CN111778334A - 一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术与基因工程技术领域，具体涉及一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法。本发明提供的评价方法，以CD90posi细胞亚群的CircRNA作为肿瘤标志物，检测肝癌患者中肿瘤细胞CD90posi的数量，进而评价肝癌的严重程度。本发明提供的评价方法，操作过程简单，可以有效检测CD90posi细胞的富集程度，为肿瘤检测提供了一种新技术，也为肿瘤治疗提供了一种新的思路。

Description

一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

技术领域

本发明属于生物技术与基因工程技术领域，具体涉及一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高、死亡率高，病死率位居国内肿瘤第二位，严重威胁人民群众的生命健康。肝癌起病隐匿，临床表现缺乏特别性，就医时往往处于肝癌中晚期，肝癌早期患者难以发现，严重影响肝癌的治疗效果。最新临床统计显示，中国每年新发原发性肝癌患者80万左右，占全球的55％；每年因原发性肝癌死亡数占全球的45％～50％，而广东省肝癌死亡率比全国平均水平高50％。

目前肝癌的临床检测手段主要通过检测患者血清甲胎蛋白(AFP)并结合影像学检查进行确诊，可分为以下几类：B超检查受肠气及周围脏器的影响，分辨率低，B超引导下进行肝脏病灶穿刺活检存在一定假阴性率；同时肝脏穿刺存在创面出血、针道转移等严重并发症。CT或MR仅能分辨直径1.0cm以上的病灶，且有一定的假阳性率与假阴性率。DSA技术虽可提高肝癌检测的准确率，但为侵入性检查，多用于肝癌治疗。

由于血清AFP显著升高一般出现在肿瘤进展期，且阳性率仅为60-70％，在准确率、检测效率、诊断扰动后对病人治疗风险性和诊断时间的滞后等方面都有明显的局限性，开发新的检测手段有其重要性与迫切性。

近年国内外研究发现了一种新型无创检测手段----液体活检。肝癌的液体活检研究主要以循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化检测为代表，其本质是通过提高痕量检测的精度增加肿瘤检测的准确率。申请者认为，寻找并验证液体活检新的肝癌分子标志物，如新发现的CircRNA，是液体活检一个新的发展方向。

肿瘤的发生是多因素协同作用的结果。以表观遗传为例，基因5’端启动子区DNA甲基化能影响启动子活性，而miRNA则从3’UTR区发挥调控功能，二者既能协同作用，也能相互制约，研究发现，约10％的miRNA表达受到DNA甲基化的影响；而circRNA可作为miRNA海绵或缓冲剂，通过吸附或释放miRNA来影响靶基因表达。而如何利用RNA检测靶标基因，现有技术并未给出。

随着人们生活水平的不断提高，肝癌患病几率不断扩大，如何更好的检测、治疗肝癌逐渐成为一个全民关注的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术普遍存在的缺陷，提供一种用CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法。本发明以CircRNA为肿瘤标志物，通过检测CD90posi细胞的数量，评价肝癌的患病情况，操作方法简单，成本低，有利于实际应用，为肿瘤检测提供了一种新技术，也为肿瘤治疗提供了一种新的思路。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，所述CircRNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

CTTTACAGATACTGTGATACGGATCAGAAACCGACACAATGATGACATTCCCACAATGGCCCAGGGTGTGATTGAATACAAGGAGAGCTTTGGGGTGGATCCTGTCACCAGCCAGAATGTTCAGTACTTTTTGGATCGATTCTACATGAGTCGCATTTCAATTAGAATGTTACTCAATCAGCACTCTTTATTGTTTGGTGGAAAAGGCAAAGGAAGTCCATCTCATCGAAAACACATTGGAAGCATAAATCCAAACTGCAATGTACTTGAAGTTATTAAAG(SEQ ID NO.1)；

优选地，所述CircRNA对应的核苷酸序列还可以为SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；

AGTCGAGGTGGAAAAAAGTTTCTTCCTGTATTGAAAGAAATCTTGGACAGGGATCCCTTGTCTCAACTGTGTGAAAATGAAATGGATCTTATTTGGACTTTGCGACAAGACTGGCCGAGAGATTTTCCCACAATCACTGCCAAAATTACTGCTGTCAATCAAGTGGAATAAACTTGAGGATGTTGCTCAGCTTCAGGCGCTGCTTCAGATTTGGCCTAAACTGCCCCCCCGGGAGGCCCTAGAGCTTCTGGATTTCAACTATCCAGACCAGTACGTTCGAGAATATGCTGTAGGCTGCCTGCGACAGATCAG(SEQ ID NO.2)；

优选地，所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

S2、提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为40～60μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针及促光亮剂，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

