CN112695105A - 栉孔扇贝的实时荧光pcr鉴定方法 - Google Patents

栉孔扇贝的实时荧光pcr鉴定方法 Download PDF

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Abstract

一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,包括以下步骤:1)提取样品DNA;2)设计具有栉孔扇贝特异性的引物和探针;上游引物:TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT;下游引物P2:AATCACCATGTCCGTACAAATGTC;带有荧光染料的探针序列为:TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG;所述的荧光染料5’端为FAM标记、3’端TAMRA标记;3)实时荧光PCR,通过荧光PCR扩增后得到Ct值对样品是否含有栉孔扇贝进行判定。优点是:具有良好的灵敏性和特异性,操作简单快速,检测结果准确可靠,为栉孔扇贝的鉴别检测提供了一种简便、有效、准确的检测方法。

Description

栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法
技术领域
本发明属于栉孔扇贝的鉴定方法,具体涉及一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法。
背景技术
栉孔扇贝(Azumapecten farreri)属软体动物门(Mollusea),瓣鳃纲(Lamellibranchia),翼形亚纲(Pterimorphia),珍珠贝目(Pterioida),扇贝科(Pectinidae),扇贝属(Pecten)。分布于中国(黄海、渤海、东海)、朝鲜半岛、日本等地;在我国主要分布于北部沿海,尤以山东半岛为多;山东长岛、威海、蓬莱、石岛、文登和辽宁大连、长山岛等地是主产地;大连老虎滩、付家庄、小平岛、金州、长海也有分布。北方的大连和山东等海域形成了一定的养殖规模。栉孔扇贝的个体适中,产量高,肉味鲜美,其闭壳肌含有丰富的营养物质,目前已成为我国主要养殖贝类之一。
传统鉴定栉孔扇贝的方法主要依靠形态学标准,例如:壳色、足丝孔、放射肋、棘等。这些形态学特征的可塑性强,受环境影响大,具有人为的主观倾向性。通常加工后的栉孔扇贝只留下闭壳肌,失去了形态学特征;栉孔扇贝幼虫浮游期、稚贝期还未形成可辨别的形态特征。因此,在这些情况下传统的形态学鉴定无法准确的鉴定栉孔扇贝。所以,开发一种高效实用的基于分子生物学技术的栉孔扇贝鉴定方法,将为栉孔扇贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力依据。
CN 103602738公开了“一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法”。多重PCR引物由栉孔扇贝引物、华贵栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物和虾夷扇贝引物组成。鉴定方法包括以下步骤:提取扇贝基因组总DNA,进行多重PCR扩增,根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝种类。该方法采用普通PCR方法,普通PCR方法反应时间较长,且反应液必须经过琼脂糖凝胶电泳检测后才能得到实验结果。琼脂糖凝胶电泳需要荧光素染色,大多数的荧光色染料都具有毒性。同时,电泳法检测特异性不太高,引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。因此,需要研究一种灵敏的、快速的鉴定栉孔扇贝的实时荧光PCR方法。
发明内容
针对现有的栉孔扇贝形态学鉴定的不足、以及普通PCR方法在检测技术中存在的缺点,本发明提供一种灵敏的、快速的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法。
本发明的技术解决方案是:
一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,其具体步骤如下:
1、提取待检样品基因组DNA;
2、特异性引物和探针的设计与合成
根据栉孔扇贝线粒体COX I基因,设计选取具有栉孔扇贝特异性的引物和探针,所述特异性引物和探针分别为:
上游引物P1:TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT;
下游引物P2:AATCACCATGTCCGTACAAATGTC;
带有荧光染料的探针序列为:TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG;所述的荧光染料5’端为FAM标记、3’端TAMRA标记;
3、实时荧光PCR
以所提取的DNA作为模板,加入所述上游引物P1、下游引物P2、带有荧光染料的探针以及实时荧光PCR反应液进行实时荧光PCR反应,记录样品反应的Ct值;
所述实时荧光PCR反应体系为:
2×Premix Ex Taq 10.0μL;
10μmol/L上游引物 0.4μL;
10μmol/L下游引物 0.4μL;
10μmol/L探针 0.8μL;
1~100ng/μL样品DNA 2.0μL;
ddH2O 6.4μL;
所述实时荧光PCR反应条件为:95℃20s,1个循环;95℃3s、58℃30s,40个循环;
所述实时荧光PCR方法设置空白对照、阴性对照、阳性对照,判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非栉孔扇贝物种基因组DNA为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以栉孔扇贝物种基因组DNA为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于30;
待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值大于等于40,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值小于等于36,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出栉孔扇贝基因;待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值在36~40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出栉孔扇贝基因。
本发明利用分子生物学手段,通过检测物种DNA序列中特异性片段,有效解决形态学鉴定不足,为栉孔扇贝样品的快速鉴定检测提供高效的解决方案。
本发明采用实时荧光PCR方法,实时荧光PCR方法是PCR反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团,随着PCR反应的进行,扩增产物不断积累,导致荧光信号不断积累,从而利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程,相较于普通PCR方法具有操作简便、速度快、通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化等优点。
本发明设计一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,具有良好的灵敏性和特异性。采用实时荧光PCR特异扩增法可以快速检测样本中是否含有栉孔扇贝,发挥了实时荧光PCR检测技术的优点,将为栉孔扇贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力依据。
附图说明
图1是本发明实施例检测栉孔扇贝阳性样品的荧光PCR扩增图;
