CN109234394A - 一种肝癌诊断标志物及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肝癌诊断标志物及其筛选方法，所述标志物的circRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示；本发明以circRNA为切入点，探索肝癌的早期诊断标志物，利用先进的高通量分子生物学筛选技术，直接对肝癌病人在对照组、手术前和手术后的外周血血浆中进行筛选，结合严谨复杂的验证实验，最终筛选得到circRNA分子，为国内外肝癌诊断标志物领域提供重要的发展方向。

Description

一种肝癌诊断标志物及其筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种肝癌诊断标准物及其筛选方法。
背景技术
原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,按细胞分型可将其分为肝细胞型、胆管细胞型及混合型肝癌，按肿瘤的形态可分为弥漫型、巨块型和结节型肝癌。肝癌发病率和死亡率在过去二十年中在全世界范围内迅速上升，每年大约有50-100万的新发病例，而其死亡率位居所有恶性肿瘤的第6位。中国目前发病人数占全球肝癌病人的一半以上，肝癌死亡率高居各种肿瘤死亡率的第2 位。因此，肝癌已经成为严重威胁世界人民特别是我国人民健康的杀手，对我国的卫生事业造成了严峻挑战。目前对于肝癌的治疗方法主要有传统的手术治疗、介入治疗、放疗和超声消融等，但是这些传统方法的治疗结果均难以令人满意。近年来，随着医学分子生物学的发展以及人们对肝癌的病理机制的深入探索，越来越多的新的治疗方案被提出并进行临床试验，取得了可喜的成果。在此过程中，对肝癌发病机制和相关基因功能的深入研究，以及对新的早期诊断标志物的探索显得尤为重要。
目前，随着医学分子生物学的发展以及人们对肝癌的病理机制的深入探索，越来越多的新的诊断标志物被发现并进行临床试验，取得了可喜的成果。在此过程中，血清/血浆的肿瘤分子标志物的开发一直受到重点关注，其中包括蛋白类和非编码RNA(ncRNA)类肿瘤标志物，ncRNA类标志物主要包括微小RNA (microRNA)、长片段非编码RNA(LncRNA)和环状RNA(circRNA)三大类。非编码RNA具有较强的组织特异性，在一些病理生理情况下特定组织会释放组织特异性的非编码RNA进入外周血，并且能在血浆和血清中稳定存在和易于检测，因此其同样具有诊断标志物的作用，近年来受到广泛关注。 MicroRNA(miRNA)广泛参与机体各项生理和病理过程，已有相关研究证实肝癌患者血清中存在的游离miRNA是肝癌诊断和个体化治疗的潜在生物标志物，新型的microRNA类潜在肝癌诊断标志物包括miR-21,miR-375，miR-199a-3p， miR-122和miR-223等；lncRNA类标志物包括RP11-160H22.5,XLOC_014172， LOC149086，GAS5，Linc00974等。但是目前为止，并没有microRNA和lncRNA 类的诊断试剂盒进入市场，表明其应用还存在一定的瓶颈，其中原因之一是目前的相关研究并没有统一的前处理和检测microRNA及lncRNA的标准操作规程，另外其诊断特异性及诊断灵敏度相比蛋白类的诊断标志物并没有提高，再者其在外周血中稳定性研究也存在一些矛盾的结果。
circRNA是近年来发现的一种新型非编码RNA，其具有如下特点：1.超高的组织特异性；2.成环状容易出膜进入体液；3.环状结构不易被RNA外切酶降解，也比线状RNA稳定；因此也被认为是理想的潜在标志物。目前 has_circ_002059已被证实可作为胃癌的潜在标志物；ciRS-7作为阿尔茨海默症的潜在标志物；cANRIL作为动脉粥样硬化的潜在标志物。但是目前在肝癌中是否存在同样的circRNA类潜在标志物国内外报道较少。CN107384915A公开了 hsa_circRNA_102347在肝癌诊断治疗预后的应用，CN107312775A公开了 hsa_circRNA_103096在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用，CN107151702A公开了hsa_circRNA_102032在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用，CN107267607A 公开了hsa_circRNA_400031在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用。
