CN107653322A - 一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宫颈病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法,该试剂盒包含的试剂有PCR反应液、固定于PCR八联管中的八个引物、阳性对照品、阴性对照品以及用于提取样本DNA的细胞裂解液;该检测方法的步骤包括提取样本DNA,处理和纯化样本DNA,配制PCR反应体系和加样,进行PCR扩增反应,收集荧光信号,并得出分析扩增曲线和熔解曲线,再通过分析扩增曲线和熔解曲线,获得每个标志物的Ct值和Tm值,制订基于加权算法的阳性判定方法,对每个标志物进行阳性判定并整合,最后进行样本结果的解释。本发明盒具有灵敏度高,特异性强,无创伤性等特点,特别适用于宫颈高级别病变或宫颈癌的辅助诊断和HPV阳性分流管理。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法。
背景技术
宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌,居妇科肿瘤第二位。根据全国肿瘤登记中心发布的最新数据估计,2015年我国宫颈癌新发病例9.89万,死亡病例3.05万,且发病率和死亡率呈逐年升高的趋势。科学研究已经证实高危型乳头瘤病毒(hrHPV)的持续感染是宫颈癌的主要病因,HPV阴性的妇女罹患宫颈癌的风险极低。然而,大多数HPV检测结果为阳性的妇女并不会发展成癌前病变或癌症,只有少部分HPV感染妇女有可能发展为宫颈癌前病变。
宫颈癌虽是恶性肿瘤,但其历程漫长,从癌前病变发展到浸润癌,有5~10年的潜伏期。所以,只要规范的体检,90%以上的宫颈癌可被预防,扼杀在“癌前病变”的萌芽状态。因此,选择合适有效的诊断方法对于宫颈癌的防治具有重要意义。目前临床上常用的宫颈癌筛查方法包括醋酸染色肉眼观察(VIA)、细胞学检查、HPV DNA检测。其中VIA的漏诊率较高,细胞学检查特异度较高,但灵敏度较低,且细胞学的建立需要依赖当地卫生资源,低资源地区难以建立。而HPV DNA检测的灵敏度较高,但大部分HPV为一过性感染,不会发展为宫颈癌前病变或宫颈癌,给妇女造成了不必要的恐慌,也浪费了医疗资源。因此,亟需一种可以识别真正具有高风险的生物学标志物,合理分配卫生资源。
DNA甲基化是一种重要的表观修饰,它在不改变DNA序列的情况下,对基因表达模式以及基因组的稳定性起重要的调控作用。人类抑癌基因启动子的高甲基化,在包括宫颈癌在内的许多肿瘤的发生、发展的各阶段均有其特异性的改变模式。多数研究显示宿主基因甲基化水平随宫颈病变严重程度的增加而升高,可以作为宫颈癌及癌前病变筛查的生物学标志物。
发明内容
针对现有技术中存在的不足,本发明旨在提供一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法,专门用于宫颈高级别病变或宫颈癌的辅助诊断和HPV阳性分流管理。
为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现:
一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒,该试剂盒中包含的试剂有PCR反应液、固定于PCR八联管中的引物、阳性对照品、PCR用水(阴性对照品)和细胞裂解液。其中,
所述PCR反应液中包含dNTPs、Taq酶、染料和溶剂;
所述阳性对照品为宫颈癌细胞DNA;
所述阴性对照品为PCR用水;
所述引物固定于PCR八联管内部,包括6对宫颈病变标志物DLX1(同源转录因子1)、ITGA4(整合素α4,integrin subunit alpha 4)、RXFP3(松弛素家族受体3,relaxin/insulin like family peptide receptor 3)、SOX17(SRY-Box 17)、ZNF671(锌指蛋白671,zinc finger protein 671)、ASTN1(星型肌动蛋白1,astrotactin 1)的引物以及两对质控标志物引物:质控QC(重亚硫酸氢盐处理的质控,Marker QC)和质控QM(甲基化质控,MarkerQM),所述质控QC和所述质控QM用于作为PCR扩增的内参。
进一步的,所述试剂盒中包含所述PCR反应液1.1mL×1支,所述PCR用水2mL×1支,所述宫颈癌细胞DNA 90μL×1支,所述细胞裂解液500μL×1支,12条固定有所述引物的所述PCR八联管以及相应数量的八联管盖;其中的10条所述PCR八联管用于样本检测,另外的2条所述PCR八联管分别用于阳性质控检测和阴性质控检测。
一种采用上述试剂盒的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,包括以下步骤:
步骤1)利用细胞裂解液从样本沉淀物中提取样本DNA;
