JP3560969B2 - 合成トランスフェクションベクター - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、合成トランスフェクションベクターに関する。
本発明は、遺伝子治療の分野にあり、種々の有用な効果を達成するために治療遺伝子を哺乳動物及びヒト細胞に安全に導入する全く新規な手段の設計及び用途に関する。
遺伝子工学、核酸調査、クロモゾームマッピング、DNAクローニング及び他の関連分野での過去20年にわたる絶え間ない進歩により現代医学は遺伝子治療の入口まで来た。幾つかの病気は、その病気を起こす生理的機能不全を正すことができる情報をコードするDNA又はRNAの断片を構築することにより処置することが可能でありうる。又、農業では、或る動物又は植物の蛋白生成物に幾つかの有益な変化をなすことも可能でありうる。
この分野の進歩での重要な限定因子は、遺伝子がそれらの仕事をすることを開始できる無傷の生物の細胞にそのような新しい遺伝子を入れることの困難さにある。幾つかの小さな動物又は植物については、遺伝子は初期胚に含まれる小数の細胞に導入され、そして複製され最終的に成熟生物の多くの又は全ての細胞に出現した。しかしながら、この試みは、その病気が受精後、又はもっと一般的には誕生後に発見されるヒトの子供又は大人の病気を処置することは実行不可能である。さらに、農業ではこの方法は、多数の大きな動物例えばウシをそのように処置しようとすると実行するのは非常に高価で困難である。
種々の方法が遺伝子を成熟動物に導入するのに試みられた。これらの方法は裸のDNAプラスミドの個々の細胞への直接注射、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を再応用する試み、DNAのリポゾームへの封入、及び一種の感染として新しいDNAを運ぶことができる模似ウイルスの構築を含む。最大の進歩は、DNAを金コロイド粒子にコートし、次いで粒子を高速に加速するために強力な電磁場にさらし、粒子を組織の細胞壁にぶつからせるという一群の技術によりなされた。粒子は組織表面を通って突込み、多くの生存DNA鎖はそれらの非分解性金キャリヤーと共に細胞内に達する。皮膚以外の組織に達するために、外科手術を行い、例えば肝臓の先端をさらし、次いで衝撃を行う。これは、さらされた組織の表面層だけに接近することになり、明らかに有害で(点状出血が組織表面に直ちに現れるので)、多量の非分解性金を組織に保持する。
本発明の方法においては、新規なDNA、RNA、プラスミド、リボソーム粒子、核酸結合蛋白及び他の全ての必要な分子がコートされ又はコートされない型の種々の金属酸化物又は混合金属結晶のいずれか一つの外表面に付着させるか、或いは適当な大きさの、そして細胞付着分子に表面付着が可能な種々の他の型の生分解性粒子の表面に付着するか又は体内に含まれるようにする。これらの粒子は、全ての付着コーティング及び他の表面分子を含む、直径5ないし100nmの範囲の大きさである。神経及び筋肉細胞に、しかし好ましくは筋肉細胞に結合する種々の神経吸着分子又は筋肉吸着細胞の1つが表面上に含まれる。
そのような粒子が構築され、次いで通常の経皮的筋肉注射により投与されると、非常に安全で効果的なトランスフェクション方法が開始する。粒子は、筋肉細胞の外表面に、及び動物神経細胞の軸索突起末端の外表面に、又は好ましくは筋肉内知覚軸索突起の樹状突起又は知覚突起に付着する。付着後、粒子は、吸着性エンドサイト−シスと呼ばれる自然方法により神経及び筋肉細胞内に摂取される。
本発明者により実施された実験は、筋肉内注射後、そのような粒子の取込みについて驚くべき効率を示した。さらに、特にそのような粒子が鉄塩で作られた場合、粒子は完全に生分解性である。通常、筋肉に注射された粒状物質はリンパ系により速やかに清浄化され、そして粒子はリソゾーム小胞に取入れられ、そこでそれらは直ちに分解性酵素にさらされる。しかしながら、本発明者は、筋肉細胞による吸着性エンドサイト−シスの方法が同調すると、注射物質のバルクは神経及び筋肉細胞内の保護区画に運ばれることを認めた。
多くの細胞は、それらの細胞質区画に現れる異質DNA又はRNAを破壊する手段を有するが、筋肉細胞は入って来る核酸を破壊する効果が唯一ない。このファッションで、及び筋肉内注射の使用により、試薬は筋肉の細胞により与えられた非常に大きな細胞内容量を入らせることができる。ニューロンによる取込みでは、ニューロンの樹状突起方法の、ニューロン細胞体の調節影響から非常に離れてRNAからの蛋白合成を実施する自然能力を利用することも可能である。知覚特異神経吸着分子、例えば神経成長因子の利用は、そこではこれが有効である運動ニューロンよりむしろ知覚ニューロンを効果的に選択するのに役立つ。ある状況では、試薬を脊髄神経節に又は近くに注射し、それにより試薬が軸索突起輪送により運ばれ、神経節中の細胞から知覚突起により刺激された全ての組織に達するのに有効でありうる。
筋肉細胞の処置又は遺伝子治療生成物が神経突起末端に生成後、神経節シナプスに入れられる処置は、疾病、例えば筋肉ジストロフィー又は特に筋肉に影響を及ぼす他の病気を処置するのに、或いは神経筋伝達に影響を及ぼす病気を処置するのに特に役立つ。
しかしながら、そのような試薬は、それらが安全に静脈内に注射できるよう十分に小さいことに注意しなければならない。例えばデキストランによるそれらの潜在的親水性コーティングのために、本発明者は、そのような試薬について血漿半減期が循環内で4時間にわたって開始注射物の25%に達し拡大維持することを示した。このことは血液骨髄、循環血液及び種々の腺及び組織での極めて種々の細胞への標的方法を提供する。これらの全ての例で、これらの粒子について適当な標的分子の選択により種々の有用な細胞型への選択的吸着を生ずるであろう。選択的に吸着された粒子の食作用の効率が組織内で変わる一方、非常に種々の近づきやすい細胞内部位がある。金属酸化物コアを通常磁性を示す方法で構築すると、外側の磁場(US 4,869,247より)は試薬を標的とするのを助けるのに用いることができる。
