CN110184272A - 一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用 - Google Patents

一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新型环状三元适配体，三条适配体单链携带有相互互补的碱基序列，三条适配体单链通过各自携带的部分互补碱基彼此配对后连接形成环状，三条适配体单链为同一种或多种适配体单链。本发明还公开上述新型环状三元适配体的合成方法，包括以下步骤：S1、根据所需要标记识别的抗原，选择与抗原匹配的三条适配体单链；S2、在目标适配体单链中引入特定碱基序列，使第一适配体单链和第二适配体单链上分别带上与第三适配体互补的碱基序列；S3、在DNA连接酶缓冲液中加入等量的三种适配体单链，退火；降温后，加入DNA连接酶进行不低于1h的反应，获得新型环状三元适配体。本发明提供一种高稳定性、高特异识别性的新型适配体，可用于肿瘤的诊断与治疗。

Description

一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用。
背景技术
由于对少量肿瘤细胞往往难以追踪和清除，早期癌症难以查出，等到中晚期 确诊时，已错过最佳治疗时间。手术虽然可以切除99％的恶性肿瘤，但仍然会有 少部分浸润在组织中的肿瘤细胞难以去除。留存的少部分肿瘤细胞会通过原发肿 瘤部位最终进入到血液与淋巴组织中，形成循环肿瘤细胞(CTCs)，而CTCs的存 在是导致癌症转移复发的根源。不管是早期产生的肿瘤细胞还是术后存留的肿瘤 细胞，如果能够做到及时监测、及时治疗，将大大减轻患者精神和经济上的痛苦。
目前我国临床使用的检测手段一般集中在传统影像学诊查，如CT、MIR、超声波诊断等， 一般产生一定大小的实体瘤才能被检测出来。而对于血液中少量的循环肿瘤细胞，目前大致 有三种检测方法，第一种是Veridex公司的Cellsearch CTCs检测系统，也是FDA唯一批准用 于检测CTCs的装置，利用铁磁流抗体与CTC表面的特异性抗原结合，在磁场下进行分离后染 色。第二种是Celsee Diagnostics公司生产的Celsee PREP检测系统，该系统利用肿瘤细胞的物 理特性来进行检测。第三种是Abnova推出的CytoQμestTM，以分子亲和力为基础，利用对 温度敏感的奈米柱阵列捕捉及释放CTCs。然而以上三种技术都比较昂贵，且缺乏CTC的体内 示踪以及杀伤功能。
核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从体外筛选获得，通常是一 种短链寡核苷酸，能折叠成独特的三维结构，能特异性识别靶标。核酸适配体具有许多优点： 任何特定靶点的适配体可经体外试验筛选，克服了传统抗体需从动物中获取的局限性；筛选 的适配体无免疫原性；可重复合成且纯度高；适配体很容易用荧光素、纳米粒子和酶类等修 饰；热变性后仍能恢复活性构象，成本较低且易于运输。由于肿瘤细胞表面往往恶性表达某 些抗原，现已有多种适配体被筛选出能够特异性与肿瘤细胞结合，如Sgc8可以特异性识别酪 氨酸激酶7，HB5可以特异性识别Her2，SYL3C可以特异性识别Epcam。当适配体上修饰荧光 分子后，可以实现体内肿瘤细胞示踪，可以成为早期以及术后的肿瘤细胞检测的一种手段。 同时，适配体易修饰，可以在适配体上接载药物，在靶向肿瘤细胞后能够进一步将其杀死， 达到诊疗一体化的目的。
现有的适配体为核酸单链，由于磷酸二酯键不稳定，易被血清中的核酸内切酶切割而丧 失功能，所以保证其生物稳定性是使用的前提。肿瘤细胞表面往往高表达一种或多种抗原， 现有技术中的核酸单链适配体只能识别肿瘤细胞表面的单个抗原，识别和标记效率较低。因 此，现在需要研发出一种稳定性高、不易被血清中核酸内切酶切割而失效，且能够识别肿瘤 细胞表面多个抗原、识别效率高的新型适配体分子，以提供更有效、价格较低的肿瘤的诊断 与治疗手段。
发明内容：
