CN113189066A - 一种仿生纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种仿生纳米探针及其制备方法和应用,属于生物纳米材料制备与应用领域;本发明的方法是先通过冻融法制备海胆式双重适配体金纳米粒子探针,随后将该仿生探针加入到血液样品中进行对目标CTC的识别与标记,然后对样品进行离心重悬清洗,最后将样品通入电感耦合等离子体质谱仪和培养孔板中进行单细胞检测和荧光成像分析。本发明的方法制备的仿生双重适配体金纳米粒子探针应用于单循环肿瘤细胞的在线检测方面,荧光性能好,作为纳米荧光探针具有良好的应用前景。新型的单个CTC在线二维检测方法,使用高效识别的海胆式双重适配体金纳米粒子探针,通过高检测效率电感耦合等离子体质谱的时间分辨检测模式和荧光成像进行单个CTC的在线分析。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米材料制备与应用领域,具体涉及一种修饰荧光基团的双重适配体金纳米粒子探针及其制备方法和应用。
背景技术
癌症,即恶性肿瘤,是100多种相关病症的统称,对生命体致死率极高,至今仍未攻克,因此成为当今分析化学、生物化学、医学研究的重点。研究表明,高达90%的癌症相关死亡是由转移性癌症引起的,即恶性肿瘤细胞从原病灶脱落,进入外周血,并发生向其他组织器官转移扩散,造成病情进一步恶化,甚至死亡。这些进入血液发生转移的恶性肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)。目前肿瘤诊断很大程度上依赖于组织切片的形态特征。但由于其准确性差、早期诊断能力差,导致传统方法逐渐由解剖病理学向分子病理学转变。CTCs作为一类新的分子病理学临床生物标记物被广泛研究。例如,患者血液中CTCs的筛查,可以作为恶性肿瘤细胞早期发现、预后、复发识别的信息来源。
研究表明,大量群体CTCs分析可能会丢失不同单个细胞的重要信息,因为不同CTC之间具有细胞异质性。因此对单个CTC的进一步分子和药理分析可以为肿瘤细胞的基因组成、发病机制和耐药模式的更多信息提供有力支撑,同时也为癌症患者发生癌细胞转移的个性化治疗提供帮助。另一方面,由于给定容量血液中CTCs含量是极为稀缺的,每毫升血液中有数百万个血球细胞,却仅有10~100个循环肿瘤细胞,这样低的样品丰度为CTCs的选择性分离和检测带来了技术上的挑战,同时也印证了从单细胞角度分析CTC的重要性。
一般而言,检测生物样品中CTCs的方法主要包括CellSearch技术、生物捕获界面-成像技术、质谱分析技术等。但是这些方法往往存在样品消耗量高、检测效率低、操作复杂、无法进行在线单细胞分析等问题,并且常用的抗体纳米探针材料在生物样品中容易降解。因此,我们提出了新型的单个CTC在线检测方法,使用高效识别的海胆式双重适配体金纳米探针以及高检测效率电感耦合等离子体质谱的时间分辨检测模式进行单个CTC的在线分析。该方法简单方便、成本低、耗时短、样品消耗量少,便于临床检测及分析。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足,提供一种新型仿生的生物纳米粒子探针及其制备方法,同时还提供所述探针在检测单个循环肿瘤细胞方面的应用。本发明方法制得的探针能够显著提升电感耦合等离子质谱单细胞检测效率,并且通过二维验证,甚至可以检测到少量生物样品中的单一稀有细胞,极大提升珍贵样品利用率,并根据结果进行单细胞分析,为初步的肿瘤筛选、细胞功能分析及亚组分类提供理论和方法依据。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种仿生纳米探针,其为双重适配体金纳米粒子探针,所述的双重适配体为两种不同的适配体,具体为Sgc8和SYL3C;该两种适配体的序列分别为:Sgc8:5’thiol-C6-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-6-FAM;SYL3C:5’thiol-C6-TTTTTTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AMCA。(对Sgc8适配体来说,5’端修饰巯基,3’端修饰荧光基团6-FAM;对SYL3C适配体来说,5’端修饰巯基,3’端修饰荧光基团AMCA;A为脱氧腺嘌呤核苷酸,T为脱氧胸腺嘧啶核苷酸,C为脱氧胞嘧啶核苷酸,G为脱氧鸟嘌呤核苷酸。)
所述的一种仿生纳米探针的制备方法,包括步骤如下:
步骤1:将两种适配体加入标准金纳米粒子溶液中混匀,形成含适配体的金纳米粒子溶液;具体步骤为:
(1)将标准金纳米粒子溶液(平均粒子直径为30.2nm,浓度为58.5μg/mL)溶于水中形成水溶液,并经过短暂的超声分散,形成均匀分散的单颗粒金纳米粒子溶液,浓度配制为1~5nM;
(2)将第一种适配体在10000~13000rpm转速下离心50~75s,再用TE缓冲溶液配制为80~120μM的适配体工作液;
(3)将第二种适配体在10000~13000rpm转速下离心50~75s,再用TE缓冲溶液配制为80~120μM的适配体工作液;