因此，筛查出一种作为肝癌再起诊断标志物的全新环状RNA(circRNA) 分子，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种肝癌诊断标志物及其筛选方法，通过先进的高通量分子生物学筛选技术，发现并验证了潜在的 circRNA肝癌诊标志物，进行多标志物的联合检测，为目前国内外肝癌诊断标志物领域提供重要的发展方向。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种肝癌诊断标志物，所述标志物包括 hsa_circRNA_020845、hsa_circRNA_020846、hsa_circRNA_100226和 hsa_circRNA_101696。
本发明中，发明人在长期临床实践中，以circRNA为切入点，探索肝癌的早期诊断标志物，利用先进的高通量分子生物学筛选技术，直接对肝癌病人在对照组、手术前和手术后的外周血血浆中进行筛选，结合严谨复杂的验证实验，最终筛选得到circRNA分子，为国内外肝癌诊断标志物领域提供重要的发展方向。
优选地，所述hsa_circRNA_020845的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述 hsa_circRNA_020846的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述hsa_circRNA_100226 的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述hsa_circRNA_101696的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
hsa_circRNA_020845的核苷酸序列SEQ ID NO.1如下：
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCCGAGGGAGTATTACAGCCGCCTCATC CACCAGAAGCATTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCTTGGCTGGAGGC CGAGGACTACCCCCGCTTCTAG.
hsa_circRNA_020846的核苷酸序列SEQ ID NO.2如下：
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCCGAGGGAGTATTACAGCCGCCTCATC CACCAGAAGCATTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCTTGGCTGGAGGC CGAGGACTACCCCCGCTTCTAGGGTCGGTGGATCTGGGTGTCTGTCTGCAC ACGTCCTGCAGTGGCCTGGACCTGCCCATGAAGGTGGTGGACATGTTCGG GTGCTGTTTGCCTGTGTGTGCCGTGAACTTCAAGTGGCAGGAGCAGAACC CGAATCTTTCTGGGGATAGCTTCACAGATCCACCGCTGAGGAGGAAACAG TGCAGAGCGAGCTGCCCACAGTGAGGCCCTGCTCCTGG.
hsa_circRNA_100226的核苷酸序列SEQ ID NO.3如下:
ATCTCTTCTCTGAAAGCTGAATTAACTAGTCAGGAATCGCAGATCTCC ACTTACGAAGAAGAATTGGCAAAAGCTAGAGAAGAGCTGAGCCGTCTACA GCAAGAAACAGCAGAATTGGAGGAGAGTGTAGAGTCAGGGAAGGCTCAG TTGGAACCTCTTCAGCAGCACCTACAAGATTCACAACAGGAAATTAGTTCA ATGCAAATGAAACTGATGGAAATGAAAGATTTGGAAAATCATAATAGTCAG TTAAATTGGTGCAGTAGCCCACACAGCATTCTTGTAAACGGAGCTACAGAT TATTGCAGCCTCAGCACCAGCAGCAGTGAAACAGCCAACCTTAATGAACA TGTTGAAGGCCAGAGCAACCTAGAGTCTGAGCCCATACACCAGGAATCTC CAGCAAGAAGTAGTCCTGAACTACTGCCTTCTGGTGTGACTGATGAAAAT GAGGTGACTACAGCTGTTACTGAAAAAGTTTGTTCTGAACTCGACAATAAT AGACATTCAAAAGAGGAAGATCCATTTAATGTAGACTCAAGTTCGCTGACA GGTCCAGTTGCAGATACAAACTTGGATTTTTTCCAGTCTGATCCTTTTGTTG GCA.
hsa_circRNA_101696的核苷酸序列SEQ ID NO.4如下:
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCTGAGGGAGTATTATAGCCGCCTCATCC ACCAGAAGCACTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCCTGGCTGGAGGCC GAGGACTACCCCCTGCTTCTAG.