そのような化合物の合成の1例において、粒子への核酸付着は特異的核酸結合蛋白によりもたらされる。DNAプラスミド又は鎖は、望ましい処置遺伝子及び選択された核酸結合蛋白への非常に高い親和性を有する切片の両者を含むよう構築する。この対合は、ブロモシアン固定化技術を用い、付着DNA切片を固定ラテックス粒子に結合することにより最適化できる。種々の核酸結合蛋白及び他の細胞成分は、次いでそのようなDNA付加ラテックス粒子のために作られたアフィニティカラムを通過させる。核酸結合蛋白の特異フラクションを次いで粒子を作るのに用いるために溶出する。
塩化第1鉄及び第2鉄の混合物は、US 4,452,773のファッション後、飽和デキストラン溶液に溶解し、7.5%アンモニア溶液の添加により沈殿させる。次いで生成物をセファデックス150カラム濾過により0.1M酢酸塩緩衝液pH6.4に移し、アミコン・セントリプレプ30限外濾過により濃縮し、セファクリル200の2.5cmと20cmのカラムを通過させてゼラチン状含水酸化物及び過剰のデキストランを除く。
次いで粒子を200nm及び100nmで濾過し、次に20mM NaIO4中で緩やかに酸化する。NaIO4をPD−10セファデックスカラムで除き、同一カラムを用い粒子をpH8.0ホウ酸塩緩衝液に移す。神経吸着分子、例えば小麦胚芽凝集素又はトランスフェリン又は活性部位の適当なブロッキングを伴う神経成長因子(塩化Ca及びMn)及び活性部位をブロックスするための小さい核酸断片を伴う適当な核酸結合蛋白を、次いで8ないし12時間粒子とインキュベートする。このあと残っている活性部位は、さらに2時間1Mグリシンを加えることによりブロックする。共有結合を還元後、粒子は未反応グリシン、NaBH4及び全ての溶解鉄塩を除くことにも役立つPD−10カラムを通してHEPES20mM pH7.4緩衝液に移す。生成物をHEPES緩衝液に希釈し、次いでアミコン・セントリプレプ100限外濾過で再び濃縮して未結合蛋白を除くのに役立たせ、次いでセファクリル200又は他のセファクリルサイズカラムを通過させて付加的な未反応蛋白を除く。
これらのカラムからの産生物をアミコン・セントリプレプ−100限外濾過により再び濃縮し、二巡アフィニティ精製に付す。第一巡は、筋肉表面は神経表面又は他の望ましい細胞表面マーカーを運ぶカラム上である。本ファッションで望ましい標的細胞に付着しないであろう全ての粒子を除去する。親和性フラクションを溶出し、希釈し再び濃縮し、そして今や粒子表面に連結した核酸結合蛋白により認識される固定化DNA断片によるカラムに対する第二アフィニティ精製に付す。
第二親和性段階の高精製生成物をHEPES20mM pH7.4に希釈し、アミコン・セントリプレプ−100又は同様の限外濾過器で再び濃縮し、次いで導出される遺伝物質に暴露する。混合プラスミド又は鎖を用いる場合は、結合蛋白はDNAの結合蛋白と相互に作用し、大きな核酸分子はDNAの結合蛋白と共に問題の活性遺伝子を運ぶ。問題のRNA又はDNAの遺伝子又は切片に直接結合する核酸結合蛋白が入手しうる場合は、そのような結合蛋白を用いることも可能である。
結合したDNAを伴う粒子は、所望によりセファクリルカラムを通過させて未結合核酸を除き、すぐにも筋肉内注射のために濃縮及び適当な生理溶液に希釈できる。そして試薬を筋肉に注射し、それにより付着及びエンドサイト−シスの自然方法は選択された細胞型への遺伝子トランスフェクションを完了する。
調製の他の例において、イオン塩の最初の沈殿を、何れのコーティングデキストラン又は他の分子をも存在させることなく、アンモニア溶液に滴加することにより行う。得られる懸濁液を遠心機中、500gで10分間回転して、ペレットを洗浄し、蒸留水に再び懸濁し、次いでこの方法を繰り返すが0.01NHClで洗浄する。得られる安定なコロイドを次いで付着分子蛋白、核酸鎖及び/又は核酸結合蛋白の混合物に暴露する。緩やかに非磁気撹拌しつつ1時間インキュベーションの後、粒子上に残っている反応性部位をデキストラン又はアルブミン蛋白の添加によりブロックする。次いで粒子をセファデクス150及びセファクリル200カラムを通し、次いで例えば親和性標識化アガロース、セファロース又はラテックスビーズのカラムを用いる細胞付着分子の手段によりアフィニティ精製する。
調製のさらに別の例では、最初の沈殿は非常に強い緩衝剤の溶溶、例えば1モル又はそれ以上の濃度のHEPES又はトリスを7.4のpHで調製することにより実施する。核酸、何れかの望ましいデキストラン及び又は標的蛋白並びに核酸結合蛋白を、この最初の強緩衝液に直接添加する。水性溶液中、又はデキストラン及び/又は蛋白及び/又は核酸を含む溶液中に溶解した第二鉄又は第三鉄イオン塩の混合物を次いで緩衝液に滴加する。本ファッションにおいて、粒子が厳格な緩衝溶液中に形成し、非常に多くのもろい蛋白及びペプチド分子を粒子被覆を形成するのにもちいることができ、そのような分子は、リボヌクレオ蛋白又はリボソーム蛋白を標的とし、又は導入するのに、或いはDNA又はRNAと共に転写シグナル又は現実の転写メカニズム蛋白の他の局面に、必要である。次いで本沈殿反応の生成物は、必要ならばさらにデキストラン又はアルブミンでブロックし、ついでセファデクス150、セファクリル200、アミコン限外濾過及び上述のようなアフィニティカラムにより精製する。
