M Tris pH 7.5, (0.15M NaCl) three times.
  • a TN solution 0.1 M Tris pH 7.5, (0.15M NaCl
  • the slides were then incubated at 4 ° C in HRP-labeled anti-Egret IgG antibody (1Z200 dilution) diluted in the blocking reagent provided with the TSA Biotin System NEL700 (PerkinElmer) at 4 ° C. After incubation for an hour, it was washed three times with a TN solution (0.1 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl).
  • the slides were incubated at room temperature for 10 minutes in a piotinylated tyramide amplification reagent attached to TSA Piotin System NEL700 (PerkinElmer), and then the TN solution ( Washed three times with 0.1M Tris pH7.5, 0.15M NaCl).
  • the slides were incubated at room temperature for 30 minutes in an anti-HRP-labeled anti-avidin antibody attached to TSA Biotin System NEL700 (manufactured by PerkinElmer), and then the TN solution (0.1 M Washed three times with Tris pH7.5, 0.15M NaCl).
  • Example 6 (Construction of Reporter Vector Containing Mouse Gml Promoter Region) p, which is a reporter vector containing the nucleotide sequence of the mouse Gml promoter region GL-Gml / 843-3900 is constructed as follows.
  • the phage DNAlOng containing the region was used for type I, and 10 / iM of pharmacophoric acid—prmGmg—843 (5—atcatcacaacaggaaagtaataaaa; rooster column number 6), 10 M reverse primer—prmGmg-3900 (5 ′ Perform PCR using attgtgcatccttcgaacgtccca; SEQ ID NO: 7) and TAKARA LA Taq polymerase (TAKARA LA Taq with GC Buffer, manufactured by Takara Shuzo).
  • the PCR conditions are as follows: for 30 seconds at, then at 30 at 60 and then at 72 ° C for 2 minutes for 1 cycle, and this cycle is performed for 35 cycles.
  • the DNA is purified and recovered using a QIAquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAGEN). The recovered DNA is used as insert DNA in the following experiments.
  • Plasmid pDrive—Gml / 843-3900 is obtained by ligating the insert DNAlOng with 50 ng of pDrive vector (QIAGEN) using T4 ligase.
  • the resulting plasmid pDrive—Gml / 843-3900 was double digested with Mlul and Sacl.
  • the obtained digest is subjected to agarose gel electrophoresis, and then purified using QIAquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAG EN) to recover DNA. Use the recovered DNA as insert DNA in the following experiments.
  • base number 843 of SEQ ID NO: 1 Amplifies the DNA having the nucleotide sequence represented by No. 3776 from pGL-Gml / 843-3, which is a repo all-in-one vector containing the nucleotide sequence of the mouse Gm1 promoter region by the same procedure as above. Build 776.
  • the transcription activation ability of the Gml promoter of the present invention is measured as follows.
  • Test cells are prepared by transfection of the cultured cells with the Gml promoter-reporter vector (pGL-Gml; 0.2 g) obtained in Example 2 using the lipofection method.
  • Gml promoter-reporter vector pGL-Gml; 0.2 g
  • the medium in the well is removed. After adding 0.10 ml of fresh medium to the well, add 0.1 ⁇ to 10 ⁇ of the test substance and incubate at 37 ° C for 24 hours.
  • the medium in the well was removed, and the well was washed with a PBS buffer solution.
  • a cell lysis solution (Pitka Gene Luciferase Kit, manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.)
  • a luminescent substrate (Pitka Gene Luciferase Kit, manufactured by Toyo Ink Mfg.) Is added to the wells. Is measured using a luminometer overnight. As a control, the luminescence intensity is similarly measured for cells not contacted with the test substance.
  • the transcriptional activation ability of the Gm1 promoter of the present invention obtained in Example 2 is measured as follows.
  • the Gm1 promoter reporter vector (pGL-Gml or pGL-GmlZSacI; 0.2 g each) obtained in Example 2 was transfected into the cultured cells by the lipofection method.
  • Test cells In addition, control cells are prepared by transfection of a repo overnight vector (pGL3; 0.2 g) having no Gml promoter overnight using the lipofection method.
  • the medium in the well was removed, and the well was washed with a PBS buffer solution.
  • a cell lysate (Pitka Gene Luciferase Kit, manufactured by Toyo Ink Mfg.)
  • a luminescent substrate (Pitka Gene Luciferase Kit, manufactured by Toyo Ink Mfg.) Is added to the wells. Measure the emission intensity of the well using a luminometer. As a control, the luminescence intensity is similarly measured for cells not contacted with the test substance.
  • the plasmid pGL-Gml58 of the present invention described in Example 3 is digested with 101 and M1uI each at 10 U at 37 in a 20 / L reaction solution for 1 hour.
  • the restriction enzyme digestion reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis, and the insert DNA is purified using QI Aquick Gel Reaction Kit.
  • TE solution 1 OmM Tris-HCl and ImMEDT A (hereinafter referred to as TE solution).
  • TE solution 1 OmM Tris-HCl and ImMEDT A (hereinafter referred to as TE solution).
  • t G 50 MicroCollums (Amersham Pharmacia Biotech) and centrifugation (room temperature, 1200 rpm, 1 minute) to elute the labeled DNA.
  • the resulting radioactivity of the eluate was measured with a scintillation Isseki one to obtain a 10 4 c pm Bruno L to become so diluted with TE solution labeled DNA solution.
  • 5X binding buffer (5 OmM Hepes potassium monoxide (pH 7.8), 250 mM potassium chloride, 5mM EDTA (pH 8.0), 25mM magnesium chloride, 50% (W / V) glycerol, 25mM dithiothreitol, 3.5mM PMS F, 10g / mL A protinin, 10g / Contains mL Pestatin, 10 II g / mL Leupeptin, and 5 mM sodium orthovanadate. ) 5 / xL, 2 ng / L polydl dC 1.5 L, 10 L of 10 M test substance and 2 L of labeled DNA solution are mixed and made up to a total of 25 L with distilled water.
  • test substance that has been selected is selected as a substance that binds to the polynucleotide of the present invention.
  • Example 11 1 Purification of a binding substance to the polynucleotide of the present invention by the purification method of the present invention
  • Plasmid of the present invention P GL— Gml 200 / g Is digested with 50 U of each of XhoI and MluI in a 200 L reaction solution at 37 ° C for 1 hour.
  • the restriction enzyme digestion reaction solution is subjected to agarose gel electrophoresis, and the DNA is obtained by purifying using a QIAQ Quick Gel Extraction Kit.
  • a medium containing FBS is added in an amount of about 10 times the amount of trypsin-EDTA solution to obtain a cell suspension. Centrifuge the obtained cell suspension (room temperature, 1,300 rpm, 5 minutes), and remove the supernatant. Suspend the cell pellet in 15 mL of phosphate buffer, centrifuge again at room temperature at 1,300 rpm for 5 minutes, and remove the supernatant. Thereafter, the cell precipitate was ice-cooled in 10 mL of 1 OmM Hepes potassium hydroxide (pH 7.8), 1 OmM potassium chloride, 0.1 mM EDTA (pH 8.0) (hereinafter referred to as buffer A).
  • a polynucleotide or the like characterized by having a base sequence that is a promoter region of a trimeric G protein ⁇ -subunit Gml.
  • the polynucleotide and the like can be obtained by a method for searching for a signal transduction regulator via the promoter of the trimeric G protein subunit Gml, and a method for obtaining the trimer G protein ⁇ subunit Gm1 obtained by the searching method. It is useful for research and development of pharmaceuticals for neurological and psychiatric disorders, characterized by containing a compound having the ability to regulate signal transduction through a promoter or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Oligonucleotide primers designed for PCR Oligonucleotide primers designed for PCR.