第二方面，本发明提供一种筛选第一方面所述标志物的方法，包括如下步骤：
(1)收集外周血血浆，提取总RNA；
(2)利用芯片高通量检测步骤(1)提取的总RNA的circRNA表达谱差异，得到潜在的circRNA分子。
优选地，步骤(1)所述外周血血浆包括肝癌病人手术前的外周血血浆、肝癌病人手术后的外周血血浆和HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆。
优选地，步骤(2)所述芯片高通量测序为Arraystar Human circRNA Array，即Arraystar人类环状RNA微阵列芯片。
优选地，所述方法还包括建模分析的步骤。
优选地，所述建模分析的步骤为：扩大临床样品量，采用定量PCR验证步骤(2)筛选得到的潜在的circRNA分子，并利用受试者工作曲线对血浆样品进行建模分析，计算特异性和敏感性。
优选地，所述受试者包括肝癌患者、HBV阳性肝炎患者。
优选地，所述方法还包括稳定性验证的步骤：
将血浆分离后提取总RNA立即测定circRNA分子浓度，然后分别测定室温放置6h、12h、24h或冻融三次的浓度，评价其浓度变化差异。
优选地，所述评价的方法为配对t检验。
作为优选技术方案，一种筛选第一方面所述标志物的方法，具体包括如下步骤:
(1)收集括肝癌病人手术前的外周血血浆、肝癌病人手术后的外周血血浆和HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆共5份，提取总RNA；
(2)利用Arraystar人类环状RNA微阵列芯片检测步骤(1)提取的总RNA 的circRNA表达谱差异，得到潜在的circRNA分子；
(3)扩大临床样品量至40-60例，采用定量PCR验证步骤(2)筛选得到的潜在的circRNA分子，并利用受试者工作曲线(ROC)对肝癌患者、HBV阳性肝炎患者的血浆样品进行建模分析，计算特异性和敏感性；
(4)将步骤(3)筛选得到的circRNA分子进行稳定性验证，将血浆分离后提取总RNA立即测定circRNA分子浓度，然后分别测定室温放置6h、12h、 24h或冻融三次的浓度，配对t检验评价其浓度变化差异。
受试者工作曲线，英文名称为Receiver Operating Characteristic Curve，简称ROC曲线。
具体地，所述筛选方法如下：
1.肝癌患者血浆标本中circRNA表达谱的检测
收集5例肝癌病人在手术前和手术后的外周血血浆，同时收集5例HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆，提取总RNA后，利用Arraystar人类环状RNA 微阵列芯片筛选出在手术前、手术后、HBV(+)肝炎患者之间的circRNA表达谱差异，将筛选出的潜在circRNA分子用定量PCR进行验证；在此阶段中，筛选出了4个circRNA分子。
2.circRNA肝癌诊断标志物的扩大临床样本验证
筛选出潜在的临床标志物后，扩大临床样本量(50例)，提取总RNA后，利用定量PCR分别对上一阶段筛选出的circRNA进行验证，同时利用受试者工作曲线(ROC)对肝癌患者、HBV阳性肝炎患者的血浆进行建模诊断，计算出特异性和敏感性，评价其作为临床诊断标志物的可行性。
3.潜在的circRNA肝癌诊断标志物的稳定性验证
通过前面几个阶段能成功筛选出潜在的circRNA分子，在此阶段则对其血浆中的稳定性，室温保存时间、反复冻融等稳定条件进行检测验证；将血浆分离后提取总RNA立即测定circRNA分子浓度，用配对t检验评价其浓度变化差异，判断其作为诊断标志物的可行性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过Arraystar人类环状RNA微阵列芯片芯片高通量进行筛选，覆盖范围更广，发现并验证了潜在的circRNA肝癌诊断标志物，首次用环状RNA 作为筛选目标，其具有超高组织特异性和稳定性，得到的标志物稳定性强，特异性好，灵敏度高；本发明提供的筛选方法直接在肝癌病人在对照组、手术前和手术后的外周血血浆中进行筛选，具有更强的转化应用可行性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1为本发明的Arraystar Human circRNA Array芯片检测热度图；
图2(A)为本发明的hsa_circRNA_020845的ROC曲线；
图2(B)为本发明的hsa_circRNA_020846的ROC曲线；
图2(C)为本发明的hsa_circRNA_100226的ROC曲线；
图2(D)为本发明的hsa_circRNA_101696的ROC曲线；
图3(A)为本发明的室温放置时间的稳定性测试结果；
图3(B)为本发明的冻融三次的稳定性测试结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1在肝癌病人血浆标本中筛选潜在的circRNA肝癌诊断标志物
收集5例肝癌病人在手术前和手术后的外周血血浆，同时收集5例HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆，利用Arraystar Human circRNA Array筛选出在手术前、手术后、HBV(+)肝炎患者之间的circRNA表达谱差异，Arraystar Human circRNA Array芯片检测热度图见图1，将筛选出的潜在circRNA分子用定量PCR 进行验证；