合成のさらに別の形では、核酸結合蛋白は用いず、細胞表面付着分子のみを用いる。核酸結合蛋白の代わりに、問題の核酸の相補断片を、ブロモシアン又は他の型の結合反応により或いは未被覆粒子型への付着により、粒子に結合させる。次いで問題の遺伝子を、結合した相補断片との相互作用により粒子に付着させ、その後で精製段階を上記のように実施する。
まとめると、本発明は、合成トランスフェクション剤、核酸を含まない相応するベクター及びその成分の全ての組合せを提供する。合成トランスフェクション剤は、ウイルスと同様の大きさの種々のセラミック金属酸化物粒子の一つの沈殿に基づくことが認識されるであろう。金属酸化物粒子は、沈殿工程の間に、デキストラン又は他の生物学的に許容しうる(tolerable)ポリマーでコートする。化学的に、基本構造は、磁気共鳴対照剤として通例の使用で、薬物と類似である。
デキストラン又は粒子の他のコーティング剤は、種々の他の型の分子が次いで共有結合する枠組みとして用いられる。典型的には標的分子、例えば抗体又は抗体断片、或いは幾つかの他の有用細胞付着分子を用いる。これにより粒子を一定の望ましい細胞型、例えばgp120断片に選択的に付着させ、CD4陽性細胞への付着を促進する。標的分子に加えて、核酸結合蛋白又は短いcDNA配列をデキストランコートに付着させることも可能である。このファッションにおいて、粒子を適当な核酸結合蛋白及び標的分子により生成でき、続いて治療DNAを積め込むことができる。
血管内投与については、粒子の大きさは血清半減期及び行先きを決定する。大きな粒子は貧食作用により細胞内皮系では除かれる傾向があり、一方小さな粒子はそれらの標的分子によってより完全に定められた目的を達する。
これらの粒子は、又、筋肉内に投与することもでき、そこでそれらは筋肉細胞に侵入することができ筋肉の神経末端によって取入れられ、続いて末梢から中枢神経系の神経細胞体に向かって軸索突起輪送に付すことができる。このファッションでヘルペスウイルスの投与進路をミミックし、筋肉内注射を神経系の選択された部分に治療目的のために血液−脳バリヤーを通ってDNAを伝えるのに用いることができる。軸索突起輪送経路は、又軸索突起を並べるシュワン細胞に対する評価をも提供する。
さらに肺投与のためのエアゾール形の粒子を提供することも可能である。静脈内投与を含む種々の他の経路の投与も可能である。
粒子キャリヤーは、血管内及び吸入経路を通って細胞内皮系統を含む疾病を処置するのに、又、経口経路により粘膜細胞を処置するのに、そして筋肉細胞への接近のための筋肉内注射に適する。神経内経路を経由してCNS及び神経節に近づくことは筋肉内及び腹腔内注射によって与えられる。
粒子は、ヒトマクロファージ、T細胞及び骨形成肉腫細胞により摂食されること、及び4時間後循環内に残っている注射投与量の25%の、ウサギの血流から粒子の遅いクリアランスがあることを示した。粒子はデキストランで被覆し、核酸結合蛋白として抗CD4及びDNAポリメラーゼの両者に接合し、続いて粒子表面に暴露しDNAプラスミドを取込む。粒子は又、デキストランでよりもDNAで直接被覆しうる。
粒子は、それらがインビボで実質的に害のない物質に分解できるという意味で生分解性である。従って、例えば異種物質、例えば金粒子は何年かのちに無傷であることが判るが、一方、鉄酸化物粒子は直ちに酸素と鉄に分解し、この両者はもちろん細胞中に自然に豊富に存在し、そして正常な細胞代謝、貯蔵及び再使用に関与する。鉄は大量存在する場合、毒性の幾らかのリスクをもたらす。フェライトの潜在的毒性は、それらが成分鉄を処理する細胞の能力よりも速くない速度でゆっくりと分解することを確かめることにより減少する。粒子の崩壊速度の延長は、元の製品が全体の大きさ及び化学成分においてフェライトと類似であるが非常に速やかに分解する鉄の含水酸化物のないことを確認することにより達成できる。加えて、フェライトの安定性を改良することができる他の成分、例えばパラジウム(これは金と異なり元素形で水溶性である)に浸漬することにより、分解の速度を遅らせることができる。
本明細書で開示したセラミック粒子に基づく系統は、望まないウイルス遺伝子の感染又は導入のリスクがないということで種々のウイルスベクターよりも利点を有する。それは粒子が生分解性であるということで金コロイド粒子よりも利点を有する。さらに、それらが蛋白に共有結合しうる被膜を有しうるので、これらの粒子は激烈さが少なくより伝統的な医薬経路を経由して体内に注射できる。種々の蛋白及び酵素を粒子表面に結合できる便利さにより、それらは簡単な脂質球よりも送達剤(deliverey agent)としてはるかに適応性のある複合体となる。
本発明において用いられる場合、粒子の大きさのためにそれらはDNAを負荷する前に濾過滅菌及びアフィニティクロマトグラフィに付すことができる。これは粒子キャリヤーをDNAと関係なく得ることができ、多くの種々の応用に便利な合成ベクターとして役立つことができることを意味する。金属酸化物コアを注射活性エミッターで標識するのにも便利であり、これはそれらの分布を追跡するのに有用である。治療用送達のための無機金属酸化物粒子の調製はWO−A−9204916に記載される。以下に示す説明に役立つ実施例において、粒子の調製により、望ましい均一性を与え望ましい遅い代謝に逆に影響しうる水溶性物質を無くす。実施例はカラムクロマトグラフィを除き、代わりに遠心濃縮機の使用に置き換え、対応するNaCl溶出緩衝液も省略する。EDTAは最初の洗浄段階で用いる緩衝液中、キレート剤として用いる。これは明らかに鉄を含水酸化物中に溶解するが、よく形成されたフェライトは溶解しない。その結果、低毒性の安定且つ均一な粒子調製品となる(というのはそれは実質的に純精なセラミック調製品であるから)。
実施例
2回蒸留した水(脱イオン化しない)を反応混合物を作るのに用いる。以下の段階を実施する。
