DE102015101555A1

DE102015101555A1 - Verfahren und Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen

Info

Publication number: DE102015101555A1
Application number: DE102015101555.2A
Authority: DE
Inventors: Alfred Hansel; Matthias Dürst; Martina Schmitz
Original assignee: Oncgnostics Bioinstrumentezentrum Jena GmbH
Current assignee: Oncgnostics Bioinstrumentezentrum Jena GmbH
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2016-08-04
Also published as: WO2016124177A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens. Dabei ist das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, vorgesehen, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder seiner malignen Vorstufen sowie ein Kit, das zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder seiner malignen Vorstufen verwendet werden kann.
Gebärmutterhalskrebs, auch als Zervixkarzinom bezeichnet, gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen. Im Gegensatz zu vielen anderen Krebserkrankungen entsteht Gebärmutterhalskrebs meist als Folge einer Infektion mit sogenannten Hochrisiko-humanen-Papillomaviren (hr-HPV). Diese Viren werden sexuell übertragen, so dass eine Infektion schon im jungen Alter auftreten kann. Damit sind von Gebärmutterhalskrebs und seinen Vorstufen sehr häufig auch schon Frauen unter 30 Jahre betroffen. Gebärmutterhalskrebs entwickelt sich langsam über Vorstufen, die als zervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN) bezeichnet werden. Diese werden unterteilt in:
CIN1 = leichte Dysplasie, geht von basal aus bis höchstens einem Drittel der Höhe des Epithels;
CIN2 = mittelgradige Dysplasie, bis zu zwei Drittel des Epithels; und
CIN3 = hochgradige Dysplasie, durchzieht fast das gesamte Epithel.
Während etwa 90% der CIN1 sich nach einer gewissen Zeit zurückbilden und die zugrunde liegende hr-HPV-Infektion nicht mehr nachweisbar ist, entwickeln sich etwa 30% der CIN2 und zwischen 30 und 50% der CIN3 zu einem Zervixkarzinom. D. h. mit anderen Worten, nicht jede der Neoplasien CIN1, CIN2 und CIN3 ist tatsächlich eine maligne, also bösartige Gewebeveränderung. Es ist daher wünschenswert, so früh wie möglich zwischen malignen Neoplasien und nicht-malignen Neoplasien zu unterscheiden.
Molekularbiologische Testverfahren haben die Krebsvorsorge in vielen Bereichen wesentlich verbessert. Da bis auf wenige Ausnahmen alle Zervixkarzinome und deren Vorstufen hr-HPV-DNA enthalten, erscheint der Nachweis von HPV-DNA als ideales Verfahren für die Krebsvorsorge. In verschiedenen veröffentlichten Studien konnte gezeigt werden, dass HPV-DNA-Nachweistests für den Nachweis von CIN2+ eine Sensitivität größer 95 % und eine Spezifität größer 90 % aufweisen. Allerdings werden durch einen positiven HPV-Test sehr viele Frauen verunsichert, obwohl nur ein geringer Teil der infizierten Frauen eine maligne Dysplasie oder ein Karzinom aufweist oder entwickeln wird, während die meisten lediglich mit HPV infiziert sind, aber keine Krebsvorstufen aufweisen (Cuzick et al., 2006; Int J Cancer, 119: 1095–1101). Somit besteht ein Bedarf an einer verbesserten Diagnostik, um maligne Läsionen bzw. sich erst entwickelnde, maligne Läsionen gezielt nachzuweisen.
In vielen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Methylierungsmarker grundsätzlich für die molekulare Diagnostik im Bereich der Früherkennung des Zervixkarzinoms geeignet sind. Wang et al., Cancer Res. 2008, 68(7), S. 2489 ff., beschreiben die Identifikation neuer Methylierungsmarker bei Zervixkarzinom. Huang et al., Abstract #50, 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, CA, USA, April 12–16, 2008, ISSN 0197-016X beschreiben die Hypermethylierung von CIDEA und RXFP3 als potentielle epigenetische Marker für Eierstockkrebs. Dürst, Hansel, Steinbach beschreiben in EP 2 478 117 B1 die Nutzung des Nachweises einer DNA-Hypermethylierung der Promotor-/5’-Bereiche der beiden Marker ASTN1 und ZNF671 zur Früherkennung von Zervixkarzinomen. Hansel et al., PLo-Sone 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0091905 beschreiben die Nutzung einer DNA-Methylierungssignatur zum Nachweis von Zervixkarzinomen. Beschrieben wurden speziell die Marker DLX1, ITGA4, RXFP3, SOX17, ZNF671.
Alle diese und auch weitere Publikationen beschreiben allerdings die Erkennung von Zervixkarzinomen und deren Vorstufen. Es wäre jedoch wünschenswert, wenn bereits vor der Ausbildung eines Zervixkarzinoms und/oder einer seiner malignen Vorstufendie beginnende Entstehung einer solchen Vorstufe, insbesondere einer beginnenden malignen zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN3), nachgewiesen werden könnte.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren angegeben werden, das eine Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen ermöglicht, und zwar bevor eine maligne Vorstufe, insbesondere CIN3, oder ein Zervixkarzinom bei dem Lebewesen entstanden ist.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 11 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens vorgesehen. Das Verfahren umfasst das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Unterscheidung zwischen Lebewesen, die eine maligne Vorstufe des Zervixkarzinoms oder ein Zervixkarzinom entwickeln werden (sofern keine medizinische Behandlung durchgeführt wird), von den Lebewesen, die keine maligne Vorstufe des Zervixkarzinoms oder ein Zervixkarzinom entwickeln werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt diese Unterscheidung lange bevor sich eine Vorstufe des Zervixkarzinoms, sei sie maligne oder nicht, gebildet hat. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die Unterscheidung zwischen malignen oder nicht-malignen Vorstufen des Zervixkarzinoms. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Erkennung einer inzidenten CIN3 mit malignem Potential geeignet. Eine inzidente CIN3 (in der Fachsprache als „incident CIN3“ bezeichnet) ist eine CIN3 am Beginn ihrer Entwicklung oder unmittelbar vor dem Beginn ihrer Entwicklung. Wie oben erläutert, besteht bei einer CIN3 ein besonders hohes Risiko eines Fortschreitens zu einem Zervixkarzinom. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher insbesondere geeignet, das Risiko, dass eine Patientin eine maligne CIN3 entwickeln wird, zu bestimmen.
Der Begriff „maligne Vorstufe“ bezeichnet eine Vorstufe, die sich – sofern keine medizinische Behandlung vorgenommen wird – zu einem Zervixkarzinom entwickeln wird.
Die Ausdrücke „Neoplasie“ und „Dysplasie“ werden in der vorliegenden Erfindung synonym verwendet.
Der Begriff „humane und tierische Lebewesen“ umfasst Menschen und Tiere, insbesondere weibliche Menschen und Tiere. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Bestimmung des Risikos bei Menschen bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise bei Frauen angewendet, die hr-HPV-positiv getestet worden sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, insbesondere bei hr-HPV-positiv getesteten Frauen diejenigen frühzeitig zu erkennen, die CIN3 und in Folge Zervixkarzinome entwickeln. Die Probe ist daher zweckmäßigerweise eine hr-HPV-positiv getestete Probe oder einer hr-HPV-positiv getesteten Frau entnommen.
Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass die Methylierung von mindestens zwei Genen oder von allen drei Genen der ersten Gruppe bestimmt wird. Erfindungsgemäß besteht ein Risiko eines Fortschreitens zu einem Zervixkarzinom, wenn nur eines der drei Gene der ersten Gruppe methyliert ist. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass ein Risiko besteht, wenn in der Probe zumindest zwei der Gene der ersten Gruppe methyliert sind oder wenn in der Probe zumindest drei der Gene der ersten Gruppe methyliert sind.
Die Begriffe „methyliert“ oder „Methylierung“ bedeuten, dass bei einer Probe der Methylierungsstatus bestimmt wird und sich dieser im Vergleich zu einer Probe ohne maligne CIN, also einer unauffälligen Probe, unterscheidet. Der Methylierungsstatus kann mittels bekannter Verfahren, beispielsweise mittels methyl-spezifischer PCR, aber auch mittels Sequenziertechniken oder Verdau mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen, bestimmt werden.
Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylierung bestimmt wird, ohne dass eines vorbereitenden Schrittes einer DNA-Isolation aus der Probe bedarf. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe und/oder zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe mittels methylierungsspezifischer PCR bestimmt wird. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, dass die Methylierung mittels Zweischritt-PCR im Echtzeit-Format bestimmt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner umfassen das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4 (α4-Integrin), RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) besteht, methyliert sind. Dabei besteht das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen, wenn

