CN111118004A - 一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用。所述核酸适配体分子信标探针的序列为5’‑ATGAGTGATAGGGGTCGGAGTGGGT GGTTATGATTGGCTCACTCAGGG‑3’，5’端修饰有荧光素FAM，3’端修饰有淬灭基团BHQ1。本发明所述的核酸适配体分子信标探针具有高特异性，在4℃，25℃，37℃均能保持良好活性；所述核酸适配体分子信标探针可一步法、快速的实现人转移性大肠癌细胞的靶向成像，实现外周血中外泌体的定量分析和循环肿瘤细胞的靶向成像。本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针既具有特异性识别转移性大肠癌细胞的能力，又具有分子信标一步法检测的荧光性能，为准确进行临床诊断提供了高效简便的分子工具，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用。
背景技术
大肠癌是常见高发的消化道恶性肿瘤，转移是患者致死的主要原因。因此，发展高灵敏度、高特异性的靶向诊断探针，对于准确预测大肠癌的转移，提高早期诊断的有效性，进而提高患者的生存率具有重要意义。
核酸适配体（aptamer）是一种通过指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）筛选获得的，能够与靶物质高特异性和高亲和力结合的寡核苷酸序列。与传统的抗体相比，具有特异性强，亲和力高，稳定性好，易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。
分子信标是基于荧光共振能量转移原理设计出的具有茎环结构的一段寡核苷酸探针；当不存在目标分子时，荧光基团和淬灭基团之间发生能量共振转移，荧光被淬灭；当存在目标分子时，分子信标的构象发生改变，荧光基团和淬灭基团分离，荧光恢复。因此，利用分子信标探针对目标分子进行检测时不需要分离未结合的探针即可实现一步法检测，具有操作简便、快捷等优点。将核酸适配体进行适当的改造并融合至分子信标中，构建的新型核酸适配体分子信标探针具备了核酸适配体和分子信标二者的优势，既具有特异性识别疾病的能力，又具有分子信标一步法检测的荧光性能，为准确进行临床诊断提供了高效简便的分子工具，因此核酸适配体分子信标探针具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用。本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针既具有特异性识别转移性大肠癌细胞的能力，又具有分子信标一步法检测的荧光性能，为准确进行临床诊断（如外泌体，循环肿瘤细胞）提供了高效简便的分子工具，具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，所述的核酸适配体分子信标探针包含核酸适配体分子信标的序列和分别连接5’端和3’端的荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1。
进一步地，所述核酸适配体分子信标序列如SEQ ID NO.1所示：
5’- ATGAGTGATAGGGGTCGGAGTGGGTGGTTATGATTGGCTCACTCAGGG -3’。
进一步地，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述荧光基团和所述淬灭基团的位置可以交换，只要满足自由状态下的所述探针中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。
具体地，所述荧光基团选自CY3、FITC或FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1、DABCYL、BDH或TAMRA。
进一步地，当所述核酸适配体分子信标探针未与靶细胞结合时，整个探针为茎环结构，探针中FAM基团的荧光信号被BHQ1基团淬灭；当所述核酸适配体分子信标探针与靶细胞结合时，探针的茎环结构改变，荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1，进而使得荧光信号可以被检测到。
一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在转移性人大肠癌细胞靶向成像中的应用，可作为转移性人大肠癌细胞靶向成像的分子探针使用。
一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在定量检测分析细胞培养上清中外泌体的应用，可作为制备定量检测分析细胞培养上清中外泌体的分子探针使用。
进一步地，所述靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在定量检测分析外周血中外泌体的应用，可作为制备定量检测分析外周血中外泌体的分子探针使用。
一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在特异性识别外周血循环肿瘤细胞中的应用，可作为制备检测外周血循环肿瘤细胞的分子探针使用。
进一步地，所述靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在特异性识别外周血循环肿瘤细胞中的应用，所述肿瘤包括大肠癌、转移性大肠癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
1、本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针制备方法简单，价格廉价。
2、本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针能够快速检测并实现定量分析。
3、本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针对靶标具有高特异性和高亲和力。
4、应用本发明提供的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针对外泌体和循环肿瘤细胞检测时，不需要任何洗涤步骤，一步法即可检测溶液中的转移性大肠癌细胞、外泌体和循环肿瘤细胞，其检测方法操作简单、省时且高效。
附图说明
图1为核酸适配体分子信标探针检测靶标的工作原理图。
图2为核酸适配体分子信标探针对转移性人大肠癌细胞的特异性结合。
图3为核酸适配体分子信标探针与靶细胞LoVo的亲和性。
图4为核酸适配体分子信标探针在不同温度下与LoVo细胞的结合情况。