1.5mlの33%NH3を4.5mlの熱dH2Oに加え(7.5%NH4OHを作る)、水浴中ふたをした万能試験管内に入れ60℃にして保持する。
1.25gのデキストラン(MW10,000)を2.0mlのdH2Oに溶解し、次いで225mgのFeCl3・6H2Oをデキストラン溶液に溶解する。別法として三価ランタニドクロリドを10ないし50%のFeCl3と置き換えうる。これを用いる場合、続く反応後のインキュベーションは2時間に及ぶ。
100mgのFeCl2・4H2OをFe3/デキストラン溶液に溶解し、次いで混合物を60℃水浴中に2分間置き、その後で6mlの熱7.5%NH3溶液(60℃)を徐々に加えはじめる。生成物を60℃の水浴中に15分間放置する。
反応生成物(デキストラン被覆フェライト)を1,000gで10分間回転し、全ての沈殿を除く。この工程を繰り返して3回の遠心を完全に行い、次いで上清を5mM EDTAを含む0.1M酢酸Na緩衝液、pH6.8で平衡化したPD−10カラムに適用する。
黒い溶出フラクションをEDTA/酢酸塩緩衝液で1:3に希釈し、次いでアミコン・セントリプレプ−100限外濾過器により初めの容量の1/10に濃縮する。次いで残留物をEDTA/酢酸塩緩衝液で1:10に希釈し、次いでC−100限外濾過器により1.5mlの容量に濃縮する。
0.30mlの20mM NaIO4を撹拌しながらデキストランフェライト溶液(約1.5ml)に加え、次いで暗所で室温下、60分間緩やかにかき回し又は振盪する。
60分間の過ヨード酸塩インキュベーションの終了時に、反応混合物を20mMホウ酸塩緩衝液(pH8,5)で平衡化したPD−10カラムに適用することにより反応を終了させる。
活性部位遮断溶液を、WGA結合反応用に100mM MnCl2/CaCl2を用い調製する。別法として、例えば子ウシ胸腺DNAは、保護されるべき蛋白活性部位が核酸結合蛋白上のある場合に用いることができる。
10mgの蛋白(例えばデオキリボヌクレアーゼフリーのDNApol1、クレノウ断片、インテグラーゼ、続く翻訳段階に有用な蛋白、核酸遮断蛋白及び抗CD4、WGA又は他の細胞標的蛋白)を、室温で500μlの20mMホウ酸Na緩衝液、pH8.5に溶解する。蛋白溶液はホウ酸塩緩衝液で12mlに希釈し、次いでセントリプレプ−10濃縮器により濃縮し、DTT、グリセロール、NaN3及び他の望ましくない蓄積付加物を除去することができる。
10μlの遮断溶液を蛋白/ホウ酸溶液に加え、次いで2.0mlの酸化磁鉄鉱デキストランを500μlの蛋白/ホウ酸塩溶液と混合する。20μlの遮断溶液をピペットで2.5ml蛋白−デキストラン−磁鉄鉱混合物に加え、よく混合し次いで緩やかにかき回し又は振盪する容器中、室温で6−18時間インキュベートする。
インキュベーション後、100μlの0,5Mグリシンを反応混合物に加え、さらに2時間インキュベートする。次いで250μlの0.25M NaBH4を磁鉄鉱−デキストラン−蛋白溶液に加え、間欠的に振盪しながら60分間放置してH2ガスを放出させる。インキュベーションの終了時に、反応混合物を20mM HEPES緩衝液pH7.4で平衡化したPD−10カラムを通過させる。溶出液をHEPES緩衝液で1:5に希釈し、次いでセントリプレプ−100限外濾過器で濃縮する。
アフィニティー精製段階は選択的であり、詳細はWGA(レクチン)標的蛋白との使用により与えられる。最終残留物(retentate)をアフィニティーカラム(20mM HEPES)に適用し、HEPESで洗浄し、次いでHEPES緩衝液pH7.4中、1M NAcGluにより特異的溶出を実施する。特異的溶出物はHEPESで平衡化したPD−10カラムを通過させ、NAcGlu、Mn及びCaを除く。
脱塩溶出物をHEPES緩衝液で24mlの容量に希釈し、セントリプレプ−100濃縮器で濃縮する。最終残留物を0.22μm遠心ミクロフィルター中、500hで1時間回転することにより滅菌する。
精製滅菌合成ベクター粒子は、1ないし2週間以内に使用するために4℃で蓄えることができる。それらは凍結又は凍結乾燥すべきでない。
問題のDNAによるDNA付着はトランスフェクションの前に直ちに行うことができる。粒子溶液は、緩やかにかき回し又は振盪しながら、6ないし24時間、問題のDNAとインキュベートする。
実験又は治療プロトコールに従って、DNA負荷ベクター溶液は、次いで1mg/ml(約5mM Fe)の合成ベクターの濃度で細胞培養に適用しうる(製造の最終生成物は25−50mgの合成ベクターである)。効率を評価するために、非吸着溶液と比較しうる。別法としてDNA負荷合成ベクターを10−100mM濃度でインビボ使用のため、静脈内又は筋肉内経路により投与しうる。非沈殿磁気基本分離技術を粒子から未結合DNAを分離するのに用いることができる。小さなDNA分子を用いた場合、分離はセントリプレプ−100の濃縮器で行うことができる。
本発明は、合成トランスフェクションベクターに関する。
本発明は、遺伝子治療の分野にあり、種々の有用な効果を達成するために治療遺伝子を哺乳動物及びヒト細胞に安全に導入する全く新規な手段の設計及び用途に関する。
遺伝子工学、核酸調査、クロモゾームマッピング、DNAクローニング及び他の関連分野での過去20年にわたる絶え間ない進歩により現代医学は遺伝子治療の入口まで来た。幾つかの病気は、その病気を起こす生理的機能不全を正すことができる情報をコードするDNA又はRNAの断片を構築することにより処置することが可能でありうる。又、農業では、或る動物又は植物の蛋白生成物に幾つかの有益な変化をなすことも可能でありうる。
