JPH07501793A - 合成トランスフェクションベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成トランスフェクションベクター 発明の分野 本発明は、合成トランスフェクンヨンベクターに関する。

本発明は、遺伝子治療の分野にあり、種々の有用な効果を達成するために治療遺 伝子を哺乳動物及びヒト細胞に安全に導入する全く新規な手段の設計及び用途に 関する。

遺伝子工学、核酸調査、クロモシームマツピング、ＤＮＡクローニング及び他の 関連分野での過去２０年にわたる絶え間ない進歩により現代医学は遺伝子治療の 入口まで来た。幾つかの病気は、その病気を起こす生理的機能不全を正すことが できる情報をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの断片を構築することにより処置する ことが可能でありうる。又、農業では、成る動物又は植物の蛋白生成物に幾つか の有益な変化をなすことも可能でありうる。

この分野の進歩での重要な限定因子は、遺伝子がそれらの仕事をすることを開始 できる無傷の生物の細胞にそのような新しい遺伝子を入れることの困難さにある 。幾つかの小さな動物又は植物については、遺伝子は初期胚に含まれる小数の細 胞に導入され、そして複製され最終的に成熟生物の多くの又は全ての細胞に出現 した。しかしながら、この試みは、その病気が受精後、又はもつと一般的には誕 生後に発見されるヒトの子供又は大人の病気を処置することは実行不可能である 。さらに、農業ではこの方法は、多数の大きな動物例えばウシをそのように処置 しようとすると実行するのは非常に高価で困難である。

種々の方法が遺伝子を成熟動物に導入するのに試みられた。これらの方法は裸の ＤＮＡプラスミドの個々の細胞への直接注射、リン酸カルシウムトランスフェク ション技術を再応用する試み、ＤＮＡのりボゾームへの封入、及び一種の感染と して新しいＤＮＡを運ぶことができる模似ウィルスの構築を含む。最大の進歩は 、ＤＮＡを金コロイド粒子にコートし、次いで粒子を高速に加速するために強力 な電磁場にさらし、粒子を組織の細胞型にぶつからせるという一群の技術により なされた。粒子は組織表面を通って突込み、多くの生存ＤＮＡ鎖はそれらの非分 解性金キャリヤーと共に細胞内に達する。皮膚以外の組織に達するために、外科 手術を行い、例えば肝臓の先端をさらし、次いて衝撃を行う。これは、さらされ た組織の表面層だけに接近することになり、明らかに有害で（点状出血が組織表 面に直ちに現れるので）、多量の非分解性金を組織に保持する。

本発明の方法においては、新規なりＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、リポソーム粒子 、核酸結合蛋白及び他の全ての必要な分子がコートされ又はコートされない型の 種々の金属酸化物又は混合金属結晶のいずれか一つの外表面に付着させるか、或 いは適当な大きさの、そして細胞付着分子に表面付着が可能な種々の他の型の生 分解性粒子の表面に付着するか又は体内に含まれるようにする。これらの粒子は 、全ての付着コーティング及び他の表面分子を含む、直径５ないし１００止の範 囲の大きさである。神経及び筋肉細胞に、しかし好ましくは筋肉細胞に結合する 種々の神経吸着分子又は筋肉吸着細胞の１つが表面上に含まれる。

そのような粒子が構築され、次いで通常の経皮的筋肉注射により投与されると、 非常に安全で効果的なトランスフェクション方法が開始する。粒子は、筋肉細胞 の外表面に、及び動物神経細胞の軸索突起末端の外表面に、又は好ましくは筋肉 内知覚軸索突起の樹状突起又は知覚突起に付着する。付着後、粒子は、吸着性エ ンドサイト−シスと呼ばれる自然方法により神経及び筋肉細胞内に摂取される。