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Abstract

本発明は、三量体Ｇタンパク質αサブユニットＧｍ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を有するポリヌクレオチド、より具体的には、プロモーター領域の塩基配列が、例えば（１）、（２）等に記載される塩基配列である前記ポリヌクレオチド、及びその利用等に関する。（１）配列番号１で示される塩基配列、（２）配列番号１で示される塩基配列における塩基番号６０３番から３８７１番で示される塩基配列

Description

005 005077
1 明細書
Gm 1プロモー夕一及びその利用 技術分野
本発明は、三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lをコードする遺伝子のプロモ —夕一及びその利用に関する。 背景技術
Gタンパク質は、 7回膜貫通型受容体である Gタンパク質共役型受容体 （以下、 G PCRと記すこともある。 ； G- pro te in coupl ed recep t or) が受けた刺激のシグナルを 細胞内に運ぶ伝達器としての役割を果たす。 Gタンパク質は α 3ァのサブュニットか らなる。 αサブユニットに GDPが結合した不活性型の Gタンパク質では、 ホルモンや 神経伝達物質などの受容体ァゴニストが GPCRに結合すると、 ひサブュニッ卜から GDP が放出され、 これに代えて GTPが結合する。 αサブユニットに GTPが結合した活性型 G タンパク質は、 GPCRから離れるとともに、 GTP結合型ひサブユニットと) 3アサブュニ ットとに解離する。活性型 Gタンパク質は、標的エフェクターであるアデニル酸シク ラーゼ、 Ca2 +チャネル、 K+チャネル、 ホスホリパーゼ C ]3等を促進又は抑制すること により、多彩な細胞機能を調節する。活性型 Gタンパク質の αサブユニットに結合し た GTPは、 αサブユニットが有する GTPaseの作用により GDPとなり、 不活性型に戻る。 これまで、哺乳動物の細胞において多種類の Gタンパク質が同定されている。 これ らの Gタンパク質はそれぞれ固有の組織分布を示す。 例えば、 神経細胞、 嗅細胞、 視 細胞、 味細胞、 肺細胞、 腎細胞又は肝細胞等に分布する Gタンパク質が知-られている 。 Gタンパク質は、 このような固有の組織において細胞のシグナル伝達系に関与する ことにより、 ホルモン受容、 神経伝達、 細胞の増殖 ·分化などに重要な役割を果たす 。
Gタンパク質 αサブュニットが正常な機能を失うことにより、様々な疾患が誘発さ れることが明らかになってきている。例えば、 Gタンパク質ひサブュニット G sが定 常的に活性化されることにより、下垂体腫瘍、 甲状腺腫瘍又は McCune-Al br i gh t症候 群等の疾患が誘発される。 また、 Gタンパク質 αサブユニット Gsの機能が消失する ことにより、 偽性副甲状腺機能低下症が誘発される。 また、 Gタンパク質 αサブュニ ット G i 2が定常的に活性化されることにより、下垂体腫瘍、副腎皮質腫瘍又は子宮 腫瘍が誘発される （例えば、 G protein mutations in endocrine diseases, European Journal of Endocrinology (2001) vol.145， 545-559) 。 発明の開示
本発明は、三量体 Gタンパク質 サブユニット Gmlをコードする遺伝子の転写を 制御する能力を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。当該ポリヌク レオチドは、 三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlの発現量の異常、 又は、 当該 サブユニットをコードする遺伝子のプロモーターを介したシグナル伝達の異常に起 因する疾患の治療 ·改善 '予防のための医薬 （即ち、 治療薬、 改善薬又は予防薬） の 有効成分としての化合物を探索するための方法等において利用することができる。 より詳しくは、 本発明は、
1.三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlをコードする遺伝子のプロモーター領 域の塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド （以下、本発明ポリヌクレ ォチドと記すこともある。 ） ；
2. プロモーター領域の塩基配列が、 以下の （1) 〜 （4) のいずれかに記載される 塩基配列であることを特徴とする前項 1記載のポリヌクレオチド。
(1) 配列番号 1で示される塩基配列、
(2)配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 603番から 3871番で示 される塩基配列、
(3) 上記 （1) 又は （2) の塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gmlをコードする遺伝子の転写を制御する能力を有する塩基配列、 及び
(4) 上記 （1) 又は （2) の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件下にハイプリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的であり、かつ 三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gmlをコードする遺伝子の転写を制御する能 力を有する塩基配列；
3 . 前項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするプラスミド （ 以下、 本発明プラスミドと記すこともある。 ） ；
4 . 前項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有し、かつ当該ポリヌクレオチドの下 流 （3 ' 側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるポリヌクレオチド を含有することを特徴とするプラスミド；
5 . 前項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有し、かつ当該ポリヌクレオチドの下 流 （3 ' 側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるレポ一ター遺伝子 を含有することを特徴とするプラスミド；
6 . 前項 1又は 2記載のポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換細胞；
7 . 前項 3又は 4記載のプラスミドが導入されてなる形質転換細胞；
8 . 前項 5記載のプラスミドが導入されてなる形質転換細胞（以下、 前項 5及び 6に 記載の形質転換細胞と一括して、 本発明形質転換細胞と記すこともある。 ） ；
9 .三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm lをコードする遺伝子のプロモータ一を 介したシグナル伝達調節物質の探索方法であつて、
( 1 ) 前項 8記載の形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、
( 2 )前記第一工程後に、 レポーター遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値をモ 二夕一する第二工程、
( 3 )前記第二工程によりモニターされた発現量又はそれと相関する指標値の変化に 基づき、前記物質が有する、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm lをコードする 遺伝子のプロモータ一を介してシグナル伝達を調節する能力を評価する第三工程、及 び
( 4 )前記第三工程で評価されたシグナル伝達調節能力に基づき、三量体 Gタンパク 質 αサブュニット Gm lをコードする遺伝子のプロモータ一を介してシグナル伝達 を調節する能力を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法 （以下、 本発明探索方法と記すこともある。 ） ；
1 0 . 物質が有する、三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lをコードする遺伝子 のプロモーターを介したシグナル伝達調節能力を評価する方法であって、 ( 1 ) 前項 8記載の形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、
( 2 )前記第一工程後に、 レポーター遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値をモ 二夕一する第二工程、 及び
( 3 )前記第二工程によりモニターされた発現量又はそれと相関する指標値の変化に 基づき、前記物質が有する、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm lをコードする 遺伝子のプロモータ一を介してシグナル伝達を調節する能力を評価する第三工程、 を有することを特徴とする評価方法 （以下、 本発明評価方法と記すこともある。 ） ；
1 1 . 前項 1記載のポリヌクレオチドと結合する物質の探索方法であって、
( 1 ) 前項 1記載のポリヌクレオチドと被験物質とを接触させる第一工程、
( 2 )前記第一工程後に、 当該ポリヌクレオチドと被験物質との複合体生成の有無を 調べる第二工程、 及び
( 3 )前記第二工程で得られた複合体生成の有無の分析結果に基づき、 当該ポリヌク レオチドと結合する物質を選抜する第三工程、
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明結合物質探索方法と記すこともあ る。 ） ；
1 2 . 前項 1記載のポリヌクレオチドと結合する物質の精製方法であって、
( 1 )前項 1記載のポリヌクレオチドと試料とを接触させて、 当該ポリヌクレオチド と、当該試料中に含有される当該ポリヌクレオチドと結合する物質との複合体を生成 させる第一工程、 及び、
( 2 ) 前記第一工程後、 生成させた複合体から、 当該ポリヌクレオチドと結合する物 質を単離する第二工程、
を有することを特徴とする精製方法 （以下、 本発明精製方法と記すこともある。 ） ；
1 3 . 前項 8記載の形質転換細胞と、 レポーター遺伝子の発現量又はそれと相関する 指標値の測定試薬とを含む、三量体 Gタンパク質ひサブュニッ卜 Gm lをコードする 遺伝子のプロモー夕一を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット（以下 、 本発明キットと記すこともある。 ） ；
1 4 . 前項 9又は 1 1記載の探索方法により得られる、三量体 Gタンパク質ひサブュ ニット Gm 1をコードする遺伝子のプロモー夕一を介したシグナル伝達調節能力を 有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成 分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする神経'精神疾患 用医薬 （以下、 本発明医薬と記すこともある。 ） ；
等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の Gmlプロモーターが転写活性能を有することを示す図である。 図 2は、 三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlの脳組織 （大脳皮質、 海馬、 小 脳） における発現を示す図である。
図 3は、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm 1の精神疾患患者脳組織における 発現を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、 たとえば、 「Mo 1 e c u 1 a r C I on i ng : A L abo r a t o r y Manu a l 2nd e d i t i onj ( 1989) , Co l d Sp r i ng Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s及び D. ， M. , G l ove r著、 DNA クローニング （DNA C 1 o n i ng) 、 I RL発行、 1985年などに記載されている通常の方法に準じて行うこと ができる。 三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlは、 大脳皮質、 海馬、 小脳の神経細胞で 高く発現している。 例えば、 神経 ·精神疾患患者 （統合失調症、 躁鬱病、 うつ病及び 不安症） の脳では、 当該 Gmlの発現が低下している。 Gタンパク質の発現量の低下 は、細胞外からのシグナルを細胞内に伝える機能の減衰を引き起こす。 このことより 、 Gmlの発現量の低下が、 これら神経，精神疾患 （統合失調症、 躁鬱病、 うつ病お よび不安症） の症状に関わっていることが示唆される。
本発明ポリヌクレオチドは、三量体 Gタンパク質ひサブュニッ卜 Gmlをコードす る遺伝子においてコーディング領域の上流に位置する領域 （約 3. 8 k b ) の塩基配列 を有するポリヌクレオチドであって、所謂プロモーターと呼ばれる調節遺伝子の一種 である。 当該ポリヌクレオチドの塩基配列は、 例えば、 σ因子を持つ R N Aポリメラ ーゼが結合してオペロンの転写を開始する部位であり、転写を促すために必要な塩基 配列を含む。 さらに、 当該ポリヌクレオチドの塩基配列は、 例えば、 細胞型特異的も しくは組織特異的な制御を受けるプロモーター要素配列や、外来性のシグナルもしく は因子（例えば、 転写活性化蛋白質） によって誘導されるプロモー夕一依存的遺伝子 発現を引き起こすために十分なプロモー夕一要素配列を含んでいてもよい。
本発明ポリヌクレオチドを含有し、 かつ当該ポリヌクレオチドの下流 （3 ' 側） に 、当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるレポーター遺伝子を含有するブラ スミドが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞は、レポーター遺伝子を含有し 当該ポリヌクレオチドは含有しないプラスミドが導入されてなる形質転換細胞に比 ベて、 レポ一夕一遺伝子の発現量が高くなる。 即ち、 本発明ポリヌクレオチドは、 例 えば哺乳動物細胞において、その下流にある遺伝子の転写を制御する能力を有してお り、 よって、三量体 Gタンパク質ひサブユニッ ト Gm lをコードする遺伝子の転写を 制御する能力を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドである。 本発明ポリヌクレオチドとしては、 具体的には例えば、 以下の （1 ) 〜 （4 ) のい ずれかに記載される塩基配列を有するポリヌクレオチド等をあげることができる。
( 1 ) 配列番号 1で示される塩基配列
( 2 )配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 6 0 3番から 3 8 7 1番で示 される塩基配列（当該配列は、配列番号 2で示される塩基配列に相当する塩基配列で ある。 ）
( 3 ) 上記 （1 ) 又は （2 ) の塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ三量体 Gタンパク質ひサブュニット
Gm lをコードする遺伝子の転写を制御する能力（以下、 当該能力を本転写制御能力 と記すこともある。 ） を有する塩基配列