1、5例肝癌病人在手术前和手术后的外周血血浆经过Arraystar Human circRNAArray芯片筛选后，筛选出3个环状RNA(hsa_circRNA_100226、 hsa_circRNA_002453、hsa_circRNA_000432)，筛选标准为：其在HB(术前) vs C(对照)中升高两倍以上，且在HA(术后)vs HB(术前)中至少4例病人下降1.5-2倍以上；
hsa_circRNA_100226HB(术前组)vs C(对照组)升高2.18倍；
hsa_circRNA_002453HB(术前组)vs C(对照组)升高2.03倍；
hsa_circRNA_000432HB(术前组)vs C(对照组)升高2.11倍；
2、同时，5例肝癌病人在手术前和手术后的外周血血浆经过Arraystar HumancircRNA Array芯片筛选后，筛选出8个环状RNA(hsa_circRNA_020846、 hsa_circRNA_101283、hsa_circRNA_011286、hsa_circRNA_074216、 hsa_circRNA_067327、hsa_circRNA_051546、hsa_circRNA_020845、hsa_circRNA_101696)，筛选标准为：其在HB(术前)vs C(对照)中升高1.5-2 倍，且HA(术后)vs HB(术前)中至少3组下降2倍以上；
hsa_circRNA_020846HB(术前组)vs C(对照组)升高1.8倍
hsa_circRNA_101283HB(术前组)vs C(对照组)升高1.4倍
hsa_circRNA_011286HB(术前组)vs C(对照组)升高1.9倍
hsa_circRNA_074216HB(术前组)vs C(对照组)升高1.6倍
hsa_circRNA_067327HB(术前组)vs C(对照组)升高1.8倍
hsa_circRNA_051546HB(术前组)vs C(对照组)升高1.6倍
hsa_circRNA_020845HB(术前组)vs C(对照组)升高1.7倍
hsa_circRNA_101696HB(术前组)vs C(对照组)升高1.8倍
3、定量PCR验证：
试剂：2X PCR master mix(Arraystar)
仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)
引物设计软件：Primer 5.0
ViiA 7Real-time PCR System(Applied Biosystems)
(1)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板
针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min； 40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；
PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；
将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1× 10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9的梯度浓度；
(2)进行Realtime PCR反应
将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系，体系配置如下：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
加样：
a.将8uL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；
b.再加入对应的2μL cDNA；
c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合；
c.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；
将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应；
所有的指标均按以下程序进行：
95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为 0.05℃/秒)；
引物序列见表1：
表1
评价方案：筛选出HB(手术前)/HA(手术后)>1.5倍以上，同时HB(手术前)/C(对照)>1.5倍以上的环状RNA。
结果：
通过进一步设计引物进行定量PCR验证后，筛选出4个环状circRNA进行第二阶段的大样本检测，分别是hsa_circRNA_020845、hsa_circRNA_020846、 hsa_circRNA_100226、hsa_circRNA_101696；
hsa_circRNA_020845的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCCGAGGGAGTATTACAGCCGCCTCATC CACCAGAAGCATTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCTTGGCTGGAGGC CGAGGACTACCCCCGCTTCTAG.