本発明者により実施された実験は、筋肉内注射後、そのような粒子の取込みにつ いて驚くべき効率を示した。さらに、特にそのような粒子が鉄塩で作られた場合 、粒子は完全に生分解性である。通常、筋肉に注射された粒状物質はリンパ系に より速やかに清浄化され、そして粒子はりリゾーム小砲に取入れられ、そこでそ れらは直ちに分解性酵素にさらされる。しかしながら、本発明者は、筋肉細胞に よる吸着性エンドサイトーノスの方法が同調すると、注射物質のバルクは神経及 び筋肉細胞内の保護区画に運ばれることを認めた。

多くの細胞は、それらの細胞質区画に現れる異質ＤＮＡ又はＲ，ＮＡを破壊する 手段を有するが、筋肉細胞は入って来る核酸を破壊する効果が唯一ない。このフ ァッションで、及び筋肉的注射の使用により、試薬は筋肉の細胞により与えられ た非常に大きな細胞内容量を入らせることができる。ニューロンによる取込みで は、ニューロンの樹状突起方法の、ニューロン細胞体の調節影響から非常に離れ てＲＮＡからの蛋白合成を実施する自然能力を利用することも可能である。知覚 特異神経吸着分子、例えば神経成長因子の利用は、そこではこれが有効である運 動ニューロンよりもむしろ知覚ニューロンを効果的に選択するのに役立つ。ある 状況では、試薬をを髄神経節に又は近くに注射し、それにより試薬が軸索突起輸 送により運ばれ、神経節中の細胞から知覚突起により刺激された全ての組織に達 するのに有効でありうる。

筋肉細胞の処置又は遺伝子治療生成物が神経突起末端に生成後、神経節シナプス に入れられる処置は、疾病、例えば筋肉ジストロフィー又は特に筋肉に影響を及 ぼす他の病気を処置するのに、或いは神経筋伝達に影響を及ぼす病気を処置する のに特に役立つ。

しかしながら、そのような試薬は、それらが安全に静脈内に注射できるよう十分 に小さいことに注意しなければならない。例えばデキストランによるそれらの潜 在的親水性コーティングのために、本発明者は、そのような試薬について血漿半 減期が循環内で４時間にわたって開始注射物の２５％に達し拡大維持することを 示した。このことは血液骨髄、循環血液及び種々の腺及び組織での極めて種々の 細胞への標的方法を提供する。これらの全ての例で、これらの粒子について適当 な標的分子の選択により種々の有用な細胞型への選択的吸着を生ずるであろう。

選択的に吸着された粒子の食作用の効率が組織内で変わる一方、非常に種々の近 づきやすい細胞内部位がある。金属酸化物コアを通常磁性を示す方法で構築する と、外側の磁場（Ｕ　Ｓ　４．８６９．２４７より）は試薬を標的とするのを助 けるのに用いることができる。

そのような化合物の合成の１例において、粒子への核酸付着は特異的核酸結合蛋 白によりもたらされる。ＤＮＡプラスミド又は鎖は、望ましい処置遺伝子及び選 択された核酸結合蛋白への非常に高い親和性を有する切片の両者を含むよう構築 する。この対合は、プロモノアン固定化技術を用い、付着ＤＮＡ切片を固定うテ ックス粒子に結合することにより最適化できる。種々の核酸結合蛋白及び他の細 胞成分は、次いでそのようなりＮＡ付加ラテックス粒子のために作られたアフイ ニティカラムを通過させる。核酸結合蛋白の特異フラクションを次いで粒子を作 るのに用いるために溶出する。

塩化第二鉄及び第三鉄塩の混合物は、Ｕ　Ｓ　４．４５２．７７３のファッショ ン後、飽和デキストラン溶液に溶解し、７．５％アンモニア溶液の添加により沈 殿させる。

次いで生成物をセファデックス１５０カラム濾過により０．１Ｍ酢酸塩緩衝液ｐ Ｈ６，４に移し、アミコン・セントリブシブ３０限外濾過により濃縮し、セファ クリル２００の２．５ｃｍと２０ｃｏ＋のカラムを通過させてゼラチン状含水酸 化物及び過剰のデキストランを除く。