( 4 ) 上記 （1 ) 又は （2 ) の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン 卜な条件下にハイプリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的であり、かつ 三量体 Gタンパク質 αサブユニット G m 1をコードする遺伝子の転写を制御する能 力を有する塩基配列 例えば、本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列としては、本発明ポリヌクレオ チドが有する三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lをコードする遺伝子の転写 を制御する能力を維持したまま、 その一部分の塩基を欠失させて得られる （例えば、 適当な制限酵素を用いて切り出すことにより調製される）ポリヌクレオチドの塩基配 列をあげることもできる。そのような塩基配列の具体的な例としては、配列番号 1で 示される塩基配列における塩基番号 1 0 0番から 3 8 7 1番で示される塩基配列、配 列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 2 0 0番から 3 8 7 1番で示される 塩基配列、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 3 0 0番から 3 8 7 1番 で示される塩基配列、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 4 0 0番から 3 8 7 1番で示される塩基配列、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 5 0 0番から 3 8 7 1番で示される塩基配列等をあげることができる。 また、 前記のい ずれかの塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加され た塩基配列からなり、かつ三量体 G夕ンパク質 αサブュニット Gm lをコードする遺 伝子の転写を制御する能力を有する塩基配列や、前記のいずれかの塩基配列からなる ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下にハイブリダィズするポリヌクレオ チドの塩基配列に相補的であり、かつ三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lをコ ードする遺伝子の転写を制御する能力を有する塩基配列等をあげることもできる。 尚、 このような本発明ポリヌクレオチドは、 通常の遺伝子工学的方法、 例えば、 「 田村隆明著 （羊土社刊） 、 新転写制御のメカニズム （2 0 0 0年） 」 3 3〜4 0頁、 「野村慎太郎、 渡辺俊樹監修著 （秀潤社刊） 、 脱アイソトープ実験プロトコール （1 998年） 」 等に記載された方法に準じて作製すればよい。 作製されたポリヌクレオチ ドが有する、三量体 Gタンパク質 αサブユニット G m 1をコードする遺伝子の転写を 制御する能力は後述する方法、例えば、 当該ポリヌクレオチドを含有しかつ当該ポリ ヌクレオチドの下流（3 '側） にレポ一夕一遺伝子を含有するプラスミドが導入され てなる形質転換細胞を用いたレポータージーンアツセィ等により確認することがで さる。 本発明において 「ポリヌクレオチド」 （オリゴヌクレオチドを含む） には、 ポリヌ クレオチドが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドも含ま れる。 また 「ポリヌクレオチド」 には、 特に言及しない限り、 DNA及び RNAの双方が含 まれる。
また 「DNA」 には、 その塩基配列を有する 1本鎖 DNAの他に、 それに相補的な 1本鎖 DNA、 及び 2本鎖 DNAが含まれる。 さらにまた、 「DNA」 には、 特に言及しない限り、 c DNA, ゲノム DNA及び合成 DNAが含まれる。 「RNA」 には、 特に言及しない限り、 total RNA、 mRNA、 r RNA及び合成 RNAが含まれる。
本発明において 「転写活性を喪失しない改変」 とは、 例えば、 既に同定されている 各種の転写調節配列 （即ち、 転写を制御する能力を有する塩基配列） と相同性が低い 部分について行うことができる改変等を意味するものである。このような改変を含む 「1個もしくは複数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列」 において、 三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlをコードする遺伝子の転写を制御する能 力を損なうことなく、 どの塩基を何個欠失、 置換もしくは付加できるかの指標は、 後 述する方法により評価及び確認することができる。
このような改変は人為的に変異導入することによって作製してもよい。具体的には 、 例えば、 A. G r e e n e r, M. C a l l a h a n、 S t r a t e g i e s (1 9 94) 7, 3 2— 34等に記載される方法を用いてランダムに変異を導入すること によって取得することができ、 、 W. K r ame r, e t 1. 、 Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c h (1 9 84) 1 2， 944 1もしくは W. K r am e r, H. J . F r i t s , Me t h o d s i n En z ymo l o gy (1 98 7) 1 54, 3 50等に記載のギャップド ·デュープレックス （g a p p e d d u p 1 e x) 法、 または T. A. Ku n k e P r o c. o f Na t l . Ac a d. S c i . U. S. A. (1 9 8 5) 8 2, 48 8もしくは T. A. Ku n k e 1 , e t a l . 、 Me t hod s i n En z ymo l ogy (1987) 154， 367等に記載のクンケル（Kunk e 1)法を用いて部位特異的に変異を 導入することによって取得することができる。 あるいは、配列番号 1で示される塩基 配列からなるポリヌクレオチド等において、 1ケ所ないし数力所の部分塩基配列を、 他のプロモーターのポリヌクレオチドの一部と入れ換えたキメラ DNAを作製する ことによって取得することができ、 それには例えば、 S. He n i k o f f , e t a 1. 、 Ge ne (1984) 28， 351、 C. Yan i s c h- Pe r r on, e t a l . 、 Ge ne (1985) 33， 103等に記載された方法を用いるこ とができる。 本願において「ストリンジェン卜な条件下にハイプリダイズするポリヌクレオチド 」 とは、 以下に示すポリヌクレオチドをいう。 即ち、 （1) 高イオン濃度下 [例えば 、 6XS SC (90 OmMの塩化ナトリウムおよび 90 mMのクェン酸ナトリウムを 含有する） 等が挙げられる。 ] に、 65°Cの温度条件でハイブリダィズさせることに よりポリヌクレオチド一ポリヌクレオチドハイプリッドを形成し、 （2)低イオン濃 度下 [例えば、 0. IX S SC (15mMの塩化ナトリウムおよび 1. 5mMのク ェン酸ナトリウムを含有する） 等が用いられる。 ] に、 65 の温度条件で 30分間 洗浄した後でも当該ハイブリッドが維持されうるポリヌクレオチドをいう。 このようなポリヌクレオチドの塩基配列には、マウス由来の塩基配列に対応する他 の生物種 （例えばヒト及びラット） 由来の塩基配列等が含まれる。 このような塩基配 列は、 例えば、 NCBIの blastサーチ （ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等により選抜す ることができる。具体的には例えば、配列番号 3で示される塩基配列を有する Gml 遺伝子の翻訳開始コドン付近の塩基配列を対象配列とした NCBIの blastサーチにより 、他の生物種のゲノム配列データベースから相同性の高い塩基配列を検索することが できる。当該検索により選択された塩基配列の翻訳開始点より上流の塩基配列からな るポリヌクレオチドを選抜することにより、対応する他の生物種のプロモーター領域 を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドを選抜することができる。選抜されたポリ ヌクレオチドが有する、三量体 Gタンパク質ひサブユニット G m 1をコードする遺伝 子の転写を制御する能力は後述する方法により確認することができる。 本発明ポリヌクレオチドの調製方法としては、 例えば、 化学合成法、 PCR、 ハイ ブリダイゼ一ション法等が挙げられる。
化学合成法を用いて調製する場合、 DNA自動合成機、 例えば DNA合成機モデ ル 380A (ABI社製） 等を用いることができる。 次に、 PCRを用いて本発明ポリヌクレオチドを調製する方法について説明する。 铸型とするゲノムライブラリ一は、例えば、 「Mo l e c u l a r C l on i ng ： A Labo r a t o r y Manu a l 2 nd e d i t i o n J (1989 )、 Co l d Sp r i ng Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s等 に記載されている方法に準じてヒト、 マウス、 ラット等の哺乳動物の組織から調製す ることができる。 また、 ヒトゲノム DN A (クローンテック製） 等の市販のゲノム D NAや、 ヒトゲノムウォー力一キット （クローンテック製） 等の市販ゲノムライブラ リーを用いることができる。次いで、増幅させるプロモータ一に対応したプライマー 、配列番号 1で示される塩基配列を有する本発明ポリヌクレオチドを調製する場合で あれば、例えば、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 1番から 20番で 示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号 1における塩基番号 3851番か ら 3871番で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマーと を用いて PC Rを行う。 尚、 かかるプライマーは、 配列番号 1で示される塩基配列に 基づいて適宜設計することができ、 また、 その 5' 末端側に、 制限酵素認識配列等を 付加してもよい。前記のようにして増幅された DNAは、 「Mo l e c u l a r C 1 o n i n g： A La bo r a t o r y Manu a l 2nd e d i t i on 」 （ 1989) ， Co l d Sp r i ng Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s, 「 Cu r r e n t P r o t o c o l s I n Mo l e c u l a r B i o l ogy」 （1987) , J ohn Wi l e y & S on s, I n c . I SBN 0— 471— 50338 _ X等に記載される通常の方法に準じてベクター にクローニングすることができる。具体的には例えば I n v i t 1" 03 611製の丁 クロ一ニングキッ卜に含まれるプラスミドベクターや S t r a t ag e ne製の p B l ue s c r i p t l lなどのプラスミドベクタ一を用いてクローニングするこ とができる。 クローニングされたポリヌクレオチドの塩基配列は、 F. S ang e r , S . N i c k l e n, A. R. Cou l s on著、 P r o c e e d i ng s o f Na t i on a l Ac ad emy o f S c i e nc e U. S. A. (19 77) , 74, 5463— 5467等に記載されるダイデォキシ夕一ミネ一ティング 法などにより分析することができる。 次に、ハイブリダィゼーシヨン法を用いて本発明ポリヌクレオチドを調製する方法 について説明する。
まず、 プローブに用いる DN Aを標識する。 プローブに用いる DNAとしては、 調 製しょうとする本発明ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部を有するポリ ヌクレオチド、例えば、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 603番か ら 3871番で示される塩基配列もしくはその一部の連続した塩基配列からなるポ リヌクレオチドであってその鎖長が 20塩基以上 1000塩基以下であるポリヌク レオチド、前記ポリヌクレオチドの塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基が欠 失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオ チドとストリンジェン卜な条件下にハイプリダイズするポリヌクレオチド等を挙げ ることができる。具体的には、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 10 0番から 3871番で示される塩基配列からなる DNA、配列番号 1で示される塩基 配列における塩基番号 200番から 3871番で示される塩基配列からなる DNA、 配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 300番から 3871番で示され る塩基配列からなる DNA、配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 400 番から 3871番で示される塩基配列からなる DNA、配列番号 1で示される塩基配 列における塩基番号 500番から 3871番で示される塩基配列からなる DNA等 を挙げることができる。
プローブに用いる前記 DNAは、 例えば、 化学合成法、 PCR、 ハイブリダィゼー シヨン法等、 「本発明ポリヌクレオチドの調製方法」 として前述した通常のポリヌク レオチドの調製方法によって得ることができる。
プローブに用いる前記 DN Aを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベー リンガー製、宝酒造製の R a n d om Lab e l l i ng K i t等を用いること ができ、 通常の PCR反応組成中の d CTPを [«—32P] dCTPに替えて、 プロ ーブに用いる前記 DN Aを铸型にして PC R反応を行うことにより、標識を行うこと もできる。 また、 プローブに用いる DN Aを蛍光色素又は酵素で標識する場合には、 例えば、 EC F D i r e c t Nu c l e i c Ac i d L abe l l i ng and De t e c t i on S y s t em(Ame r s h am P h a r m a c i a B i o t e c h製）又は A 1 k p h o s D i r e c t DNA l ab e l i n g and d e t e c t i on k i t (Ame r s h am P h a r m a c i a B i o t e c h製） 等を用いることができる。
プローブをハイブリダィズさせる DNAライブラリ一としては、 例えば、 マウス、 ラットなどのげつ歯類や、ヒトなどの霊長類等の動物由来のゲノム DN Aライブラリ 一等を使用することができる。