本发明目的是提供了一种高稳定性，高特异识别性的新型新型环状三元适配体及其合成 方法和应用，要解决现有技术中单个适配体用于肿瘤细胞诊断时所存在的稳定性差、识别效 率低等技术问题，以用于肿瘤的诊断与治疗，提供效率更高、成本更低的诊治技术。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型环状三元适配体，三条适配体单链携带有相互互补的碱基序列，所述的三条适 配体单链通过各自携带的部分互补碱基彼此配对后连接形成环状，所述的三条适配体单链为 同一种或两种及以上的适配体单链。也即可以是三条适配体单链之间的识别功能和/或碱基序 列完全相同，比如都用于识别同一个抗原；也可以是两个适配体单链之间的识别功能和/或碱 基序列不一样；或者是三条适配体单链的识别功能和/或碱基序列完全相同。
在上述实施方式的基础上，优选的，所述适配体单链均带有与肿瘤细胞表面抗原特异性 识别的识别区域。
优选的，至少有一条所述适配体单链上修饰有标记分子和/或化学官能团。
优选的，所述标记分子为荧光素、羧基四甲基罗丹明、生物素、地高辛、荧光物质、纳 米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸和酶中的一种或两种及以上。
优选的，所述荧光素为羧基荧光素(FAM)或异硫氰酸荧光素(FITC)。
优选的，所述化学官能团为氨基、羧基、巯基、羟基、醛基和硝基中的一种或两种及以 上。
优选的，所述新型环状三元适配体通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物，所述药物 为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单 抗和曲妥珠单抗中的一种或两种及以上。
优选的，所述适配体单链的核心序列为SE15-8，其核苷酸序列为SEQ No.1。
优选的，所述携带有互补碱基序列的三条适配体单链的核苷酸序列分别为SEQNo.2、SEQ No.3、SEQ No.4。
优选的，SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4三条所述适配体单链上至少有一条修饰有羧基荧 光素基团和氨基，且5’端磷酸基团磷酸。
优选的，所述适配体单链的核心序列为EPCAM-Apt，其SEQ No.5。
优选的，所述携带有互补碱基序列的三条适配体单链的核苷酸序列分别为SEQNo.6、SEQ No.7和SEQ No.8。
优选的，SEQ No.6、SEQ No.7和SEQ No.8三条所述适配体单链上至少有一条修饰有羧基 荧光素基团和氨基，且5’端磷酸基团磷酸。
本发明还提供上述的新型环状三元适配体的合成方法，包括以下步骤：
S1、根据所需要标记识别的一个或多个抗原，选择与抗原匹配的三条适配体单链，三条 适配体单链可以为同一种类或不同种类；
S2、在目标适配体单链中引入特定碱基序列，使得第一适配体单链和第二适配体单链上 分别带有一段与第三适配体互补的碱基序列，所引入的碱基序列不插入至三条适配体单链的 活性部位；
S3、在DNA连接酶缓冲液中加入等物质的量浓度的所述步骤S2中制备所得三种适配体 单链，根据互补的碱基序列设定退火温度进行退火；将完成退火的混合溶液降至室温后，加 入DNA连接酶于16℃进行反应，反应时间不低于1h，获得新型环状三元适配体。
优选的，所述步骤S2中还包括，在三条适配体单链中引入互补的碱基序列之后，在至少 一条适配体单链中引入标记分子和/或化学官能团。
更优选的，所述步骤S2中还包括，通过化学官能团或物理嵌合方式在适配体单链上装载 药物。
优选的，所述步骤S1中的抗原为肿瘤细胞表面过表达的抗原。
本发明还提供上述新型环状三元适配体在肿瘤的诊断和治疗中的应用。
以下简要介绍本发明技术方案中环状三元适配体合成和识别肿瘤细胞的工作原理：在不 影响适配体单链活性部位的前提下，对适配体单链进行改造，使三条适配体核酸单链具有彼 此互补的部分互补序列，然后在核酸连接酶的作用下使三条单链连接成环，所得到的环状三 元产物无外露的磷酸二酯键，因此具有较高的生物稳定性。因为肿瘤细胞表面往往高表达一 种或多种抗原，本发明中环状产物由三条适配体组合而成，可以是三条相同的适配体单链， 这样能增强适配体对抗原的亲和力，也可以采用不同的适配体达到多抗原识别的目的；相比 于采用单个适配体对肿瘤细胞的识别，本发明中环状三元适配体能够显著增强对肿瘤细胞的 识别效率。
本发明的技术方案至少具有以下有益效果：