次いで粒子を２００ｒ＋ａ＋及び１００止で濾過し、次に２０ｍＭ　Ｎａ１０． 中で緩やかに酸化する。Ｎａ１Ｏ４をＰＤ−１０セフアデツクスカラムで除き、 同一カラムを用い粒子をｐＨｓ、ｏホウ酸塩緩衝液に移す。神経吸着分子、例え ば小麦胚芽凝集素又はトランスフェリン又は活性部位の適当なブロッキングを伴 う神経成長因子（塩化Ｃａ及びＭｎ）及び活性部位をブロツクスするための小さ い核酸断片を伴う適当な核酸結合蛋白を、次いで８ないし１２時間粒子とインキ ュベートする。

このあと残っている活性部位は、さらに２時間ＩＭグリシンを加えることにより ブロックする。共有結合を還元後、粒子は未反応グリシン、ＮａＢＨ４及び全て の溶解鉄塩を除（ことにも役立つＰＤ−１０カラムを通してＨＥＰＥＳ２０＋ａ ＭｐＨ７，４緩衝液に移す。生成物をＨＥＰＥＳ緩衝液に希釈し、次いでアミコ ン・セントリブシブ１００限外濾過で再び濃縮して未結合蛋白を除くのに役立た せ、次いでセファクリル２００又は他のセファクリルサイズカラムを通過させて 付加的な未反応蛋白を除く。

これらのカラムからの産生物をアミコン・セントリブレブー１００限外濾過によ り再び濃縮し、二進アフィニティ精製に付す。第−巡は、筋肉表面又は神経表面 又は他の望ましい細胞表面マーカーを運ぶカラム上である。本ファ・ソンヨンで 望ましい標的細胞に付着しないであろう全ての粒子を除去する。親和性フラクシ ョンを溶出し、希釈し再び濃縮し、そして今や粒子表面に連結した核酸結合蛋白 により認識される固定化ＤＮＡ断片によるカラムに対する第ニアフィニティ精製 に付す。

第二親和性段階の高精製生成物をＨＥＰＥＳ２０ｍＭｐＨ７，４に希釈し、アミ コン・セントリブレブー１００又は同様の限外濾過器で再び濃縮し、次いで導出 される遺伝物質に暴露する。混合プラスミド又は鎖を用いる場合は、結合蛋白は ＤＮＡの結合蛋白と相互に作用し、大きな核酸分子はＤＮＡの結合蛋白と共に問 題の活性遺伝子を運ぶ。問題のＲＮＡ又はＤＮＡの遺伝子又は切片に直接結合す る核酸結合蛋白が入手しつる場合は、そのような結合蛋白を用いることも可能で ある。

結合したＤＮＡを伴う粒子は、所望によりセファクリルカラムを通過させて未結 合核酸を除き、すぐにも筋肉内注射のために濃縮及び適当な生理溶液に希釈でき る。そして試薬を筋肉に注射し、それにより付着及びエンドサイトーンスの自然 方法は選択された細胞型への遺伝子トランスフェクションを完了する。

調製の他の例において、イオン塩の最初の沈殿を、何れのコーティングデキスト ラン又は他の分子をも存在させることなく、アンモニア溶液に滴加することによ り行う。得られる懸濁液を遠心機中、５００ｇで１０分間回転して、ペレットを 洗浄し、蒸留水に再び督濁し、次いでこの方法を繰り返すが０．０ＩＮＨＣ１で 洗浄する。得られる安定なコロイドを次いで付着分子蛋白、核酸鎖及び／又は核 酸結合蛋白の混合物に暴露する。緩やかに非磁気撹拌しつつ１時間インキュベー ションの後、粒子上に残っている反応性部位をデキストラン又はアルブミン蛋白 の添加によりブロックする。次いで粒子をセファデクス１５０及びセファクリル ２００カラムを通し、次いで例えば親和性標識化アガロース、セファロース又は ラテックスビーズのカラムを用いる細胞付着分子の手段によりアフイニテイ精製 する。