(i) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann; und
(ii) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.

Die Bestimmung, ob zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe methyliert ist, ist dann besonders zweckmäßig, wenn nicht ganz klar festgestellt werden kann, ob zumindest ein Gen der ersten Gruppe methyliert ist. Die Bestimmung, ob zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe methyliert ist, kann aber auch dann durchgeführt werden, wenn feststeht, dass zumindest eines der Gene der ersten Gruppe methyliert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Prognose, ob die Patientin, der die Probe entnommen worden ist, ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, entwickelt, sofern sie sich keiner Behandlung unterzieht. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher vorteilhafterweise mit einer Probe durchgeführt, die einer Patienten entnommen wurde, bei der zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder vorher kein Zervixkarzinomen und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, festgestellt worden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher mit einer Probe durchgeführt, die einer Patientin entnommen wurde, die weder zum Zeitpunkt der Probenentnahme noch zu einem früheren Zeitpunkt ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe davon, insbesondere maligne CIN3, aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein prognostisches Verfahren zur Bestimmung, ob eine Patientin ein Zervixkarzinom und/oder eine maligne Vorstufe, insbesondere maligne CIN3, davon entwickeln könnte.
Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit der frühzeitigen Diagnose von Gewebeveränderungen des Gebärmutterhalses, die das Potenzial zur Entwicklung einer malignen zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN3) haben, durch den Nachweis von hypermethylierten DNA-Regionen. Solche CIN3 haben eine hohe Wahrscheinlichkeit, zu einem Karzinom fortzuschreiten, gelten daher als Krebsvorstufen, die behandelt werden müssen. Ihr frühzeitiger zuverlässiger Nachweis ist von besonders hohem Interesse, da Patientinnen mit Potenzial zur Entwicklung einer solchen hochgradigen Dysplasie bereits vor deren Ausbildung erkannt, entsprechend diagnostisch überwacht und schließlich auch rechtzeitig gezielt behandelt werden können. Dies ist von besonderem Interesse, da solche CIN3 bereits bei Frauen mit Kinderwunsch auftreten. Nach einer operativen Behandlung einer hochgradigen Dysplasie haben Frauen ein stark erhöhtes Risiko zur Früh- und Fehlgeburtlichkeit, wobei das Risiko umso höher ist, je tiefgreifender der operative Eingriff war. Die (frühzeitige) Entfernung von möglichst kleinen malignen Gewebeveränderungen minimiert damit das Risiko der erhöhten Früh- und Fehlgeburtlichkeit. Weiterhin hilft die Unterscheidung zwischen malignen und nicht malignen Dysplasien, Operationen bei Frauen mit nicht malignen Dysplasien zu vermeiden und damit, bei diesen das Risiko einer aus einer solchen Operation folgenden erhöhten Früh- und Fehlgeburtlichkeit zu minimieren.
Damit unterscheidet sich die vorliegende Erfindung erheblich vom Stand der Technik, aus dem zwar die Erkennung von Zervixkarzinomen und deren Vorstufen bekannt ist. Im Stand der Technik ist aber nicht beschrieben, dass Neoplasien mit malignem Potential, die sehr häufig zu einem Karzinom führen, bereits vor ihrer histopathologischen Erkennung durch den Nachweis von DNA-Methylierungsmarkern erkannt und von nicht-malignen Neoplasien diskriminiert werden können. Dies wurde in den der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchungen erstmals gezeigt.
In den erfindungsgemäßen Verfahren wird speziell die Hypermethylierung von DNA-Regionen im Promotorbereich und/oder im 5’-Bereich der Gene ASTN1 (Astrotactin 1), und/oder DLX1 (distal-less homeobox 1, Transkriptionsfaktor), und/oder ZNF671 (Zinkfinger-Protein 671; Transkriptionsfaktor) untersucht. Die dieser Erfindung zugrunde liegenden Untersuchungen haben gezeigt, dass eine DNA-Methylierung in Guanin-/Cytosin-reichen Bereichen, sogenannten CpG-Inseln, im Promotorbereich und/oder im 5’-Bereich wenigstens eines dieser drei Gene oder zwei dieser drei Gene oder aller drei Gene bereits frühzeitig in der Entstehung von hochgradigen malignen Dysplasien (CIN3) nachgewiesen werden kann. Ihr Nachweis kann damit für die frühzeitige Erkennung von sich entwickelnder maligner CIN3, also einer inzidenten malignen CIN3, diagnostisch genutzt werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass es unter Verwendung einer ersten Probe, die dem Lebewesen zu einem ersten Zeitpunkt entnommen wurde, und einer zweiten Probe, die dem Lebewesen zu einem zweiten Zeitpunkt entnommen wurde, durchgeführt wird, wobei der zweite Zeitpunkt zumindest 10 Tage nach dem ersten Zeitpunkt liegt und wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und,
(b) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind;