(4)将装有第一种适配体的离心管置于89~95℃的水浴1.5~3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(5)将装有第二种适配体的离心管置于89~95℃的水浴1.5~3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(6)取5~10μL 80~120μM的退火后的第一种适配体加入到0.8~1.2mL 0.5~1.5nM的标准金纳米粒子溶液中,混匀,形成含有第一种适配体和标准金纳米粒子的混合溶液;
(7)取5~10μL 80~120μM的退火后的第二种适配体加入到步骤(6)中得到的混合溶液中,混匀,形成含有两种适配体以及标准金纳米粒子的混合溶液;
步骤2:将含适配体的金纳米粒子溶液置于-15~-30℃环境中1.5~2.5h,随后于室温下融解,形成双重适配体金纳米粒子探针。
上述一种仿生纳米探针的制备方法,其中:
所述步骤1中,两种适配体分别为Sgc8和SYL3C;该两种适配体的序列分别为:Sgc8:5’thiol-C6-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-6-FAM;SYL3C:5’thiol-C6-TTTTTTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AMCA。(对Sgc8适配体来说,5’端修饰巯基,3’端修饰荧光基团6-FAM;对SYL3C适配体来说,5’端修饰巯基,3’端修饰荧光基团AMCA;A为脱氧腺嘌呤核苷酸,T为脱氧胸腺嘧啶核苷酸,C为脱氧胞嘧啶核苷酸,G为脱氧鸟嘌呤核苷酸。)
所述步骤2中,含适配体的金纳米粒子溶液经过冻融处理形成的探针,原理为通过冻融反应,适配体一端的巯基与金纳米粒子表面以金-硫键的方式完成键合。
所述的一种仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面应用,具体应用方法包括:
步骤1:将制得的双重适配体金纳米粒子探针引入电感耦合等离子体质谱仪中进行时间分辨模式检测;
步骤2:按照体积比为1:100~1:1的比例,向生物样品中加入制备好的双重适配体金纳米粒子探针,混合均匀形成样品-探针混合液,冰浴20~40min后,双重适配体金纳米粒子探针则识别修饰到生物样品中循环肿瘤细胞表面,形成初步处理后的生物样品;
步骤3:将步骤2中初步处理后的生物样品经过离心洗涤,得到纯净的样品;
步骤4:将步骤3中得到的样品的一部分引入电感耦合等离子体质谱仪中进行时间分辨模式的检测;
步骤5:将步骤3中得到的样品的另一部分引入细胞培养孔板中进行荧光成像分析;
步骤6:重复步骤4~步骤5,进行三次平行检测。
上述应用方法,其中:
所述步骤1中,在电感耦合等离子体质谱仪的时间分辨模式下对样品中单个双重适配体金纳米粒子探针进行检测,具体为:将制备好的双重适配体金纳米粒子探针由微量注射泵以5~20μL/min的流速利用毛细管引入雾化系统内;其中进入雾化系统被纯度为99.999%,流量为0.3~1.5L/min的载气氩气雾化;其中形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪;其中电感耦合等离子体功率为1240~1400W,积分时间为0.1~1ms;在时间分辨模式下进行检测;得到单个双重适配体金纳米粒子探针的信号响应值,用于计算步骤4中检测得到的修饰在目的细胞上双重适配体金纳米粒子探针的数量,用于初步评估肿瘤细胞相关蛋白表达水平。
所述步骤2中,生物样品通常指临床患者的血液等具有循环肿瘤细胞的样品。冰浴为将样品插入由制冰机制备的碎冰碴中进行反应。双重适配体金纳米粒子探针识别到循环肿瘤细胞的表面是通过两种适配体Sgc8和SYL3C通过自身特殊的二级结构,分别与肿瘤细胞表面表达的PTK7蛋白和EpCAM蛋白特异的结合。PTK7和EpCAM都与肿瘤细胞发生转移有关,因此可用于初步评估癌症发生进展。
形成初步处理后的生物样品的具体步骤为:
(1)在细胞培养孔板中,将第一培养基中培养细胞至对数生长期,去除第一培养基并清洗;
(2)将孵育好的细胞从细胞培养孔板中消化下来,并进行离心清洗,用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液,其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/L,pH=7.4;
(3)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数,并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度104~106cells/mL;
(4)在细胞悬浮液中加入含有双重适配体金纳米粒子探针,冰浴20~40min,使得双重适配体金纳米粒子探针与细胞表面目标蛋白结合。
所述步骤3中,处理后的样品指经冰浴后所得到的样品;离心洗涤是指通过离心机以750~1100rpm的转速,离心2.5~5min,用磷酸缓冲液对样品进行三次重悬洗涤,以得到纯净的标记了探针的循环肿瘤细胞。
所述步骤4中,在电感耦合等离子体质谱仪的时间分辨模式下对样品中单个CTC检测,驻留时间设置为1ms。由于样品中CTCs的数量稀少,而一个细胞的离子羽通过检测器的时间小于1ms,并且两个CTCs的间隔远远超过1ms,这就保证了在1ms驻留时间的检测数据只属于一个细胞。设置电感耦合等离子体质谱仪检测质量数为197,由于双重适配体金纳米粒子探针具有高度特异性,只针对样品中的CTC进行识别,因此一旦检测到197Au信号,则说明样品中存在CTC。对所得结果与步骤1所得结果进行分析,可以推算出单个CTC上被结合的双重适配体金纳米粒子探针数量,可用于初步探究不同的单个CTC上的相关蛋白表达水平。