調製のさらに別の例では、最初の沈殿は非常に強い緩衝剤の溶液、例えば１モル 又はそれ以上の濃度のＨＥＰＥＳ又はトリスを７，４のｐＨで調製することによ り実施する。核酸、何れかの望ましいデキストラン及び又は標的蛋白並びに核酸 結合蛋白を、この最初の強緩衝液に直接添加する。水性溶液中、又はデキストラ ン及び／又は蛋白及び／又は核酸を含む溶液中に溶解した第二鉄又は第三鉄イオ ン塩の混合物を次いで緩衝液に滴加する。本ファッションにおいて、粒子が厳格 な緩衝溶液中に形成し、非常に多くのもろい蛋白及びペプチド分子を粒子被覆を 形成するのにもちいることができ、そのような分子は、リポヌクレオ蛋白又はリ ポソーム蛋白を標的とし、又は導入するのに、或はＤＮＡ又はＲＮＡと共に転写 シグナル又は現実の転写メカニズム蛋白の他の局面に、必要である。次いで本沈 殿反応の生成物は、必要ならばさらにデキストラン又はアルブミンでブロックし 、ついでセファデクス１５０、セファクリル２００、アミコン限外濾過及び上述 のようなアフィニティカラムにより精製する。

合成のさらに別の形では、核酸結合蛋白は用いず、細胞表面付着分子のみを用い る。核酸結合蛋白の代わりに、問題の核酸の相補断片を、ブロモシアン又は他の 型の結合反応により或いは未被覆粒子型への付着により、粒子に結合させる。

次いで問題の遺伝子を、結合した相補断片との相互作用により粒子に付着させ、 その後で精製段階を上記のように実施する。

まとめると、本発明は、合成トランスフェリンヨン剤、核酸を含まない相応する ベクター及びその成分の全ての組合せを提供する。合成トランスフェクション剤 は、ウィルスと同様の大きさの種々のセラミック金属酸化物粒子の一つの沈殿に 基づくことが認識されるであろう。金属酸化物粒子は、沈殿工程の間に、デキス トラン又は他の生物学的に許容しうる（ｔｏｌｅｒａｂｌｅ）ポリマーでコート する。化学的に、基本構造は、磁気共鳴対照剤として通例の使用で、薬物と類似 である。

デキストラン又は粒子の他のコーティング剤は、種々の他の型の分子が次いで共 有結合する枠組みとして用いられる。典型的には標的分子、例えば抗体又は抗体 断片、或いは幾つかの他の有用細胞付着分子を用いる。これにより粒子を一定の 望ましい細胞型、例えばｇｐ１２０断片に選択的に付着させ、ＣＤ４陽性細胞へ の付着を促進する。標的分子に加えて、核酸結合蛋白又は短いｃＤＮＡ配列をデ キストランコートに付着させることも可能である。このファッションにおいて、 粒子を適当な核酸結合蛋白及び標的分子により生成でき、続いて治療ＤＮＡを積 め込むことができる。

血管内投与については、粒子の大きさは血清半減期及び行先きを決定する。大き な粒子は貧食作用により細胞内皮系では除かれる傾向があり、−カルさな粒子は それらの標的分子によってより完全に定められた目的を達する。

これらの粒子は、又、筋肉内に投与することもでき、そこでそれらは筋肉細胞に 侵入することができ筋肉の神経末端によって取入れられ、続いて末梢から中枢神 経系の神経細胞体に向かって軸索突起輸送に付すことができる。このファッショ ンでヘルペスウィルスの投与進路をミミックし、筋肉内注射を神経系の選択され た部分に治療目的のために血液−脳バリヤーを通ってＤＮＡを伝えるのに用いる ことができる。軸索突起輸送経路は、又軸索突起を並べるシュワン細胞に対する 評価をも提供する。