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass es die Schritte umfasst:

(a1) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind;
(a2) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der zweiten

(b1) wenn in der zweiten Probe (i) eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder (ii) wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt,

Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und

(b2) wenn in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind;

(i) in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt; und
(ii) in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen vorgesehen. Das Kit ist insbesondere für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt. Das Kit umfasst Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelte Proben-DNA binden. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4, RXFP3 und SOX17 besteht, in der Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelte Proben-DNA aus der Probe binden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den nachfolgend näher beschriebenen Erkenntnissen der Erfinder hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen dem Methylierungsstatus bestimmter DNA-Abschnitte und der Entwicklung von hochgradigen Dysplasien CIN3, die das Potenzial zur Progression zu einem Zervixkarzinom (malignes Potentail) haben. In solchen hochgradigen Dysplasien CIN3 und in Karzinomen werden im Vergleich zum entsprechenden Normalgewebe die Cytosin/Guanin-reichen CpG-Inseln im Upstream-, Promotor- und in promotornahen Exonbereichen von bestimmten Genen häufig methyliert. Diese Methylierung von DNA-Regionen geschieht nicht willkürlich, sondern ist von den jeweiligen Tumor-Entitäten und Tumor-Typen abhängig (Esteller, 2007, Hum. Mol. Genet., 16: R50–R59).
Im Rahmen der Erfindung wurden Abstrichproben von Frauen untersucht, die bereits vor der Erkennung einer histopathologisch bestätigten hochgradigen Dysplasie CIN3 mindestens einmal an einer Untersuchung mit Entnahme einer Abstrichprobe sowie einer Gewebeprobe teilgenommen haben. Die hier aufgeführte Analyse zeigt erstmals, dass die Methylierung bestimmter Bereiche der Gene ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 einen wertvollen Marker zur frühzeitigen Diagnose von Patientinnen mit beginnenden malignen Dysplasien, insbesondere hochgradigen malignen Dysplasien CIN3, in einer Probe darstellt. Die vorliegende Erfindung stellt daher verbesserte Methoden zum Nachweis einer inzidenten malignen CIN3 in einer Probe (z.B. Zellabstrich des Gebärmuttermundes, Zervikalspülung) bereit.
Obwohl die Bestimmung des Methylierungsstatus der drei vorgenannten Genregionen, wie von den Erfindern gezeigt, schon höchst aussagekräftig ist, kann es zur Absicherung der Diagnose in medizinischen Ausnahmefällen hilfreich sein, auch den Methylierungsstatus einer oder mehrerer weiterer Genregionen wie ITGA4 (α4-Integrin) und/oder RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und/oder SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) zu ermitteln.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Nachweis des Methylierungsstatus von ASTN1, DLX1 und ZNF671. Der Nachweis kann ein direkter oder ein indirekter Nachweis sein. Vorzugsweise wird nachgewiesen, ob die Promotorbereiche der Gene ASTN1, DLX1 und ZNF671 hypermethyliert sind. Da Methylierung meist an Promotorregionen von Genen stattfindet, konzentrieren sich Methoden zum Nachweis der Methylierung der relevanten Gene meist auf diese Regionen. Allerdings können Gene auch in anderen als der Promotorregion methyliert sein, da die GC-reichen CpG-Inseln sich nicht nur dort befinden. Der Nachweis einer Methylierung in solchen weiteren Bereichen der genannten Gene kann auch von diagnostischem Nutzen sein und ist damit auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Zum Nachweis des Methylierungsstatus der Gene ASTN1, DLX1 und ZNF671 wird untersucht, ob bestimmte Cytosine zu 5-Methylcytosin modifiziert, also methyliert sind oder nicht. In DNA aus einer Probe von einer Frau ohne hr-HPV-Infektion oder von einer Frau mit einer hr-HPV-Infektion ohne nachweisbare klinische Veränderungen ist die Methylierung in den entsprechenden Positionen der DNA selten bis gar nicht nachweisbar. Bei Frauen mit maligner Dysplasie oder Karzinom ist die Wahrscheinlichkeit für eine Methylierung an den gewählten Cytosinresten dagegen hoch.
Die Untersuchungen, welche dieser Erfindung zugrunde liegen, haben überraschend gezeigt, dass bei Frauen, die eine hochgradige Dysplasie mit malignem Potential entwickeln, die Methylierung der Genabschnitte ASTN1, DLX1 und ZNF671 zeitlich bereits deutlich vor der histopathologischen Entdeckung dieser Dysplasie nachweisbar ist. Damit ist gezeigt, dass die Methylierung dieser DNA-Regionen ein frühes Ereignis in der Ausbildung von hochgradigen Dysplasien und folglich wahrscheinlich auch von Karzinomen darstellt. Somit ist das hier aufgezeigte Verfahren dazu geeignet, frühzeitig in der Krebsfrüherkennung diejenigen Patientinnen zu erkennen, die sehr genau auf Gewebeveränderungen untersucht werden müssen, um durch frühzeitige gezielte Eingriffe die negativen Folgen zu minimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere ein Verfahren zur Erkennung von inzidenter CIN3 mit Potenzial zur Progression zu einem Zervixkarzinom durch die Bestimmung des Methylierungsstatus bestimmter Genregionen im Bereich von ASTN1 (Astrotactin 1), DLX1 (distal-less homeobox 1, Transkriptionsfaktor) und ZNF671 (Zinkfinger-Protein 671, Transkriptionsfaktor), wobei eine nachweisbare Methylierung wenigstens einer dieser Genregionen ein Hinweis auf die Entstehung einer hochgradigen Dysplasie CIN3 ist.
Im Verlauf der Untersuchungen, die dieser Erfindung zugrunde liegen, wurde auch der Methylierungsstatus der Genregionen ITGA4 (α4-Integrin), RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass optional bei uneindeutigen Befunden zusätzlich noch der Methylierungsstatus dieser Gene untersucht werden kann.