1.本发明提供的环状三元适配体分子，原料简单、易于合成，具有生产时间短、成本低 易于推广的优点。
2.本发明提供的环状三元适配体分子，由于其环状结构，大大提高了适配体的稳定性， 使其位于血清和外切酶的环境条件下，比单链适配体具有更高的稳定性，能够在体内更长时 间循环和识别肿瘤细胞。
3.本发明提供的环状三元适配体分子，由三个单链适配体分子连接而成，较单链适配体 分子具有更强的识别效率，能大大增强适配体识别肿瘤细胞的灵敏性。
4.本发明提供的环状三元适配体分子能通过化学结合和/或物理嵌合的方式接载肿瘤治 疗药物，使得适配体在识别肿瘤细胞的同时能够进一步杀灭肿瘤细胞，达到治疗的目的。
附图说明
图1为实施例1中改造后的三种单链适配体(T1、T2、T3)和环状三元适配体(CTA)的可能二级结构示意图及合成过程示意图；
图2为实施例1中改造后的三种单链适配体(T1、T2、T3)、双链结合体(T3+T2和T3+T1) 以及环状三元适配体(CTA)的电泳表征图；
图3为实施例2中改造后的三种单链适配体(T1’、T2’、T3’)和环状三元适配体(CTA) 的电泳表征图；
图4为实施例1中的环状三元适配体与改造后单链适配体(T1)分别在核酸外切酶EXO Ⅰ、10％和20％的胎牛血清中酶解不同时间后的对比电泳图；
图5为实施例1中的环状三元适配体与改造后单链适配体(T1)在不同条件下，经流式 检测对靶细胞的识别能力对比图。
具体实施方式
以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到, 本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
实施例1
本实施例中的环状三元适配体是由三条单链适配体经端部的碱基互补配对连接而成的环 状分子，其具体的合成方法包括以下步骤：
S1、通过文献查找，选择与肿瘤细胞表面高表达抗原特异性识别的适配体单链SE15-8， 其中SE15-8的核苷酸序列为SEQ No.1：AGC CGC GAG GGG AGG GAT AGG GTA GGGCGC GGCT-AGTCAAGA1。本实施例中适配体单链SE15-8能特异性识别肿瘤细胞上相对分子质量为 185000的跨膜受体样蛋白，该蛋白由原癌基因人类表皮生长因子受体2(humanepidermal growth factor receptor-2，HER2)基因，即c-erbB-2基因编码。
S2、首先对SE15-8序列进行改造使其具有部分配对序列，分别获得SEQ No.2、SEQNo.3 和SEQ No.4三条核苷酸序列(具体碱基序列参见序列表)，然后修饰上羧基荧光基团6-FAM 和氨基，并将5’端磷酸基团进行磷酸化，获得改造后三条适配体单链T1、T2和T3；由生工 生物工程(上海)股份有限公司合成T1、T2和T3三条序列；
T1：
TTCGGAGTCAACTAT/iNH2C6dT/ATCAACTGAAGCCGCGAGGGGAGGGA/i6FAMdT/AGGGTAGGGCGCG GCT；
T2：TCAGTTGATGGAGCCGCGAGGGGAGGGATAGGG/i6FAMdT/AGGGCGCGGCTCCTAGTT；
T3：GACTCCGAAAGCCGCGAGGGGAGGGATAGGG/i6FAMdT/AGGGCGCGGCT。
其中，引入的部分配对的碱基序列不插入至适配体单链的活性部位。本实施例中T3端部 的碱基序列与T1和T2的端部碱基序列互补。因此，基于碱基互补配对原则，T1与T2能分 别与T3端部的一段序列进行碱基互补配对。
S3、进行T1、T2和T3适配体单链的连接环化。先将步骤S2中获得的T1、T2和T3三条适配体单链分别稀释至10μmol/l。在1.5ml离心管中加入59μl纯化水，然后加入稀释后的T1、T2、T3溶液各10μl，再分别加入T4DNA连接酶缓冲液10μl，混合后在90℃金属浴下 退火5分钟；缓慢降至室温(约20℃)后加入T4DNA连接酶1μl，将离心管置于16℃金 属浴下反应2h，反应完毕得到产物环状三元适配体(以下简称CTA)。T1、T2、T3、CTA的 可能二级结构示意和合成反应过程示意参见附图1所示。
按照上述操作步骤和反应条件，取T3和T2作为原料合成T3+T2；取T3和T1作为原料合成T3+T1，制备所得的T3+T2和T3+T1二元适配体分子作为对照。