この分野の進歩での重要な限定因子は、遺伝子がそれらの仕事をすることを開始できる無傷の生物の細胞にそのような新しい遺伝子を入れることの困難さにある。幾つかの小さな動物又は植物については、遺伝子は初期胚に含まれる小数の細胞に導入され、そして複製され最終的に成熟生物の多くの又は全ての細胞に出現した。しかしながら、この試みは、その病気が受精後、又はもっと一般的には誕生後に発見されるヒトの子供又は大人の病気を処置することは実行不可能である。さらに、農業ではこの方法は、多数の大きな動物例えばウシをそのように処置しようとすると実行するのは非常に高価で困難である。
種々の方法が遺伝子を成熟動物に導入するのに試みられた。これらの方法は裸のDNAプラスミドの個々の細胞への直接注射、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を再応用する試み、DNAのリポゾームへの封入、及び一種の感染として新しいDNAを運ぶことができる模似ウイルスの構築を含む。最大の進歩は、DNAを金コロイド粒子にコートし、次いで粒子を高速に加速するために強力な電磁場にさらし、粒子を組織の細胞壁にぶつからせるという一群の技術によりなされた。粒子は組織表面を通って突込み、多くの生存DNA鎖はそれらの非分解性金キャリヤーと共に細胞内に達する。皮膚以外の組織に達するために、外科手術を行い、例えば肝臓の先端をさらし、次いで衝撃を行う。これは、さらされた組織の表面層だけに接近することになり、明らかに有害で(点状出血が組織表面に直ちに現れるので)、多量の非分解性金を組織に保持する。
本発明の方法においては、新規なDNA、RNA、プラスミド、リボソーム粒子、核酸結合蛋白及び他の全ての必要な分子がコートされ又はコートされない型の種々の金属酸化物又は混合金属結晶のいずれか一つの外表面に付着させるか、或いは適当な大きさの、そして細胞付着分子に表面付着が可能な種々の他の型の生分解性粒子の表面に付着するか又は体内に含まれるようにする。これらの粒子は、全ての付着コーティング及び他の表面分子を含む、直径5ないし100nmの範囲の大きさである。神経及び筋肉細胞に、しかし好ましくは筋肉細胞に結合する種々の神経吸着分子又は筋肉吸着細胞の1つが表面上に含まれる。
そのような粒子が構築され、次いで通常の経皮的筋肉注射により投与されると、非常に安全で効果的なトランスフェクション方法が開始する。粒子は、筋肉細胞の外表面に、及び動物神経細胞の軸索突起末端の外表面に、又は好ましくは筋肉内知覚軸索突起の樹状突起又は知覚突起に付着する。付着後、粒子は、吸着性エンドサイト−シスと呼ばれる自然方法により神経及び筋肉細胞内に摂取される。
本発明者により実施された実験は、筋肉内注射後、そのような粒子の取込みについて驚くべき効率を示した。さらに、特にそのような粒子が鉄塩で作られた場合、粒子は完全に生分解性である。通常、筋肉に注射された粒状物質はリンパ系により速やかに清浄化され、そして粒子はリソゾーム小胞に取入れられ、そこでそれらは直ちに分解性酵素にさらされる。しかしながら、本発明者は、筋肉細胞による吸着性エンドサイト−シスの方法が同調すると、注射物質のバルクは神経及び筋肉細胞内の保護区画に運ばれることを認めた。
多くの細胞は、それらの細胞質区画に現れる異質DNA又はRNAを破壊する手段を有するが、筋肉細胞は入って来る核酸を破壊する効果が唯一ない。このファッションで、及び筋肉内注射の使用により、試薬は筋肉の細胞により与えられた非常に大きな細胞内容量を入らせることができる。ニューロンによる取込みでは、ニューロンの樹状突起方法の、ニューロン細胞体の調節影響から非常に離れてRNAからの蛋白合成を実施する自然能力を利用することも可能である。知覚特異神経吸着分子、例えば神経成長因子の利用は、そこではこれが有効である運動ニューロンよりむしろ知覚ニューロンを効果的に選択するのに役立つ。ある状況では、試薬を脊髄神経節に又は近くに注射し、それにより試薬が軸索突起輪送により運ばれ、神経節中の細胞から知覚突起により刺激された全ての組織に達するのに有効でありうる。
筋肉細胞の処置又は遺伝子治療生成物が神経突起末端に生成後、神経節シナプスに入れられる処置は、疾病、例えば筋肉ジストロフィー又は特に筋肉に影響を及ぼす他の病気を処置するのに、或いは神経筋伝達に影響を及ぼす病気を処置するのに特に役立つ。
しかしながら、そのような試薬は、それらが安全に静脈内に注射できるよう十分に小さいことに注意しなければならない。例えばデキストランによるそれらの潜在的親水性コーティングのために、本発明者は、そのような試薬について血漿半減期が循環内で4時間にわたって開始注射物の25%に達し拡大維持することを示した。このことは血液骨髄、循環血液及び種々の腺及び組織での極めて種々の細胞への標的方法を提供する。これらの全ての例で、これらの粒子について適当な標的分子の選択により種々の有用な細胞型への選択的吸着を生ずるであろう。選択的に吸着された粒子の食作用の効率が組織内で変わる一方、非常に種々の近づきやすい細胞内部位がある。金属酸化物コアを通常磁性を示す方法で構築すると、外側の磁場(US 4,869,247より)は試薬を標的とするのを助けるのに用いることができる。
そのような化合物の合成の1例において、粒子への核酸付着は特異的核酸結合蛋白によりもたらされる。DNAプラスミド又は鎖は、望ましい処置遺伝子及び選択された核酸結合蛋白への非常に高い親和性を有する切片の両者を含むよう構築する。この対合は、ブロモシアン固定化技術を用い、付着DNA切片を固定ラテックス粒子に結合することにより最適化できる。種々の核酸結合蛋白及び他の細胞成分は、次いでそのようなDNA付加ラテックス粒子のために作られたアフィニティカラムを通過させる。核酸結合蛋白の特異フラクションを次いで粒子を作るのに用いるために溶出する。