ASTN1 (Astrotactin 1; accession number NM_004319.1, NM_207108 enthalten in NC_000001.9) ist ein Adhäsionsprotein, das eine wichtige Rolle bei der Migration von neuronalen Zellen spielt. DLX1 (distal-less homeobox1; accession numbers NM_178120, NM_001038493, enthalten in NC_000002.11) ist ein Transkriptionsfaktor und beeinflusst Zelldifferenzierung. ZNF671 (accession number NM_ 024883, enthalten in NC_000019.9) ist ein Transkriptionsfaktor mit einem typischen Zinkfinger-Motiv. ITGA4 (α-4-Integrin; accession number NM_000885, enthalten in NC_000002.10) gehört zur Familie der α-Integrine, welche zusammen mit jeweils einem β-Integrin als integrale Membranproteine auftreten. Sie dienen als Rezeptoren für Fibronectin und spielen somit eine wesentliche Rolle bei der Zelladhäsion. RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3; accession number NM_016568, enthalten in NC_000005.8) dient als G-Protein-gekoppelter Rezeptor für Relaxin 3. SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17; accession number NM_022454, enthalten in NC_000008.11) ist ein Transkriptionsfaktor, der bei Embryogenese und Zelldifferenzierung eine Rolle spielt. Die vorstehend angegebenen Accession Numbers beziehen sich auf die Datenbank GenBank.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „Probe“ umfasst jegliche Körperproben, in denen DNA-Methylierung nachgewiesen werden kann. Beispiele solcher Körperproben sind Blut, Abstriche, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, gastrointestinale Sekrete, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Organpunktate und Biopsien. Insbesondere sind Abstriche und Biopsien vorteilhaft, wenn inzidente CIN mit malignem Potential erkannt werden sollen. Der Fachmann kennt geeignete Verfahren und Hilfsmittel zur Probenentnahme. Der Fachmann kennt auch Verfahren und Reagenzien zur DNA-Isolierung aus der Probe, z. B. Extraktion mit Phenol/Chloroform oder mittels kommerzieller Kits.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „Methylierungsstatus“ bezieht sich auf die Hypermethylierung der genomischen DNA im Bereich der Primer-Bindungsstellen der betreffenden Genregionen, vorzugsweise in GC-reichen CpG-Inseln im 5’- und Promotorbereich der bezeichneten Gene.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Methylierung von CG-reichen Regionen im Bereich der Gene ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 bestimmt. Der hier verwendete Begriff „Methylierung“ ist synonym mit dem in der Molekularbiologie gängigen Begriff „Hypermethylierung“. Er bezeichnet die vom Normalzustand abweichende Methylierung innerhalb eines allgemein an Guanin und Cytosin und besonders an CG-Dinukleotiden reichen DNA-Abschnittes, einer sogenannten CpG-Insel. Vorzugsweise handelt es sich bei der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Probe um einen Gebärmutterhalsabstrich, der sehr zuverlässige Ergebnisse liefert.
Vorzugsweise wird die Methylierung von DNA nach einer vorangegangenen chemischen Modifikation von nicht-methylierten Cytosinen durch die Bisulfit-Methode mittels einer sogenannten methylierungsspezifischen PCR (MSP) unter Verwendung geeigneter Primerpaare nachgewiesen. Bei der Bisulfit-Methode werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, methylierte Cytosine (5-Methylcytosin) sind vor dieser Umwandlung geschützt. Uracil weist andere Paarungseigenschaften als Cytosin auf, d.h., es verhält sich wie Thymin. Die MSP ist eine etablierte Technik zum Nachweis von DNA-Methylierung. Die MSP beruht auf Primern und eventuell Sonden, die eine Unterscheidung zwischen methylierter und unmethylierter DNA erlauben, d. h., die Ausbildung eines Amplifikationsproduktes zeigt eine Methylierung an, entspricht somit einem positiven Befund.
Das Design der Primer für die Detektion des Methylierungsstatus hängt von der Lokalisierung und Sequenz der Methylierungsbereiche von ASTN1 und/oder DLX1 und/oder ZNF671 sowie von den Methylierungsbereichen von ITGA4 und/oder RXFP3 und/oder SOX17 ab, falls optional auch der Methylierungsstatus dieser Gene bestimmt werden soll.
Die in dieser Erfindung verwendbaren methylierungsspezifischen Primer für ASTN1, DLX1 und ZNF671 binden während des Testverfahrens nur dann an die chemisch mit Bisulfit modifizierte Proben-DNA, wenn diese an bestimmten Cytosinen innerhalb der Primerbindestellen methyliert war. Waren diese Bereiche vor Bisulfit-Behandlung nicht methyliert, binden auch die Primer nicht, und es entsteht kein Reaktionsprodukt. So weist die Anwesenheit eines Reaktionsproduktes auf eine Methylierung des DNA-Bereiches des jeweiligen Gens und damit auf das mögliche Vorliegen eines Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen, insbesondere einer inzidenten CIN3, hin.
Der Nachweis der methylierten Genregionen erfolgt vorzugsweise in einem Real-time PCR-Verfahren (QMSP), das nicht nur eine qualitative Erfassung der Methylierung, sondern auch eine Quantifizierung der methylierten DNA-Abschnitte erlaubt. Diese QMSP kann in einem fluoreszenzbasierten Realtime-Verfahren durchgeführt werden, bei dem die Entstehung des methylierungsspezifischen Produktes durch den Einbau eines fluoreszenten Farbstoffes, z. B. SYBR-Green oder EVA-Green, verfolgt wird.
Mit beiden Verfahren, MSP und QMSP, kann die Methylierung von Markergenen in einem hohen Hintergrund von nicht-methylierter DNA nachgewiesen werden (Shames et al., 2007, Cancer Lett. 251: 187–98). PCR-basierte Methoden können auch in Hochdurchsatz-Verfahren angewendet werden und sind daher auch für den diagnostischen Nachweis im Rahmen der Krebsfrüherkennung besonders geeignet.
Alternativ kann die Entstehung der PCR-Produkte der MSP auch nach Abschluss der PCR durch ein Hybridisierungsverfahren, z. B. durch Streifen oder Arrays mit fixierten Sonden, an denen entstandene PCR-Produkte binden, nachgewiesen werden.
Weiterhin können bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens positive und/oder negative Kontrollgene, z.B., ein unmethyliertes oder ein methyliertes Kontrollgen co-amplifziert werden.
Dem Fachmann sind weitere Techniken, wie z. B. der Einsatz von methylierungssensitiven DNA-Restriktionsenzymen zur Unterscheidung zwischen methylierter und nicht-methylierter DNA mit anschließender PCR, oder die Hochdurchsatz-Sequenzierung von chemisch mit Bisulfit behandelter DNA zum Nachweis vormals methylierter DNA-Abschnitte, bekannt, um methylierte DNA-Regionen nachzuweisen. Auch diese und weitere Nachweistechniken für die methylierten DNA-Regionen umfasst die Erfindung.
Es ist bekannt, dass die Methylierung von Genen oft mit einer Transkriptionsblockade und dadurch einer fehlenden Translation in Zusammenhang steht. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch die indirekte Bestimmung des Methylierungsstatus durch Bestimmung der Konzentration der entsprechenden RNA bzw. des Proteins. Deren Nachweis kann durch übliche Verfahren erfolgen, z. B. (für RNA) über Northern-Blot-Analyse, RT-PCR etc. und (für Proteine) Antikörper-basierte Verfahren oder Verfahren, die auf der Bestimmung einer biologischen Aktivität des Proteins basieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auf den folgenden Schritten beruhen:

(i) Vom Zellabstrich der zu testenden Person wird DNA nach einem Standard-Verfahren isoliert, z. B. QiaAmp DNA-Mini Kit, nach Vorschrift des Herstellers (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Alternativ kann eine Abstrichprobe mit einem lysierenden Medium, wie z. B. STM (QIAGEN) versetzt und direkt auf die Anwesenheit von hr-HPV-DNA, siehe nachfolgend (ii), untersucht oder in der chemischen Behandlung durch Bisulfit, siehe nachfolgend (iv), eingesetzt werden, ohne den vorherigen Schritt der Aufreinigung der Proben-DNA.
(ii) Vorzugsweise wird in einem zweiten Schritt untersucht, ob die zu analysierende Probe hr-HPV-DNA enthält. Dieser Nachweis erfolgt mit einem bereits etablierten Verfahren wie z.B. dem GP5+/6+-PCR EIA-Verfahren (Jacobs et al., 1995, J Clin Microbiol 33: 901–905) oder einem kommerziellen Verfahren, wie z. B. Hybrid Capture II (QIAGEN). Sämtliche hr-HPV-Typen (HPV16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82) sollten erfasst werden. Durch den Nachweis eines house-keeping Gens, z.B. β-Globin, ACHE oder β-Actin, wird sichergestellt, dass in der Probe eine ausreichende Menge an DNA von ausreichender Qualität vorliegt, die auch amplifizierbar ist.
(iii) Bei einer HPV-negativen Probe ist die Entstehung einer malignen Dysplasie nahezu 100 % ausgeschlossen (Cuzick et al., 2006; Int. J. Cancer. 119: 1095–1101). Diese Proben müssen daher nicht weiter untersucht werden. Die Differenzierung zwischen Frauen mit einem hr-HPV-positiven Befund entweder mit oder ohne maligne CIN erfolgt dann über die Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene von ASTN1, DLX1 und ZNF671; der Nachweis des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene ITGA4, RXFP3 und SOX17 kann bei der Diagnose unterstützen.
(iv) Dazu wird die DNA der hr-HPV-positiven Proben oder Material aus einem Abstrich in STM-Medium nach der Bisulfit-Methode, z. B. mittels eines kommerziellen Kits (z. B. EpiTect Fast, QIAGEN), chemisch konvertiert. Dabei werden durch Behandlung mit Natrium-Bisulfit und nachfolgende alkalische Hydrolyse alle nicht methylierten Cytosine der DNA-Probe in Uracile umgewandelt.
(v) Die vormals methylierte DNA wird mittels spezifischer Primer für die methylierte Form der jeweiligen Genomabschnitte durch PCR amplifiziert und analysiert.
(vi) Zum Nachweis der Methylierung des Gens ASTN1 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Name	Primersequenz
ASTN1-f	CGTAAGCGTTGTTAGCGTAGC
ASTN1-rev	CGCGAAATCGAAACGAAAACG

