CN108815520B - 一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用。所述的仿生二元协同纳米载体包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的葡萄糖氧化酶和载铁铁蛋白纳米粒子，以及在所述的红细胞膜表面嵌入或内部包载光敏剂；实现肿瘤饥饿治疗与化学动力学治疗的连锁刺激响应性协同，利用红细胞膜的生物亲和性以及靶向分子肿瘤靶向，使两种酶随载体输送到机体的靶向位点，通过肿瘤处808nm近红外光照破膜实现精确给药，有效解决了耐药性问题，并显著降低因药物施用造成的系统毒性，有效避免在体内循环过程中对其他正常组织产生损伤。本发明还提供了所述的仿生二元协同纳米载体的制备方法，具有良好的应用前景。

Description

一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域，具体涉及一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤化疗是临床治疗癌症的最重要的技术手段之一，但目前疗法本身存在两项技术难题需要解决。首先，如何实现药物体内的长效循环以及对癌细胞的特异性输送是提高药效及降低毒副作用的关键；其次，化疗诱导产生的癌细胞抗药性是导致化疗效果不佳的重要因素。基于目前的现状，针对肿瘤治疗的药物载体设计与构建显示出至关重要的地位。
肿瘤治疗中药物载体的构建有两个重要的方面，其一是降低对正常组织的损害，即在体内传输过程中保持长循环，同时能够靶向化肿瘤组织；其二是提高抗肿瘤效果，即到达肿瘤组织后能够快速地释放所负载的药物，使其发挥治疗的目的。利用仿生技术构建出具有性能优异的药物载体，为肿瘤治疗提供了更加广阔的前景。加州大学张良方教授课题组首次尝试用来源于天然红细胞的细胞膜对纳米颗粒进行包覆，并成功地提升了纳米颗粒体系循环能力。紧接着，利用天然细胞膜包覆纳米粒子-细胞膜仿生纳米载体系统，以其优良的生物相容性和免疫逃逸的特征，被广泛用于各种生物医学方面的应用研究。Q.Hu等(Q.Hu,W.Sun,C.Qian,C.Wang,H.N.Bomba,Z.Gu.Adv.Mater.2015,27,7043.)利用血小板膜所包覆的纳米内核是酸敏交联的纳米凝胶，在肿瘤细胞溶酶体微酸环境下发生酸敏刺激响应性的释放药物，由于小分子药物可通过半透膜，所以此种药物载体被成功地用于肿瘤的治疗；该技术采用的是生物膜药物递送，使用阿霉素(DOX)作为治疗药物，由于阿霉素是小分子药物，可以直接通过血小板膜，无需破膜。但DOX作为一种化疗药物，对人体正常组织也会产生较大的毒性，长期使用会产生耐药性，降低治疗效果。
专利CN 106943378 A公开了一种红细胞膜包封聚酯类载三氧化二砷(ATO)纳米粒及其制备方法，所述纳米粒以红细胞膜为外壳，聚酯类材料为核心；所述聚酯类材料负载有三氧化二砷。该制备的纳米粒粒径在200nm左右，形状圆整，分布均匀，且具有清晰的壳-核结构；且稳定性良好，不会引起红细胞溶血和凝集，可用于静脉注射。该递药系统与游离药物相比具有显著的缓释作用，可以解决三氧化二砷静脉注射后，血药浓度快速升高的问题，因3～400nm大小物质一般不会从肾脏或排异系统排出，有利于在血液系统的循环，达到被动靶向的效果，有利于减小毒性药物的血药浓度，从而减轻毒性，为毒性抗肿瘤药物制剂的开发提供了新的策略。但三氧化二砷即俗称的砒霜，对人体具有一定毒性，虽然红细胞膜包封的三氧化二砷虽然可以减轻毒性，但是仍然会对正常组织产生一定损伤。
目前，癌症化疗药物在体内循环过程中对正常组织产生一定损伤及耐药性等问题亟待解决。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，解决现有癌症化疗药物在体内循坏过程中对正常组织会产生一定损伤的问题，提供一种仿生二元协同纳米载体，该纳米载体将产生连锁刺激响应性的二元协同治疗，通过产生的羟基自由基进行治疗，不会产生耐药性，对正常组织无毒性，同时有效避免在体内循环过程中对其他正常组织产生损伤。