さらに肺投与のためのエアゾール形の粒子を提供することも可能である。静脈内 投与を含む種々の他の経路の投与も可能である。

粒子キャリヤーは、血管内及び吸入経路を通って細胞内皮系統を含む疾病を処置 するのに、又、経口経路により粘膜細胞を処置するのに、そして筋肉細胞への接 近のための筋肉内注射に適する。神経内経路を経由してＣＮＳ及び神経節に近づ くことは筋肉内及び腹腔内注射によって与えられる。

粒子は、ヒトマクロファージ、Ｔ細胞及び骨形成肉腫細胞により摂食されること 、及び４時間後衛環内に残っている注射投与量の２５％の、ウサギの血流から粒 子の遅いクリアランスがあることを示した。粒子はデキストランで被覆し、核酸 結合蛋白として抗ＣＤ４及びＤＮＡポリメラーゼの両者に接合し、続いて粒子表 面に暴露しＤＮＡプラスミドを取込む。粒子は又、デキストランでよりもＤＮＡ で直接被覆しつる。

粒子は、それらがインビボで実質的に害のない物質に分解できるという意味で生 分解性である。従って、例えば異種物質、例えば金粒子は何年かのちに無傷であ ることが判るが、一方、鉄酸化物粒子は直ちに酸素七鉄に分解し、この両者はも ちろん細胞中に自然に豊富に存在し、そして正常な細胞式ｉ１、貯蔵及び再使用 に関与する。鉄は大量存在する場合、毒性の幾らかのリスクをもたらす。フェラ イトの潜在的毒性は、それらが成分鉄を処理する細胞の能力よりも速くない速度 でゆっくりと分解することを確かめることにより減少する。粒子の崩壊速度の延 長は、元の製品が全体の大きさ及び化学成分においてフェライトと類似であるが 非常に速やかに分解する鉄の含水酸化物のないことを確認することにより達成で きる。加えて、フェライトの安定性を改良することができる他の成分、例えばパ ラジウム（これは金と異なり元素形で水溶性である）に浸漬することにより、分 解の速度を遅らせることができる。

本明細書で開示したセラミック粒子に基づ（系統は、望まないウィルス遺伝子の 感染又は導入のリスクがないということで種々のウィルスベクターよりも利点を 有する。それは粒子が生分解性であるということで金コロイド粒子よりも利点を 有する。さらに、それらが蛋白に共有結合しうる被膜を有しつるので、これらの 粒子は激烈さが少なくより伝統的な医薬経路を経由して体内に注射できる。種々 の蛋白及び酵素を粒子表面に結合できる便利さにより、それらは簡単な脂質球よ りも送達剤（ｄｅｌｉｖｅｒｅｙ　ａｇｅｎｔ）としてはるかに適応性のある複 合体となる。

本発明において用いられる場合、粒子の大きさのためにそれらはＤＮＡを負荷す る前に濾過滅菌及びアフィニティクロマトグラフィに付すことができる。これは 粒子キャリヤーをＤＮＡと関係な（売ることができ、多くの種々の応用に便利な 合成ベクターとして役立つことができることを意味する。金属酸化物コアを注射 活性エミッターで標識するのにも便利であり、これはそれらの分布を追跡するの に有用である。治療用送達のための無機金属酸化物粒子の調製はＷＯ−Ａ−９２ ０４９１６に記載される。以下に示す説明に役立つ実施例において、粒子の調製 により、望ましい均一性を与え望ましい遅い代謝に逆に影響しつる水溶性物質を 無（す。実施例はカラムクロマトグラフィを除き、代わりに遠心濃縮機の使用に 置き換え、対応するＮａＣ１溶出緩衝液も省略する。ＥＤＴＡは最初の洗浄段階 で用いる緩衝液中、キレート剤として用いる。これは明らかに鉄を含水酸化物中 に溶解するが、よく形成されたフェライトは溶解しない。その結果、低毒性の安 定且つ均一な粒子調製品となる（というのはそれは実質的に純情なセラミック調 製品であるから）。