Zum Nachweis der Methylierung des Gens DLX1 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Name Primersequenz

DLX1-f GTACGTTGTAGGAGTCGTAAAC

DLX1-rev CGACCGAACTAAAACTCAACTCG
Zum Nachweis der Methylierung des Gens ZNF671 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Name Primersequenz

ZNF671-f CGGAGGACGTAGTATTTATTCGC

ZNF671-rev CTACGTCCCCGATCGAAACG
Das erfindungsgemäße Verfahren beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser Primer für den Nachweis der Methylierung der Gene ASTN1, DLX1 und/oder ZNF671. Die Nutzung von Primern mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der bezeichneten Genregionen dienen können, werden durch diese Erfindung ebenfalls erfasst.

(vii) Zum Nachweis der Methylierung der Genabschnitte ASTN1, DLX1 und/oder ZNF671 durch MethyLight-Analyse können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Primern eine oder mehrere der folgenden fluoreszierenden Sonden eingesetzt werden:

Name	Sondensequenz
ASTN1	GTAATTCGTTTGTTTCGTAAGTTGTTCG3
DLX1	CGTAAACGTTAGCTGTTCTGGAAACCG
ZNF671	ACCGCTCCCGACAACTATCCGC

Die Sonden können, je nach Applikation, mit entsprechenden fluoreszenten Farbstoffen gekoppelt sein. Die Erfindung beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser speziellen Sonden für den Nachweis der Methylierung der Genregionen ASTN1, DLX1 und/oder ZNF671. Sie umfasst auch Sonden mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der beiden Gene dienen können.
Eine Quantifizierung der Methylierung der Markergene ist nicht zwingend. Entscheidend ist, dass, z.B. durch MSP oder QMSP, mindestens eine Zelle mit methylierten Markergen(en) in einem Hintergrund von 1000 Zellen ohne methylierte(s) Markergen(e) nachgewiesen werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Methylierung einer oder mehrerer der Gene ITGA4, RXFP3 und/oder SOX17 überprüft. Zum Nachweis der Methylierung des Gens ITGA4 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

Name Primersequenz

ITGA4-f CGAATTCGGTTTTCGAAGGGTC

ITGA4-rev CACGACCGAATAACCGAACAAC
Zum Nachweis der Methylierung des Gens RXFP3 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

RXFP3-f ATTTCGGAAAGCGTTTTTCGC

RXFP3-rev CTACGTCTCTCCGCGATTATC
Zum Nachweis der Methylierung des Gens SOX17 in einer methylierungsspezifischen PCR oder QMSP können die folgenden methylierungsspezifischen Primer eingesetzt werden:

SOX17-f GGGATACGGTTTAAGAGTCGTTC

SOX17-rev ACGATACTCCACTACTACGCCG
Zum Nachweis der Methylierung der Gene ITGA4, RXFP3 und/oder SOX17 durch MethyLight-Analyse können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Primern eine oder mehrere der folgenden fluoreszierenden Sonden eingesetzt werden:

Name Sondensequenz

ITGA4 GTAATTCGTTTGTTTCGTAAGTTGTTCG

RXFP3 CGTTTCGGGATTACGTATGTTTTTTG

SOX17 CGTGGGCGCGGACAGTTGTCGGGAGCG
Die Sonden können, je nach Applikation, mit entsprechenden fluoreszenten Farbstoffen gekoppelt sein. Die Erfindung beschränkt sich aber nicht auf den Einsatz dieser speziellen Sonden für den Nachweis der Methylierung der Gene ITGA4, RXFP3 und SOX17. Sie umfasst auch Sonden mit anderen Sequenzen, die zum Nachweis der Methylierung der beiden Gene dienen können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein solches Kit umfasst genspezifische Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus der Genregionen von ASTN1 (Astrotactin 1), DLX1 (distal-less homeobox1) und ZNF671 (Zinkfingerprotein, Transkriptionsfaktor), vorzugsweise die vorstehend näher definierten Primer bzw. Primerpaare. In einer weiteren Ausführungsform kann das Kit zusätzlich genspezifische Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus von ITGA4 (α4-Integrin) und/oder RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und/oder SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17), vorzugsweise die vorstehend näher definierten Primer bzw. Primerpaare, enthalten.
Das Kit kann zusätzlich zu den Primerpaaren für die jeweiligen Genregionen fluoreszent markierte Sonden enthalten, falls eine Detektion der Marker mit dem MethyLight-Verfahren erfolgen soll.
Das Kit kann in getrennten Behältern zusätzlich folgende Reagenzien und Bestandteile enthalten:

(a) Enzyme zur Amplifikation von DNA
(b) einen oder mehrere Puffer

Von den einzelnen Kitkomponenten können einzelne oder mehrere Vertreter vorliegen.
Werden die Reaktionsprodukte im Anschluss an die Amplifikation durch Endpunkt-PCR nachgewiesen, kann das Kit zusätzlich zu den obigen Bestandteilen

a) Arrays oder Teststreifen mit fixierten Detektionssonden zum Nachweis der Reaktionsprodukte
b) einen oder mehrere Puffer

Mit der vorliegenden Erfindung ist es somit möglich, frühzeitig zu erkennen, ob ein Lebewesen ein Zervixkarzinom oder eine seiner malignen Vorstufen, insbesondere eine maligne inzidente CIN3, entwickelt. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens kann bestimmt werden, ob eine maligne Vorstufe entsteht oder vorliegt. Damit können Frauen mit hr-HPV-Infektion identifiziert werden, die eine hochgradige Dysplasie CIN3 mit malignem Potenzial bzw. ein Karzinom entwickeln werden. Kennzeichnend ist ferner, dass die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erzielten Ergebnisse nicht einer subjektiven Bewertung unterliegen, wodurch z.B. die falsch-negativen bzw. falsch-positiven Ergebnisse eines mikroskopischen Verfahrens wie des Pap-Tests vermieden werden können. Somit liefert die vorliegende Erfindung einen wichtigen Beitrag zur modernen Diagnostik im Bereich Gebärmutterhalskrebs.
Mittels einer Kombination der Bestimmung des Methylierungsstatus von ASTN1, DLX1 und ZNF671 kann eine Erkennung einer inzidenten CIN3 erreicht werden, die über die Einzelbestimmung anderer Gene hinausgeht.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels näher erläutert.
Beispiel: Frühzeitige Bestimmung der DNA-Methylierung in Abstrichen
Untersucht wurden Abstriche von 31 Frauen, die im Rahmen von kolposkopischen Untersuchungen genommen wurden. Von jeder Frau wurden Abstriche an mindestens zwei unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten genommen. Zusätzlich wurden an den jeweiligen Untersuchungszeitpunkten teilweise Gewebeproben genommen. Zum jeweils letzten Untersuchungszeitpunkt wurde bei den Frauen histopathologisch eine hochgradige Dysplasie CIN3 diagnostiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und den Tabellen 2A und 2B dargestellt.
Tabelle 1 zeigt, wie häufig die Genregionen ASTN1, DLX1 und ZNF671 zu einem ersten Zeitpunkt methyliert vorlagen (Zeile „vorher“). In der Zeile „gleichzeitig“ ist angeben, wie häufig die Genregionen ASTN1, DLX1 und ZNF671, die zum ersten Zeitpunkt nicht methyliert vorlagen, zum zweiten Zeitpunkt, bei dem eine CIN3 histologisch nachgewiesen wurde, methyliert vorlagen. In der Zeile „nicht“ ist angeben, wie häufig die Genregionen ASTN1, DLX1 und ZNF671, die zum ersten Zeitpunkt nicht methyliert vorlagen, auch zum zweiten Zeitpunkt, bei dem eine CIN3 histologisch nachgewiesen wurde, nicht methyliert vorlagen.
Eine frühere Methylierung wenigstens eines der Gene trat bei 84 % der Patientinnen auf. Durch die Kombination der drei Gene kann somit eine frühere Diagnose einer sich entwickelnden CIN3 erreicht werden. Dies zeigt die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Außerdem konnte eine starke Korrelation nachgewiesen werden zwischen einem positiven Methylierungsbefund und einem malignen Potential einer histopathologisch bestätigten CIN3. Tabelle 1: Methylierungsstatus von konsekutiv gesammelten Abstrichproben von Frauen mit histopathologischer Enddiagnose CIN3. Insgesamt wurden die Abstrichproben von 31 Patientinnen untersucht, wobei von jeder einzelnen Patientin mindestens zwei Proben vorlagen. Eine Probe gilt als positiv, wenn in wenigstens einer der drei Genregionen in der Analyse eine Methylierung nachgewiesen werden kann.