当該 DN Aライブラリ一には、市販のゲノム DN Aライブラリーを用いることもでき るし、 また 「Mo l e c u l a r C 1 o n i n g： A Labo r a t o r y M a n u a 1 2nd e d i t i on」 （1989) ， Co l d S p r i ng H a r bo r L abo r a t o r y P r e s sゃ「 Cu r r e n t P r o t o c o l s I n Mo l e c u l a r B i o l ogy」 （1987) ， J ohn W i 1 e y & Son s, I n c. I SBN0— 471— 50338— X等に記載さ れる通常のライブラリ一作製法に従い、例えば、 S t r a t age n e製の λ F I X I I、 λ EMBL 3> λ EMBL4、 λ DASH I I等の λベクターを 用レ 、 G i g ap a c k p a c k a g i ng Ex t r a c t s (S t r a t ag e n e製）等を i n v i t r oパッケージングに用いてゲノム DNAライブラリー を作製し、 これを用いることもできる。 ハイブリダィゼ一シヨン方法としては、コロニーハイブリダィゼーションゃプラー クハイブリダイゼーシヨンをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベ クタ一の種類に応じて方法を選択するとよい。例えば、使用されるライブラリーがプ ラスミドベクタ一で構築されたライブラリ一である場合には、コロニ一ハイプリダイ ゼーシヨンを行うことができる。具体的にはまず、 ライブラリーの DNAを宿主微生 物に導入して形質転換細胞を取得し、得られた形質転換細胞を希釈して寒天培地にま き、 コロニーが現れるまで 37°Cで培養を行う。 また、 使用されるライブラリーがフ ァ一ジベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダィゼ ーションを行うことができる。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファー ジを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上に まく。 その後、 プラークが現れるまで 37°Cで培養を行う。 より具体的には、 例えば 、 Mo l e c u l a r C l on i ng 2nd e d i t i on (J. S amb r o o k, E. F. F r i s c h, T. Man i a t i s著、 Co l d S p r i n g Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s 1989年） 2. 60か ら 2. 65等に記載されている方法に準じて、 NZY寒天培地に寒天培地 lmm2当 り 0. 1〜1. O p f uの密度で、 約 9. 0 X 105 p f uのファージライブラリ一 を広げ、 37°Cで 6〜10時間培養する。 次いで、.前記のいずれのハイブリダィゼ一ション法を用いた場合も、前述の培養を 行つた寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転 換細胞やファージを当該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルタ —をアルカリ処理した後、 中和処理し、 次いで、 DNAを当該フィルタ一に固定する 処理を行う。 より具体的には例えば、 プラークハイブリダィゼーシヨンの場合には、 クロ一ニングとシークェンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、 杉浦 編集、 農村文化社 1989年） 等に記載の通常の方法に準じて、 前記寒天培地の上に ニトロセルロースフィルタ一又はナイロンフィル夕一等、例えば、 Hybond— N + (Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h製） を置き、 約 1分間 静置してファージ粒子をメンブレンフィル夕一に吸着させる。次に、 当該フィルター をアルカリ溶液 （1. 5M塩化ナトリウム、 0. 5N水酸化ナトリウム） に約 3分間 浸してファージ粒子を溶解させてファージ DNAをフィルタ一上に溶出させた後、中 和溶液 （1. .5 M塩化ナトリウム、 0. 5M卜リス塩酸、 pH7. 5) に約 5分間浸 す処理を行う。 当該フィルターを洗浄溶液（30 OmM塩化ナトリウム、 3 OmMク ェン酸ナトリゥム、 200 mMトリス塩酸） で約 5分間洗つた後、 例えば、 約 80 °C で約 90分間べ一キングすることによりファージ DN Aをフィル夕一に固定する。こ のように調製されたフィルタ一と、前記プローブとを用いてハイブリダィゼーシヨン を行う。 ハイブリダィゼーシヨンを行う際の試薬及び温度条件は、 例えば、 D. M. G l ove r編「DNA c l on i ng, a p r a c t i c a l app r o a c h」 I RL PRESS ( 1985) I SBN 0— 947946— 18 - 7、 クローニングとシークェンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル （渡辺、 杉浦編集、 農村文化社 1989年） 、 または、 Mo l e c u l a r C l on i n 2nd e d i t i on (J. S amb r ook, E. F. F r i s c h, T. M an i a t i s著、 Co l d S p r i ng H r bo r Labo r a t o r y P r e s s, 1989年） 等に記載の方法に準じて行うことができる。 例えば、 4 50〜 90 OmMの塩化ナトリウム、 45〜 90 mMのクェン酸ナトリウムを含み、 ドデシル硫酸ナトリウム （SDS) を 0. 1〜1. 0% (W/V) の濃度で含み、 変 性した非特異的 DNAを 0〜200 ^ g/mLの濃度で含み、場合によってはアルブ ミン、 フイコール、 ポリビニルピロリドン等をそれぞれ 0〜0. 2% (W/V) の濃 度で含んでいてもよいプレハイブリダィゼーシヨン溶液、好ましくは、 90 OmMの 塩化ナトリウム、 9 OmMのクェン酸ナトリウム、 1% (W/V) の SDSおよび 1 00 g/mLの変性 C a 1 f — t hymu s DNAを含むプレハイブリダィゼ —シヨン溶液を、 前記のようにして作製したフィルター 1 cm2当り 50〜 200 Lの割合で準備し、 当該溶液に前記フィルター.を浸して 42〜68°Cで 1〜4時間、 好ましくは、 45 °Cで 2時間保温する。 次いで、 例えば、 450〜90 OmMの塩化 ナトリウム、 45〜9 OmMのクェン酸ナトリウムを含み、 SDSを 0. 1〜1. 0 % (W/V) の濃度で含み、 変性した非特異的 DNAを 0〜200 gZmLの濃度 で含み、 場合によってはアルブミン、 フイコール、 ポリビニルピロリドン等をそれぞ れ 0〜0. 2 % (W/V) の濃度で含んでいてもよいハイブリダィゼ一シヨン溶液、 好ましくは、 90 OmMの塩ィ匕ナトリウム、 9 OmMのクェン酸ナトリウム、 1% ( WZV)の SDSおよび 100 gZmLの変性 C a 1 f - t h ymu s DNAを 含むハイブリダィゼ一シヨン溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（例え ば、 32 P標識されたプローブをフィルター 1 cm2当り 1. 0 X 1 04〜2. 0 X 1 0 6 c pm相当量）とを混合した溶液をフィルタ一 1 cm2当り 50〜200 の割合 で準備し、 当該溶液にフィルターを浸し 42〜68°Cで 4〜20時間、 好ましくは、
45°Cで 16時間保温しハイブリダィゼーシヨン反応を行う。当該ハイブリダィゼー シヨン反応後、 フィルターを取り出し、 15〜 30 OmMの塩化ナトリウム、 1. 5 〜3 OmMのクェン酸ナトリウム、 および 0. 1〜1. 0% (W/V) の SDS等を 含む 42〜68 °Cの洗浄溶液等、 好ましくは、 30 OmMの塩化ナトリウム、 30m Mのクェン酸ナトリウム、 および 1% (W/V) の SDSを含む 55 °Cの洗浄溶液で 、 10〜60分間のフィルター洗浄を 1〜4回、好ましくは 15分間の洗浄を 2回行 う。 さらに、 フィルターを 2 XS SC溶液 （30 OmM塩化ナトリウム、 および 30 mMクェン酸ナトリウムを含む。 ） で軽くすすいだのち乾燥させる。 このフィルタ一 を、例えば、ォ一トラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を 検出することにより、用いたプローブとハイブリダィズする DN Aのフィルタ一上の 位置を検出する。検出された DN Aのフィルタ一上の位置に相当するクローンをもと の寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該 DN Aを有するクローンを単 離することができる。 具体的には例えば、 フィルターをイメージングプレート （富士 フィルム） に 4時間露光させ、次いで当該プレートをイメージングアナライザ一 B A
52000 (富士フィルム） を用いて解析し、 シグナルを検出する。 フィルターの作 製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約 5 mm角 にくり抜き、 これを約 500 の SMバッファー （5 OmMトリス—塩酸 pH7. 5、 0. 1M塩化ナトリウム、 7 mM硫酸マグネシウム、 および 0. 01% (W/V ) ゼラチンを含む。 ) に 2〜16時間、 好ましくは 3時間浸してファージ粒子を溶出 させる。得られたファージ粒子溶出液を Mo 1 e c u 1 a r C l on i ng 2 n d e d i t i on (J. S amb r ook, E. F. F r i s c h, T. M a n i a t i s著、 Co l d Sp r i ng Ha r o r ： L a b o r a t o r y P r e s s、 1989年） 2. 60から 2. 65に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、 37°Cで 6〜10時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でフ ァージ DN Aをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイ ブリダィゼーシヨンを行う。 フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、 シグナル が検出された位置に相当する部分からファ一ジ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ 、 前述の方法と同様にフィルターを作製し、 ハイブリダィゼ一シヨンを行う。 このよ うなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブ リダイズする塩基配列からなる D N Aを含むファージクローンが得られる。 上述のようなハイブリダィゼ一ションによるスクリーニングを行うことにより得 られたクローンの保有する D N Aは、 D N A調製や解析が容易なプラスミドベクタ一 、 例えば市販の pUC 18、 pUC 19、 pBLUESCR I PT KS十、 pBL UESCR I PT KS- 等にサブクローニングして、プラスミド DNAを調製し 、 F. S ang e r, S . N i c k l e n, A. R. Cou l s on著、 P r o c e e d i n g s o f Na t i on a l Ac ad emy o f S c i e n c e U. S. A. (1977) , 74, 5463— 5467等に記載されるダイデォキ シタ一ミネ一ティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分 析に用いる試料の調製は、例えば、 Mo l e c u l a r C l on i ng 2nd e d i t i on (J. S amb r ook, E. F. F r i s c h, T. Man i a t i s著、 Co l d Sp r i ng Ha r o r Labo r a t o r y P r e s s、 1989年） 13. 15等に記載されているプライマ一エクステンション法に準 じて行うことができる。 また、 ファ一ジクローンを Mo l e c u l a r C l on i n g 2 nd e d i t i on (J. S amb r ook, E. F. F r i s c h, T . Man i a t i s著、 Co l d S p r i ng Ha r o r Labo r a t o r y P r e s s、 1989年） 2. 60から 2. 65等に記載の方法に準じて N;'Z YM液体培地で増幅し、 ファージ液を調製して、 これから例えば、 L ambd a— T RAP PLUS DNA I s o l a t i on K i t (C 1 o n t e c h製）等を 用いてファージクローン DNAを抽出し、 当該 DNAを錶型として、 例えば、 前述の プライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分 析することもできる。 このようにして作製されたポリヌクレオチドが有する、三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlをコードする遺伝子の転写を制御する能力は、後 述する方法により確認することができる。 本発明プラスミドの調製において、 本発明ポリヌクレオチド （因みに、 ここでの本 発明ポリヌクレオチドは DNAを意味する。 ） が挿入されるプラスミドとしては、 所 望の細胞内で機能可能なプラスミドであれば良く、当該プラスミドが導入された細胞 を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、 カナマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイ シン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等） を含んでいてもよい。 また、 前記ブラ スミドにおいて、本発明ポリヌクレオチドおよび所望の遺伝子がプラスミド上で機能 可能な形で連結されるような位置、例えば本発明ポリヌクレオチドが挿入される部位 の下流に遺伝子挿入部位がさらに有ると、所望の遺伝子を細胞内で発現させるための プラスミドの構築等に好ましく利用できる。 ここで遺伝子挿入部位とは、 例えば、 遺 伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であ り、本発明ポリヌクレオチドを有するプラスミド上に唯一存在する種類の制限酵素認 識配列が好ましい。 当該プラスミドとして具体的には、 例えば、 大腸菌を宿主とする 場合には PBR322 (Boehringer Mannheim製） 、 pUC12、 pUC118、 pUC119 (宝酒造製) 等 の PUC系プラスミド、 pBluescript等、 バチルス属細菌を宿主とする場合には pUBl 10 、 pC194等が挙げられる。 酵母を宿主とする場合には Yip5、 Yep24等が挙げられる。 昆 虫細胞を宿主とする場合には AcNPV等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合には p UC18, PUC19等が挙げられる。
本発明ポリヌクレオチドの前記プラスミドへの挿入は、 通常の方法、 例えば「Mo l e c u l a r C 1 o n i n g： A L abo r a t o r y Manu a l 2 n d e d i t i onj ( 1989) , Co l d S p r i ng Ha r bo r L a bo r a t o r y P r e s s、 「 Cu r r e n t P r o t o c o l s I n M o l e c u l a r B i o l ogy」 （1987) , J ohn Wi l e y & S on s， I nc. I S B N 0— 471 _ 50338— X等に記載される方法に準じて 行うことができる。 本発明プラスミドのうち、本発明探索方法において用いられる形質転換細胞に導入 されるプラスミドとしては、 例えば、 本発明ポリヌクレオチドの下流 （3' 側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるポリヌクレオチドを含有するブラ スミド、 より具体的には、 本発明ポリヌクレオチドを含有し、 かつ当該ポリヌクレオ チドの下流 （3' 側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるレポ一夕 一遺伝子を含有するプラスミド等をあげることができる。例えば、 レポ一ター遺伝子 がルシフェラ一ゼ遺伝子である場合には、本発明ポリヌクレオチドの制御下にルシフ エラーゼ遺伝子を含む本発明プラスミドは、当該プラスミド中に含まれる本発明ポリ ヌクレオチドの本転写制御能力を測定する場合に好ましく利用することができる。か かるプラスミドは、 ルシフェラ一ゼ遺伝子を含む市販のプラスミド、 例えば、 PGL 3_b a s i c (P r ome g a製) 、 P i c aGe ne Ba s i c V e c t o r (東洋インキ製） 等のプラスミドを使って作製することができる。 具体的には、 p GL 3-b a s i cの遺伝子挿入部位に通常の方法により本発明ポリヌクレオチド を機能可能な形で挿入することにより、本発明ポリヌクレオチドの制御下にルシフエ ラ一ゼ遺伝子を含む本発明プラスミドを作製することができる。 本発明形質転換細胞（即ち、本発明ポリヌクレオチド又は本発明プラスミドが導入 されてなる形質転換細胞） の調製方法について以下に説明する。