另外,所述步骤4中将步骤3中得到的样品的一部分由微量注射泵,以流量为5~20μL/min,细胞密度为104~106cells/mL,通过长度为5~40cm,外径为250~400μm,内径为30~100μm的毛细管引入雾化系统内;进入雾化系统被纯度为99.999%,流量为0.3~1.5L/min的载气氩气雾化;形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪,其中,电感耦合等离子体功率为1240~1400W,积分时间为0.1~10ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个肿瘤细胞上修饰的双重适配体金纳米粒子探针的金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个肿瘤细胞上的双重适配体金纳米粒子探针定量分析。
所述步骤5中,将样品中的细胞引入细胞培养孔板中进行荧光成像。荧光成像分析中修饰在目标上的双重适配体金纳米粒子探针上具有6-FAM和AMCA两种荧光基团,激发波长分别为494nm和350nm。如果同时可以观察到细胞表面激发出绿光和蓝光,则证明样品中存在CTC。正置荧光显微镜明场拍摄设置为自动曝光,暗场荧光拍摄曝光时间设置为30~500ms,并用自带软件进行荧光强度分析,实现对生物样品中单个循环肿瘤细胞进行二维检测分析。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
1、与传统电感耦合等离子体质谱单细胞检测方式相比,本发明方法的细胞检测效率得到极大的提升,由传统的3%提升到70%以上;
2、与现有成熟的群体循环肿瘤细胞检测方法(Cellsearch等方法,检测到样品中40%的目标细胞)相比,本发明方法可以实现检测到少量样品中(100μL)的一个细胞,检出限和灵敏度得到了极大的提高,并实现了单细胞检测;
3、与常规抗体捕获识别循环肿瘤细胞的方法相比,本发明方法可以极大的提升探针在复杂生命样品中的稳定性,因为适配体比抗体而言更不容易被生物样品中的酶降解;
4、与常规双重适配体识别和单种适配体纳米粒子探针相比,本发明方法构建的双重适配体金纳米粒子探针对于细胞上的生物标志物的亲和力分别提升了50倍和3倍;
5、与常规循环肿瘤细胞的检测分析相比,本发明方法通过质谱测试和成像分析的二维检测方法,实现多维度的单细胞在线检测和数据分析。
本发明的有益效果:
本发明的方法是先通过冻融法制备海胆式的双重适配体金纳米粒子探针,随后将该仿生探针加入到血液样品中进行对目标CTC的识别与标记,然后对样品进行离心重悬清洗,最后将样品通入电感耦合等离子体质谱仪和培养孔板中进行单细胞检测和荧光成像分析。本发明方法简单方便、成本低、耗时短、样品消耗量少,便于临床检测及分析。本发明的方法制备的仿生双重适配体金纳米粒子探针,荧光性能好,作为纳米荧光探针具有良好的应用前景。新型的单个CTC在线二维检测方法,使用高效识别的海胆式双重适配体金纳米粒子探针,通过高检测效率电感耦合等离子体质谱的时间分辨检测模式和荧光成像进行单个CTC的在线分析。
附图说明
图1为实施例1中制得的双重适配体金纳米粒子(goldnanoparticles,AuNPs)探针(dual-multivalent-aptamer-AuNPs,DMA-AuNPs)123的扫描电镜图。
图2为本发明方法制备的双重适配体金纳米粒子探针(DMA-AuNPs)123的示意图;图中,1、标准金纳米粒子,2、第一种适配体Sgc8,3、第二种适配体SYL3C。
图3为本发明方法制得的仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面应用时采用的检测系统的示意图;图中,4、本发明方法中制备的样品,其中含有图2所示的双重适配体金纳米粒子探针123,5、微量注射泵,6、毛细管(内径:80~250μm),7、商用雾化系统,8、电感耦合等离子体质谱仪,9、正置荧光显微镜,10、细胞培养孔板。
图4为实施例3生物样品中单个循环肿瘤细胞对应的197Au信号的时间脉冲质谱图。
图5为实施例3生物样品中单个循环肿瘤细胞被双重适配体金纳米粒子探针123标记的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例中采用的各种原料均来自市购。
197Au检测采用的电感耦合等离子体质谱仪,型号为Agilent TechnologiesInductively Coupled Plasma Mass Spectrometer 8900。
成像分析所用仪器是正置荧光显微镜,型号为Olympus BX53M。
荧光性能所用的仪器是酶标仪,型号为BioTek Synergy H1。