优选地，步骤S1中的原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把胚胎尽量剪碎，每个组织块小于1mm3，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤2-5次，低速离心，去除上清液，然后向其中加入0.8～1.0％的双抗，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清600～800μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内1-2h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入6-8mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养3-5小时，即得。

优选地，步骤(2)中的双抗由青霉素与链霉素按质量比3：5组成。

优选地，步骤(3)所得的培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基95.9％～97.6％，芦荟提取物0.5％～0.8％，虎尾兰提取物0.3％～0.6％，穿心莲粉0.5～1.0％，I型胶原蛋白0.8～1.2％，弹性蛋白0.3％～0.5％。

优选地，步骤(1)所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用3-5mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入500～600μL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.1～0.2mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加4～6mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO2培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

优选地，步骤(1)所述的胰酶的质量浓度为0.25％，所述培养瓶的规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

优选地，所述步骤S2中提取CD90posi细胞中的CircRNA采用ABI，StepOne Plus试剂盒。

优选地，所述步骤S3中的亲和荧光探针为hsa-circ-0001727probe；所述促光亮剂的加入量为0.05～0.08g，由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比1～3：7～10组成。

本发明中，在培养CD90posi细胞的过程中，加入了芦荟提取物，虎尾兰提取物，穿心莲粉等成分，用于消除细胞培养过程中产生的各种细菌、真菌等，提高了细胞纯度，而且，在实际细胞培养过程中，申请人发现将I型胶原蛋白及弹性蛋白加入培养基中，可以提高细胞活性，有利于CircRNA的提取。

而且，申请人还发现，在利用CircRNA作为肿瘤标志物时，向其中加入适量的促光亮剂，可以提高CircRNA的荧光亮度，这样，在对CD90posi细胞时，便于与其他细胞区分，提高计数效率，对肝癌的评价效果更佳。

与现有技术相比，本发明提供的用CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法具有如下优势：

(1)本发明提供的用CircRNA作为肿瘤标志物的评价方法，在CD90posi细胞的培养过程中，加入了芦荟提取物，虎尾兰提取物，穿心莲粉等成分，减少了杂菌污染，加入的I型胶原蛋白及弹性蛋白，有利于提高细胞活性，提高了CircRNA的提取效率；

(2)本发明提供的用CircRNA作为肿瘤标志物的评价方法，在制备肿瘤标志物的过程中，加入了促光亮剂，提高了亲和荧光探针的荧光亮度，便于对CD90posi细胞计数，评价效果更佳；

(3)本发明提供的用CircRNA作为肿瘤标志物的评价方法，操作方法简单，成本低，有利于实际应用，为肿瘤检测提供了一种新技术，也为肿瘤治疗提供了一种新的思路。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

所述芦荟提取物可购自武汉莱恩德科技有限公司；所述虎尾兰提取物可购自西安青芷生物技术有限公司；所述穿心莲粉可购自深圳市森迪生物科技有限公司；所述弹性蛋白可购自西安千叶草生物科技有限公司；所述I型胶原蛋白可购自上海抚生实业有限公司；所述RPMI1640培养基可购自北京亚米生物科技有限公司其余试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。

实施例1一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

其中，原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤2次，于50rpm的转速下离心10min，去除上清液，然后向其中加入由青霉素与链霉素按质量比3：5组成的双抗0.8％，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清600μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内1h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入6mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养3小时，即得；所述培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基97.6％，芦荟提取物0.5％，虎尾兰提取物0.3％，穿心莲粉0.5％，I型胶原蛋白0.8％，弹性蛋白0.3％；

所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用3mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入500μL，质量浓度为0.25％的胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.1mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加4mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO2培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

培养过程中选择的培养瓶规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

S2、用Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus)试剂盒提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为40μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针hsa-circ-0001727probe 0.5g及由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比1：7组成的促光亮剂0.05g，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

实施例2一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

其中，原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤5次，于50rpm的转速下离心10min，去除上清液，然后向其中加入由青霉素与链霉素按质量比3：5组成的双抗1.0％，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清800μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内2h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入8mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养5小时，即得；所述培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基95.9％，芦荟提取物0.8％，虎尾兰提取物0.6％，穿心莲粉1.0％，I型胶原蛋白1.2％，弹性蛋白0.5％；

所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用5mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入600μL，质量浓度为0.25％的胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.2mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加6mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO₂培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

培养过程中选择的培养瓶规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

S2、用Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus)提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为60μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针hsa-circ-0001727probe 0.5g及由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比3：10组成的促光亮剂0.08g，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

实施例3一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

其中，原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤4次，于50rpm的转速下离心10min，去除上清液，然后向其中加入由青霉素与链霉素按质量比3：5组成的双抗0.9％，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清700μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内1.5h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入7mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养4小时，即得；所述培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基96.6％，芦荟提取物0.7％，虎尾兰提取物0.5％，穿心莲粉0.8％，I型胶原蛋白1.0％，弹性蛋白0.4％；