本発明ポリヌクレオチド又は本発明プラスミドが導入される宿主細胞としては、大 腸菌 （例えば K12) 、 バチルス属細菌 （例えば MI114) 等の細菌、 酵母 （例えば AH22 ) 、 植物細胞、 動物細胞等の細胞をあげることができ、 本発明ポリヌクレオチド又は 本発明プラスミドが細胞内で保持される細胞であればよい。本発明探索方法に用いら れる本発明形質転換細胞を調製するための宿主細胞としては、好ましくは動物細胞（ 例えば PC- 12細胞、 Neuro-2a細胞、 IMR- 32細胞、 C0S-7細胞、 Vero細胞、 CH0細胞、 E S細胞等） 、 特に好ましくは神経細胞を挙げることができる。 尚、 宿主細胞が ES細 胞である本発明形質転換細胞とは、本発明ポリヌクレオチド又は本発明プラスミドが 導入された ES細胞を分化させた形質転換細胞や、 ES細胞を分化した後、 当該細胞 に本発明ポリヌクレオチド又は本発明プラスミドが導入された形質転換細胞を含む。 また本発明形質転換細胞は、これら形質転換細胞から発生させることにより作出され た動物個体 （即ち、 形質転換動物） 内に存在する状態での細胞をも含む。 本発明ポリヌクレオチド又は本発明プラスミドの宿主細胞への導入法としては、細 胞に応じた導入方法を適用することができ、例えば動物細胞にはリン酸カルシウム法 、 電気導入法、 DEAEデキストラン法、 ミセル形成法などを適用することができる 。 具体的には例えば、 リン酸カルシウム法としては、 Gr imm， S. e t 1 . ， P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA, 93， 10923- 1092 7等に記載の方法を挙げることができ、電気導入法および D EAEデキストラン法と しては、 T i ng， A. T. e t a 1. , EMBO J. ， 15, 6189— 6 196等に記載の方法を挙げることができ、 ミセル形成法としては、 Hawk i n s , C. J. e t a l . , P r o c. Na t l . Ac ad. S c i. USA, 93 , 13786— 13790等に記載の方法を挙げることができる。 ミセル形成法とし ては例えば、 リボフェクトァミン （G i b e oBRL製） やフユ一ジーン （B o e h r i nge r Mannhe i m製） 等の市販の試薬を使用することも可能である。 本発明ポリヌクレオチドもしくは本発明プラスミドの導入処理を施した細胞を、例 えば、本発明ポリヌクレオチドもしくは本発明プラスミドと同時に宿主細胞に導入さ れた選抜マーカー遺伝子や、本発明プラスミドに含まれる選抜マーカー遺伝子等を利 用し、 当該選択マ一カー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質 転換細胞を選抜することができる。 本発明は、本発明形質転換細胞に被験物質を接触させる工程を含む方法を提供して いる。即ち、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlのプロモーターを介したシグ ナル伝達調節物質の探索方法であって、
(1) 本発明ポリヌクレオチドを含有しかつ当該ポリヌクレオチドの下流 （3' 側） にレポ一夕一遺伝子を含有するプラスミドが導入されてなる形質転換細胞に被験物 質を接触させる第一工程、 及び、
( 2 )前記第一工程後に、 レポ一ター遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値をモ 二夕一する第二工程、
( 3 )前記第二工程によりモニターされた発現量又はそれと相関する指標値の変化に 基づき、前記物質が有する、三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gm lをコードする 遺伝子のプロモ一夕一を介してシグナル伝達を調節する能力を評価する第三工程、及 び
( 4 )前記第三工程で評価されたシグナル伝達調節能力に基づき、三量体 Gタンパク 質ひサブュニット Gm 1をコ一ドする遺伝子のプロモーターを介してシグナル伝達 を調節する能力を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法 （即ち、 本発明探索方法） である。 当該探索方法 は、 いわゆるレポ一夕一ジーンアツセィを用いて、三量体 Gタンパク質 サブュニッ ト Gm lをコードする遺伝子のプロモータ一を介してシグナル伝達を調節する能力 を有する物質を探索する方法である。 本発明探索方法に使用される細胞としては、哺乳動物細胞を宿主細胞とする本発明 形質転換細胞が好ましく、 例えば、 PC- 12細胞、 Neuro-2a細胞、 IMR- 32細胞、 Vero細 胞、 Hel a細胞、 CV1細胞、 C0S1細胞、 CH0細胞、 E S細胞等の公知の哺乳動物細胞を宿 主細胞とする本発明形質転換細胞が特に好ましい。 当該形質転換細胞は、上述のよう にして調製すればよい。 上記の第一工程において、本発明ポリヌクレオチドを含有しかつ当該ポリヌクレオ チドの下流 （3 '側） にレポ一夕一遺伝子を含有するプラスミドが導入されてなる形 質転換細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約 0 . 0 0 1 M〜約 1 0 で あればよく、 約 0 . 0 1 i M〜約 1 0 が好ましく、 約 0 . l M〜約1 0 ；u Mが より好ましい。 当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、 通常、 約 1時間以上 5日 間程度であり、 数時間から 4日間程度が好ましい。 好ましくは、 1 8時間以上 6 0時 間程度であり、 より好ましくは 2 4時間から 4 0時間程度が挙げられる。 当該細胞と被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えば よい。 例えば、 哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合には、 適宜ゥシ 胎児血清等の哺乳動物由来の血清を添加した D_MEM、 OPT I -MEM, RPM I 1640培地 （G i b c o_BRL製） 等の市販の培地中で培養できる。 培養は、 通常約 30°C〜約 40°C、 約 2% (V/V) 〜： L 0% (V/V) 二酸化炭素存在下で 実施すればよく、 約 35°C〜約 37 、 約 4% (VZV) 〜約 6% (V/V) 二酸化 炭素存在下で実施するのがより好ましい。
被験物質と接触させる際の当該細胞の細胞数は、例えば 96ゥエルプレートを用い る場合、通常約 1 X 104個/ゥエル〜約 1 X 105個/ゥエルであればよく、 約 5 X 104個 Zゥエル〜約 8 X 104個ノゥエルが好ましい。 上記の探索方法において、 「レポーター遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値 をモニターする」方法としては、前記形質転換細胞中におけるレポ一夕一遺伝子の発 現量又はそれと相関する指標値を時間経過に沿って連続的に又は不連続に測定でき る方法であればどのような方法であってもよい。例えば、 レポーター遺伝子の発現産 物、即ち当該遺伝子に対応する mRN Aもしくは当該遺伝子にコードされる蛋白質を 検出する方法 （具体的にはノザンブロッテイング、 ウエスタンブロッテイング等） を 利用することができる。 また、 レポーター遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合には 、 当該酵素の活性測定法等を利用すればよい。
より具体的には、 レポーター遺伝子に対応する mRNAの量は、 例えば、 レポ一夕 一遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドを用いたノ一ザンブロット法、 R T _ P C R などによって測定することができる。 レポーター遺伝子に対応する蛋白質の量は、 レ ポーター遺伝子より産生されるタンパク質に対する抗体を用いて測定することがで さる。
また、 レポ一夕一遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合には、 「レポ一夕一遺伝子 の発現量と相関する指標値」 として、 産生された酵素の活性値を測定すればよい。 使 用され得るレポーター遺伝子としては、 例えば、 ルシフェラーゼ遺伝子、 分泌型アル カリフォスファターゼ（SEAP)遺伝子、 クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフエ ラーゼ遺伝子、 i3ガラクトシダ一ゼ遺伝子等、発現生成した蛋白質の活性の測定が容 易であるものを好ましくあげることができる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細 胞溶解液に発光基質であるルシフェリン（例えば東洋インキ社製） を添加し基質の分 解による発光をルミノメ一ター、液体シンチレーションカウンター又はトップカウン 夕一等を用いて測定すればよい。 アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現量は、例え ば Lumi- Phos530 (和光純薬社製） を用いて測定することができる。 クロラムフエニコ —ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量は、 FAST CAT Chrola即 henicol Ac etyltransferase Assay Kit (和光純薬社製）を用いて測定することができる。 ]3-ガラ クトシダーゼ遺伝子の発現量は Aurora Gal-XE (和光純薬社製） を用いて測定するこ とができる。
レポ一夕一遺伝子として GF P (G r e e n F l uo r e s c e n t P r o t e i n)遺伝子のように、 当該遺伝子にコードされる蛋白質が蛍光等を発する場合に は、 産生された蛋白質が発する蛍光の量を測定すればよい。 前記のようにして、前記細胞と被験物質との接触および前記細胞における本発明ポ リヌクレオチドの本転写制御能力の測定を行い、対照と比較して当該転写制御能力の 上昇が検出された場合 （例えば、 30%程度、 好ましくは 50%程度、 さらに好ましくは 100%程度増加するような変化が認められた場合） または低下が検出された場合 （例 えば、 30%程度、 好ましくは 50%程度、 さらに好ましくは 100%程度減少するような 変化が認められた場合） には、 当該被験物質を当該プロモーターに作用し当該転写制 御能力を調節する物質、即ち、三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlをコードす る遺伝子のプロモーターを介したシグナル伝達調節物質として選抜することができ る。 被験物質の種類は特に限定されない。 例えば、 タンパク質、 ペプチド、 非ペプチド 性化合物 （糖質、 脂質等） 、 有機低分子化合物、 無機低分子化合物、 醃酵生産物、 細 胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液等が挙げられる。 被験物質を接触させた後の細胞における、本発明ポリヌクレオチドと機能可能な形 で連結されてなるレポーター遺伝子の発現量 （以下、 測定値 1と記す。 ） を、 被験物 質を接触させなかった細胞における前記発現量 （以下、 測定値 2と記す。 ） と比較す ることによって、 当該被験物質の本転写制御能力を評価してもよい。 この場合、 本転 写制御能力を、前記測定値を用いて、下記の式に従って転写制御率として求めるとよ い。
転写制御率 （％) = { (測定値 1 一測定値 2 ) Z測定値 2 } X I 0 0
被験物質の本転写制御能力を表わす転写制御率が、統計学的に有意な値を示す物質 、 具体的に好ましくは、 例えば、 3 0 %以上を示す物質、 より好ましくは 5 0 %以上 を示す物質を、 本転写制御能力を有する物質として選抜する。 さらに上記の探索方法では、被験物質として異なる 2種以上の物質を各々独立して 用いた区におけるレポ一夕一遺伝子の発現量の変化を比較することにより得られる 差異に基づき前記物質の本転写制御能力を評価してもよい。このようにして評価され た本転写制御能力に基づき本転写制御能力を有する物質を選抜することもできる。 さらにまた、前記異なる 2種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質を本転写制 御能力を有さない物質 （例えば、 溶媒、 バックグランドとなる試験系溶液等であって fcよい。
) として、 他方の被験物質が有する本転写制御能力を評価してもよい。 また、 前記異 なる 2種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が有する本転写制御能力を基準と しながら他方の被験物質が有する本転写制御能力を評価してもよい。 本発明キットは、 本発明ポリヌクレオチド （ここでは DNA) を有する組み換えレポ 一夕一ベクターを保持する試験細胞とレポーター活性の測定用試薬とを含むキット である。 本発明キットは、 さらに、 本発明ポリヌクレオチド （ここでは DNA) を有し ないプラスミドが導入されてなる対照細胞を含んでいてもよい。このような対照細胞 はネガティブコントロールとして利用することができる。 当該キットは、上述した本 発明探索方法に使用できる。 上記のような探索方法により選抜された物質は、本発明ポリヌクレオチドの活性を 制御し得ることから、本発明ポリヌクレオチドの制御下にある遺伝子の細胞内での発 現を制御することができる。 よって、 当該物質またはその薬学的に許容される塩は、 それらを有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化さ れてなることを特徴とする転写制御剤として利用してもよい。 当該物質は、 例えば、 当該遺伝子の翻訳産物の発現過多もしくは発現過少に起因する疾患のための医薬と して有用である。 また、 当該物質は、 本発明ポリヌクレオチドの制御下に連結した所 望の遺伝子、 例えば神経 ·精神疾患との関連が推定される遺伝子等の、 神経細胞にお ける作用や、 Gm 1の発現量の異常又は Gm 1遺伝子のプロモーターを介したシグナ ル伝達の異常に起因する疾患 （特に、 神経，精神疾患） への影響を検討する際に転写 調節剤として利用することもできる。 次に、本発明ポリヌクレオチドと結合する物質の探索方法について以下に説明する 本発明ポリヌクレオチドと結合する物質の選抜方法は、本発明ポリヌクレオチドと 被験物質とを接触させる第一工程、前記第一工程後に当該ポリヌクレオチドと被験物 質との複合体生成の有無を調べる第二工程及び前記第二工程で得られた複合体生成 の有無の分析結果に基づき当該ポリヌクレオチドと結合する物質を選抜する第三ェ 程を含む。
本発明ポリヌクレオチドと被験物質とを接触させる第一工程に使用されるポリヌ クレオチドは、 本発明ポリヌクレオチドを、 例えば市販の DNA標識キットを用い、 ラジオアイソトープ若しくは蛍光色素化合物で標識して用いると、当該ポリヌクレオ チドと被験物質との複合体の検出が容易になる点で好ましい。本発明ポリヌクレオチ ドを放射性同位元素により標識するには、例えば、市販の R and om La e l l i ng K i t等を用いることができる。通常の PCR反応組成中の dCTPを [ ひ一32 P] dCTPに替えて、 本発明ポリヌクレオチドを铸型にして PC R反応を行 うことにより、 当該ポリヌクレオチドを標識することもできる。 また、 本発明ポリヌ クレオチドを蛍光色素で標識する場合には例えば、 EC F D i r e c t Nu c 1 e i c Ac i d L a b e l l i n g a n d D e t e c t i o n S y s t em等を用いることができる。