hsa_circRNA_020846的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)如下：
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCCGAGGGAGTATTACAGCCGCCTCATC CACCAGAAGCATTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCTTGGCTGGAGGC CGAGGACTACCCCCGCTTCTAGGGTCGGTGGATCTGGGTGTCTGTCTGCAC ACGTCCTGCAGTGGCCTGGACCTGCCCATGAAGGTGGTGGACATGTTCGG GTGCTGTTTGCCTGTGTGTGCCGTGAACTTCAAGTGGCAGGAGCAGAACC CGAATCTTTCTGGGGATAGCTTCACAGATCCACCGCTGAGGAGGAAACAG TGCAGAGCGAGCTGCCCACAGTGAGGCCCTGCTCCTGG.
hsa_circRNA_100226的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下:
ATCTCTTCTCTGAAAGCTGAATTAACTAGTCAGGAATCGCAGATCTCC ACTTACGAAGAAGAATTGGCAAAAGCTAGAGAAGAGCTGAGCCGTCTACA GCAAGAAACAGCAGAATTGGAGGAGAGTGTAGAGTCAGGGAAGGCTCAG TTGGAACCTCTTCAGCAGCACCTACAAGATTCACAACAGGAAATTAGTTCA ATGCAAATGAAACTGATGGAAATGAAAGATTTGGAAAATCATAATAGTCAG TTAAATTGGTGCAGTAGCCCACACAGCATTCTTGTAAACGGAGCTACAGAT TATTGCAGCCTCAGCACCAGCAGCAGTGAAACAGCCAACCTTAATGAACA TGTTGAAGGCCAGAGCAACCTAGAGTCTGAGCCCATACACCAGGAATCTC CAGCAAGAAGTAGTCCTGAACTACTGCCTTCTGGTGTGACTGATGAAAAT GAGGTGACTACAGCTGTTACTGAAAAAGTTTGTTCTGAACTCGACAATAAT AGACATTCAAAAGAGGAAGATCCATTTAATGTAGACTCAAGTTCGCTGACA GGTCCAGTTGCAGATACAAACTTGGATTTTTTCCAGTCTGATCCTTTTGTTG GCA.
hsa_circRNA_101696的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)如下:
AGTTTGAACAACTGACTCTTGATGGACACAACCTTCCTTCTCTCGTCT GTGTGATAACAGGCAAAGGGCCTCTGAGGGAGTATTATAGCCGCCTCATCC ACCAGAAGCACTTCCAGCACATCCAGGTCTGCACCCCCTGGCTGGAGGCC GAGGACTACCCCCTGCTTCTAG.
实施例2 circRNA肝癌诊断标志物的扩大临床样本验证
筛选出潜在的临床标志物后，扩大临床样本量(50例)，利用受试者工作曲线(ROC)对早期肝癌患者、肝炎患者血浆进行建模诊断，ROC曲线如图2(A) -图2(B)所示；计算出特异性和敏感性，分别为hsa_circRNA_020845：灵敏度79％，特异性80％；hsa_circRNA_020846：灵敏度82％，特异性77％； hsa_circRNA_100226：灵敏度81％，特异性81％；hsa_circRNA_101696：灵敏度80％，特异性83％。
实施例3肝癌诊断标志物的稳定性验证
对上述研究筛选出的hsa_circRNA_020845、hsa_circRNA_020846、 hsa_circRNA_100226、hsa_circRNA_101696在室温保存6、12、24小时和冻融3 次后进行测定相应浓度，统计评价其浓度变化差异，结果见图3(A)-图3(B)，结果显示其在室温放置24小时和冻融3次后都保持很强的稳定性。
综上所述，本发明提供一种肝癌诊断标志物及其筛选方法，通过先进的高通量分子生物学筛选技术，发现并验证了潜在的circRNA肝癌诊标志物，进行多标志物的联合检测，为目前国内外肝癌诊断标志物领域提供重要的发展方向。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市南山区人民医院
<120> 一种肝癌诊断标志物及其筛选方法
<130> 2018年
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agtttgaaca actgactctt gatggacaca accttccttc tctcgtctgt gtgataacag 60
gcaaagggcc tccgagggag tattacagcc gcctcatcca ccagaagcat ttccagcaca 120
tccaggtctg caccccttgg ctggaggccg aggactaccc ccgcttctag 170
<210> 2
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agtttgaaca actgactctt gatggacaca accttccttc tctcgtctgt gtgataacag 60
gcaaagggcc tccgagggag tattacagcc gcctcatcca ccagaagcat ttccagcaca 120
tccaggtctg caccccttgg ctggaggccg aggactaccc ccgcttctag ggtcggtgga 180
tctgggtgtc tgtctgcaca cgtcctgcag tggcctggac ctgcccatga aggtggtgga 240
catgttcggg tgctgtttgc ctgtgtgtgc cgtgaacttc aagtggcagg agcagaaccc 300
gaatctttct ggggatagct tcacagatcc accgctgagg aggaaacagt gcagagcgag 360
ctgcccacag tgaggccctg ctcctgg 387
