CN111494643B - 一种白蛋白-dna复合功能化材料及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白蛋白‑DNA复合功能化材料及其制备与应用，具体涉及一种环状DNA适配体的复合物通过含N‑羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂与人血清蛋白键合的功能化材料及其制备方法，以及在肿瘤转移和预防方面的应用。将环状DNA偶联于白蛋白构成了高度特异性识别血中的微量循环肿瘤细胞的复合物，白蛋白在血液中的长半衰期特性将促进复合材料在血液中长效的捕获并抑制循环肿瘤细胞的活性，达到预防肿瘤转移的目的。

Description

一种白蛋白-DNA复合功能化材料及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种白蛋白-DNA复合功能化材料及其制备与应用。
背景技术
半个世纪以来，重大疾病如心脏病、传染病、肺结核等死亡率已经下降了>50 %，但是癌症死亡率仅减少约 5 % ，其中绝大多数死于肿瘤手术后的再转移。2019年 2 月 1日，《柳叶刀》公布了最新全球癌症生存报告，显示全球癌症患者的存活率呈上升趋势。该统计分析表明从 1977年到2022年，美国肿瘤首次诊疗后幸存者的总数将上升6倍。但是纵观从 1930-2011 年这长 达 81 年的统计数据表明，在美国男、女和各种肿瘤的综合死亡率并没有显著下降。 这不断上升的肿瘤首次诊疗后幸存者的总数和没有显著下降的肿瘤死亡率的反差提示大多数肿瘤首次诊疗后幸存者最终死于肿瘤的全身转移。目前认为，癌症转移复发的根源是血中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）。 CTC 在其微环境各种因素的影响下，转为具有 EMT（上皮-间质转化）活性的 CTC，从而开始了向血管内膜粘附和向血管外侵的肿瘤转移瀑布反应，而再次转移往往是全身多器官的转移，抗癌药和靶向药物对此都束手无策。因此肿瘤转移后造成的死亡是需要解决关键问题。
自1990 年Tuerk与Ellingtong首次基于 SELEX 技术筛选出噬菌体一段特异性RNA适配体以来，适配体的在生物医药方面取得了广大的应用。适配体是人工合成的一段体外核苷酸序列，根据所检测对象进行设计，能够特异性识别靶标，使其具有“化学抗体”之称。目前已有多种特异性识别肿瘤细胞的适配体，能够对肿瘤进行识别检测，特异性靶向，甚至抑制肿瘤生长，但由于常见适配体往往都为单链结构，在血液中不能稳定存在，因此提高适配体在生物应用的稳定性十分重要。
多数纳米材料被肝的 Kupffer 细胞、B细胞和肝血窦内皮细胞吞噬而无法达到靶组织。而HSA作为天然的内源性物质则能长久存在于人体血液中，HSA是血浆中含量最丰富的循环蛋白（占总血浆蛋白含量的 60 %），且具有长达 19 天的体内半衰期。相对于其它生物纳米材料而言，HSA 具有明显优势：来自人体自身的内源性蛋白，无毒、无免疫原性,不容易被体内网状内皮系统所清除、能够避免在肝脏的富集，具有超长的体内半衰期。HSA可用于改善癌症治疗药物的自身缺陷（如半衰期短、水溶性差、毒副作用大、靶向肿瘤的能力低）。
虽然通过与白蛋白结合域连接制备白蛋白融合物是本领域提高目标物半衰期的方法之一，但是构建得到半衰期延长同时药效活性增强的白蛋白融合物却并非易事，其关键的难点在于：与目标物如核酸适配体或蛋白连接后白蛋白结合域本身可能会影响目标物活性，同时改造后的目标物与白蛋白结合后也可能对其活性有影响，而的结构复杂，核酸和蛋白之间的相互作用规律也不清楚，因此，选择何种白蛋白结合域，连接在核酸或蛋白什么部位可以得到的半衰期延长同时药效活性优良的融合蛋白是不确定的，极有可能得到没有活性的融合蛋白。比如，一种白蛋白结合域SA21，将其与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)连接后并未明显延长hTRAIL半衰期；另外，将白蛋白结合域ABD连接在hTRAIL C-末端，不仅未显著延长半衰期，还降低了hTRAIL的体内抗肿瘤活性。事实说明，通过添加白蛋白结合域的方式构建得到的半衰期延长同时抗肿瘤活性增强的融合蛋白并非易事。