本発明ポリヌクレオチドと被験物質とを、約 4°C〜約 3 7°C、好ましくは約 2 X 〜約 30°Cで、 約 5分間〜約 6 0分間、 好ましくは約 1 0分間〜約 3 0分間、 適当な バッファ一中、 例えば T r i s、 He p e s、 ME S等のバッファ一中、 好ましくは He p e sバッファ一中で接触させる。 被験物質の濃度は通常約 0. 1 ^^1〜約1 , 000 であればよく、 1 M〜1 00 Mが好ましい。 当該ポリヌクレオチドの 量は通常約 1 f mo 1〜約 1 0 f mo 1であればよく、 2 f mo 1〜7 f mo 1が好 ましい。 本発明ポリヌクレオチドと被験物質との複合体生成の有無を調べる方法としては、 ゲルシフト法、 フットプリント法、 B I AC ORE法等を挙げることができる。 被験 物質が比較的高分子量の化合物 （例えばタンパク質、 DNA等） の場合、 ゲルシフト 法、 フットプリント法等を用いるとよい。被験物質が比較的低分子量の化合物の場合 、 B I ACORE法、 例えば「永田和宏*半田宏共著 生体物質相互作用のリアル夕 ィム解析実験法一 B I ACOREを中心にーシュプリンガー'フエアラーク東京株式 会社」 記載の方法を用いるとよい。 例えば、 ゲルシフト法の場合、 先ず本発明ポリヌ クレオチドと被験物質との混合液を、通常の方法でポリアクリルアミドゲル電気泳動 に供する。 電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを乾燥した後、 例えば、 ォ一トラジ ォグラフィーなどに供してゲル上の当該ポリヌクレオチドの位置を検出することに より、当該ポリヌクレオチドと被験物質が結合しているかどうか調べることが出来る 具体的には例えば、乾燥したゲルをイメージングプレートに約 1時間〜約 1晚、 よ り好ましくは 6〜 8時間感光し、イメージングアナライザ一で画像ィメ一ジを取得す る。被験物質が当該ポリヌクレオチドと結合した場合、ポリヌクレオチドー被験物質 複合体の移動度が遊離のポリヌクレオチドより小さくなり、画像イメージ上でバンド のシフ卜が起こる。バンドのシフ卜力検出された場合の被験物質を、本発明ポリヌク レオチドと結合する物質として選抜することが出来る。 このようにして選抜される結合物質は、本発明ポリヌクレオチドに結合できること から、 本発明ポリヌクレオチドの本転写制御能力を制御し得る。 さらに、 本発明ポリ ヌクレオチドの制御下にある遺伝子の細胞内での発現を制御し得る。よって、 当該物 質またはその薬学的に許容される塩は、それらを有効成分として含み、 当該有効成分 が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする転写制御剤とし て利用してもよい。 当該物質は、 当該遺伝子の翻訳産物の発現過多もしくは発現過少 に起因する疾患のための医薬として有用である。 また、 当該物質は、 本発明ポリヌク レオチドの制御下に連結した所望の遺伝子、例えば神経 ·精神疾患との関連が推定さ れる遺伝子や行動や記憶との関連が推定される遺伝子等の、神経細胞における作用や 、 Gm 1の発現量の異常又は Gm 1のプロモーターを介したシグナル伝達の異常に起 因する疾患 （特に、 神経 ·精神疾患） や行動 ·記憶等への影響を検討する際に転写調 節剤として利用することもできる。 本発明精製方法について以下に説明する。
本発明精製方法は、本発明ポリヌクレオチドと試料とを接触させて、 当該ポリヌク レオチドと当該試料中に含有される当該ポリヌクレオチドと結合する物質との複合 体を生成させる第一工程、 及び、 前記第一工程後、 生成させた複合体から当該結合物 質を単離する第二工程を含む。
本発明ポリヌクレオチドと試料とを接触させる際には、通常、 当該ポリヌクレオチ ドを担体に結合させた形態で試料との接触を行うと、当該ポリヌクレオチドもしくは 当該ポリヌクレオチドと結合物質との複合体を容易に回収できる点で好ましい。当該 ポリヌクレオチドを結合させる担体の種類は特に限定されないが、例えば、市販のァ フィニティーク口マトグラフィー用担体、好ましくは臭化シアン活性化セファロース 4 B (Am e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h製）等を使用するこ とができる。 当該ポリヌクレオチドを担体に結合させる場合には、 当該ポリヌクレオ チドを直接担体に結合させる方法と、スぺ一サーを介して結合させる方法がある。結 合させる際の条件は、例えば、 当該ポリヌクレオチドと臭化シアン活性化セファロー ス 4 Bを混合し、約 4 °C〜約 1 0 で 1晚 1 0 0 0 r p mで撹拌し、 当該ポリヌクレ ォチドをセファロ一ス上に固定する。ついで、未反応の臭化シアンの活性基を無くす ために、 アミノ基を持つ化合物を含んだバッファ一、 例えば、 1 Mグリシンを含む炭 酸水素ナトリウム溶液中で、例えば約 4 °C〜約 1 O :で 1晚放置する。得られたゲル は、 通常のバッチ法により試料と接触させてもよく、 また、 そのゲルを市販のクロマ トグラフ管に充填することで、本発明ポリヌクレオチドと結合する物質用ァフィニテ ィーカラムを作製し、通常のカラムクロマトグラフィー法により試料と接触させても よい。 例えば、 カラムクロマトグラフィー法で接触 ·単離を行う場合、 試料を前記したァ フィニティーカラムに供し本発明ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合物質の 複合体を形成せしめた後、担体の洗浄、結合物質の溶出を通常の方法で行うことによ り、 結合物質を単離することができる。 具体的には、 まず試料を前記したァフィニテ ィーカラムにロードし、次いで、 ロードするときと同組成のバッファ一でカラムを洗 浄し、 複合体を形成しなかった試料中成分を除去する。 その後、 バッファーに含まれ る塩濃度を上昇させるグラジェント溶出を行って本発明ポリヌクレオチドと結合し ていた物質をカラムから溶出させることによって、本発明ポリヌクレオチドと結合す る物質を単離することができる。溶出に使われる前記の塩は、例えば塩化ナトリウム 、 塩化カリウム、 硫安等を挙げることができる。
本発明,精製方法によって、本発明ポリヌクレオチドの本転写制御能力を制御する物 質の上述の選抜方法によつて選抜される物質又は本発明ポリヌクレオチドと結合す る物質の上述の選抜方法によって選抜される物質を精製することができる。 本発明探索方法もしくは本発明結合物質探索方法により選抜される物質またはそ の薬学的に許容される塩を有効成分とする転写制御剤は、その有効量を経口的または 非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与す る場合には、 本転写制御剤は錠剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 懸濁液等の通常の形態 で使用することができる。 また、 非経口的に投与する場合には、 本転写制御剤を溶液 、 乳剤、 懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。 前記形態の本転写制 御剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投 与する方法等を挙げることができる。 前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、 賦型剤、 結合剤、 安定剤、 希釈剤 等に本探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合する ことにより製造することができる。 また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝 剤、 溶解補助剤、 等張剤等を添加することもできる。 投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性別、 体重、 疾患の程度、 本転写制御剤の 種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で 1日あたり有効成 分量として約 l m g〜約 2 g、好ましくは有効成分量として約 5 m g〜約 1 gを投与 すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約 0 . l m g〜約 5 0 0 m gを 投与すればよい。
また、 前記の 1日の投与量を 1回または数回に分けて投与することができる。 本転写制御剤の適用可能な疾患としては、 Gタンパク質遺伝子のプロモーターを介 したシグナル伝達の異常に起因する疾患 （特に、 神経 ·精神疾患） 等をあげることが でき、 具体的には例えば、 統合失調症、 躁鬱病、 うつ病及び不安症等の神経 ·精神疾 患があげられる。 これらの疾患を治療 ·改善 ·予防するために本転写制御剤を用いれ ばよい。 実施例
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれ らの例に限定されるものではない。 実施例 1 (マウス Gmlプロモータ一領域を含むポリヌクレオチドのクローニング )
マウス Gmlプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを以下のようにして単離 した。
(1) ファージスクリーニング用プローブの作製
ファージライブラリーのスクリーニングを行なうために、以下に示す手順によって マウス G m 1遺伝子の 5'上流領域を含むプローブ D N Aを作製した。
マウス C 5 7 BL/6由来のゲノム DNA 1 gを铸型に用い、 IO Mのフォヮ一ドプ ライマー mGmg— 1 (5 ' tgttctcccgacccttcagggatcttcttt；配列番号 4) 、 ΙΟ^Μ のリノ 一スフ。ライマー mGmg _ 2 (5， 一 acctatgagcagcaatggatagagtctat；酉己列 番号 5) および TAKARATaqポリメラーゼ （TAKARALATaq with GC Buffer, 宝酒造社製 ) を用いて P C Rを行うことにより増幅 DN Aを得た。
P CR条件は、 95 で 30秒間、 次いで 60tで 30秒間、 次いで 72 で 2分 間の保温を 1サイクルとしてこれを 35サイクル行った。
得られた DNAをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN製） を用いて精製し、 回収した。 回収された DN Aをプローブ用铸型 D N Aとして以下の 験で用いた。
次に当該プローブ用铸型 DNA10 1と、 Alkphos Direct DNA labeling and dete ctionキット （アマシャムバイオサイエンス社製） とを用い、 当該キットに添付され たプロトコ一ルに従って、アルカリフォスフォ夕ーゼでラベルされたプローブ DNA を調製した。
(2) ゲノムライブラリ一のスクリーニング
マウス 1 29Zs V由来ゲノムライブラリー （STRATAGENE社製） を用い、 以下の手 順でマウス Gmlプロモーターの単離を行なった。
1 5 cmのNZYプレ一卜 20枚に lx 106 のファージを播き、 これを 37°Cで 8時間培養することにより、 プラークを形成させた。 プラークが形成されたプレート にニトロセルロースメンブレンを接触させることにより、形成されたプラークをニト ロセルロースメンブレン上に移した。 このニトロセルロースメンブレンと、 アルカリ フォスフオタ一ゼでラベルされたプロ一ブ DNAを、 Alkphos Direct DNA labeling and detectionキット （アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 当該キットに添 付されたプロトコールに従って、ハイブリダィゼーシヨンを行なった。 またハイプリ ダイゼーシヨンによるシグナルの検出も、 Alkphos Direct DNA labeling and detec tionキット （アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 当該キットに添付されたプ 口トコ一ルに従って行なった。
ハイブリダィゼーシヨンによりシグナルが検出されたファージより、 Wizard Lamb da Prepsキット （プロメガ社製） を用い、 その添付プロトコールに従って、 DNAを回 収した。 このようにして、マウス Gmlプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを クローニングした。 実施例 2 (マウス Gmlプロモーター領域を含むレポ一夕一ベクターの構築） マウス Gm 1プロモーター領域を有するポリヌクレオチドを含有するレポーター ベクタ一である pGL— Gml、および、 pGL— Gml/S a c Iを以下のように して作製した。
実施例 1で得られたマウス Gm 1プロモータ一領域を含むファージ DNAを Sacl で消化した。 得られた消化物をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extr action kit (QIAGEN製） を用いて精製し、 DNAを回収した。 回収された DNAを インサート DNAとして以下の実験で用いた。 pGL 3を Saclで消化した後、 アル力 リフォスフォ夕ーゼ処理することにより、 ベクタ一 DNAを調製した。次いで、 調製 されたベクター DNA 50 n gと上記ィンサート DNA 10 n gとを T4ライゲー スを用いて連結することにより、 Gmlプロモ一夕一レポーターベクタ一 pGL— G ml/S c Iを作製した。 当該ベクター p GL _ Gm 1 ZS a c Iにおいては、配 列番号 2で示される塩基配列（当該配列は、配列番号 1における塩基番号 603番か ら 3871番で示される塩基配列に相当する。 ） 力 pGL 3の Sacl部位に揷入され ている。
さらに、実施例 1で得られたマウス G m 1プロモーター領域を含むファージ D N A を Nhelで消化した。 得られた消化物をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Ge 1 Extraction kit (QIAGEN製） を用いて精製し、 DNAを回収した。 回収された D N Aをィンサ一ト D N Aとして以下の実験で用いた。次いで p G L 3を Nhelで消化し た後、 アルカリフォスフォターゼ処理することにより、 ベクタ一 DNAを調製した。 調製されたべクタ一 DNA 50 ngとインサート DNA10118とを丁4ラィゲー スを用いて連結することにより、 Gmlプロモーターレポ一夕一ベクター pGL_G ml/Nh e Iを作製した。次に p GL— Gm 1 ZS a c Iを Ndelおよび Xholで二重 消化し、 得られた消化物をァガロースゲル電気泳動した後、 2kbの DNAを QIAquick Ge 1 Extraction kit (QIAGEN製） を用いて精製し、 回収した。 回収された DNAをイン サート DNAとして以下の実験で用いた。 pGL— Gml/Nh e Iを Ndelおよび X hoiで二重消化した。 得られた消化物 （ベクタ一 DNA) 50ngとインサート DN A 10 n gとを T4ライゲースを用いて連結することにより、 Gmlプロモータ一レ ポーターベクター pGL— Gmlを作製した。当該べクタ一 pGL— Gmlにおいて は、配列番号 1で示される塩基配列が、 pGL 3の Sacl部位と Nhel部位との間に挿入 されている。 実施例 3 (マウス Gm 1プロモーターの転写活性の測定）
実施例 2で得られた本発明 Gm 1プロモーターの転写活性化能を以下のようにし て測定した。
PC12細胞を 96穴プレートの各ゥエル内に 5 X104cells/wellで播種し、 約 24時間 培養した。培養された細胞に実施例 2で得られた Gmlプロモーターレポ一夕一べク 夕一 pGL - Gml (0. 2 g) 又は pGL - GmlZS ac I (0. 2 g) を 、 リポフエクション法を用いてトランスフエクションすることにより、試験細胞を調 製した。 尚、 上記と同じように播種された細胞に、 Gmlプロモーターを含有しない レポ一夕一べクタ一 （pGL 3 ； 0. 2 g) を、 リポフエクシヨン法を用いてトラ ンスフエクシヨンすることにより対照細胞を調製した。
次いで、 これらの細胞を 37 °Cで 24時間培養した後、 ゥエル内の培地を除き、 PB S緩衝溶液で洗浄した。洗浄された細胞を細胞溶解液（ピツカジーンルシフェラーゼ キット、 東洋インキ製造社製） で溶解した後、 ゥエル内に発光基質 （ピツカジーンル シフェラ一ゼキット、 東洋インキ製造社製） を添加し、 各ゥエルの蛍光強度を、 ルミ ノメーターを用いて測定した。対照として、対照細胞も同様にして蛍光強度を測定し た。 結果を図 1に示す。
対照細胞のルシフェラーゼ活性を 100 %として、試験細胞のルシフェラーゼ活性 が 130%以上を示す場合を、 転写制御能を有するとした。 実施例 4 (脳組織における抗 G m 1抗体を用いた免疫染色）