所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用4mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入550μL，质量浓度为0.25％的胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.15mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加5mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO₂培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

培养过程中选择的培养瓶规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

S2、采用Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为50μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针hsa-circ-0001727probe 0.5g及由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比2：9组成促光亮剂0.07g，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

对比例1一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中不包含促光亮剂。

对比例2一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例2采用RPMI1640培养基进行CD90posi细胞培养。

对比例3一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

所述CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例3中的促光亮剂由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比1：1组成。

试验例 以CircRNA作为肿瘤标志物评价肝癌

1.试验方法：分别采用实施例1-3及对比例1-3所述的步骤S1-S3制备的肿瘤标志物。

取肝癌组织经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，用1％的质量分数为0.25％的胰酶消化，孵育30分钟后，加入胎牛血清终止反应，用移液管反复吹打，用70μm孔径的细胞筛过滤，除掉大块没消化的团块，然后于1200rpm的转速下离心10min，去掉上清液，将沉淀物用RPMI1640培养基培养10小时，然后用PBS缓冲液将细胞稀释至1.0×10⁵cell/mL，等分成六份。

将肿瘤标志物分别加入稀释后的细胞悬液中，制成玻片，置于荧光显微镜下观察、计数。

CD90posi细胞率＝发荧光细胞数/总细胞数×100％

2.试验结果：具体试验结果见表1。

表1不同试验方法检测到的CD90posi细胞率

由表1可知，采用本发明实施例1-3的方法进行肝癌组织中CD90posi细胞评价时，其细胞率在88％左右，而对比例1及对比例3，改变了促光亮剂的组分或去掉促光亮剂，导致某些CD90posi细胞亮度不够，被误认为是正常细胞，会造成误评，而对比例2在细胞培养过程中，去掉了培养基中的其他成分，杀菌效果有所降低，形成的肿瘤标志物中，CircRNA较少，在评价肝癌组织中的CD90posi细胞数时，导致某些CD90posi细胞无法与荧光亲和结合，也会影响评价效果。

最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

<130> 2020.7.9

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 281

<212> DNA

<213> CircRNA核苷酸序列1(CircRNA nucleotide sequence 1)

<400> 1

ctttacagat actgtgatac ggatcagaaa ccgacacaat gatgacattc ccacaatggc 60

ccagggtgtg attgaataca aggagagctt tggggtggat cctgtcacca gccagaatgt 120

tcagtacttt ttggatcgat tctacatgag tcgcatttca attagaatgt tactcaatca 180

gcactcttta ttgtttggtg gaaaaggcaa aggaagtcca tctcatcgaa aacacattgg 240

aagcataaat ccaaactgca atgtacttga agttattaaa g 281

<210> 2

<211> 312

<212> DNA

<213> CircRNA核苷酸序列2(CircRNA nucleotide sequence 2)

<400> 2

agtcgaggtg gaaaaaagtt tcttcctgta ttgaaagaaa tcttggacag ggatcccttg 60

tctcaactgt gtgaaaatga aatggatctt atttggactt tgcgacaaga ctggccgaga 120

gattttccca caatcactgc caaaattact gctgtcaatc aagtggaata aacttgagga 180

tgttgctcag cttcaggcgc tgcttcagat ttggcctaaa ctgccccccc gggaggccct 240

agagcttctg gatttcaact atccagacca gtacgttcga gaatatgctg taggctgcct 300

gcgacagatc ag 312

Claims (10)

1.一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，其特征在于，所述CircRNA对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述CircRNA对应的核苷酸序列还可以为SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的评价方法，其特征在于，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

S2、提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为40～60μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针及促光亮剂，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

4.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中的原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把胚胎尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤2-5次，低速离心，去除上清液，然后向其中加入0.8～1.0％的双抗，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清600～800μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内1-2h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入6-8mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养3-5小时，即得。

5.如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)中的双抗由青霉素与链霉素按质量比3：5组成。

6.如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所得的培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基95.9％～97.6％，芦荟提取物0.5％～0.8％，虎尾兰提取物0.3％～0.6％，穿心莲粉0.5～1.0％，I型胶原蛋白0.8～1.2％，弹性蛋白0.3％～0.5％。

7.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用3-5mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入500～600μL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.1～0.2mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加4～6mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO₂培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

8.如权利要求7所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述的胰酶的质量浓度为0.25％，所述培养瓶的规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

9.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述步骤S2中提取CD90posi细胞中的CircRNA采用ABIStepOne Plus试剂盒。

10.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述步骤S3中的亲和荧光探针为hsa-circ-0001727probe；所述促光亮剂的加入量为0.05～0.08g，由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比1～3：7～10组成。