步骤2)取出一定量的所述样本DNA,使用重亚硫酸氢盐试剂盒进行处理和纯化,得到Bis DNA;
步骤3)在固定有6对宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的引物以及质控QC、质控QM的PCR八联管中加入一定量的所述PCR反应液,配制成PCR反应体系,并随后加入等量的所述Bis DNA,并密封;
步骤4)利用荧光定量PCR仪,按照以下扩增程序,对加入所述Bis DNA的所述PCR反应体系进行PCR扩增:
阶段1:94℃预变性1分钟;
阶段2:94℃反应15秒,67℃反应30秒,循环42次;
阶段3:95℃反应15秒,60℃反应20秒,95℃反应30秒,30℃反应60秒;
其中,在阶段2的67℃反应30秒的保温期和阶段3的95℃反应30秒之前的升温期收集荧光信号,并得出分析扩增曲线和熔解曲线;
步骤5)在荧光定量PCR仪上,设置适用于样本的分析阈值和开始、结束循环基线,通过检测嵌入性荧光染料和定义熔解曲线峰值,分析扩增曲线和熔解曲线,分别获得标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1、QC、QM的Ct值(cycle threshold,循环阈值)和Tm值(melting temperature,熔解温度);
步骤6)分别给出各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围;并且给6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1分别赋予相应的分值;
步骤7)利用给出的各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围,分别评价6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的Ct值和Tm值;若某个标志物的Ct值和Tm值在阳性判定范围内,则将该标志物定义为阳性,并且获得该标志物所赋予的相应分值;若某个标志物的Ct值和Tm值超出阳性判定范围,则将该标志物定义为阴性,并且获得的分值为零;
步骤8)计算6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的分值总和,若分值总和小于样本阳性判定值,则样本检测结果为阴性;若分值总和大于等于样本阳性判定值,则样本检测结果为阳性,提示有宫颈癌可能,需要进一步检查并结合组织病理检测结果。
进一步的,步骤1)中,所述的提取样本DNA的具体方法为,首先高速涡旋混匀样本5±1秒,并立即转移1mL样本到1.5mL EP管中;然后10.000×g,离心5分钟,小心移除上清液;接着向样本沉淀物中加入40μL所述细胞裂解液,并高速涡旋混匀3±1秒;最后将样本沉淀物与所述细胞裂解液的混合物置于在恒温摇匀器块中,60℃,1000rpm孵育30分钟,得到样本DNA。
进一步的,所述样本为宫颈脱落细胞。
进一步的,步骤2)中,用于进行重亚硫酸氢盐处理的所述样本DNA的体积为40 μL。
进一步的,步骤3)中,加入到所述八联管中的所述BisDNA和所述PCR反应液的体积均为10μL。
进一步的,步骤4)中,所述荧光定量PCR仪为ABI7500、ABI7300或RocheLightCycler® 480的荧光定量PCR仪。
进一步的,步骤5)中,所述分析阈值为0.5,所述开始循环基线为5,所述结束循环基线为20或23。
进一步的,步骤6)中,所述样本阳性判定值为0.5。
本发明的有益效果是:
1、利用本发明试剂盒进行的宫颈癌基因甲基化检测是一种基于荧光定量PCR方法,针对宫颈脱落细胞中生物标志物的甲基化进行检测,其样品采集方便,检测周期短。本发明的试剂盒中包含6个甲基化标志物引物和2个质控标志物引物,所有甲基化标志物引物的PCR条件相同,从而实现了多个样本不同引物可以在同一个反应体系下完成。同时,本发明试剂盒的手动操作时间短,结果分析更具客观性,减少了人为误差。
2、本发明采用大量样本对本发明试剂盒及其检测方法进行验证,以病理结果作为病人分层的金标准,计算出针对不同级别宫颈病变的灵敏度和特异性,大于30岁女性中,CINIII灵敏度为96.2%,特异性为77%。因此本发明的试剂盒及其检测方法对高级别宫颈病变具有灵敏度高,特异性强,无创伤性等特点,能够识别HPV阳性患者中的高风险人群,基于不同进展风险实行分层管理,减少筛查妇女不必要的精神负担,指导临床及时干预。
3、本发明试剂盒及其检测方法可分析的样品具有多样性,可以是宫颈组织样本,也可以是宫颈脱落细胞;并且甲基化分析可在用于hrHPV测试和TCT的相同样本上实施,这也使得本发明在自取样材料的使用上具有重大意义。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明的检测方法中使用ABI7500荧光定量PCR仪获得的扩增曲线;