脳における三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm 1夕ンパク質の発現分布の解 析を、 抗 Gml抗体を用いて蛍光組織免疫染色法より行った。 即ち、 パラホルムアル デヒドを用いて固定されたマウス脳切片（N o V a g e n社製） を脱パラフィン処理 した後、 0.01Mクェン酸溶液中でオートクレープ処理 （120で、 15分） した。 次に、 脳切片を、 TSAキット # 12 (モルキユラ一プローブ社製） に付属された ブロッキング試薬を用いて希釈された抗 Gml抗体 （1/100希釈） 中で、 4°Cで 1時間インキュベーションした。 次いで、 当該脳切片を PBS溶液で 2回洗浄した後 、 TSAキット # 12 (モルキュラープローブ社製） に付属された HRPラベル抗ゥ サギ I gG抗体中で、 4 :で 1時間インキュベーションした。 次いで、 脳切片を PB S溶液で 2回洗浄した後、 TSAキット # 12 (モルキュラープローブ社製） に付属 されたチラミドシグナル増幅キットを用いて、当該キットに添付されたプロトコ一ル に従って、蛍光シグナルの検出を行なった。蛍光シグナルは蛍光顕微鏡を用いて観察 された。結果を図 2に示す。三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlタンパク質が 、 大脳皮質、 海馬、 小脳の神経細胞で高く発現していることが明らかとなった。 実施例 5 (精神疾患患者脳組織における抗 Gm 1抗体を用いた免疫染色）
ヒト精神疾患患者の脳における三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gmlタンパ ク質の発現の解析を、 抗 Gml抗体を用いた組織免疫染色法により行った。
即ち、 パラホルムアルデヒドを用いて固定されたヒト脳切片スライド LandMark Lo w Density Neuropsychiatr ic Tissue MicroArrays (Ambion千土製) を脱ノ、。ラフィン処 理した後、 0. (MMクェン酸溶液中でオートクレープ処理 （120°C、 15分） した。 次に、 脳切片を含むスライド （以下、 「スライド」 と略称する） を超純水で洗浄し た後、 3%過酸化水素水を含むメタノール中で、 室温で 10分間インキュベートした。 次にインキュベートされたスライドを TN溶液 （0. lM Tris pH7.5, 0.15M NaCl )で 3回洗浄した後、 TS Aピオチンシステム NEL 700 (Pe r k i nE lme r社製） に付属されたブロッキング試薬中で、 室温で 30分間インキュベートした。 次に、 スライドを TS Aピオチンシステム NEL 700 (P e r k i nE lme r 社製） に付属されたブロッキング試薬を用いて希釈された抗 Gml抗体（1ノ100 希釈） 中で、 4でで 1時間インキュベーションした後、 これを TN溶液 （0.1M Tris pH7.5, 0.15M NaCl) で 3回洗浄した。
次に、スライドを TS Aピオチンシステム NEL 700 (P e r k i nE lme r 社製）に付属されたブロッキング試薬に希釈された HRPラベル抗ゥサギ I gG抗体 (1Z200希釈） 中で、 4°Cで 1時間インキュベーションした後、 これを TN溶液 (0.1M Tris pH7.5, 0.15M NaCl) で 3回洗浄した。
次に、スライドを TS Aピオチンシステム NEL 700 (P e r k i nE lme r 社製） に付属されたピオチン化チラミド増幅試薬中で、室温で 10分間インキュべ一シ ヨンした後、 これを TN溶液 （0.1M Tris pH7.5, 0.15M NaCl) で 3回洗浄した。 次に、 スライドを TS Aピオチンシステム NEL 700 (P e r k i nE lme r 社製） に付属された抗 HRPラベル抗ァビジン抗体中で、室温で 30分間インキュベー シヨンした後、 これを TN溶液 （0.1M Tris pH7.5, 0.15M NaCl) で 3回洗浄した。 このようにして得られたスライドを、 DAB夕ブレット 1錠（シグマ社製） を 15 ml超純水に溶かしたものを用いて発色させた後、顕微鏡で観察した。結果を図 3に 示す。 三量体 Gタンパク質 αサブユニット Gmlタンパク質の発現が、 神経'精神疾 患 （統合失調症、 躁鬱病、 うつ病及び不安症） の患者の脳で、 健常者よりも低下して いることが明らかとなった。 実施例 6 (マウス Gmlプロモーター領域を含むレポーターベクターの構築） マウス Gmlプロモータ一領域の塩基配列を含有するレポ一夕一ベクタ一である p GL - Gml/843- 3900を以下のようにして構築する。
配列番号 1の塩基番号 843番から 387 1番で示される塩基配列の 3 '端に 29 塩基が付加されてなる塩基配列を有する DNAを増幅するために、 実施例 1で得られた マウス Gmlプロモーター領域を含むファージ DNAlOngを铸型に用い、 10/iMのフ 才ヮ——ドフライマ——prmGmg— 843 (5 —atcatcacaacaggaaagtaataaaa；酉己列番 6 ) 、 10 Mのリバースプライマ一 prmGmg-3900 (5' 一 attgtgcatccttcgaacgtccca；配列 番号 7) および TAKARA LA Taqポリメラーゼ （TAKARA LA Taq with GC Buffer, 宝酒 造製） を用いて PCRを行なう。
PCR条件は、 で 30秒間次いで 60でで 30秒間次いで 72°Cで 2分間の保温を 1サイク ルとしてこれを 35サイクル行なう。得られた DNAをァガロースゲル電気泳動した後、 Q IAquick Gel Extraction kit (QIAGEN製） を用いて精製、 回収する。 回収された DNA をィンサート DNAとして以下の実験で用いる。
インサート DNAlOngと pDriveベクタ一 （QIAGEN社製） 50ngとを T4ライゲースを用い て連結することにより、 プラスミド pDrive— Gml/843- 3900を得る。
得られたプラスミド pDrive— Gml/843- 3900を Mlulおよび Saclで二重消化した。得ら れた消化物をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction kit (QIAG EN製） を用いて精製し、 DNAを回収する。 回収された DNAをインサート DNAと して以下の実験で用いる。 pGL 3を Mlulおよび Saclで二重消化する。得られた消化 物（ベクター） 5 O ngとインサート DNA10 n gとを T 4ライゲースを用いて連 結することにより、 Gmlプロモーターレポーターベクタ一 pGL-Gml/843- 3900を作製 する。
10 Mのフォワードプライマ一 prmGmg-1232 (5' _ tggtgccctct tctggtgtgtct；配列 番号 8) および ΙΟ^Μのリバースプライマー prmGmg_3900 (5' -at tgtgcatcct tcgaac gtccca;配列番号 7) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 1232番から 387 1番で 示される塩基配列の 3 ' 端に 29塩基が付加されてなる塩基配列を有する DNAを増幅 し、上記と同様な手順で、 マウス Gmlプロモーター領域の塩基配列を含有するレポ —夕一ベクターである pGい Gml/1232- 3900を構築する。
10 Mのフォワードプライマー prmGmg- 1.989 (5' -atgccatatact tgagtcacagt t tgtg aa ;配列番号 9) および IO Mのリバースプライマー prmGmg- 3900 (5' -attgtgcatc cttcgaacgtccca;配列番号 8) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 1 98 9番から 3 8 7 1番で示される塩基配列の 3 ' 端に 2 9塩基が付加されてなる塩基配列を有する！) NAを増幅し、上記と同様な手順で、 マウス Gmlプロモーター領域の塩基配列を含有 するレポーターベクターである pGい Gml/1989- 3900を構築する。
ΙΟ/iMのフォワードプライマー prmGmg- 2937 (5' -ctcccgagccttcagggatcttcttt； 配列番号 1 0) および 10 Mのリバースプライマー pnnGing- 3900 (5' -at tgtgcatcct tcgaacgtccca ;配列番号 8) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 29 37番から 38 7 1番で示される塩基配列の 3 ' 端に 2 9塩基が付加されてなる塩基配列を有する DNA を増幅し、上記と同様な手順で、マウス Gmlプロモーター領域の塩基配列を含有す るレポ一夕一ベクタ一である pGL-Gml/2937-3900を構築する。
10 Mのフォワードプライマ一 prmGmg - 843 (5 -atcatcacaacaggaaagtaataaaa； ad 列番号 6) および のリバースプライマー prmGmg-3776 (5' -agactgctccggttac cgtaaatactgcct；配列番号 1 1) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 843番から 3 7 76番で示される塩基配列を有する DNAを増幅し、 上記と同様な手順で、 マウス Gm 1プロモーター領域の塩基配列を含有するレポ一夕一ベクタ一である pGL-Gml/843 - 3 776を構築する。
10〃Mのフォワードプライマー prmGmg- 1232 (5' 一 tggtgccctcttctggtgtgtct；配列 番号 8) および 10 Mのリバースプライマー prmGmg-3776 (5' -agactgctccggt taccg taaatactgcct；配列番号 1 1) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 1 232番から 3 7 7 6番で示される塩基配列を有する DNAを増幅し、 上記と同様な手順で、 マウス Gm 1プロモーター領域の塩基配列を含有するレポ一夕一ベクターである pGL-Gml/1232- 3776を構築する。
10 Μのフォワードプライマー prmGmg-1989 (5' -atgccatatacttgagtcacagtttgtg aa ;配列番号 9) および IO Mのリバ一スプライマ一 prmGmg- 3776 (5' -agactgctcc ggttaccgtaaatactgcct；配列番号 1 1) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 1 9 8 9番 から 3 7 7 6番で示される塩基配列を有する DNAを増幅し、 上記と同様な手順で、 マ ウス Gm 1プロモータ一領域の塩基配列を含有するレポーターベクターである pGL-G ml/1989- 3776を構築する。 '
10 Mのフォワードプライマ一 prmGmg- 2937 (5' -ctcccgagccttcagggatcttcttt； 配列番号 10) および 10 zMのリバースプライマ一 prmGmg-3776 (5' -agactgctccgg ttaccgtaaatactgcct；配列番号 1 1) を用いて、 配列番号 1の塩基番号 2937番か ら 3776番で示される塩基配列を有する DNAを増幅し、 上記と同様な手順で、 マウ ス Gm 1プロモーター領域の塩基配列を含有するレポーターベクターである pGL-Gml /2937-3776を構築する。 実施例 7 (マウス Gmlプロモーターの転写調節領域の決定）
実施例 6で得られたレポ一ターベクターを用いて、本発明の Gmlプロモーターの 転写活性化能を以下のようにして測定する。
PC12細胞を 96穴プレートの各ゥエル内に 5 X104cells/wellで播種し、 約 24時間 培養する。培養された細胞に実施例 6で得られた Gmlプロモー夕一レポーターべク 夕一 (pGL-Gml/843-3900, pGL-Gml/1232-3900, pGL-Gml/1989-3900、 pGL-Gml/2937- 3900、 pGL-Gml/843-3776, pGL-Gml/1232-3776, pGL-Gml/1989-3776または pGL- Gml/2 937- 3776；各 0.2 g) を、 リポフエクシヨン法を用いてトランスフエクシヨンする ことにより、 試験細胞を調製する。 尚、 上記と同じように播種された細胞を用いて、 Gmlプロモーターを含有しないレポ一夕一ベクター （pGL 3 ; 0. 2 n g) を、 リポフエクシヨン法を用いてトランスフエクションすることにより、対照細胞を調製 する。
次いで、 この細胞を 37 °Cで 24時間培養した後、 ゥエル内の培地を除き、 PBS緩 衝溶液で洗浄する。洗浄された細胞を細胞溶解液（ピツカジーンルシフェラ一ゼキッ ト、 東洋インキ製造社製） で溶解した後、 ゥエル内に発光基質 （ピツカジーンルシフ エラーゼキット、 東洋インキ製造社製） を添加し、 各ゥヱルの蛍光強度を、 ルミノメ 一夕一を用いて測定する。 対照として、 対照細胞も同様にして蛍光強度を測定する。 対照細胞のルシフェラーゼ活性を 100%として、試験細胞のルシフェラーゼ活性 が 130%以上を示す場合を、 転写調節能を有するとする。 実施例 8 (レポーター活性を指標としたスクリーニング）
PC12細胞を 96穴プレートの各ゥエル内に 5 X104cel ls/wellで播種し、 約 24時間 培養する。培養された細胞に実施例 2で得られた Gmlプロモータ一レポーターべク 夕一 （pGL - Gml ； 0. 2 g) を、 リポフエクシヨン法を用いてトランスフエ クシヨンすることにより、 試験細胞を調製する。
次いで、 この細胞を約 24時間培養した後、 ゥエル内の培地を除く。 ゥエル内に、 新 たに 0.10mlの新鮮な培地を加えた後、 さらに 0.1ηΜ〜10ηΜの被験物質を添加し、 これ を 37 °Cで 24時間培養する。
次いで、 ゥェル内の培地を除き、 PBS緩衝溶液で洗浄した。 洗浄された細胞を細 胞溶解液（ピツカジーンルシフェラ一ゼキット、 東洋インキ製造社製） で溶解した後 、 ゥエル内に発光基質 （ピツカジーンルシフェラーゼキット、 東洋インキ製造社製） を添加し、 各ゥエルの発光強度を、 ルミノメ一夕一を用いて測定する。 対照として、 被験物質を接触させない細胞についても同様にして発光強度を測定する。
被験物質を接触させない場合のルシフェラ一ゼ活性を 100%として、被験物質を 接触させた場合のルシフェラーゼ活性のパーセンテージが 50%以下になる物質又は 15 0%以上になる物質をシグナル伝達調節物質として選択する。 実施例 9 (レポ一夕一活性を指標としたスクリーニング）
実施例 2で得られた本発明の Gm 1プロモーターの転写活性化能を以下のように して測定する。
PC12細胞を 96穴プレートの各ゥエル内に 5 X104cells/wellで播種し、 約 24時間 培養する。培養された細胞に実施例 2により得られた Gm 1プロモーターレポ一ター ベクター （pGL - Gml又は pGL— GmlZS a c I ；各 0. 2 g) を、 リポ フエクシヨン法を用いてトランスフエクションすることにより、試験細胞を調製する 。 また、 Gmlプロモ一夕一を有しないレポ一夕一ベクター （pGL 3 ； 0. 2 g ) を、 リポフエクシヨン法を用いてトランスフエクシヨンすることにより、 対照細胞 を調製する。
次いで、 これら細胞を約 24時間培養した後、 ゥエル内の培地を除く。 ゥエル内に、 新たに 0.10mlの新鮮な培地を細胞に加えた後、 さらに 0.1 〜 ΙΟηΜの被験物質を添加 し、 これを 37 °Cで 24時間培養する。
次いで、 ゥエル内の培地を除き、 PBS緩衝溶液で洗浄した。 洗浄された細胞を細 胞溶解液（ピツカジーンルシフェラ一ゼキット、 東洋インキ製造社製） で溶解した後 、 ゥエル内に発光基質 （ピツカジーンルシフェラ一ゼキット、 東洋インキ製造社製） を添加し、 各ゥエルの発光強度を、 ルミノメータ一を用いて測定する。 対照として、 被験物質を接触させない細胞についても同様にして発光強度を測定する。
被験物質を接触させた場合と被験物質を接触させていない場合のルシフェラーゼ 活性の比が対照細胞に比べて、試験細胞で 1.3倍以上または 0.7倍以下になる物質をシ グナル伝達物質として選択する。 実施例 1 0 (本発明ポリヌクレオチド結合物質の選抜）