图5为核酸适配体分子信标探针的血浆稳定性。
图6为核酸适配体分子信标探针对细胞上清中外泌体的定量检测。
图7为核酸适配体分子信标探针对临床大肠癌患者血浆中外泌体的定量检测。
图8为核酸适配体分子信标探针对掺入人全血中靶细胞LoVo的靶向成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
洗涤缓冲液（pH=7.4）由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在溶剂中的浓度为：4 .5g/L葡萄糖、137mM NaCl、2 .7mM KCl、2mM KH2PO4、5mM MgCl2、1mM CaCl2。结合缓冲液（pH=7.4）是含有1mg/ml BSA和0.1 mg/ml 鲱鱼精DNA的洗涤缓冲液。
实施例1 核酸适配体分子信标探针的设计和制备。
根据分子信标的设计原则，在转移性人大肠癌特异性核酸适配体（5’-AGCAGCGTGGAGGATAGGGGTCGGAGTGGGTGGTTATGATTGGCTCTTCTGCGCTGC -3’）的基础上进行分子信标的设计，保留环部序列的碱基（斜体部分），对茎部的碱基序列进行改造。最终形成的核酸适配体分子信标探针是由48个碱基组成的单链DNA探针5’-ATGAGTGATAGGGGTCGGAGTGGGTGGTTATGATTGGCTCACTCAGGG-3’。其中5’末端和3’末端的碱基序列部分互补（下划线部分）形成茎部，并分别在5’末端添加荧光基团FAM和在3’末端添加淬灭基团BHQ1。如图1所示，本发明检测转移性人大肠癌细胞、外泌体和循环肿瘤细胞的核酸适配体分子信标探针的工作原理图。
实施例2 流式细胞术检测核酸适配体分子信标探针对转移性人大肠癌细胞的特异性识别。
分别取处于对数生长期的人大肠癌细胞系LoVo， SW620， HCT116，HT29和CL187，用无酶消化液消化细胞并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。然后加入含250nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液200µl于4℃摇床上轻摇孵育30min，利用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图2所示，核酸适配体分子信标探针对具有侵袭转移能力的细胞系有较好的结合能力，如LoVo, SW620和HCT116，而对侵袭转移能力弱的细胞系如HT29和CL87并不发生结合，提示核酸适配体分子信标探针具有转移性大肠癌细胞结合特异性。
实施例3 核酸适配体分子信标探针的解离常数测定。
将核酸适配体分子信标配制成不同的浓度，分别与等量的靶细胞LoVo进行孵育，依实施例2操作分别进行流式细胞术检测，测定不同核酸适配体分子信标探针浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体分子信标探针的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合曲线，得到核酸适配体分子信标探针的解离曲线，如图3所示。由解离曲线得到的核酸适配体
分子信标探针的解离常数Kd=13.26 ± 3.25 nM , 提示核酸适配体分子信标探针具有很好的亲和力。
实施例4 核酸适配体分子信标探针在不同温度下与LoVo细胞的结合活性。
将处于对数生长期的转移性人大肠癌细胞系LoVo，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，与含有250nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液200µl分别在不同温度（4℃，25℃和37℃）下孵育，依实施例2操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图4A所示，在所使用的不同温度条件下，核酸适配体分子信标探针均显示了与LoVo细胞的结合能力，为不同条件下进行核酸适配体分子信标探针的应用提供了可能。
将处于对数生长期的转移性人大肠癌细胞系LoVo用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，利用细胞计数板进行计数，取1×105个细胞培养于共聚焦培养皿中。在细胞培养箱中培养24h后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后将含有250nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液100µl与LoVo细胞分别在不同温度（4℃，25℃和37℃）下孵育30min。最后在共聚焦显微镜下观察细胞表面的荧光。结果如图4B所示，在所使用的不同温度条件下，LoVo细胞表面均呈现明显的绿色荧光，提示核酸适配体分子信标在不同温度条件下具有作为分子探针进行特异性成像的能力。
实施例5 流式细胞术检测核酸适配体分子信标探针的血浆稳定性。
取处于对数生长期的转移性人大肠癌细胞系LoVo，用非酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液。将核酸适配体分子信标探针（终浓度为250nM）分别加入RPMI1640培养基（含10% FBS）和人新鲜血浆中孵育3h；然后将上述孵育3h后的核酸适配体分子信标探针分别与LoVo细胞进行结合实验后，依实施例2操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图5所示，孵育3h后的核酸适配体分子信标探针与LoVo细胞的荧光结合峰几乎没有发生改变，提示孵育后的探针基本上保持了与靶细胞原有的结合能力。
实施例6 利用多功能酶标仪测定核酸适配体分子信标探针对细胞培养上清中外泌体的定量检测。
收集培养24h后的LoVo，SGC7901、SW480、U266和HL60的细胞培养上清，利用超速离心的方法进行外泌体的提取，再分别利用透射电镜和Western Blot对提取的外泌体的形态和分子标志物进行表征。然后利用纳米颗粒跟踪分析 ZetaView PMX 110检测外泌体样品的浓度粒径。根据外泌体的浓度粒径，对样品进行稀释处理。将含有500nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液100μl加入至黑色96酶标板中，再分别加入100μl稀释好的外泌体样品使其终浓度分别为0、2.5×107个/μl、5×107个/μl、7.5×107个/μl、10×107个/μl、12.5×107个/μl、15×107个/μl、17.5×107个/μl，，室温孵育30min后，使用多功能酶标仪在激发波长488nm和发射波长525nm下对每个样品孔的荧光信号进行检测。结果如图6A所示，随着外泌体量的增多，利用核酸适配体分子信标探针测定的荧光值也随着提高，并且呈一定的线性关系。