目前已经上市或者已经进入临床试验阶段的人血清白蛋白药物中，Abraxane （白蛋白结合型紫杉醇纳米粒）是HSA纳米药物研发的典型范例，它是第一个被 FDA 批准的用于治疗转移性乳腺癌、非小细胞肺癌和转移性胰腺癌的 HSA 纳米药物。然而Abraxane 的杀伤机制仍然是使用化疗药物，使其具有一定的毒副作用。因此开发安全有效且能在较长时间内发挥作用的预防肿瘤术后转移的药物十分迫切。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种白蛋白-DNA复合功能化材料及其制备与应用，该材料稳定存在于血液中且高度识别肿瘤细胞，制备工艺简单，稳定性好，易于实现产业化，可作为一种在血液长时间捕获肿瘤细胞的工具，达到预防肿瘤转移的目的。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种白蛋白-DNA复合功能化材料，该白蛋白-DNA复合功能化材料通过偶联剂将白蛋白的功能化巯基/二硫键与DNA表面修饰的官能团连接组装而成；
所述DNA为环状包含三个功能化区域的特异性识别肿瘤细胞的适配体；
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂，根据DNA表面修饰的官能团选择对应的偶联剂。
进一步的，所述偶联剂为（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
一种白蛋白-DNA复合功能化材料的应用，将所述白蛋白-DNA复合功能化材料应用于抑制基于循环肿瘤细胞为主要转移途径的肿瘤的转移扩散。
进一步的，所述白蛋白-DNA复合功能化材料应用于以所述白蛋白-DNA复合功能化材料为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备预防肿瘤细胞转移的产品。
进一步的，所述白蛋白-DNA复合功能化材料可通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物。
一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，包括以下步骤：
步骤一、合成环状DNA
将等量的三条特异性识别肿瘤细胞的适配体DNA单链进行退火后，缓降至室温，加入连接酶反应时间大于1小时，得环状DNA；
步骤二、合成复合物DNA-偶联剂
按分子量数量小于1∶1的比例取环状DNA与偶联剂，在水溶液中进行DNA与偶联剂的反应，控制溶液pH为7-9，在搅拌条件下反应时间大于0.5h；纯化后即得到复合物DNA-偶联剂；
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂；
步骤三、还原白蛋白
白蛋白与巯基还原剂按分子量数量小于1∶1的比例称取，在称取的白蛋白中加入巯基还原剂，将蛋白质二硫键还原成巯基；
步骤四、合成白蛋白-DNA
将DNA-偶联剂与还原后白蛋白在pH6.5-7.5环境下进行反应，反应时间大于0.5h，纯化后即得白蛋白-DNA。
进一步的，所述巯基还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇中的任一种。
进一步的，所述偶联剂为（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
进一步的，步骤二中所述的环状DNA与偶联剂的比例为1∶50。
进一步的，步骤三中所述的白蛋白与巯基还原剂的比例为1∶10。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的白蛋白-DNA复合功能化材料是白蛋白的功能化巯基/二硫键与DNA表面修饰的官能团通过偶联剂连接组装而成，兼具白蛋白与DNA的特性，可延长半衰期、增强对循环肿瘤细胞捕获和活性抑制功能。不但解决了核酸与白蛋白融合后仍保持核酸对肿瘤细胞的捕获和活性抑制功能，还兼具蛋白质在血液中半衰期长的功能。
2、本发明白蛋白与环状DNA适配体的复合物，具有白蛋白在血液中长时间循环而不被免疫细胞清除的特点，同时具有环状适配体在血液中稳定存在不被分解且环状适配体中包含三个适配体识别结构能够对血液中肿瘤细胞高度识别的特点，使得复合物能够在血液中长时间循环且识别和作用于CTC，使其丧失进一步转移的能力，从而达到预防肿瘤转移治疗的目的。
3、由于该材料稳定性好，制备工艺易稳定实现，达到了易于实现产业化的目的，解决了当前大多数抗癌药物易失活，不易制备，更不易产业化的技术问题。
附图说明
图1为本发明白蛋白-DNA复合物构建示意图；
图2为本发明白蛋白-DNA复合物合成的电泳表征图；
图3为本发明白蛋白-DNA复合物对肿瘤细胞的特异性捕获的流式细胞仪检测图；
图4为本发明白蛋白-DNA复合物癌细胞抑制效果及转移灶数量图。