塩化第1鉄及び第2鉄の混合物は、US 4,452,773のファッション後、飽和デキストラン溶液に溶解し、7.5%アンモニア溶液の添加により沈殿させる。次いで生成物をセファデックス150カラム濾過により0.1M酢酸塩緩衝液pH6.4に移し、アミコン・セントリプレプ30限外濾過により濃縮し、セファクリル200の2.5cmと20cmのカラムを通過させてゼラチン状含水酸化物及び過剰のデキストランを除く。
次いで粒子を200nm及び100nmで濾過し、次に20mM NaIO4中で緩やかに酸化する。NaIO4をPD−10セファデックスカラムで除き、同一カラムを用い粒子をpH8.0ホウ酸塩緩衝液に移す。神経吸着分子、例えば小麦胚芽凝集素又はトランスフェリン又は活性部位の適当なブロッキングを伴う神経成長因子(塩化Ca及びMn)及び活性部位をブロックスするための小さい核酸断片を伴う適当な核酸結合蛋白を、次いで8ないし12時間粒子とインキュベートする。このあと残っている活性部位は、さらに2時間1Mグリシンを加えることによりブロックする。共有結合を還元後、粒子は未反応グリシン、NaBH4及び全ての溶解鉄塩を除くことにも役立つPD−10カラムを通してHEPES20mM pH7.4緩衝液に移す。生成物をHEPES緩衝液に希釈し、次いでアミコン・セントリプレプ100限外濾過で再び濃縮して未結合蛋白を除くのに役立たせ、次いでセファクリル200又は他のセファクリルサイズカラムを通過させて付加的な未反応蛋白を除く。
これらのカラムからの産生物をアミコン・セントリプレプ−100限外濾過により再び濃縮し、二巡アフィニティ精製に付す。第一巡は、筋肉表面は神経表面又は他の望ましい細胞表面マーカーを運ぶカラム上である。本ファッションで望ましい標的細胞に付着しないであろう全ての粒子を除去する。親和性フラクションを溶出し、希釈し再び濃縮し、そして今や粒子表面に連結した核酸結合蛋白により認識される固定化DNA断片によるカラムに対する第二アフィニティ精製に付す。
第二親和性段階の高精製生成物をHEPES20mM pH7.4に希釈し、アミコン・セントリプレプ−100又は同様の限外濾過器で再び濃縮し、次いで導出される遺伝物質に暴露する。混合プラスミド又は鎖を用いる場合は、結合蛋白はDNAの結合蛋白と相互に作用し、大きな核酸分子はDNAの結合蛋白と共に問題の活性遺伝子を運ぶ。問題のRNA又はDNAの遺伝子又は切片に直接結合する核酸結合蛋白が入手しうる場合は、そのような結合蛋白を用いることも可能である。
結合したDNAを伴う粒子は、所望によりセファクリルカラムを通過させて未結合核酸を除き、すぐにも筋肉内注射のために濃縮及び適当な生理溶液に希釈できる。そして試薬を筋肉に注射し、それにより付着及びエンドサイト−シスの自然方法は選択された細胞型への遺伝子トランスフェクションを完了する。
調製の他の例において、イオン塩の最初の沈殿を、何れのコーティングデキストラン又は他の分子をも存在させることなく、アンモニア溶液に滴加することにより行う。得られる懸濁液を遠心機中、500gで10分間回転して、ペレットを洗浄し、蒸留水に再び懸濁し、次いでこの方法を繰り返すが0.01NHClで洗浄する。得られる安定なコロイドを次いで付着分子蛋白、核酸鎖及び/又は核酸結合蛋白の混合物に暴露する。緩やかに非磁気撹拌しつつ1時間インキュベーションの後、粒子上に残っている反応性部位をデキストラン又はアルブミン蛋白の添加によりブロックする。次いで粒子をセファデクス150及びセファクリル200カラムを通し、次いで例えば親和性標識化アガロース、セファロース又はラテックスビーズのカラムを用いる細胞付着分子の手段によりアフィニティ精製する。
調製のさらに別の例では、最初の沈殿は非常に強い緩衝剤の溶溶、例えば1モル又はそれ以上の濃度のHEPES又はトリスを7.4のpHで調製することにより実施する。核酸、何れかの望ましいデキストラン及び又は標的蛋白並びに核酸結合蛋白を、この最初の強緩衝液に直接添加する。水性溶液中、又はデキストラン及び/又は蛋白及び/又は核酸を含む溶液中に溶解した第二鉄又は第三鉄イオン塩の混合物を次いで緩衝液に滴加する。本ファッションにおいて、粒子が厳格な緩衝溶液中に形成し、非常に多くのもろい蛋白及びペプチド分子を粒子被覆を形成するのにもちいることができ、そのような分子は、リボヌクレオ蛋白又はリボソーム蛋白を標的とし、又は導入するのに、或いはDNA又はRNAと共に転写シグナル又は現実の転写メカニズム蛋白の他の局面に、必要である。次いで本沈殿反応の生成物は、必要ならばさらにデキストラン又はアルブミンでブロックし、ついでセファデクス150、セファクリル200、アミコン限外濾過及び上述のようなアフィニティカラムにより精製する。
合成のさらに別の形では、核酸結合蛋白は用いず、細胞表面付着分子のみを用いる。核酸結合蛋白の代わりに、問題の核酸の相補断片を、ブロモシアン又は他の型の結合反応により或いは未被覆粒子型への付着により、粒子に結合させる。次いで問題の遺伝子を、結合した相補断片との相互作用により粒子に付着させ、その後で精製段階を上記のように実施する。
まとめると、本発明は、合成トランスフェクション剤、核酸を含まない相応するベクター及びその成分の全ての組合せを提供する。合成トランスフェクション剤は、ウイルスと同様の大きさの種々のセラミック金属酸化物粒子の一つの沈殿に基づくことが認識されるであろう。金属酸化物粒子は、沈殿工程の間に、デキストラン又は他の生物学的に許容しうる(tolerable)ポリマーでコートする。化学的に、基本構造は、磁気共鳴対照剤として通例の使用で、薬物と類似である。