一种仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面应用,采用如图2所示的双重适配体金纳米粒子探针和如图3所示的检测系统。图2中所述的标准金纳米粒子1型号为BBIsolutionGC30;所述双重适配体金纳米粒子探针由第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3修饰在标准金纳米粒子1表面上。图3中所述待测样品4为添加了按照样品比例计算后的双重适配体金纳米粒子探针123,并经过冰浴和常规离心重悬清洗三次后的生物样品,一部分用于电感耦合等离子体质谱仪8检测,一部分用于正置荧光显微镜9检测;所述毛细管6的一端与微量注射泵5的出口相连,另一端通过商用雾化系统7与电感耦合等离子体质谱仪8相连;所述毛细管6作为样品细胞的出口通道;所述微量注射泵5流速设置为10μL/min;所述商用雾化系统7的型号为Agilent Technologies MicroMistNebulizerENYAMIST 42,534,所述毛细管6的长度为10cm,外径为400μm,内径为50μm;所述正置荧光显微镜明场曝光设置为自动曝光,暗场曝光时间设置为30~500ms。所述细胞培养孔板根据细胞数量选用不同数量的孔板。
实施例1
一种仿生纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:将两种适配体加入标准金纳米粒子溶液中混匀,形成含适配体的金纳米粒子溶液;具体步骤为:
(1)将标准金纳米粒子1溶液(平均粒子直径为30.2nm,浓度为58.5μg/mL)溶于水中形成水溶液,并经过短暂的超声分散,形成均匀分散的单颗粒金纳米粒子溶液,浓度配制为1nM;
(2)将第一种适配体(Sgc8)2(2.5OD)在10000rpm转速下离心50s,再用TE缓冲溶液配制为80μM的适配体工作液;
(3)将第二种适配体(SYL3C)3(2.5OD)在10000rpm转速下离心50s,再用TE缓冲溶液配制为80μM的适配体工作液;
(4)将装有第一种适配体(Sgc8)2的离心管置于94℃的水浴1.5min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(5)将装有第二种适配体(SYL3C)3的离心管置于94℃的水浴1.5min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(6)取5μL 80μM的退火后的第一种适配体(Sgc8)2加入到0.8mL0.5nM的标准金纳米粒子1溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2和标准金纳米粒子1的混合溶液;
(7)取5μL 80μM的退火后的第二种适配体(SYL3C)3加入到步骤(6)中得到的混合溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液。
步骤2:将步骤1中得到的含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液置于-20℃的环境中1.5h;随后置于室温下融解,得到双重适配体金纳米粒子探针123。由于第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3的5’端修饰了巯基,可以与标准金纳米粒子1表面以Au-S键的方式在标准金纳米粒子1上装配了第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3。图1为制得的双重适配体金纳米粒子(goldnanoparticles,AuNPs)探针(dual-multivalent-aptamer-AuNPs,DMA-AuNPs)123的扫描电镜图;图2为制备的双重适配体金纳米粒子探针(DMA-AuNPs)123的示意图,表示适配体修饰在了金纳米粒子表面,图中,1表示标准金纳米粒子,其平均粒径为30.2nm,2表示第一种适配体Sgc8,一个金纳米粒子上修饰约500条适配体,3表示第二种适配体SYL3C,一个金纳米粒子上修饰约1200条适配体。
上述制备得到的仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面应用,采用如图3所示的检测系统,具体应用方法包括:
步骤1:将制备好的双重适配体金纳米粒子探针123由微量注射泵5以5μL/min的流速利用毛细管6引入商用雾化系统7内;其中进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为0.3L/min的载气氩气雾化;其中形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8;其中电感耦合等离子体功率为1240W,积分时间为0.1ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个双重适配体金纳米粒子探针的瞬时金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个双重适配体金纳米粒子探针的定量分析;
步骤2:按照体积比为1:100的比例,向生物样品中加入制备好的双重适配体金纳米粒子探针123,混合均匀形成生物样品-探针混合液,冰浴30min后,双重适配体金纳米粒子探针则识别修饰到生物样品中循环肿瘤细胞表面,形成初步处理后的生物样品。形成初步处理后的生物样品的具体步骤为:
(1)在细胞培养孔板中,将第一培养基中培养细胞至对数生长期,去除第一培养基并清洗;