<210> 3
<211> 607
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atctcttctc tgaaagctga attaactagt caggaatcgc agatctccac ttacgaagaa 60
gaattggcaa aagctagaga agagctgagc cgtctacagc aagaaacagc agaattggag 120
gagagtgtag agtcagggaa ggctcagttg gaacctcttc agcagcacct acaagattca 180
caacaggaaa ttagttcaat gcaaatgaaa ctgatggaaa tgaaagattt ggaaaatcat 240
aatagtcagt taaattggtg cagtagccca cacagcattc ttgtaaacgg agctacagat 300
tattgcagcc tcagcaccag cagcagtgaa acagccaacc ttaatgaaca tgttgaaggc 360
cagagcaacc tagagtctga gcccatacac caggaatctc cagcaagaag tagtcctgaa 420
ctactgcctt ctggtgtgac tgatgaaaat gaggtgacta cagctgttac tgaaaaagtt 480
tgttctgaac tcgacaataa tagacattca aaagaggaag atccatttaa tgtagactca 540
agttcgctga caggtccagt tgcagataca aacttggatt ttttccagtc tgatcctttt 600
gttggca 607
<210> 4
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agtttgaaca actgactctt gatggacaca accttccttc tctcgtctgt gtgataacag 60
gcaaagggcc tctgagggag tattatagcc gcctcatcca ccagaagcac ttccagcaca 120
tccaggtctg caccccctgg ctggaggccg aggactaccc cctgcttcta g 171
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gggaaactgt ggcgtgat 18
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gagtgggtgt cgctgttga 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cgaggactac ccccgcttct 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gccctttgcc tgttatcaca ca 22
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<212> DNA
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caccgctgag gaggaaaca 19
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<212> DNA
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cacacagacg agagaaggaa gg 22
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tccagtctga tccttttgtt gg 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctgtttcttg ctgtagacgg ct 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tcatccacca gaagcacttc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ccctttgcct gttatcacac a 21

Claims (10)

1.一种肝癌诊断标志物，其特征在于，所述标志物包括hsa_circRNA_020845、hsa_circRNA_020846、hsa_circRNA_100226和hsa_circRNA_101696。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述hsa_circRNA_020845的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述hsa_circRNA_020846的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述hsa_circRNA_100226的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述hsa_circRNA_101696的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
3.一种筛选权利要求1或2所述标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集外周血血浆，提取总RNA；
(2)利用芯片高通量检测步骤(1)提取的总RNA的circRNA表达谱差异，得到潜在的circRNA分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述外周血血浆包括肝癌病人手术前的外周血血浆、肝癌病人手术后的外周血血浆和HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述芯片高通量筛选为Arraystar人类环状RNA微阵列芯片。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括建模分析的步骤；