图2为本发明的检测方法中使用ABI7500荧光定量PCR仪获得的熔解曲线;
图3为本发明的试剂盒在一项针对217例HPV阳性样本的研究中,计算不同年龄阶段的不同级别宫颈病变样本的甲基化检测阳性比例示意图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本发明,并非用于限制本发明。以下实施例中所使用的材料、试剂等,除非另外指出,否则所有试剂都是商业获得的。
本发明的所提供的宫颈病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒,如表1所示,包含以下组分:
表1 试剂盒组分
所述PCR八联管内部固定有8对引物,如表2所示,包括6对宫颈病变标志物DLX1(同源转录因子1)、ITGA4(整合素α4,integrin subunit alpha 4)、RXFP3(松弛素家族受体3,relaxin/insulin like family peptide receptor 3)、SOX17(SRY-Box 17)、ZNF671(锌指蛋白671,zinc finger protein 671)、ASTN1(星型肌动蛋白1,astrotactin 1)的引物以及两对质控标志物引物:质控QC(重亚硫酸氢盐处理的质控,Marker QC)和质控QM(甲基化质控,Marker QM);
表2 PCR八联管内固定的引物对
其中,绿标八联管为检测样本用,红标八联管为检测阳性质控用,黄标八联管为检测阴性质控用;质控QC和质控QM均用于作为PCR扩增的内参。
采用本发明的试剂盒应用于宫颈病变及宫颈癌相关基因甲基化检测,其检测方法的具体步骤如下:
1、检测实验所需设备如下所示:
ABI7500、ABI7300或Roche LightCycler® 480的荧光定量PCR仪(本实施例采用的是ABI7500)、0.5mL和1.5mL台式离心机、八联管台式离心机、普通PCR仪(热循环仪)、恒温摇匀仪、微量移液器和连续加样器、超净工作台。
2、样本DNA的提取;
采用宫颈脱落细胞或组织作为样本,并利用细胞裂解液从样本沉淀物中提取样本DNA,其具体方法为:
1)以最大速度涡旋混匀样本5±1秒,并立即转移1mL样本到1.5mL EP管中;
2)10.000×g,离心5分钟;
3)小心移除上清液,最多移出980μL;注意:沉淀物或多或少,取决于样本
4)向样本沉淀物中加入40μL所述细胞裂解液,并以最大速度涡旋混匀3±1秒;
5)将装有混合的离心管物置于在恒温摇匀器块中,60℃,1000rpm孵育30分钟,得到样本DNA;
3、样本DNA的处理和纯化,其具体方法为:
甲基化检测前,取出40μL的所述样本DNA,使用重亚硫酸氢盐试剂盒进行处理和纯化,得到Bis DNA。
注意:本发明的试剂盒中不包含重亚硫酸氢盐处理试剂,其操作规程请参照厂家说明书。
4、宫颈癌相关基因的甲基化检测,其具体方法为:
1)配制PCR反应体系和加样:
a)如果Bis DNA储存在冷冻条件下,请先在室温下解冻;
b)在每个Bis DNA样本中加入70μL PCR用水;
c)以最大速度涡旋混匀Bis DNA样本3±1秒,短暂离心;
d)从试剂盒中取出PCR反应液和PCR八联管,并将PCR八联管放在 PCR管架上,其中绿标八联管用于检测样本,红标八联管用于阳性质控,黄标八联管用于阴性质控;
注意:在PCR八联管的摆放方向要求上,管盖子上突出部分必须在左侧,此外PCR八联管的反应管有编号1~8 ,反应管1必须在PCR管架的A行,反应管8位于PCR管架的H行;
e)漩涡混匀PCR反应液3±1秒,短暂离心;
f)打开所有PCR八联管的管盖,丢弃;
g)在每条PCR八联管的反应管中分别加入10μL PCR反应液;
注意:因为每条PCR八联管的反应管中已包含引物,因此每次加液都必须换枪头;
h)在每条PCR八联管的反应管中分别加入10μL Bis DNA;
注意:因为每条PCR八联管的反应管中已包含引物,因此每次加样都必须换枪头;
i)加样完成后,所有PCR八联管直接盖上平顶透明盖子(试剂盒提供),并密封;
注意:取出和盖上管盖时应避免接触管盖内侧,并从侧面检查确保管盖盖紧;
J)以最大速度涡旋混匀所有PCR八联管3±1秒,短暂离心。
2)PCR扩增:
在PCR八联管放入荧光定量PCR仪器前,先完成PCR反应软件和参数设置。注意:PCR系统设置期间,已配置好的反应体系可保存在冰箱内不超过15分钟。
根据荧光定量PCR仪器制造商提供的说明书对仪器进行以下设置:
参比荧光(Reference Dye):ROX;
每孔反应体积20μl;
采集信号:“阶段2”(30秒保温)和“阶段3”(1%升降温率)。
利用荧光定量PCR仪,按照如表3所示的PCR扩增程序,对加入Bis DNA的PCR反应体系进行PCR扩增:
表3 PCR扩增程序