(2)将孵育好的细胞从细胞培养孔板中消化下来,并进行离心清洗,用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液,其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/L,pH=7.4;
(3)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数,并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度104cells/mL;
(4)在细胞悬浮液中加入含有双重适配体金纳米粒子探针123,冰浴30min,使得双重适配体金纳米粒子探针123与细胞表面目标蛋白结合,形成初步处理后的生物样品;
步骤3:将步骤2中初步处理后的生物样品经过离心洗涤,得到纯净的样品4;离心条件为750rpm,离心5min,重悬液为1mL磷酸缓冲液;
步骤4:将步骤3中得到的纯净的样品4一部分由微量注射泵5提供,流量为5μL/min,细胞密度为105cells/mL,通过长度为5cm,外径为250μm的毛细管6引入商用雾化系统7内;进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为0.3L/min的载气氩气雾化;形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8,其中,电感耦合等离子体功率为1240W,积分时间为0.1ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个肿瘤细胞上修饰的双重适配体金纳米粒子探针的金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个肿瘤细胞上的双重适配体金纳米粒子探针定量分析;
步骤5:将步骤3中得到的纯净的样品4的另一部分收集于置于正置荧光显微镜9上的细胞培养孔板10中用于图像拍摄处理,其中正置荧光显微镜9明场拍摄设置为自动曝光,暗场荧光拍摄曝光时间设置为30ms,并用自带软件进行荧光强度分析;
步骤6:重复步骤4~步骤5,进行三次平行检测。
实施例2
一种仿生纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:将两种适配体加入标准金纳米粒子溶液中混匀,形成含适配体的金纳米粒子溶液;具体步骤为:
(1)将标准金纳米粒子1溶液(平均粒子直径为30.2nm,浓度为58.5μg/mL)溶于水中形成水溶液,并经过短暂的超声分散,形成均匀分散的单颗粒金纳米粒子溶液,浓度配制为5nM;
(2)将第一种适配体(Sgc8)2(2.5OD)在13000rpm转速下离心75s,再用TE缓冲溶液配制为120μM的适配体工作液;
(3)将第二种适配体(SYL3C)3(2.5OD)在13000rpm转速下离心75s,再用TE缓冲溶液配制为120μM的适配体工作液;
(4)将装有第一种适配体(Sgc8)2的离心管置于94℃的水浴3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(5)将装有第二种适配体(SYL3C)3的离心管置于94℃的水浴3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(6)取10μL 120μM的退火后的第一种适配体(Sgc8)2加入到1.2mL1.5nM的标准金纳米粒子1溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2和标准金纳米粒子1的混合溶液;
(7)取10μL 120μM的退火后的第二种适配体(SYL3C)3加入到步骤(6)中得到的混合溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液;
步骤2:将步骤1中得到的含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液置于-20℃的环境中2.5h;随后置于室温下融解,得到双重适配体金纳米粒子探针123。由于第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3的5’端修饰了巯基,可以与标准金纳米粒子1表面以Au-S键的方式形成在标准金纳米粒子1上装配了第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3。所述探针123的示意图如图2所示。
上述制备得到的仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面应用,采用如图3所示的检测系统,应用方法具体包括:
步骤1:将制备好的双重适配体金纳米粒子探针123由微量注射泵5以20μL/min的流速利用毛细管6引入商用雾化系统7内;其中进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为1.5L/min的载气氩气雾化;其中形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8;其中电感耦合等离子体功率为1400W,积分时间为10ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个双重适配体金纳米粒子探针的瞬时金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个双重适配体金纳米粒子探针的定量分析;