对T1、T2、T3、CTA、T3+T2和T3+T1同时进行电泳，电泳结果照片参见附图2所示。
具体的电泳操作步骤为：制备浓度为10％PAGE胶，取T3、T2、T1、T3+T2、T3+T1、CTA各10μl(1μmol/L)与6×的DNA上样缓冲液2μl混合后，分别加入凝胶孔道中，电压80V 下电泳90分钟，参将附图2所示，可知CTA产物的电泳条带位置与T3、T2、T1、T3+T2、T3+ T1的位置均不同，证明CTA产物合成成功。上述操作步骤中，制备PAGE胶和上样缓冲液为 本技术领域现有技术，所使用到的化学用品及电泳仪均为正规厂家所够的市售产品，在此不 进行赘述。
实施例2
本实施例中的环状三元适配体具体的合成方法包括以下步骤：
S1、通过文献查找，选择与肿瘤细胞表面高表达抗原EPCAM特异性识别的适配体单链 EPCAM-Apt，其中EPCAM-Apt的核苷酸序列为SEQ No.5：ACGUAUCCCUUUUCGCGU2。
S2、首先对EPCAM-Apt序列进行改造使其具有部分配对序列，分别获得SEQ No.6、SEQ No.7 和SEQ No.8三条核苷酸序列(具体碱基序列参见序列表)，然后修饰上羧基荧光基团6-FAM 和氨基，并将5’端磷酸基团进行磷酸化，获得改造后三条适配体单链T1’、T2’和T3’； 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成T1’、T2’和T3’三条序列；
T1’:TTCGGAGTCAACTAT/iNH2C6dT/TATCAACTGAAGCCGCGAGGGGAGGGAT/i6FAMdT/AGGGTAGGGCGC GGCT
T2’:TCAGTTGATGGAGCCGCGAGGGGAGGGATAGGGT/i6FAMdT/AGGGCGCGGCTCCTAGTT
T3’:GACTCCGAAAGCCGCGAGGGGAGGGATAGGGT/i6FAMdT/AGGGCGCGGCT
其中，引入的部分配对的碱基序列不插入至适配体单链的活性部位。本实施例中T3’端 部的碱基序列与T1’和T2’的端部碱基序列互补。因此，基于碱基互补配对原则，T1’与 T2’能分别与T3’端部的一段序列进行碱基互补配对。
S3、进行T1’、T2’和T3’适配体单链的连接环化。先将步骤S2中获得的T1’、T2’ 和T3’三条适配体单链分别稀释至10μmol/l。在1.5ml离心管中加入59μl纯化水，然后加 入稀释后的T1’、T2’、T3’溶液各10μl，再分别加入T4DNA连接酶缓冲液10μl，混合 后在90℃金属浴下退火5分钟；缓慢降至室温(约20℃)后加入T4DNA连接酶1μl，将 离心管置于16℃金属浴下反应2h，反应完毕得到产物环状三元适配体(以下简称CTA)。T1’、 T2’、T3’、CTA的可能二级结构示意和合成反应过程示意参见附图1所示。
对T1’、T2’、T3’、CTA同时进行电泳，电泳结果照片参见附图3所示。
具体的电泳操作步骤为：制备浓度为10％PAGE胶，取T3’、T2’、T1’、CTA各10μ l(1μmol/L)与6×的DNA上样缓冲液2μl混合后，分别加入凝胶孔道中，电压80V下电泳 90分钟，参将附图2所示，可知CTA产物的电泳条带位置与T3’、T2’、T1’的位置均不同， 证明CTA产物合成成功。上述操作步骤中，制备PAGE胶和上样缓冲液为本技术领域现有技 术，所使用到的化学用品及电泳仪均为正规厂家所够的市售产品，在此不进行赘述。
上述两个实施例的合成产物均为环状三元适配体，为节约实验资源选取实施例1中所获 得的环状三元适配体作进一步的生物验证。
实验例1环状三元适配体的酶解稳定性实验
由于适配体在进入生物体内后，其稳定性主要受到血清以及血液中外切酶的影响，因此 设计实验考察实施例1中的环状三元适配体在0.25Μ的核酸外切酶(EXOⅠ)条件下的稳定 性。按照下述各原料和配比配置对照组和实验组的反应溶液。
对照组：纯化水：76μl、T1：9μl(1μM)、EXOⅠ：5μl(5Μ)、EXOⅠbμffer：10 μl；
实验组：纯化水：55μl、CTA：30μl(1μM)、EXOⅠ：5μl(5Μ)、EXOⅠbμffer： 10μl。