表3中*表示在阶段2的67℃反应30秒的保温期和阶段3的95℃反应30秒之前的升温期收集荧光信号,并由此得出分析扩增曲线和熔解曲线。
5、检测结果的判读,其具体方法为:
1)在荧光定量PCR仪上,设置适用于样本的分析阈值和开始、结束循环基线:
本发明主要对保存在STMTM中的样本和TCT采取的保存在ThinPrep® PreservCyt®Solution中的剩余样本进行了MSP检测,分别确定了适用于这两种样本的分析阈值、开始和结束循环反应基线,如表4所示:
表4 分析阈值、开始和结束循环基线
2)数据有效性的判断:
参见图1和图2所示,首先通过检测嵌入性荧光染料和定义熔解曲线峰值,分析扩增曲线和熔解曲线,分别获得标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1、QC、QM的Ct值(cycle threshold,循环阈值)和Tm值(melting temperature,熔解温度);然后针对STMTM样本和PreservCyt 样本,制订不同的基于加权算法的阳性判定方法:
如表5和表6所示,分别给出STMTM样本和PreservCyt 样本各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围:
表5 STMTM阳性判定
表6 PreservCyt 样本阳性判定
注意:若标志物QC的Ct值或者Tm值超出表中范围,则需要重复实验。
如表7所示,给6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1分别赋予相应的分值:
表7 每个标志物所赋予的分值
利用表5和表6中给出的各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围,分析6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的Ct值和Tm值;
若某个标志物的Ct值和Tm值在阳性判定范围内,则将该标志物定义为阳性,并且获得表7中该标志物所赋予的相应分值;
若某个标志物的Ct值和Tm值超出阳性判定范围,则将该标志物定义为阴性,并且获得的分值为零。
6、样本结果的解释,其具体方法为:
计算6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1所获得的分值总和,若分值总和小于0.5,则样本检测结果为阴性;若分值总和大于等于0.5,则样本检测结果为阳性,提示有宫颈癌可能,需要进一步检查并结合组织病理检测结果。
利用本发明试剂盒进行的宫颈癌基因甲基化检测是一种基于荧光定量PCR方法,针对宫颈脱落细胞中生物标志物的甲基化进行检测,其样品采集方便,检测周期短。本发明的试剂盒中包含6个宿主基因甲基化标志物引物和2个质控标志物引物,所有甲基化标志物引物的PCR条件相同,从而实现了多个样本不同引物可以在同一个反应体系下完成。本发明试剂盒的6个标志物采用加权算法评估,标志物总分大于等于0.5就表示是阳性结果。同时,本发明试剂盒的手动操作时间短,结果分析更具客观性,减少了人为误差。
本发明的试剂盒还进行了以下临床样本的检测试验:
收集2013名参与实验的病人宫颈脱落细胞样本DNA,选取217例HPV检测结果为阳性的样本,并且已知217例样本的组织病理结果,如表8所示:
表8 217例HPV阳性病人样本的组织病理结果
使用本发明的试剂盒检测217例样本,参见图3所示,汇总甲基化检测结果。计算在不同年龄阶段,本发明的试剂盒对CINⅢ的灵敏度和特异性,计算结果为:大于30岁样本组中,CINⅢ灵敏度为96.2%,特异性为77%;全年龄样本中,CINⅢ灵敏度为76.2%,特异性为82.9%。因此本发明的试剂盒具有灵敏度高,特异性强,无创伤性等特点,特别适用于宫颈高级别病变或宫颈癌的辅助诊断和HPV阳性分流管理。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点,其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中包含的试剂有PCR反应液、固定于PCR八联管中的引物、阳性对照品、阴性对照品以及用于提取样本DNA的细胞裂解液;其中,
所述PCR反应液由dNTPs、Taq酶、染料和溶剂组成;
所述阳性对照品为宫颈癌细胞DNA;
所述阴性对照品为PCR用水;
所述的固定于PCR八联管中的引物包括6对宫颈病变标志物引物以及两对质控标志物引物;
6对所述宫颈病变标志物引物分别为宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的引物;
两对所述质控标志物引物分别为重亚硫酸氢盐质控QC和样本甲基化状态质控QM。