本发明的另一目的在于提供所述的仿生二元协同纳米载体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的仿生二元协同纳米载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种仿生二元协同纳米载体，包括红细胞膜(RBC)和包覆于红细胞膜内的葡萄糖氧化酶(GOD)和载铁铁蛋白纳米粒子(M-HFn)，以及在所述的红细胞膜表面嵌入或内部包载(包载入膜内)的光敏剂。该仿生二元协同纳米载体上的光敏剂可经近红外光照射产生单线态氧破坏红细胞膜的完整性，从而释放所述的葡萄糖氧化酶和载铁铁蛋白纳米粒子。
所述的光敏剂优选为ICG或DIR中的至少一种。
具体的，DIR为表面嵌入红细胞膜，ICG为进入红细胞膜内。
所述的红细胞膜优选为人O型血红细胞膜。
所述的载铁铁蛋白纳米粒子通过如下制备方法制得：
在惰性气氛下，将人去铁铁蛋白与脱气NaCl溶液混合在65℃±3℃下反应，然后同时恒速加入pH 8±1的脱气硫酸亚铁铵、脱气过氧化氢溶液与NaOH溶液，反应至少持续5min，加入柠檬酸钠；超滤离心或透析，制得所述的载铁铁蛋白纳米粒子。
所述的人去铁铁蛋白可通过基因工程技术制备或通过市售途径购买得到。
所述的仿生二元协同纳米载体表面还可以连接靶向分子，进一步实现靶向。
所述的靶向分子优选为Angiopep-2、RGD多肽、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种。
所述的仿生二元协同纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
当光敏剂内部包载于红细胞膜时，将光敏剂、葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分溶解后，加入到红细胞膜的低渗溶液中，混匀并静置，使光敏剂、葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分低渗进入膜内，离心、洗涤，得到红细胞血影悬浮液，将红细胞血影悬浮液依次通过400nm，200nm，100nm或50nm脂质体制备仪器反复挤压成型，即得所述的仿生二元协同纳米载体；
或者，当光敏剂嵌入红细胞膜表面时，将葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分溶解后，加入到红细胞膜的低渗溶液中，混匀并静置，使葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分低渗进入膜内，离心、洗涤，得到包载了葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子的红细胞膜溶液，然后加入光敏剂混合后常温孵育，离心，洗涤，得到红细胞血影悬浮液，将红细胞血影悬浮液依次通过400nm，200nm，100nm或50nm脂质体制备仪器反复挤压成型，即得所述的仿生二元协同纳米载体。
当所述的仿生二元协同纳米载体表面还连接靶向分子时，则将所述的仿生二元协同纳米载体与靶向分子混合孵育，即得所述的靶向化的仿生二元协同纳米载体。
所述的仿生二元协同纳米载体作为载体材料或制备靶向药物中的应用。所述的仿生二元协同纳米载体通过近红外定点光照，实现在肿瘤部位破膜释放出其所包载的葡萄糖氧化酶(GOD)和载铁铁蛋白纳米粒子。
所述的近红外定点光照优选为808nm近红外激光定点光照。
本发明构建了“连锁刺激响应型仿生二元协同纳米载体”系统，简称“仿生协同载体”(如图1所示)。该载体采用内源性的“红细胞膜”包覆“葡萄糖氧化酶”和“仿生过氧化物酶—载铁铁蛋白纳米粒子”，用于肿瘤诊疗一体化。首先，将靶向化的仿生协同载体注射入体内后，实时核磁共振显影定位肿瘤组织，然后采用近红外光照射促使载体红细胞膜表面嵌入或内部包载的光敏剂产生单线态氧破坏膜的完整性，从而释放两种酶。接着在肿瘤微环境中，将以丰富的特征性内源性物质，“葡萄糖”(Glucose)和“过氧化氢”(H2O2)，作为肿瘤治疗的研究对象，完成“体内的连锁反应”。即由“葡萄糖氧化酶”将“葡萄糖”氧化成“葡萄糖酸”(简称“肿瘤饥饿治疗”)和“过氧化氢”，接着通过“铁蛋白纳米粒子”催化“过氧化氢”产生“羟基自由基”，类似于强氧化反应-“芬顿”(Fenton)反应，进而“羟基自由基”杀灭肿瘤细胞(简称“化学动力学治疗”)。本发明设计的“仿生协同载体”将产生连锁刺激响应性的二元协同治疗，有望克服肿瘤治疗中一些难以逾越的障碍，获得更好的治疗效果，所采用的人O型血红细胞膜适用于各种血型的病人，具有大规模产业化生产的潜力，通过酶进行治疗不仅不产生抗药性，还可以显著降低因药物施用造成的系统毒性，具有极高的临床应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明设计制备的连锁刺激响应型仿生二元协同纳米载体，实现肿瘤饥饿治疗与化学动力学治疗的连锁刺激响应性协同。利用红细胞膜对机体组织器官或者细胞类型的生物亲和性，能够使两种酶随载体一起输送到机体的靶向位点，实现精确给药。