其中1为栉孔扇贝闭壳肌,2为栉孔扇贝组织样品。
具体实施方式
实施例1
1.所用引物和探针:
选择栉孔扇贝mtDNA的COX I基因作为对象,通过Primer Express 3.0软件设计实时荧光PCR特异性扩增引物和探针,本发明所用的实时荧光PCR引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实时荧光PCR引物和探针序列为:
上游引物P1:TGGCTTCTGCCTTTGTTGTTG;
下游引物P2:GCAAAAGGGACAAGCCAAAA;
探针:AGATTCCCTCGGGTCAACGCTCTGA,该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记,3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。
2.栉孔扇贝样品DNA的提取:
将栉孔扇贝样品置于研钵中,倒入液氮研磨混匀,取200mg样品的液氮混合物,采用Promega
Figure BDA0002943266260000032
RSC Tissue DNA Kit提取试剂盒提取样品DNA,将提取的DNA溶解在100μL TE中,置于-20℃冰箱保存、备用。
3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
表1实时荧光PCR反应体系
Figure BDA0002943266260000031
Figure BDA0002943266260000041
4.按照仪器操作要求选择相应的荧光通道,设置扩增反应条件95℃20s 1个循环;95℃3s、58℃30s,40个循环,记录样品反应的Ct值。
5.所述确定质量控制指标是:
空白对照:以ddH2O为模板,按照3和4所述条件,进行实时荧光PCR
反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非栉孔扇贝物种基因组DNA为模板,按照3和4所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以栉孔扇贝基因组DNA为模板,按照3和4所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于30;
6.结果判定:
待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值大于等于40,阴性对照、阳性对照和空
白对照结果正常者,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;
待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值小于等于36,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出栉孔扇贝基因;
待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值在36~40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出栉孔扇贝基因。
7.检测结果与分析:
作为优选,本实施例荧光定量PCR仪为Quant Studio 7Flex
本实施例在特异性和灵敏度验证实验中,荧光PCR反应都重复三次,表示结果的Ct值表示每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数,取三次结果的平均值;SD表示标准差。
引物和探针的特异性验证以及灵敏度验证
1)引物和探针的特异性验证
本实施例中设计的引物和探针经特异性验证后显示,引物和探针在不同的退火温度下特异性不同。结果显示退火温度60℃时特异性最佳,此时,只有目标物种栉孔扇贝得到阳性扩增,见表2
表2引物探针特异性验证
Figure BDA0002943266260000051
注:*为实时荧光PCR退火温度;——:Ct值低于检测限。
2)引物和探针灵敏度验证
对DNA进行梯度稀释,检测引物和探针的灵敏度。结果显示如表3,当DNA浓度稀释至0.005ng/μL时,得到的Ct值为33.23;当DNA浓度稀释至0.004ng/μL时,Ct值已经低于检测限。该引物和探针的灵敏度为0.005ng/μL。
表3引物和探针灵敏度验证
Figure BDA0002943266260000052
Figure BDA0002943266260000061
注:——:Ct值低于检测限。
3)总结
本发明实施例1将栉孔扇贝闭壳肌和栉孔扇贝组织样品提取DNA后,进行实时荧光PCR检测。经检测,含有栉孔扇贝基因的栉孔扇贝闭壳肌和栉孔扇贝组织的样品显示如图1所示的阳性扩增曲线,实施例表明本发明的引物探针具有良好的特异性。
以上仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,其特征是:
具体步骤如下:
a.提取待检样品基因组DNA;
b.特异性引物和探针的设计与合成
根据栉孔扇贝线粒体COX I基因,设计选取具有栉孔扇贝特异性的引物和探针,所述特异性引物和探针分别为:
上游引物P1:TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT;
下游引物P2:AATCACCATGTCCGTACAAATGTC;
带有荧光染料的探针序列为:TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG;所述的荧光染料5’端为FAM标记、3’端TAMRA标记;
3、实时荧光PCR
以所提取的DNA作为模板,加入所述上游引物P1、下游引物P2、带有荧光染料的探针以及实时荧光PCR反应液进行实时荧光PCR反应,记录样品反应的Ct值。
2.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,其特征是:
所述实时荧光PCR反应体系为:
Figure FDA0002943266250000011
3.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,其特征是:
所述实时荧光PCR反应条件为:95℃20s,1个循环;95℃3s、58℃30s,40个循环。
4.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法,其特征是:
所述实时荧光PCR方法设置空白对照、阴性对照、阳性对照,判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非栉孔扇贝物种基因组DNA为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以栉孔扇贝物种基因组DNA为模板,按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于30;
待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值大于等于40,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值小于等于36,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出栉孔扇贝基因;待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值在36~40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出栉孔扇贝基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出栉孔扇贝基因。
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