以上实验组和对照组在37℃下反应0h、1h、3h、5h、8h、12h、24h后，分别取10 μl样品置于离心管中，于65℃进行10分钟的酶失活处理，然后加入DNA上样缓冲液，在 10％PAGE胶中80V电泳90分钟，电泳结果如附图4中最上部的条带所示。
通过电泳结果可知，相比反应0h、1h、3h的各条带，CTA在0.25Μ的核酸外切酶(EXOⅠ)条件下反应24h后，其电泳条带亮度没有明显降低，因此可推知反应24h后，CTA的含 量无明显降低核酸外切酶(EXOⅠ)进行大量降解。而T1在0.25Μ的核酸外切酶(EXOⅠ) 条件下反应1h后，其条带亮度即出现了明显降低，在反应8h，T1的条带亮度几乎不可见， 这说明T1能够被0.25Μ核酸外切酶进行了降解，且降解时间大约为8h。本实验结果表明CTA 在0.25Μ核酸外切酶(EXOⅠ)条件具有酶稳定性，不易被降解。
实验例2
为考察CTA在血清中的稳定性，按照下述对照组和实验组的各配比配置溶液：
实验组1：CTA 9μl(1μM)、10％胎牛血清1μl；
对照组1：T1 9μl(1μM)、10％胎牛血清1μl。
实验组2：CTA 9μl(1μM)、20％胎牛血清1μl；
对照组2：T1 9μl(1μM)、20％胎牛血清1μl。
对于每个实验组或对照组，分别取7个500μl容量的离心管，按上述列出的加样量分别 制备反应24h、12h、8h、5h、3h、1h和0h的样品。然后将取得的各个样品加入上样缓冲液， 在10％PAGE胶中80V电泳90分钟，电泳结果参见附图4的中部和下部条带。
通过电泳结果可知，相比反应0h的条带亮度，在10％的胎牛血清中，CTA的条带亮度差 别不大，而T1中反应5h后的条带亮度明显暗淡，说明T1发生了大量降解。在20％胎牛血清 中，CTA的条带亮度依旧未发现明显变化，而T1则在反应1h后就获得了暗淡的条带。这说 明，CTA在10％胎牛血清和20％的胎牛血清中可稳定存在24h，基本上不发生降解；而T1在 20％胎牛血清中之只能存在3h。实验结果说明CTA相比于T1在牛血清中的稳定性更高，不易 被降解，有利于其在体内更加稳定的存在并发挥作用。
实验例3环状三元适配体CTA的特异性识别实验
由于人乳腺癌细胞系BT474高表达HER2，而CTA和T1均可HER2编码的蛋白进行特异性 识别。因此设计本实验，通过流式细胞术验证T1与CTA对BT474细胞的识别作用以及对二者 的识别强度进行对比。
取对数生长期的BT474细胞，加入1ml不含EDTA的胰蛋白酶在培养箱中消化5min，取两份 BT474细胞，每一份通过细胞计数仪计数约为1×105个；分别加入5μl(10μM)的T1与17 μl(1μM)的CTA，4℃下孵育2h；然后于1300rpm下离心5min后弃上清，用PBS溶液重新悬浮；重复离心两次去掉未特异性识别的适配体，最后加入300μl PBS溶液悬浮离心后的细胞， 并上流式进行检测，并以消化后的BT474细胞直接上流式进行检测作为对照。
检测结果如附图5中的0h对应的一栏，可知T1与CTA都能特异性识别BT474，且CTA所识别的细胞数量远远大于T1所识别的细胞数量，因此说明CTA对BT474细胞的特异性识别能力远高于T1，证明合成的环状三元适配体相比T1单链适配体具有较高的识别灵敏性和识别效率。这是因为一个环状三元适配体分子CTA携带有3个HER2特异性识别区域，因此CAT与细胞表面的HER2蛋白能接触时，允许更多的角度进行结合与识别。
实验例4环状三元适配体CTA在血清和酶环境下的特异性识别实验
由于适配体在进入生物体内后，其稳定性主要受到血清以及血液中外切酶的影响，因此 设计本实验考察在10％的胎牛血清及0.25ΜEXOⅠ酶作用反应不同时间时，CTA对BT474细 胞特异性识别能力。
分别取实验例1和实验例2中的CAT与10％的胎牛血清、T1和10％的胎牛血清，以及CAT 和EXOⅠ酶作用、T1和EXOⅠ酶作用1h、3h、5h、8h、12h和24h后的溶液，作为CTA和T1 溶液，按照实验例3中的步骤进行BT474细胞特异性识别实验。
实验结果如图5所示，可见在EXOⅠ酶作用情况下(参见图5中左侧两个图)，相比实验例3中0h(未进行酶解作用)的细胞识别结果，CTA对BT474细胞特异性识别数量没有明 显下降；而T1适配体识别的细胞数量则有明显降低。