(2)相比于传统的纳米药物载体，本发明的仿生协同载体不仅可以实现体内长循环，极大地提升酶的生物利用度，所产生的羟基自由基治疗不会产生耐药性，还可以显著降低因药物施用造成的系统毒性，本发明利用肿瘤部位高糖的特点，通过葡糖糖氧化酶将葡糖糖氧化成葡糖糖酸，起到肿瘤饥饿治疗的目的，同时产生的过氧化氢被载铁铁蛋白纳米粒子催化成羟基自由基，实现化学动力学治疗，从而杀灭肿瘤细胞，双重治疗进一步提高肿瘤治疗的效果。
(3)本发明通过内源性人O型血红细胞膜外接靶向分子达到肿瘤靶向的目的，同时由于红细胞膜载体长循环的优点实现被动靶向，提高肿瘤部位药物的富集，通过在肿瘤部位808nm近红外激光定点光照破膜，破膜后葡萄糖氧化酶和载铁铁蛋白释放以达到对肿瘤的精准治疗，有效避免在体内循环过程中对其他正常组织产生损伤。由于恶性肿瘤细胞表面过度表达TfR1铁蛋白受体，载铁铁蛋白释放后能够进一步对肿瘤细胞进行靶向，提高治疗效果。
(4)本发明所使用的红细胞膜(RBC)，葡萄糖氧化酶(GOD)，载铁铁蛋白(M-HFn)等均为人体内源性物质，对正常组织无生物毒性，并可以有效避免在体内循环过程中对其他正常组织产生损伤。
附图说明
图1是本发明的仿生协同载体的作用机制示意图。
图2是包膜红细胞膜透射电镜照片图，其中A是808光照前照片，B是光照破膜后照片。
图3是动物实验中15天内肿瘤大小变化结果分析图。
图4是动物实验中15天内小鼠体重变化结果分析图。
图5是动物实验中第15天不同处理组的肿瘤照片图。
图6是动物实验中第15天不同处理组的肿瘤质量结果分析图。
图7是是动物实验中小鼠血液9种成分的结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1ICG破膜仿生二元协同纳米载体的制备
1.去铁铁蛋白纳米笼(HFn)和载铁铁蛋白纳米粒子(M-HFn)的制备
(1)基因工程法制备去铁铁蛋白纳米笼(HFn)
表达去铁铁蛋白纳米笼的阳性菌株由湖北百奥斯生物科技有限公司进行构建，该公司提供质粒构建等服务，细胞亦来源于该公司。
提取人骨骼肌细胞RNA，反转录成cDNA作为模板；扩增人FTH1基因，PCR引物如下(黑色下划线为酶切位点)：
F:5’-A GTC GCC CAT ATG ACG ACC GCG TCC-3’(Nde I)
R:5’-GCC GGA TCC TTA GCT TTC ATT ATCA C-3’(Bam HI)
将PCR产物纯化回收后，经双酶切与pET-30a(+)载体连接，产物转化XL2-Blue感受态细胞，经Kan+抗性平板筛选，挑菌落鉴定后送至测序。将测序正确的质粒再转入感受态BL21(DE3)E.Coli中，筛选出阳性菌株。将阳性菌株加入1L含30mg/L Kan的LB培养基过夜培养，加入1mM的IPTG诱导4h后，离心收集菌体，用45mL的裂解液(100mM HEPES,50mM NaCl,pH8.0)重悬沉淀，并分别加入溶菌酶、DNAse和RNAse使其终浓度为50、60和100μg/uL，室温孵育30min后用弗氏细胞压碎器，处理后在超声破碎仪下进行破碎。离心超声后的溶液以去掉细胞碎片，取上清在60℃中水浴10min，然后离心去除大部分细菌杂蛋白，上清通过分子排阻色谱法进行纯化，使用Superose 6亲和层析柱，将收集到的纯化蛋白在280nm下测吸光值计算蛋白含量，得到去铁铁蛋白纳米笼。
(2)制备载铁铁蛋白纳米粒子(M-HFn)
将脱气8.0mL,100mM NaCl溶液加到反应瓶中(氩气保护，严格无氧操作)，随后将2.0mg，3.9nmol步骤(1)制得的去铁铁蛋白纳米笼(HFn 1mg/mL)加进去，温度控制在65℃，pH 8.5的12.5mM，1566μL脱气硫酸亚铁铵，以化学计量比H2O2：Fe2+＝1:3配制4.17mM，1566μL脱气过氧化氢溶液，25mM，1566μLNaOH溶液用于中和反应过程中产生的H+以维持pH8.5；三者同时以恒速31.3μL/min加入，理论加载5000Fe；全部加进去之后反应持续5min；反应完成后，200μL,300mM柠檬酸钠被加进去蟄合游离铁；超滤离心/透析，制得载铁铁蛋白纳米粒子。