実施例 ２回蒸留した水（脱イオン化しない）を反応混合物を作るのに用いる。以下の段 階を実施する。

１．５ｍｌの３３％ＮＨ３を４．５ｍｌの熱ｄ　Ｈ２０に加え（７，５％ＮＨ４ ＯＨを作る）、水浴中ふたをした万能試験管内に入れ６０℃にして保持する。

１．２５ｇのデキストラン（ＭＷｌｏ、　０００）を２．０ｍｌのｄＨ！Ｏに溶 解し、次いで２２５＋ａｇのＦｅＣ１，・６Ｈ７０をデキストラン溶液に溶解す る。別法として三価ランタニドクロリドを１０ないし５０％のＦｅＣ１，と置き 換えつる。これを用いる場合、続く反応後のインキュベーションは２時間に及ぶ 。

１００ｍｇのＦｅＣ１，・４Ｈ，ＯをＦｅ＠／デキストラン溶液に溶解し、次い で混合物を６０℃水浴中に２分間置き、その後で６ｍｌの熱７，５％ＮＨｓ溶液 （６０℃）を徐々に加えはじめる。生成物を６０℃の水浴中に１５分間放置する 。

反応生成物（デキストラン被覆フェライト）を１．０００　ｇで１０分間回転し 、全ての沈殿を除く。この工程を繰り返して３回の遠心を完全に行い、次いで上 清を５＋Ｍ　ＥＤＴＡを含む０，１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６，８で平衡化した ＰＤ−１０カラムに適用する。

黒い溶出フラクションをＥＤＴＡ／酢酸塩緩衝液で１：３に希釈し、次いでアミ コン・セントリブレブー１００限外濾過器により初めの容量の１／１０に濃縮す る。次いで残留物をＥＤＴＡ／酢酸塩緩衝液で１：１０に希釈し、次いでＣ−１ ００限外濾過器により１．５ｉ１の容量に濃縮する。

０、３０ｍｌの２０ｍＭ　Ｎａｌ０イを撹拌しながらデキストランフェライト溶 液（約１．５ｍ１）に加え、次いで暗所で室温下、６００分間置かにかき回し又 は振盪する。

６０分間の過ヨード酸塩インキュベーションの終了時に、反応混合物を２０ｍＭ ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＰＤ−１０カラムに適用することに より反応を終了させる。

活性部位遮断溶液を、ＷＧＡ結合結合用応用００ｍＭ　ＭｎＣ１，／ＣａＣ１□ を用い調製する。別法として、例えば子ウシ胸腺ＤＮＡは、保護されるべき蛋白 活性部位が核酸結合蛋白上にある場合に用いることができる。

１０ｍｇの蛋白（例えばデオキリボヌクレアーゼフリーのＤＮＡｐｏｌｌ、フレ ノウ断片、インテグラーゼ、続く翻訳段階に有用な蛋白、核酸遮断蛋白及び抗Ｃ Ｄ４、ＷＧＡ又は他の細胞標的蛋白）を、室温で５００μｍの２０ｍＭホウ酸Ｎ ａ緩衝液、ｐＨ８，５に溶解する。蛋白溶液はホウ酸塩緩衝液で１２１１１に希 釈し、次いでセントリブレブー１０濃縮器により濃縮し、ＤＴＴ、グリセロール 、ＮａＮ３及び他の望ましくない蓄積付加物を除去することができる。

１０μｍの遮断溶液を蛋白／ホウ酸溶液に加え、次いで２．０１１１１の酸化磁 鉄鉱デキストランを５００β１の蛋白／ホウ酸塩溶液と混合する。２０ｐｌの遮 断溶液をピペットで２．５ｍｌ蛋白−デキストラン−磁鉄鉱混合物に加え、よく 混合し次いで緩やかにかき回し又は振盪する容器中、室温で６−１８時間インキ ュベートする。

インキュベーション後、１００μｍの領５Ｍグリシンを反応混合物に加え、さら に２時間インキュベートする。次いで２５０μＩの０．２５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｂ　 Ｈ４を磁鉄鉱−デキストラン−蛋白溶液に加え、間欠的に振盪しながら６０分間 放置してＨ２ガスを放出させる。インキュベーションの終了時に、反応混合物を ２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４で平衡化したＰＤ−１０カラムを通過させ る。溶出液をＨＥＰＥＳ緩衝液で１＝５に希釈し、次いでセントリブレブー１０ ０限外濾過器で濃縮する。