参见附图5右侧的两个图，在10％的胎牛血清环境中，相比实验例3中0h(未进行酶解 作用)的细胞识别结果，T1适配体识别的细胞数量显著降低，而CAT在反应24h后仍能识别 103的BT474细胞。因此本实验说明在10％的胎牛血清及0.25ΜEXOⅠ酶作用情况下，CTA依旧 能非常有效的识别靶细胞，对人乳腺癌BT474细胞具有较高的生物稳定识别能力。
由于改造后的三条适配体单链T1、T2和T3的活性部位相同，差别在于各自的互补序列 长度不一样。实验例1-4中选择T1作为对照实验，可以预见到如将T1替换成T2或T3，对实验结果影响没有实质性的影响。为节约实验资源，申请人未对T2和T3同时进行实验。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制， 尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领 域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但 以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种新型环状三元适配体，其特征在于，三条适配体单链携带有相互互补的碱基序列，所述的三条适配体单链通过各自携带的互补碱基配对后彼此连接形成环状，所述的三条适配体单链为同一种或两种及以上的适配体单链。
2.根据权利要求1所述的新型环状三元适配体，其特征在于，至少有一条所述适配体单链上修饰有标记分子和/或化学官能团。
3.根据权利要求2所述的新型环状三元适配体，其特征在于，所述标记分子为荧光素、羧基四甲基罗丹明、生物素、地高辛、荧光物质、 纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸和酶中的一种或两种及以上。
4.根据权利要求2所述的新型环状三元适配体，其特征在于，所述化学官能团为氨基、羧基、巯基、羟基、醛基和硝基中的一种或两种及以上。
5.根据权利要求2所述的新型环状三元适配体的合成方法，其特征在于，所述新型环状三元适配体通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物，所述药物为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗中的一种或两种及以上。
6.根据权利要求1所述的新型环状三元适配体的合成方法，其特征在于，所述适配体单链的核心序列为SE15-8或EPCAM-Apt，其核苷酸序列为SEQ No.1或SEQ No.5。
7.根据权利要求6所述的新型环状三元适配体，其特征在于，所述携带有互补碱基序列的三条适配体单链的核苷酸序列分别是SEQ No.2、SEQ No.3和SEQ No.4，或者是SEQ No.6、SEQ No.7和SEQ No.8。
8.根据权利要求7所述的新型环状三元适配体，其特征在于，每一组的三条所述适配体单链上至少有一条修饰有羧基荧光素基团和氨基，且5’端磷酸基团磷酸化。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的新型环状三元适配体的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据所需要标记识别的一个或多个抗原，选择与抗原匹配的三条适配体单链，三条适配体单链为同一种或两种及以上的适配体单链；
S2、在目标适配体单链中引入特定碱基序列，使得第一适配体单链和第二适配体单链上分别带有一段与第三适配体互补的碱基序列，所引入的碱基序列不插入至三条适配体单链的活性部位；
S3、在DNA 连接酶缓冲液中加入等物质的量浓度的所述步骤S2中制备所得三种适配体单链，根据互补的碱基序列设定退火温度进行退火；将完成退火的混合溶液降至室温后，加入DNA连接酶于16℃进行反应，反应时间不低于1h，获得新型环状三元适配体。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的新型环状三元适配体在肿瘤诊断和治疗中的应用。
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