実施例 3に記載された本発明プラスミド pGL— Gml 5 8を、 1 01ぉょ び M 1 u I各 10Uを用いて 20 / Lの反応液中で 37 で 1時間消化する。制限酵 素消化反応液をァガロースゲル電気泳動し、 Q I Aq u i c k Ge l E r a c t i o n K i tを用いてインサート DN Aを精製する。 得られた DNA1 , [ α -32 P] d C T P (Am e r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h製 ) 5 L、 非標識ヌクレオチド （dATP, dTTP, dGTP) (宝酒造製） 各 1 L l OXk l e now Bu f f e r (宝酒造製） 2； Lおよび k 1 e n ow 酵素 （宝酒造製） 1 I Lを加え蒸留水で合計 20 iiLとし、 37°Cで 1時間ィンキ ュべ一トすることで、 標識された DN Aを得る。 次に、 未反応 [a— 32P] dCTP と標識された DNAとを分離するために反応液を 1 OmMトリス塩酸、 ImMEDT A (以後 TE溶液と表記する。） で平衡化した P r o b eQu an t G— 50 M i c r o Co l umn s (Ame r s h am Ph a rmac i a B i o t e c h製） に供し、 遠心分離 （室温、 1200 r pm、 1分間） を行い、 標識された DN Aを溶出する。 得られた溶出液の放射活性をシンチレ一夕一で測定し、 104 c pm ノ Lになるよう TE溶液で希釈して標識 DNA溶液を得る。次いで、 5 Xバインデ ィングバッファ一 （5 OmM He p e s一水酸化カリウム （pH7. 8) 、 250 mM塩化カリウム、 5mM EDTA (pH8. 0) 、 2 5mM塩化マグネシウム、 50 % (W/V) グリセロール、 2 5 mMジチオスレイト一ル、 3. 5mM PMS F、 10 g/mL A p r o t i n i n, 1 0 g/mL P e p s t a t i n、 10 II g/mL L e u p e p t i n、および 5 mM s o d i um o r t h o v a n a d a t eを含有する。 ） 5 /xL、 2 n g/ L p o l y d l dC 1. 5 L、 1 0 M被験物質 5 Lおよび標識 DNA溶液 2 Lを混合し蒸留水で合計 2 5 Lにする。該液を室温で 3 0分間インキュベートした後、 ポリアクリルアミドゲル 電気泳動をおこなう。 電気泳動後、 ゲルをゲル板よりはがして、 ワットマン 3MMろ 紙上にて 8 0 ：、 1時間真空ポンプにて乾燥後、イメージングプレートに 2時間感光 後、 B AS 2 00 0で画像イメージを取得する。被験物質が標識 DN Aと結合し標識 DNA-被験物質複合体が形成された結果、ゲル上での移動度が遊離の標識 D N Aよ り小さくなり、画像ィメ一ジ上のバンドのシフトが検出された場合の被験物質を本発 明ポリヌクレオチドへの結合物質として選抜する。 実施例 1 1 (本発明精製方法による本発明ポリヌクレオチドへの結合物質の精製） ( 1 ) 本発明ポリヌクレオチド結合物質精製用ァフィ二ティ一力ラムの作製 本発明プラスミド P GL— Gml 200 / gを Xh o I、M l u I 各 50Uを 用いて 200 Lの反応液中で 37 °Cで 1時間消化する。制限酵素消化反応液をァガ ロースゲル電気泳動し、 Q I AQ u i c k Ge l Ex t r a c t i o n K i t を用いて精製することにより該 DNAを得る。 2mLの臭化シアン活性化セファロ一 ス 4Bに 44 gの該 DNAを加え、 4"Cで 1晚 1 000 r pmで撹拌し、該 DNA をセファロ一ス上に固定する。ついで、未反応の臭化シアンの活性基を無くすために 、 1Mグリシンを含む炭酸水素ナトリウム溶液 （pH 9. 5) 20mLを加え 4°C で 1晚放置する。 こうして得られたゲルを 1 0 X 3 0 0mmクロマトグラフ管（イワ キガラス製） に充填することで、本発明ポリヌクレオチドへの結合物質用ァフィニテ ィ一カラムを作製する。 ヒト神経由来培養細胞 I MR— 32を 15 cmシャーレ（ファルコン社製） 40枚 にシャーレあたり 1 X 107個の細胞を捲き込む。 10% (W/V) FBSを添加し た D— MEM培地 （高グルコース） を用い、 37°C、 5% (V/V) 二酸化炭素存在 下でニ晚培養する。 ニ晚後、 培地を除去した後、 15mLのリン酸緩衝液でシャーレ の器壁を 1回洗浄した後、 該シャーレにトリプシン— EDTA溶液 （0. 05% (W /V) トリプシン、 0. 53mM EDTAを含む。 G i bc o製） 2mLを細胞が 浸るように添加し、 37°Cで 5分間放置する。 これに、 FBS含有培地をトリプシン 一 EDTA溶液の約 10倍量添加し、細胞懸濁液を得る。得られた細胞懸濁液を遠心 分離 （室温、 1， 300 r pm、 5分間） し、 上清を除去する。 細胞沈殿を 15mL のリン酸緩衝液に懸濁し、 再度室温で 1， 300 r pm、 5分間遠心分離し、 上清を 除去する。 その後、 細胞沈殿を氷冷した 1 OmM He p e s一水酸化力リウム （P H7. 8) 、 1 OmM 塩化カリウム、 0. 1 mM EDTA (pH8. 0) 溶液 （ 以下、 バッファー Aと記す。 ） 10mLに懸濁する。 10分間氷上で冷却した後、 4 °C、 1 , 300 r pm、 5分間遠心分離する。 上清を除去後、 細胞沈殿を 3 Om 1の バッファー Aで再懸濁し、 ダウンスホモジナイザ一ぺッスル B (Whe a t on製） を用いて氷上で冷却しながら細胞を完全に破碎する。得られた細胞破砕液を遠心分離 (4°C、 1300 r pm、 5分間） し、 上清を除去する。 この沈殿を 5 OmM He p e s— KOH (pH7. 8) 、 42 OmM 塩化カリウム、 0. 1 mM EDTA (pH8. 0) 、 5 mM塩化マグネシウム、 2% (W/V) グリセロール溶液 （以下 バッファー Bと記す。 ） 2mLに懸濁する。 4°Cで 30分間ローテ一ターにて穏やか に回転させた後、 遠心分離 （4°C、 24000 g、 30分間） する。 上清を回収し、 蒸留水で 5倍に希釈した希釈液を精製の試料とする。
(3) 単離の工程
上記 （2) で調製された試料を上記 （1) 記載のァフィ二ティーカラムにロードす る。 さらに、 5倍希釈したバッファ一 B 1 OmLをロードすることにより、 複合体 形成しなかった試料中成分を除去する。その後、塩化カリウム濃度を 1Mまで上昇さ せるグラジェント溶出を行い本発明ポリヌクレオチドへの結合物質を溶出すること によって、 本発明ポリヌクレオチドへの結合物質を含む画分を得る。 産業上の利用の可能性
本発明により、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gm lのプロモーター領域であ る塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド等が提供可能となる。当該ポ リヌクレオチド等は、三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lのプロモーターを介 したシグナル伝達調節物質の探索方法、 当該探索方法により得られる、三量体 Gタン パク質 αサブユニット G m 1のプロモーターを介したシグナル伝達調節能力を有す る化合物若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有してなることを 特徴とする神経 ·精神疾患用医薬等の研究 ·開発に有用である。 配列表フリーテキスト
配列番号 4
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 5
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 6
P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 7
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 8
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 9
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 1 0
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 1 1
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一

Claims

請求の範囲
1. 三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlをコードする遺伝子のプロモーター 領域の塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
2. プロモータ一領域の塩基配列が、 以下の （1) 〜 (4) のいずれかに記載され る塩基配列であることを特徴とする請求項 1記載のポリヌクレオチド。
(1) 配列番号 1で示される塩基配列、
(2)配列番号 1で示される塩基配列における塩基番号 603番から 3871番で示 される塩基配列、
(3) 上記 （1) 又は （2) の塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ三量体 G夕ンパク質 αサブユニット Gm 1をコードする遺伝子の転写を制御する能力を有する塩基配列、 及び
(4) 上記 （1) 又は （2) の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件下にハイプリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的であり、かつ 三量体 Gタンパク質ひサブユニット Gmlをコードする遺伝子の転写を制御する能 力を有する塩基配列。
3. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするプラスミ ド。
4. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有し、 かつ当該ポリヌクレオチド の下流 （3' 側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるポリヌクレオ チドを含有することを特徴とするプラスミド。
5. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含有し、 かつ当該ポリヌクレオチド の下流 （3'側） に、 当該ポリヌクレオチドによって転写が制御されるレポーター遺 伝子を含有することを特徴とするプラスミド。
6. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換細胞。
7. 請求項 3又は 4記載のプラスミドが導入されてなる形質転換細胞。
8. 請求項 5記載のプラスミドが導入されてなる形質転換細胞。
9. 三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlをコードする遺伝子のプロモーター を介したシグナル伝達調節物質の探索方法であつて、
(1) 請求項 8記載の形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2)前記第一工程後に、 レポーター遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値をモ 二ターする第二工程、
(3)前記第二工程によりモニタ一された発現量又はそれと相関する指標値の変化に 基づき、 前記物質が有する、三量体 Gタンパク質ひサブユニット Gmlをコードする 遺伝子のプロモーターを介してシグナル伝達を調節する能力を評価する第三工程、及 び
(4)前記第三工程で評価されたシグナル伝達調節能力に基づき、三量体 Gタンパク 質 αサブュニット Gmlのプロモータ一を介してシグナル伝達を調節する能力を有 する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法。
10. 物質が有する、三量体 Gタンパク質ひサブユニット Gmlをコードする遺伝 子のプロモーターを介したシグナル伝達調節能力を評価する方法であつて、
(1) 請求項 8記載の形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2)前記第一工程後に、 レポ一夕一遺伝子の発現量又はそれと相関する指標値をモ 二夕一する第二工程、 及び
(3)前記第二工程によりモニタ一された発現量又はそれと相関する指標値の変化に 基づき、 前記物質が有する、三量体 Gタンパク質 αサブュニット Gmlをコードする 遺伝子のプロモーターを介してシグナル伝達を調節する能力を評価する第三工程、 を有することを特徴とする評価方法。
1 1 . 請求項 1記載のポリヌクレオチドと結合する物質の探索方法であって、 ( 1 ) 請求項 1記載のポリヌクレオチドと被験物質とを接触させる第一工程、
( 2 )前記第一工程後に、 当該ポリヌクレオチドと被験物質との複合体生成の有無を 調べる第二工程、 及び
( 3 )前記第二工程で得られた複合体生成の有無の分析結果に基づき当該ポリヌクレ ォチドと結合する物質を選抜する第三工程、
を有することを特徴とする探索方法。
1 2 . 請求項 1記載のポリヌクレオチドと結合する物質の精製方法であって、
( 1 )請求項 1記載のポリヌクレオチドと試料とを接触させて、 当該ポリヌクレオチ ドと、当該試料中に含有される当該ポリヌクレオチドと結合する物質との複合体を生 成させる第一工程、 及び、
( 2 ) 前記第一工程後、 生成させた複合体から、 当該ポリヌクレオチドと結合する物 質を単離する第二工程、
を有することを特徴とする精製方法。
1 3 . 請求項 8記載の形質転換細胞と、 レポ一夕一遺伝子の発現量又はそれと相関 する指標値の測定試薬とを含む、三量体 Gタンパク質ひサブュニット Gm lをコード する遺伝子のプロモータ一を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
1 4 . 請求項 9又は 1 1記載の探索方法により得られる、三量体 Gタンパク質ひサ ブュニット Gm lをコードする遺伝子のプロモーターを介したシグナル伝達調節能 力を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有 効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする神経'精神 疾患用医薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1889905A4 (en) * 2005-05-17 2009-05-20 Sumitomo Chemical Co METHOD FOR MITIGATING MOISTURE DISORDER-INDUCED PATHOLOGY

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002034575A (ja) * 2000-07-28 2002-02-05 Shiseido Co Ltd ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途
EP1382613A1 (en) * 2002-07-16 2004-01-21 Sumitomo Chemical Company, Limited Novel G protein, polynucleotide encoding the same and utilization thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5489519A (en) * 1992-10-27 1996-02-06 Queen's University At Kingston Multidrug resistance protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002034575A (ja) * 2000-07-28 2002-02-05 Shiseido Co Ltd ヒトＩＩ型５α−レダクターゼのプロモーター遺伝子およびその用途
EP1382613A1 (en) * 2002-07-16 2004-01-21 Sumitomo Chemical Company, Limited Novel G protein, polynucleotide encoding the same and utilization thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1889905A4 (en) * 2005-05-17 2009-05-20 Sumitomo Chemical Co METHOD FOR MITIGATING MOISTURE DISORDER-INDUCED PATHOLOGY

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