アフィニティー精製段階は選択的であり、詳細はＷＧＡ（レクチン）標的蛋白と の使用により与えられる。最終残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をアフィニティー カラム（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）に適用し、ＨＥＰＥＳで洗浄し、次Ｌ’でＨＥ ＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４中、ＩＭ　ＮＡｃＧｌｕにより特異的溶出を実施する。

特異的溶出物はＨＥＰＥＳで平衡化したＰＤ−１０カラムを通過させ、ＮＡｃＧ ｌｕ、Ｍｎ及びＣａを除く。

脱塩溶出物をＨＥＰＥＳ緩衝液で２４ｍ１の容量に希釈し、セントリブレブー１ ００濃縮器で濃縮する。最終残留物を０．２２μｍ遠心ミクロフィルター中、５ ０ｏｈで１時間回転することにより滅菌する。

精製滅菌合成ベクター粒子は、工ないし２週間以内に使用するために４℃で蓄え ることができる。それらは凍結又は凍結乾燥すべきでない。

問題のＤＮＡによるＤＮＡ付着はトランスフェクションの前に直ちに行うことが できる。粒子溶液は、緩やかにかき回し又は振盪しながら、６ないし２４時間、 問題のＤＮＡとインキュベートする。

実験又は治療プロトコールに従って、ＤＮＡ負荷ベクター溶液は、次いで１１ｇ ／ｍｌ　（約５ｍＭ　Ｆｅ）の合成ベクターの濃度で細胞培養に適用しつる（製 造の最終生成物は２５−５０ｍｇの合成ベクターである）。効率を評価するため に、非吸着溶液と比較しうる。別法としてＤＮＡ負荷合成ベクターを１１０−１ Ｏ０ａ濃度でインビボ使用のため、静脈内又は筋肉内経路により投与しつる。非 沈殿磁気基本分離技術を粒子から未結合ＤＮＡを分離するのに用いることができ る。小さなりＮＡ分子を用いた場合、分離はセントリブレブー１００の濃縮器で 行うことができる。

１ｍ＋＋＋＋＋＋＋ム１．賜　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１７０３

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞結合成分及び核酸が結合する無機粒子を含む、細胞に核酸を送達するの に適応される、生理的に許容しうる試薬。
2. ２．粒子が生分解性の金属酸化物又は塩である、請求項１の試薬。
3. ３．粒子がポリマーコーチングを有する請求項１又は請求項２の試薬。
4. ４．コーチングが生分解性である、請求項３の試薬。
5. ５．粒子が５ないし１００ｎｍの大きさである、全ての先行請求項の試薬。
6. ６．粒子が磁化できる、全ての先行請求項の試薬。
7. ７．ヌクレアーゼ阻害剤をさらに含む、全ての先行請求項の試薬。
8. ８．阻害剤が第３族イオンである、請求項７の試薬。
9. ９．核酸結合蛋白をさらに含む、全ての先行請求項の試薬であって、核酸は蛋白 に対し、親和性を有する配列を含む。
10. １０．核酸が粒子に結合した相補型配列を経由して結合する、請求項１ないし８ のいずれかの試薬。
11. １１．粒子が均一及び／又は実質的に水溶性物質フリーである、全ての先行請求 項の試薬。
12. １２．治療での使用のための全ての先行請求項の試薬。
13. １３．全ての先行請求項の試薬及び生理的に許容しうる希釈液を含む注射可能な 組成物。
14. １４．被覆粒子及び結合した細胞結合成分を含むが請求項１ないし１１のいずれ かで定義された核酸は含まない生理的に許容しうるベクター。
15. １５．遺伝子治療に用いる医薬の製造のための請求項１ないし１１のいずれかの 試薬の用途。