分别取100μl LoVo，SGC7901、SW480、U266和HL60的细胞培养上清提取的外泌体与100μl含有500nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液加入至黑色96酶标板中，室温孵育30min后，使用多功能酶标仪在激发波长488nm和发射波长525nm下对每个样品孔的荧光信号进行检测。结果如图6B所示，核酸适配体分子信标探针对不同细胞来源的外泌体的定量水平与细胞来源本身的转移性一致，提示该探针对转移性肿瘤细胞来源的外泌体具有结合特异性。
实施例7 利用多功能酶标仪测定核酸适配体分子信标探针对临床大肠癌患者血浆中外泌体的定量检测。
取健康志愿者和临床大肠癌患者血液（5ml）置于EDTA抗凝管（紫色）内，3000g 离心，取血浆上清。取49.5μl含有500nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液加入黑色96孔酶标板后，再分别加入0.5μl 上述的血浆上清，室温孵育30min后，使用多功能酶标仪在激发波长488nm和发射波长525nm下对每个样品孔的荧光信号进行检测。结果如图7所示，临床大肠癌患者血浆的荧光值显著高于健康人血浆的荧光值，提示核酸适配体分子信标探针能够对大肠癌患者血浆中的外泌体进行定量检测。
实施例8 激光共聚焦显微镜观察核酸适配体分子信标探针对掺入人全血中LoVo细胞的靶向成像。
取生长至对数生长期的LoVo细胞，用非酶消化液消化后吹打制成单细胞悬液，计数后调整细胞密度。取1000个LoVo细胞加入100μl人全血中混匀后，加至共聚焦小皿内，再加入100μl含有250nM核酸适配体分子信标探针的结合缓冲液，室温孵育30min后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图8所示，全血中的红细胞，白细胞等均没有被染色，而靶细胞LoVo被染成了绿色，表明核酸适配体分子信标探针能够特异性的识别掺入人全血中的靶细胞，提示其可作为特异性的分子探针对临床大肠癌患者中的循环肿瘤细胞进行靶向捕获。
序列表
<110> 中国医科大学
<120> 一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用
<130> 1
<141> 2020-03-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagtgata ggggtcggag tgggtggtta tgattggctc actcaggg 48
Claims (10)
1.一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标探针包含核酸适配体分子信标的序列和分别连接5’端和3’端的荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1。
2.如权利要求1所述的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标序列如SEQ ID NO.1所示：
5’- ATGAGTGATAGGGGTCGGAGTGGGTGGTTATGATTGGCTCACTCAGGG -3’。
3.如权利要求1所述的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置可以交换，只要满足自由状态下的所述探针中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。
4.如权利要求1所述的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，所述荧光基团选自CY3、FITC或FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1、DABCYL、BDH或TAMRA。
5.如权利要求1所述的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，当所述核酸适配体分子信标探针未与靶细胞结合时，整个探针为茎环结构，探针中FAM基团的荧光信号被BHQ1基团淬灭；当所述核酸适配体分子信标探针与靶细胞结合时，探针的茎环结构改变，荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1，进而使得荧光信号可以被检测到。
6.一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在转移性人大肠癌细胞靶向成像中的应用，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标探针作为转移性人大肠癌细胞靶向成像的分子探针使用。
7.一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在定量检测分析细胞培养上清中外泌体的应用，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标探针作为制备定量检测分析细胞培养上清中外泌体的分子探针使用。
8.一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在定量检测分析外周血中外泌体的应用，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标探针作为制备定量检测分析外周血中外泌体的分子探针使用。
9.一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在特异性识别外周血循环肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述的核酸适配体分子信标探针作为制备检测外周血循环肿瘤细胞的分子探针使用。
10.如权利要求9所述的靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针在特异性识别外周血循环肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括大肠癌、转移性大肠癌。
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