2.根据权利要求1所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中包含12条固定有所述引物的PCR八联管以及相应数量的八联管盖,其中的10条所述PCR八联管用于样本检测,另外的2条所述PCR八联管分别用于阳性质控检测和阴性质控检测;所述PCR反应液的体积为1.1mL,所述PCR用水的体积为2mL;所述宫颈癌细胞DNA的体积为90μL,所述细胞裂解液的体积为500μL。
3.一种采用如权利要求1所述的试剂盒的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1)利用细胞裂解液从样本沉淀物中提取样本DNA;
步骤2)取出一定量的所述样本DNA,使用重亚硫酸氢盐试剂盒进行处理和纯化,得到Bis DNA;
步骤3)在固定有6对宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的引物以及质控QC、质控QM的PCR八联管中加入一定量的所述PCR反应液,配制成PCR反应体系,并随后加入等量的所述Bis DNA,并密封;
步骤4)利用荧光定量PCR仪,按照以下扩增程序,对加入所述Bis DNA的所述PCR反应体系进行PCR扩增:
阶段1:94℃预变性1分钟;
阶段2:94℃反应15秒,67℃反应30秒,循环42次;
阶段3:95℃反应15秒,60℃反应20秒,95℃反应30秒,30℃反应60秒;
其中,在阶段2的67℃反应30秒的保温期和阶段3的95℃反应30秒之前的升温期收集荧光信号,并得出分析扩增曲线和熔解曲线;
步骤5)设置适用于样本的分析阈值和开始、结束循环基线,通过检测嵌入性荧光染料和定义熔解曲线峰值,分析扩增曲线和熔解曲线,分别获得标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1、QC、QM的Ct值和Tm值;
步骤6)分别给出各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围;并且给6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1分别赋予相应的分值;
步骤7)利用给出的各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围,分别评价6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的Ct值和Tm值;若某个标志物的Ct值和Tm值在阳性判定范围内,则将该标志物定义为阳性,并且获得该标志物所赋予的相应分值;若某个标志物的Ct值和Tm值超出阳性判定范围,则将该标志物定义为阴性,并且获得的分值为零;
步骤8)计算6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的分值总和,若分值总和小于样本阳性判定值,则样本检测结果为阴性;若分值总和大于等于样本阳性判定值,则样本检测结果为阳性,提示有宫颈癌变转化风险高,需要进一步阴道镜检查并结合组织病理检测结果。
4.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤1)中,所述的提取样本DNA的具体方法为,首先高速涡旋混匀样本5±1秒,并立即转移1mL样本到1.5mL EP管中;然后10.000×g,离心5分钟,小心移除上清液;接着向样本沉淀物中加入40μL所述细胞裂解液,并高速涡旋混匀3±1秒;最后将样本沉淀物与所述细胞裂解液的混合物置于在恒温摇匀器块中,60℃,1000rpm孵育30分钟,得到样本DNA。
5.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:所述样本为宫颈脱落细胞。
6.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤2)中,用于进行重亚硫酸氢盐处理的所述样本DNA的体积为40 μL。
7.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤3)中,加入到所述八联管中的所述BisDNA和所述PCR反应液的体积均为10μL。
8.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤4)中,所述荧光定量PCR仪为ABI7500、ABI7300或Roche LightCycler® 480的荧光定量PCR仪。
9.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤5)中,所述分析阈值为0.5,所述开始循环基线为5,所述结束循环基线为20或23。
10.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法,其特征在于:步骤6)中,所述样本阳性判定值为0.5。
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