デキストラン又は粒子の他のコーティング剤は、種々の他の型の分子が次いで共有結合する枠組みとして用いられる。典型的には標的分子、例えば抗体又は抗体断片、或いは幾つかの他の有用細胞付着分子を用いる。これにより粒子を一定の望ましい細胞型、例えばgp120断片に選択的に付着させ、CD4陽性細胞への付着を促進する。標的分子に加えて、核酸結合蛋白又は短いcDNA配列をデキストランコートに付着させることも可能である。このファッションにおいて、粒子を適当な核酸結合蛋白及び標的分子により生成でき、続いて治療DNAを積め込むことができる。
血管内投与については、粒子の大きさは血清半減期及び行先きを決定する。大きな粒子は貧食作用により細胞内皮系では除かれる傾向があり、一方小さな粒子はそれらの標的分子によってより完全に定められた目的を達する。
これらの粒子は、又、筋肉内に投与することもでき、そこでそれらは筋肉細胞に侵入することができ筋肉の神経末端によって取入れられ、続いて末梢から中枢神経系の神経細胞体に向かって軸索突起輪送に付すことができる。このファッションでヘルペスウイルスの投与進路をミミックし、筋肉内注射を神経系の選択された部分に治療目的のために血液−脳バリヤーを通ってDNAを伝えるのに用いることができる。軸索突起輪送経路は、又軸索突起を並べるシュワン細胞に対する評価をも提供する。
さらに肺投与のためのエアゾール形の粒子を提供することも可能である。静脈内投与を含む種々の他の経路の投与も可能である。
粒子キャリヤーは、血管内及び吸入経路を通って細胞内皮系統を含む疾病を処置するのに、又、経口経路により粘膜細胞を処置するのに、そして筋肉細胞への接近のための筋肉内注射に適する。神経内経路を経由してCNS及び神経節に近づくことは筋肉内及び腹腔内注射によって与えられる。
粒子は、ヒトマクロファージ、T細胞及び骨形成肉腫細胞により摂食されること、及び4時間後循環内に残っている注射投与量の25%の、ウサギの血流から粒子の遅いクリアランスがあることを示した。粒子はデキストランで被覆し、核酸結合蛋白として抗CD4及びDNAポリメラーゼの両者に接合し、続いて粒子表面に暴露しDNAプラスミドを取込む。粒子は又、デキストランでよりもDNAで直接被覆しうる。
粒子は、それらがインビボで実質的に害のない物質に分解できるという意味で生分解性である。従って、例えば異種物質、例えば金粒子は何年かのちに無傷であることが判るが、一方、鉄酸化物粒子は直ちに酸素と鉄に分解し、この両者はもちろん細胞中に自然に豊富に存在し、そして正常な細胞代謝、貯蔵及び再使用に関与する。鉄は大量存在する場合、毒性の幾らかのリスクをもたらす。フェライトの潜在的毒性は、それらが成分鉄を処理する細胞の能力よりも速くない速度でゆっくりと分解することを確かめることにより減少する。粒子の崩壊速度の延長は、元の製品が全体の大きさ及び化学成分においてフェライトと類似であるが非常に速やかに分解する鉄の含水酸化物のないことを確認することにより達成できる。加えて、フェライトの安定性を改良することができる他の成分、例えばパラジウム(これは金と異なり元素形で水溶性である)に浸漬することにより、分解の速度を遅らせることができる。
本明細書で開示したセラミック粒子に基づく系統は、望まないウイルス遺伝子の感染又は導入のリスクがないということで種々のウイルスベクターよりも利点を有する。それは粒子が生分解性であるということで金コロイド粒子よりも利点を有する。さらに、それらが蛋白に共有結合しうる被膜を有しうるので、これらの粒子は激烈さが少なくより伝統的な医薬経路を経由して体内に注射できる。種々の蛋白及び酵素を粒子表面に結合できる便利さにより、それらは簡単な脂質球よりも送達剤(deliverey agent)としてはるかに適応性のある複合体となる。
本発明において用いられる場合、粒子の大きさのためにそれらはDNAを負荷する前に濾過滅菌及びアフィニティクロマトグラフィに付すことができる。これは粒子キャリヤーをDNAと関係なく得ることができ、多くの種々の応用に便利な合成ベクターとして役立つことができることを意味する。金属酸化物コアを注射活性エミッターで標識するのにも便利であり、これはそれらの分布を追跡するのに有用である。治療用送達のための無機金属酸化物粒子の調製はWO−A−9204916に記載される。以下に示す説明に役立つ実施例において、粒子の調製により、望ましい均一性を与え望ましい遅い代謝に逆に影響しうる水溶性物質を無くす。実施例はカラムクロマトグラフィを除き、代わりに遠心濃縮機の使用に置き換え、対応するNaCl溶出緩衝液も省略する。EDTAは最初の洗浄段階で用いる緩衝液中、キレート剤として用いる。これは明らかに鉄を含水酸化物中に溶解するが、よく形成されたフェライトは溶解しない。その結果、低毒性の安定且つ均一な粒子調製品となる(というのはそれは実質的に純精なセラミック調製品であるから)。
実施例
2回蒸留した水(脱イオン化しない)を反応混合物を作るのに用いる。以下の段階を実施する。
1.5mlの33%NH3を4.5mlの熱dH2Oに加え(7.5%NH4OHを作る)、水浴中ふたをした万能試験管内に入れ60℃にして保持する。
1.25gのデキストラン(MW10,000)を2.0mlのdH2Oに溶解し、次いで225mgのFeCl3・6H2Oをデキストラン溶液に溶解する。別法として三価ランタニドクロリドを10ないし50%のFeCl3と置き換えうる。これを用いる場合、続く反応後のインキュベーションは2時間に及ぶ。
100mgのFeCl2・4H2OをFe3/デキストラン溶液に溶解し、次いで混合物を60℃水浴中に2分間置き、その後で6mlの熱7.5%NH3溶液(60℃)を徐々に加えはじめる。生成物を60℃の水浴中に15分間放置する。
反応生成物(デキストラン被覆フェライト)を1,000gで10分間回転し、全ての沈殿を除く。この工程を繰り返して3回の遠心を完全に行い、次いで上清を5mM EDTAを含む0.1M酢酸Na緩衝液、pH6.8で平衡化したPD−10カラムに適用する。