具体实施方式
以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
一种白蛋白-DNA复合功能化材料，该白蛋白-DNA复合功能化材料通过偶联剂将白蛋白的功能化巯基/二硫键与DNA表面修饰的官能团连接组装而成；
所述DNA为环状包含三个功能化区域的特异性识别肿瘤细胞的适配体；
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂，根据DNA表面修饰的官能团选择对应的偶联剂。
进一步的，所述偶联剂为（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
一种白蛋白-DNA复合功能化材料的应用，将所述白蛋白-DNA复合功能化材料应用于抑制基于循环肿瘤细胞为主要转移途径的肿瘤的转移扩散。
进一步的，所述白蛋白-DNA复合功能化材料应用于以所述白蛋白-DNA复合功能化材料为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备预防肿瘤细胞转移的产品。
进一步的，所述白蛋白-DNA复合功能化材料可通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物。
为了验证本发明，申请人设置了以下实施例。
实施例1
一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，如图1所示，该白蛋白-DNA复合功能化材料通过白蛋白的功能化巯基/二硫键与DNA表面修饰的官能团通过偶联剂连接组装而成；具体包括以下步骤：
步骤一、合成环状DNA，将等量的三条特异性识别肿瘤细胞的适配体DNA单链进行退火后，缓降至室温，加入连接酶反应时间大于1小时，得环状DNA（CTA）；
所述的三条适配体单链为同一种或两种及以上的适配体单链，本实施例采用同一适配体，本实施例选择与肿瘤细胞表面高表达抗原特异性识别的适配体单链EPCAM-Apt，其中EPCAM-Apt的核苷酸序列为SEQ No.1：ACGUAUCCCUUUUCGCGU，经修饰改造后为C/iNH2C6dT/CCGAACGCGCACGUAUCCCUUUUCGCGUGCGCG
具体操作为：将经磷酸化修饰的特异性识别肿瘤细胞的适配体DNA适配体粉末T1，T2,T3分别用1*TE稀释成10uM，取500ul的ep管，加入60ul 超纯水，10ul 10* ligasebuffer，T1，T2，T3各10ul，混匀后在90℃下退火5分钟，缓降至室温，加入1ul ligase酶，在16℃下反应时间大于1h，65℃下10分钟使酶失活，即得环状DNA适配体(CTA)；
步骤二、合成环状DNA-偶联剂，按分子量数量小于1∶1的比例，取环状DNA与偶联剂，本发明人取1∶50，混合进行DNA与偶联剂的反应，控制溶液pH为7-9，在搅拌条件下反应时间大于0.5h；纯化后即得到环状DNA-偶联剂；根据DNA表面修饰的官能团选择对应的偶联剂，该原理为：DNA上面修饰氨基，白蛋白上面有巯基，选择含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂可以分别连接氨基和巯基从而使DNA和蛋白质相连。
其中DNA与偶联剂的分子量比例小于1∶1的目的在于确保所有DNA都能充分与偶联剂反应，偶联剂分子量需大于DNA，若小于则部分DNA不能完全与偶联剂结合，则影响本发明材料的有效率。
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂，如（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)。
具体操作为：取合成后环状DNA适配体 200ul，偶联剂sulf-SMCC 100ul（1mg/ml），超纯水100ul，调节溶液pH至7-9，在37℃，650rpm金属浴中过夜，用10kd超滤管超滤纯化3次（8000rpm，5min）得到环状DNA-SMCC；
步骤三、还原白蛋白，白蛋白与巯基还原剂按分子量数量小于1∶1的比例称取，在称取的白蛋白中加入巯基还原剂，将蛋白质二硫键还原成巯基；巯基还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇中的任一种；具体操作为：
称取4mg人血清白蛋白（HSA）溶解于超纯水中，加入二硫苏糖醇DTT（6mg/ml）20ul,HSA与DTT的分子数量比例1:10，还原HSA中巯基1h后超滤3次（8000rpm，10min），得纯化的还原后白蛋白；