步骤2:按照体积比为1:20的比例,向生物样品中加入制备好的双重适配体金纳米粒子探针,混合均匀形成样品-探针混合液,冰浴30min后,双重适配体金纳米粒子探针则识别修饰到生物样品中循环肿瘤细胞表面,形成初步处理后的生物样品。形成初步处理后的生物样品的具体步骤为:
(1)在细胞培养孔板中,将第一培养基中培养细胞至对数生长期,去除第一培养基并清洗;
(2)将孵育好的细胞从细胞培养孔板中消化下来,并进行离心清洗,用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液,其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/L,pH=7.4;
(3)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数,并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度106cells/mL;
(4)在细胞悬浮液中加入含有双重适配体金纳米粒子探针123,冰浴30min,使得双重适配体金纳米粒子探针123与细胞表面目标蛋白结合,形成初步处理后的生物样品;
步骤3:将步骤2中初步处理后的生物样品经过离心洗涤,得到纯净的样品4;其中离心条件为1100rpm,离心2min,重悬液为2mL磷酸缓冲液;
步骤4:将步骤3中得到的纯净的样品4一部分由微量注射泵5提供,流量为20μL/min,细胞密度为106cells/mL,通过长度为40cm,外径为400μm的毛细管6引入商用雾化系统7内;进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为1.5L/min的载气氩气雾化;形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8,其中,电感耦合等离子体功率为1400W,积分时间为10ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个肿瘤细胞上修饰的双重适配体金纳米粒子探针的金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个肿瘤细胞上的双重适配体金纳米粒子探针定量分析;
步骤5:将步骤3中得到的纯净的样品4的另一部分收集于置于正置荧光显微镜9上的细胞培养孔板10中用于图像拍摄处理,其中正置荧光显微镜9明场拍摄设置为自动曝光,暗场荧光拍摄曝光时间设置为500ms,并用自带软件进行荧光强度分析;
步骤6:重复步骤4~步骤5,进行三次平行检测。
实施例3
一种仿生纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:将两种适配体加入标准金纳米粒子溶液中混匀,形成含适配体的金纳米粒子溶液;具体步骤为:
(1)将标准金纳米粒子1溶液(平均粒子直径为30.2nm,浓度为58.5μg/mL)溶于水中形成水溶液,并经过短暂的超声分散,形成均匀分散的单颗粒金纳米粒子溶液,浓度配制为2.5nM;
(2)将第一种适配体(Sgc8)2(2.5OD)在11000rpm转速下离心2min,再用TE缓冲溶液配制为100μM的适配体工作液;
(3)将第二种适配体(SYL3C)3(2.5OD)在11000rpm转速下离心2min,再用TE缓冲溶液配制为100μM的适配体工作液;
(4)将装有第一种适配体(Sgc8)2的离心管置于94℃的水浴2min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(5)将装有第二种适配体(SYL3C)3的离心管置于94℃的水浴2min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(6)取6μL 110μM的退火后的第一种适配体(Sgc8)2加入到0.9mL1.1nM的标准金纳米粒子1溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2和标准金纳米粒子1的混合溶液;
(7)取6μL 110μM的退火后的第二种适配体(SYL3C)3加入到步骤(6)中得到的混合溶液中,混匀,形成含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液;
步骤2:将步骤1中得到的含有第一种适配体(Sgc8)2、第二种适配体(SYL3C)3以及标准金纳米粒子1的混合溶液置于-20℃的环境中2h;随后置于室温下融解,得到双重适配体金纳米粒子探针123。由于第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3的5’端修饰了巯基,可以与标准金纳米粒子1表面以Au-S键的方式形成在标准金纳米粒子1上装配了第一种适配体(Sgc8)2和第二种适配体(SYL3C)3。得到的探针123示意图如图2所示,适配体修饰在了金纳米粒子表面。
上述制备得到的仿生纳米探针在单循环肿瘤细胞的在线检测方面的应用,采用如图3所示的检测系统,应用方法具体包括:
步骤1:将制备好的双重适配体金纳米粒子探针123由微量注射泵5以15μL/min的流速利用毛细管6引入商用雾化系统7内;其中进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为1.09L/min的载气氩气雾化;其中形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8;其中电感耦合等离子体功率为1300W,积分时间为0.5ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个双重适配体金纳米粒子探针的瞬时金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,得到单个双重适配体金纳米粒子探针的定量分析;
步骤2:按照体积比为1:20的比例,向生物样品中加入制备好的双重适配体金纳米粒子探针,混合均匀形成样品-探针混合液,冰浴35min后,双重适配体金纳米粒子探针123则识别修饰到生物样品中循环肿瘤细胞表面,形成初步处理后的生物样品;
步骤3:将步骤2中初步处理后的生物样品经过离心洗涤,得到纯净的样品4;离心条件为1000rpm,重悬液为1.5mL磷酸缓冲液;
步骤4:将步骤3中得到的纯净的样品4一部分由微量注射泵5提供,流量为10μL/min,通过将长度为10cm,外径为300μm的毛细管6引入商用雾化系统7内;进入商用雾化系统7被纯度为99.999%,流量为1.09L/min的载气氩气雾化;形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪8,其中,电感耦合等离子体功率为1300W,积分时间为0.5ms;在时间分辨模式下进行检测;可以获得单个肿瘤细胞上修饰的双重适配体金纳米粒子探针的金信号并随时间响应,根据迭代算法获取有效信号,通过有效信号获取信号强度-频率分布状况,对频率分布状况进行高斯拟合,如图4所示,得到标记在单个循环肿瘤细胞上的双重适配体金纳米粒子探针123对应的197Au信号的时间脉冲质谱图,表明生物样品中的两个循环肿瘤细胞被成功检测到,并对得到单个肿瘤细胞上的双重适配体金纳米粒子探针定量分析;
步骤5:将步骤3中得到的纯净的样品4的另一部分收集于置于正置荧光显微镜9上的细胞培养孔板10中用于图像拍摄处理,其中正置荧光显微镜9明场拍摄设置为自动曝光,暗场荧光拍摄曝光时间设置为200ms,如图5所示得到被双重适配体金纳米粒子探针123标记的两个循环肿瘤细胞荧光图,并用自带软件进行荧光强度分析;
步骤6:重复步骤4~步骤5,进行三次平行检测。
Claims (10)
1.一种仿生纳米探针,其特征在于,其为双重适配体金纳米粒子探针;所述的双重适配体分别为Sgc8和SYL3C;其序列分别为:Sgc8:5’thiol-C6-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-6-FAM;SYL3C:5’thiol-C6-TTTTTTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AMCA。
2.一种权利要求1所述仿生纳米探针的制备方法,其特征在于,包括步骤如下:
步骤1:将两种适配体加入标准金纳米粒子溶液中混匀,形成含适配体的金纳米粒子溶液;具体步骤为:
(1)平均粒径为30.2nm,浓度为58.5μg/mL的标准金纳米粒子溶液溶于水中形成水溶液,并经过短暂的超声分散,形成均匀分散的单颗粒金纳米粒子溶液,浓度为0.5~5nM;
(2)将第一种适配体在10000~13000rpm转速下离心50~75s,再用TE缓冲溶液配制为80~120μM的适配体工作液;
(3)将第二种适配体在10000~13000rpm转速下离心50~75s,再用TE缓冲溶液配制为80~120μM的适配体工作液;
(4)将装有第一种适配体的离心管置于89~95℃的水浴1.5~3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(5)将装有第二种适配体的离心管置于89~95℃的水浴1.5~3min,随后逐步冷却至室温进行DNA链退火,使得适配体链充分展开,恢复其自身DNA结构;
(6)取5~10μL 80~120μM的退火后的第一种适配体加入到0.8~1.2mL 0.5~5nM的金纳米粒子溶液中,混匀,形成含有第一种适配体和标准金纳米粒子的混合溶液;
(7)取5~10μL 80~120μM的退火后的第二种适配体加入到步骤(6)中得到的混合溶液中,混匀,形成含有两种适配体以及标准金纳米粒子的混合溶液;
步骤2:将含适配体的金纳米粒子溶液置于-15~-30℃环境中1.5~2.5h,随后于室温下融解,形成双重适配体金纳米粒子探针。
3.根据权利要求2所述的一种仿生纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤1中两种适配体分别为Sgc8和SYL3C;该两种适配体的序列分别为:Sgc8:5’thiol-C6-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-6-FAM;SYL3C:5’thiol-C6-TTTTTTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AMCA。