黒い溶出フラクションをEDTA/酢酸塩緩衝液で1:3に希釈し、次いでアミコン・セントリプレプ−100限外濾過器により初めの容量の1/10に濃縮する。次いで残留物をEDTA/酢酸塩緩衝液で1:10に希釈し、次いでC−100限外濾過器により1.5mlの容量に濃縮する。
0.30mlの20mM NaIO4を撹拌しながらデキストランフェライト溶液(約1.5ml)に加え、次いで暗所で室温下、60分間緩やかにかき回し又は振盪する。
60分間の過ヨード酸塩インキュベーションの終了時に、反応混合物を20mMホウ酸塩緩衝液(pH8,5)で平衡化したPD−10カラムに適用することにより反応を終了させる。
活性部位遮断溶液を、WGA結合反応用に100mM MnCl2/CaCl2を用い調製する。別法として、例えば子ウシ胸腺DNAは、保護されるべき蛋白活性部位が核酸結合蛋白上のある場合に用いることができる。
10mgの蛋白(例えばデオキリボヌクレアーゼフリーのDNApol1、クレノウ断片、インテグラーゼ、続く翻訳段階に有用な蛋白、核酸遮断蛋白及び抗CD4、WGA又は他の細胞標的蛋白)を、室温で500μlの20mMホウ酸Na緩衝液、pH8.5に溶解する。蛋白溶液はホウ酸塩緩衝液で12mlに希釈し、次いでセントリプレプ−10濃縮器により濃縮し、DTT、グリセロール、NaN3及び他の望ましくない蓄積付加物を除去することができる。
10μlの遮断溶液を蛋白/ホウ酸溶液に加え、次いで2.0mlの酸化磁鉄鉱デキストランを500μlの蛋白/ホウ酸塩溶液と混合する。20μlの遮断溶液をピペットで2.5ml蛋白−デキストラン−磁鉄鉱混合物に加え、よく混合し次いで緩やかにかき回し又は振盪する容器中、室温で6−18時間インキュベートする。
インキュベーション後、100μlの0,5Mグリシンを反応混合物に加え、さらに2時間インキュベートする。次いで250μlの0.25M NaBH4を磁鉄鉱−デキストラン−蛋白溶液に加え、間欠的に振盪しながら60分間放置してH2ガスを放出させる。インキュベーションの終了時に、反応混合物を20mM HEPES緩衝液pH7.4で平衡化したPD−10カラムを通過させる。溶出液をHEPES緩衝液で1:5に希釈し、次いでセントリプレプ−100限外濾過器で濃縮する。
アフィニティー精製段階は選択的であり、詳細はWGA(レクチン)標的蛋白との使用により与えられる。最終残留物(retentate)をアフィニティーカラム(20mM HEPES)に適用し、HEPESで洗浄し、次いでHEPES緩衝液pH7.4中、1M NAcGluにより特異的溶出を実施する。特異的溶出物はHEPESで平衡化したPD−10カラムを通過させ、NAcGlu、Mn及びCaを除く。
脱塩溶出物をHEPES緩衝液で24mlの容量に希釈し、セントリプレプ−100濃縮器で濃縮する。最終残留物を0.22μm遠心ミクロフィルター中、500hで1時間回転することにより滅菌する。
精製滅菌合成ベクター粒子は、1ないし2週間以内に使用するために4℃で蓄えることができる。それらは凍結又は凍結乾燥すべきでない。
問題のDNAによるDNA付着はトランスフェクションの前に直ちに行うことができる。粒子溶液は、緩やかにかき回し又は振盪しながら、6ないし24時間、問題のDNAとインキュベートする。
実験又は治療プロトコールに従って、DNA負荷ベクター溶液は、次いで1mg/ml(約5mM Fe)の合成ベクターの濃度で細胞培養に適用しうる(製造の最終生成物は25−50mgの合成ベクターである)。効率を評価するために、非吸着溶液と比較しうる。別法としてDNA負荷合成ベクターを10−100mM濃度でインビボ使用のため、静脈内又は筋肉内経路により投与しうる。非沈殿磁気基本分離技術を粒子から未結合DNAを分離するのに用いることができる。小さなDNA分子を用いた場合、分離はセントリプレプ−100の濃縮器で行うことができる。
Claims (13)
- 水溶液から第1鉄塩と第2鉄塩を共沈殿させることによって得られうる、キレート化剤としてのEDTAとの処理を経た、EDTAとキレート形成可能な含水酸化物(hydrous oxide)を含まないフェライト粒子。
- 大きさが5〜100nmである、請求項1記載のフェライト粒子。
- デキストランのような生物学的耐性を有するポリマーで被覆されている、請求項1または2記載のフェライト粒子。
- DNA、RNA、プラスミド、リボソーム粒子または核酸結合蛋白質を坦持する、請求項1〜3のいずれか記載のフェライト粒子。
- 神経接着性分子を坦持する、請求項1〜3のいずれか記載のフェライト粒子。
- 超常磁性を示す、請求項1〜5のいずれか記載のフェライト粒子。
- 治療または診断用の、請求項1〜6のいずれか記載のフェライト粒子。
- 水溶液から第1鉄塩と第2鉄塩を共沈殿させ、この共沈殿物をキレート化剤としてのEDTAで処理し、そこで生じたキレート化物を除去することを特徴とする、EDTAとキレート形成可能な含水酸化物を含まないフェライト粒子の製造法。
- フェライト粒子が5〜100nmの大きさを有する、請求項8記載の製造法。
- フェライト粒子がデキストランのような生物学的耐性を有するポリマーで被覆されている、請求項8または9記載の製造法。
- フェライト粒子がDNA、RNA、プラスミド、リボソーム粒子または核酸結合蛋白質を坦持する、請求項8〜10のいずれか記載の製造法。
- フェライト粒子が神経接着性分子を坦持する、請求項8〜10のいずれか記載の製造法。
- フェライト粒子が超常磁性を示す、請求項8〜12のいずれか記載の製造法。
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