其中白蛋白与巯基还原剂按分子量数量小于1∶1的原理在于充分将白蛋白还原，若还原剂数量少于白蛋白，则有部分白蛋白不能得到还原，为了保证所有白蛋白被还原，则需要加入更多的还原剂。
步骤四、合成白蛋白-DNA
将环状DNA-偶联剂与还原后与白蛋白在pH6.5-7.5环境下进行反应，反应时间大于0.5h，纯化后即得白蛋白-DNA。
具体为：将还原后HSA与DNA-SMCC混合，调节溶液pH至6.5-7.5，在37℃，650rpm金属浴中过夜，将得到产物用100kd超滤管超滤纯化，即得白蛋白-DNA复合物；该白蛋白-DNA复合功能化材料可通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物。
将制得的白蛋白-DNA复合功能化材料应用于抑制基于循环肿瘤细胞为主要转移途径的肿瘤的转移扩散；以该白蛋白-DNA复合功能化材料为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备预防肿瘤细胞转移的产品。
为了验证本发明白蛋白-DNA对于预防肿瘤细胞转移的效果，发明人设置了以下实施例：
实施例2：白蛋白-DNA复合物的电泳表征
制备1%的琼脂糖胶，分别取环状DNA适配体（CTA）、白蛋白(HSA)、白蛋白-DNA复合物各10ul，加入2ul 6*上样缓冲液，在80v电压下电泳30min，在化学发光仪下显色，结果为图2所示白蛋白-DNA复合物合成电泳表征图；
如图2所示，第一张为环状DNA适配体电泳图，图中可见6个条带，分别代表了DNA的6个状态，验证了环状DNA的形成；第二张电泳图为白蛋白-DNA复合物电泳图，该电泳图第一条带为合成的环状DNA即CTA以及白蛋白HSA，第二条为CTA及还原巯基的白蛋白，第三条为接上sulf-SMCC的CTA与HSA，第四条为接上sulf-SMCC的CTA与还原巯基的HSA，该图验证了白蛋白-DNA产物的形成。
实施例3
白蛋白-DNA复合物对肿瘤细胞的特异性捕获研究
取健康人血样1ml，加入红细胞裂解液于37℃下避光裂解15分钟，弃去上清，得到底部细胞，将细胞重悬后加入BT474细胞（乳腺癌细胞）1000个，并加入白蛋白-DNA复合物，共同孵育2h后离心，加入hoechast33342染料活染细胞核15分钟后，洗去未结合探针与染料在共聚焦显微镜下进行拍摄。
如图3所示，分别为Blank对照组，hoechast33342染料组图，FAM荧光组图以及hoechast燃料与Fam荧光联合Merge图，在共聚焦成像下，白蛋白-DNA复合物在血液中识别出肿瘤细胞，即模拟的CTC，验证了本发明白蛋白-DNA复合物对肿瘤细胞特异性捕获。
实施例4
为了验证本发明白蛋白-DNA复合物体内抑制肿瘤转移，发明人设置了白蛋白-DNA分别对血液中CTC以及原位癌转移抑制的试验。
1、对血液中CTC转移抑制试验
取对数生长良好的BT474细胞，在对照组裸鼠中直接尾静脉注射，每只约3*106个细胞，在实验组裸鼠尾静脉注射BT474后，再注射白蛋白-DNA复合物材料，其中对照组注射磷酸缓冲盐溶液（PBS组），实验组分别注射单链的DNA（AP组）、合成的环状DNA（CTA组）、单链DNA-白蛋白（AP-HSA组）、合成的环状DNA-白蛋白（CTA-HSA组）；
各组分别注射20ul浓度10u M材料；
28天之后，解剖裸鼠，取肺部计数转移灶数量；得图4中癌细胞抑制效果示意图（a）及转移灶数量图（b）。
2、对原位癌转移抑制试验
取生长对数良好的BT474细胞，并在裸鼠乳腺下原位接种形成乳腺癌模型，待肿瘤长到3*3*3之后，实验组每隔三天尾静脉注射一次白蛋白-DNA复合物材料，其中对照组注射磷酸缓冲盐溶液（PBS组），实验组分别注射单链的DNA（AP组）、合成的环状DNA（CTA组）、单链DNA-白蛋白（AP-HSA组）、合成的环状DNA-白蛋白（CTA-HSA组）；
各组分别注射20ul浓度10u M材料；
28天之后，解剖裸鼠，取肺部计数转移灶数量。
得图4中的癌细胞抑制效果示意图（c）及转移灶数量图（d）；
如图4中的（b）所示，血液中CTC转移抑制的试验中，PBS对照组转移灶数量为76，AP组52，CTA组26，AP-HSA组42，CTA-HSA组22；CTA-HSA组转移灶数量最低，且明显少于对照组；
如图4中的（d）所示,原位癌转移抑制试验中，PBS对照组转移灶数量为47，AP组40，CTA组38，AP-HSA组34，CTA-HSA组10；CTA-HSA组转移灶数量最低，且明显少于对照组；