4.一种权利要求1所述仿生纳米探针的应用,其特征在于,所述的仿生纳米探针用于单循环肿瘤细胞的在线检测。
5.根据权利要求4所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,具体包括:
步骤1:将制得的双重适配体金纳米粒子探针引入电感耦合等离子体质谱仪中进行时间分辨模式检测;
步骤2:按照体积比为1:100~1:1的比例,向生物样品中加入制备好的双重适配体金纳米粒子探针,混合均匀形成样品-探针混合液,冰浴20~40min后,双重适配体金纳米粒子探针则识别修饰到生物样品中循环肿瘤细胞表面,形成初步处理后的生物样品;
步骤3:将步骤2中初步处理后的生物样品以750~1100rpm的转速,离心洗涤2.5~5min,得到纯净的样品;
步骤4:将步骤3中得到的样品的一部分引入电感耦合等离子体质谱仪中进行时间分辨模式的检测;
步骤5:将步骤3中得到的样品的另一部分引入细胞培养孔板中进行荧光成像分析;
步骤6:重复步骤4~步骤5,进行三次平行检测。
6.根据权利要求5所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,所述步骤1中,在电感耦合等离子体质谱仪的时间分辨模式下对样品中单个双重适配体金纳米粒子探针进行检测,具体为:将制备好的双重适配体金纳米粒子探针由微量注射泵以5~20μL/min的流速利用毛细管引入雾化系统内;进入雾化系统被纯度为99.999%,流量为0.3~1.5L/min的载气氩气雾化,形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪;其中,电感耦合等离子体功率为1240~1400W,积分时间为0.1~1ms;在时间分辨模式下进行检测,得到单个双重适配体金纳米粒子探针的信号响应值。
7.根据权利要求5所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,所述步骤2中,形成初步处理后的生物样品的具体步骤为:
(1)在细胞培养孔板中,将第一培养基中培养细胞至对数生长期,去除第一培养基并清洗;
(2)将孵育好的细胞从细胞培养孔板中消化下来,并进行离心清洗,用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液,其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/L,pH=7.4;
(3)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数,并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度104~106cells/mL;
(4)在细胞悬浮液中加入含有双重适配体金纳米粒子探针,冰浴20~40min,使得双重适配体金纳米粒子探针与细胞表面目标蛋白结合。
8.根据权利要求5所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,所述步骤4中,将步骤3中得到的样品的一部分由微量注射泵,以流量为5~20μL/min,细胞密度为104~106cells/mL,通过长度为5~40cm,外径为250~400μm,内径为30~100μm的毛细管引入雾化系统内;进入雾化系统被纯度为99.999%,流量为0.3~1.5L/min的载气氩气雾化;形成的雾化产物由载气氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪,其中,电感耦合等离子体功率为1240~1400W,积分时间为0.1~10ms;在时间分辨模式下进行检测。
9.根据权利要求5所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,所述步骤5中,荧光成像分析中修饰在目标上的双重适配体金纳米粒子探针上具有6-FAM和AMCA两种荧光基团,激发波长分别为494nm和350nm;正置荧光显微镜明场拍摄设置为自动曝光,暗场荧光拍摄曝光时间设置为30~500ms。
10.根据权利要求5所述的仿生纳米探针的应用,其特征在于,采用一种检测系统实现,所述检测系统包括:微量注射泵、毛细管、商用雾化系统、电感耦合等离子体质谱仪、正置荧光显微镜、细胞培养孔板;所述毛细管的一端与微量注射泵的出口相连,另一端通过雾化系统与电感耦合等离子体质谱仪相连;所述毛细管作为样品细胞的出口通道;所述微量注射泵流速设置为5~20μL/min;所述雾化系统的型号为Agilent Technologies MicroMistNebulizer ENYA MIST 42,534,所述毛细管的长度为5~40cm,外径为250~400μm,内径为30~100μm;所述正置荧光显微镜明场曝光设置为自动曝光,暗场曝光时间设置为30~500ms;所述细胞培养孔板根据细胞数量选用不同数量的孔板,孔数量为6~96孔/板;通过将相同样品进行单细胞电感耦合等离子体质谱的时间分辨模式检测和正置荧光显微镜成像系统的荧光强度分析,实现对生物样品中单个循环肿瘤细胞进行二维检测分析。
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