Erkennung im Vergleich zu Histopathologie CIN3	ASTN1	DLX1	ZNF671	Anzahl Patientinnen, die für mindestens einen der drei Marker positiv ist	Relativer Anteil der Patien tinnen, die für mindestens einen der drei Marker positiv ist
vorher	10	19	14	26	83,9 %
gleichzeitig	7	8	7	4	12,9 %
nicht	13	3	9	1	3,2 %

In den Tabellen 2A und 2B ist gezeigt, wie viel früher eine Diagnose aufgrund des Methylierungsstatus der drei Genregionen ASTN1, DLX1 oder ZNF671 gestellt werden konnte, und zwar bei den 26 Patientinnen, bei denen eine der Genregionen ASTN1, DLX1 und ZNF671 zu einem ersten Zeitpunkt methyliert vorlag (vgl. die Zeile „vorher“ in Tabelle 1). Bei über 46 % der Patientinnen war eine Methylierung einer der drei Genregionen bereits von größer 1 Jahr bis 6 Jahre, bei fast 31 % der Patientinnen eine Methylierung einer der drei Genregionen 6 bis 12 Monate vor der histopathologischen Diagnose von CIN3 möglich. Dies belegt, dass aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Nachweis einer Methylierung zumindest einer der drei genannten Genregionen eine frühzeitige Erkennung von inzidentem CIN3 mit malignem Potential und damit eine bessere Strategie für eine schonende Behandlung von Gewebeveränderungen am Gebärmutterhals erfolgen kann. Tabelle 2A: Zeitliche Verteilung der Diagnosen: Wie frühzeitig vor einer CIN3-Diagnose wurde eine Methylierung eines der drei Marker ASTN1, DLX1, und ZNF671 nachgewiesen?

Monate/Jahre vor erster Histodiagnose CIN3	Anzahl früher erkannt (insgesamt 26)	Anteil an allen 26 früher erkannten Patientinnen
< 6 Monate	6	23,1%
6–12 Monate	8	30,8%
> 12 Monate–6 Jahre	12	46,1%

Tabelle 2B Zeitliche Verteilung der Diagnosen aus Tabelle 2A, aufgeschlüsselt nach Monaten bzw. Jahren

Monate/Jahre vor erster Histodiagnose CIN3	Anzahl früher erkannt (insgesamt 26)	Anteil an allen 26 früher erkannten Patientinnen
1 Monat	1	6 (d. h. bei 23,1 % der früher Erkannten wurde eine inzidente CIN3 in einem Zeitraum kleiner 6 Monate früher erkannt)
2 Monate	1
3 Monate	1
5 Monate	3
6 Monate	1	8 (d. h. bei 30,8 % der früher Erkannten wurde eine inzidente CIN3 6 bis 12 Monate früher erkannt)
7 Monate	2
9 Monate	1
10 Monate	2
12 Monate	2
18 Monate	4	12 (d. h. bei 46,1 % d. früher Erkannten wurde eine inzidente CIN3 mehr als 12 Monate früher erkannt)
2 Jahre	2
3 Jahre	1
4 Jahre	1
5 Jahre	1
6 Jahre	3

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 2478117 B1 [0005]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Cuzick et al., 2006; Int J Cancer, 119: 1095–1101 [0004]
Wang et al., Cancer Res. 2008, 68(7), S. 2489 ff. [0005]
Huang et al., Abstract #50, 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, CA, USA, April 12–16, 2008, ISSN 0197-016X [0005]
Hansel et al., PLo-Sone 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0091905 [0005]
Esteller, 2007, Hum. Mol. Genet., 16: R50–R59 [0029]
Shames et al., 2007, Cancer Lett. 251: 187–98 [0045]
Jacobs et al., 1995, J Clin Microbiol 33: 901–905 [0050]
Cuzick et al., 2006; Int. J. Cancer. 119: 1095–1101 [0050]

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen unter Verwendung einer Probe des Lebewesens, umfassend das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst das Bestimmen in der Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4 (α4-Integrin), RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3) und SOX17 (SRY-(sex-determining region Y)-box 17) besteht, methyliert sind, wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn (i) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann; und (ii) in der Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine hr-HPV-positiv getestete Probe ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe einem humanen oder tierischen Lebewesen entnommen wurde, das kein Zervixkarzinom oder eine seiner malignen Vorstufen aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Gebärmuttermund- und/oder Gebärmutterhalsabstrich ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung einer ersten Probe, die dem Lebewesen zu einem ersten Zeitpunkt entnommen wurde, und einer zweiten Probe, die dem Lebewesen zu einem zweiten Zeitpunkt entnommen wurde, durchgeführt wird, wobei der zweite Zeitpunkt zumindest 10 Tage nach dem ersten Zeitpunkt liegt und wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und, (b) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn in der ersten und zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: (a1) Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; (a2) wenn in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der zweiten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; (b1) wenn in der zweiten Probe (i) eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder (ii) wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der ersten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; und (b2) wenn in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder wenn eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann, Bestimmen in der ersten Probe, ob zumindest eines oder mehrere der Gene, die aus der zweiten Gruppe ausgewählt sind, methyliert sind; wobei das Risiko einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei dem Lebewesen besteht, wenn (i) in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der zweiten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt; und (ii) in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe vorliegt oder in der ersten Probe eine Methylierung zumindest eines der Gene der ersten Gruppe nicht ausgeschlossen werden kann und eine Methylierung zumindest eines der Gene der zweiten Gruppe vorliegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung ohne vorherige DNA-Isolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung zumindest eines Genes der ersten Gruppe oder der zweiten Gruppe mittels methylierungsspezifischer PCR bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierung mittels Zweischritt-PCR im Echtzeit-Format bestimmt wird.
Kit zur Bestimmung des Risikos einer Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder einer seiner malignen Vorstufen bei einem humanen oder tierischen Lebewesen, umfassend Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer ersten Gruppe ausgewählt sind, die aus ASTN1, DLX1 und ZNF671 besteht, in einer Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA binden.
Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst Primer oder Primerpaare zur Bestimmung des Methylierungsstatus zumindest eines der Gene, die aus einer zweiten Gruppe ausgewählt sind, die aus ITGA4, RXFP3 und SOX17 besteht, in der Probe, wobei die Primer spezifisch an die methylierte Form von zuvor mit der Bisulfit-Methode behandelten Proben-DNA aus der Probe binden.