优选地，所述建模分析的步骤为：扩大临床样品量，采用定量PCR验证步骤(2)筛选得到的潜在的circRNA分子，并利用受试者工作曲线对血浆样品进行建模分析，计算特异性和敏感性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受试者包括肝癌患者、HBV阳性的肝炎患者。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括稳定性验证的步骤：
将血浆分离提取总RNA后立即测定circRNA分子浓度，然后分别测定室温放置6h、12h、24h或冻融三次的浓度，评价其浓度变化差异。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述评价的方法为配对t检验。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)收集包括肝癌病人手术前的外周血血浆、肝癌病人手术后的外周血血浆和HBV阳性的慢性肝炎患者的外周血血浆，提取总RNA；
(2)利用Arraystar人类环状RNA微阵列芯片检测步骤(1)提取的总RNA的circRNA表达谱差异，得到潜在的circRNA分子；
(3)扩大临床样品量，采用定量PCR验证步骤(2)筛选得到的潜在的circRNA分子，并利用受试者工作曲线对肝癌患者、HBV阳性的慢性肝炎患者的血浆样品进行建模分析，计算特异性和敏感性；
(4)将步骤(3)筛选得到的circRNA分子进行稳定性验证，将血浆分离提取总RNA后立即测定circRNA分子浓度，然后分别测定室温放置6h、12h、24h或冻融三次的浓度，配对t检验评价其浓度变化差异。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549138A (zh) * 2020-05-22 2020-08-18 中山大学孙逸仙纪念医院 一种基于CD90posi细胞检测肿瘤的试剂盒
CN111778334A (zh) * 2020-07-13 2020-10-16 中山大学孙逸仙纪念医院 一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法
CN112063715A (zh) * 2020-09-07 2020-12-11 清华大学 一种用于肝细胞癌早期筛查的系统
CN113337607A (zh) * 2021-06-28 2021-09-03 东莞市寮步医院 一种用于检测或疗效评价肝癌的分子标志物及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1659287A (zh) * 2002-04-05 2005-08-24 美国政府健康及人类服务部 诊断肝癌转移或发病可能性及鉴定治疗靶点的方法
CN102936629A (zh) * 2012-11-28 2013-02-20 首都医科大学附属北京佑安医院 用于肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小rna的方法和组合物
CN105018495A (zh) * 2015-07-30 2015-11-04 广州吉赛生物科技有限公司 肝癌中环状rna-met基因及其表达方法和荧光定量pcr检测方法
CN105802964A (zh) * 2016-04-21 2016-07-27 中国科学院生物物理研究所 一种用于肝细胞癌筛查的cRNA-FUT8的检测及其应用
CN105861716A (zh) * 2016-05-24 2016-08-17 张理义 一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片
CN107384915A (zh) * 2017-06-15 2017-11-24 深圳市东亿健康服务有限公司 hsa_circRNA_102347在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1659287A (zh) * 2002-04-05 2005-08-24 美国政府健康及人类服务部 诊断肝癌转移或发病可能性及鉴定治疗靶点的方法
CN102936629A (zh) * 2012-11-28 2013-02-20 首都医科大学附属北京佑安医院 用于肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小rna的方法和组合物
CN105018495A (zh) * 2015-07-30 2015-11-04 广州吉赛生物科技有限公司 肝癌中环状rna-met基因及其表达方法和荧光定量pcr检测方法
CN105802964A (zh) * 2016-04-21 2016-07-27 中国科学院生物物理研究所 一种用于肝细胞癌筛查的cRNA-FUT8的检测及其应用
CN105861716A (zh) * 2016-05-24 2016-08-17 张理义 一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片
CN107384915A (zh) * 2017-06-15 2017-11-24 深圳市东亿健康服务有限公司 hsa_circRNA_102347在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
甘晴: "原发性肝癌围手术期肝移植患者外周血环状RNA的差异表达研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549138A (zh) * 2020-05-22 2020-08-18 中山大学孙逸仙纪念医院 一种基于CD90posi细胞检测肿瘤的试剂盒
CN111778334A (zh) * 2020-07-13 2020-10-16 中山大学孙逸仙纪念医院 一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法
CN112063715A (zh) * 2020-09-07 2020-12-11 清华大学 一种用于肝细胞癌早期筛查的系统
CN112063715B (zh) * 2020-09-07 2021-09-14 清华大学 一种用于肝细胞癌早期筛查的系统
CN113337607A (zh) * 2021-06-28 2021-09-03 东莞市寮步医院 一种用于检测或疗效评价肝癌的分子标志物及应用

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