验证了白蛋白-DNA复合物能在体内有效的抑制肿瘤转移。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
序列表
<120> 一种白蛋白-DNA复合功能化材料及其制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211>18
<212> RNA
<213> 人工序列（人工序列）
<400> 2
acguaucccu uuucgcgu 18
序列表
<120> 一种白蛋白-DNA复合功能化材料及其制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
acguaucccu uuucgcgu 18

Claims (10)

1.一种白蛋白-DNA复合功能化材料，其特征在于：该白蛋白-DNA复合功能化材料通过偶联剂将白蛋白的功能化巯基/二硫键与DNA表面修饰的官能团连接组装而成；
所述DNA为环状包含三个功能化区域的特异性识别肿瘤细胞的适配体；
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂。
2.根据权利要求1所述的一种白蛋白-DNA复合功能化材料，其特征在于：所述偶联剂为（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
3.一种如权利要求1所述的白蛋白-DNA复合功能化材料的应用，其特征在于：所述白蛋白-DNA复合功能化材料在制备抑制基于循环肿瘤细胞为主要转移途径的肿瘤的转移扩散药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种白蛋白-DNA复合功能化材料的应用，其特征在于：所述白蛋白-DNA复合功能化材料应用于以所述白蛋白-DNA复合功能化材料为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备预防肿瘤细胞转移的产品。
5.根据权利要求3所述的一种白蛋白-DNA复合功能化材料的应用，其特征在于：所述白蛋白-DNA复合功能化材料可通过化学官能团或物理嵌合方式装载药物。
6.一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、合成环状DNA
将等量的三条特异性识别肿瘤细胞的适配体DNA单链进行退火后，缓降至室温，加入连接酶反应时间大于1小时，得环状DNA；
步骤二、合成复合物DNA-偶联剂
按分子量数量小于1∶1的比例取环状DNA与偶联剂，在水溶液中进行DNA与偶联剂的反应，控制溶液pH为7-9，在搅拌条件下反应时间大于0.5h；纯化后即得到复合物DNA-偶联剂；
所述偶联剂为含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与马来酰亚胺的双功能偶联剂；
步骤三、还原白蛋白
白蛋白与巯基还原剂按分子量数量小于1∶1的比例称取，在称取的白蛋白中加入巯基还原剂，将蛋白质二硫键还原成巯基；
步骤四、合成白蛋白-DNA
将DNA-偶联剂与还原后白蛋白在pH6.5-7.5环境下进行反应，反应时间大于0.5h，纯化后即得白蛋白-DNA。
7.根据权利要求6所述一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，其特征在于：所述巯基还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇中的任一种。
8.根据权利要求6所述一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，其特征在于：所述偶联剂为（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或二苯基环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
9.根据权利要求6所述一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，其特征在于：步骤二中所述的环状DNA与偶联剂的比例为1∶50。
10.根据权利要求6所述一种白蛋白-DNA复合功能化材料的制备，其特征在于：步骤三中所述的白蛋白与巯基还原剂的比例为1∶10。
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