2.靶向配体连接磷脂的制备
本发明中含有端氨基的磷脂先与含有氨基反应性NHS基团的MAL-PEG-NHS反应，得到MAL-PEG-Lipid，再将含有巯基的靶向配体与MAL-PEG-Lipid中的马来酰亚胺(MAL)端基的加成反应，形成“靶向配体-聚乙二醇-磷脂”。
3.人O型血红细胞膜的制备
(1)取人O型血全血1mL(保存在等体积抗凝剂里)，(4℃)2500rpm离心5min，除去上层血清和血小板等。
(2)下层加入1mL生理盐水，反复吸出，(4℃)2500rpm离心5min，洗涤两次，缓慢吸掉上清。
(3)冰浴下向洗涤后的红细胞中加入1mL生理盐水，10mL灭菌水，轻轻混匀，静置30min(15min时取出上下晃动使分布均匀)。3500rpm离心5min，除去上层清液(血红蛋白)。1mL生理盐水复溶，冻干保存。
4.Angiopep-2靶向的红细胞膜包裹葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子的制备(A-RBC@GOD/M-HFn)的制备
将人O型血的全血经过低渗预膨胀法及低渗透析法处理得到红细胞，其机理是利用红细胞在低渗膨胀溶血时，细胞膜上会短暂形成许多直径20～50nm的膜孔，通过渗透压的作用将溶液中的纳米粒子载入红细胞膜内。具体步骤为：首先将1mg的吲哚菁绿(ICG)、5mg葡萄糖氧化酶及5mg载铁铁蛋白纳米笼溶于1mL水中，待其充分溶解后，加入10mg溶于100uL生理盐水中的红细胞膜，震荡混匀后，静置30min(15min时取出上下晃动使分布均匀)，使ICG和酶充分低渗进入膜内。随后3500rpm离心5min，除去上清液，生理盐水洗涤3次除去膜外附着的酶与ICG。最终获得负载两种酶及光敏试剂ICG的红细胞血影悬浮液。接下来，将红细胞血影依次通过400nm，200nm，100nm或50nm的脂质体制备仪器(Avanti miniextruder)的反复挤压成型，得到红细胞膜包裹葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子(RBC@GOD/M-HFn)；接下来上述的纳米血影与0.5mg的Angiopep-2-聚乙二醇-磷脂分子混合孵育30min，最终获得靶向化的仿生协同载体(A-RBC@GOD/M-HFn)。
通过动态光散射测定仿生协同载体的粒径和电位。图2为所制得的靶向化的仿生协同载体透射电镜照片图，其中A是808光照前照片，B是经过808激光器1w光照2min破膜后照片。
实施例2 DIR破膜仿生二元协同纳米载体的制备
1.去铁铁蛋白纳米笼(HFn)和载铁铁蛋白纳米粒子(M-HFn)的制备
(1)基因工程法制备去铁铁蛋白纳米笼
提取人骨骼肌细胞RNA，反转录成cDNA作为模板；扩增人FTH1基因，PCR引物如下(黑色下划线为酶切位点)：
F:5’-A GTC GCC CAT ATG ACG ACC GCG TCC-3’(Nde I)
R:5’-GCC GGA TCC TTA GCT TTC ATT ATCA C-3’(Bam HI)
将PCR产物纯化回收后，经双酶切与pET-30a(+)载体连接，产物转化XL2-Blue感受态细胞，经Kan+抗性平板筛选，挑菌落鉴定后送至测序。将测序正确的质粒再转入感受态BL21(DE3)E.Coli中，筛选出阳性菌株。将阳性菌株加入1L含30mg/L Kan的LB培养基过夜培养，加入1mM的IPTG诱导4h后，离心收集菌体，用45mL的裂解液(100mM HEPES,50mM NaCl,pH8.0)重悬沉淀，并分别加入溶菌酶、DNAse和RNAse使其终浓度为50、60和100μg/uL，室温孵育30min后用弗氏细胞压碎器，处理后在超声破碎仪下进行破碎。离心超声后的溶液以去掉细胞碎片，取上清在60℃中水浴10min，然后离心去除大部分细菌杂蛋白，上清通过分子排阻色谱法进行纯化，使用Superose 6亲和层析柱，将收集到的纯化蛋白在280nm下测吸光值计算蛋白含量，得到去铁铁蛋白纳米笼。
(2)制备载铁铁蛋白纳米粒子(M-HFn)
将脱气16.0mL,100mM NaCl溶液加到反应瓶中(氩气保护，严格无氧操作)，随后将4.0mg，3.9nmol步骤(1)制得的去铁铁蛋白纳米笼(HFn 1mg/mL)加进去，温度控制在68℃，pH 9.0的12.5mM，1878μL脱气硫酸亚铁铵，以化学计量比H2O2：Fe2+＝1:3配制4.17mM，1878μL脱气过氧化氢溶液，25mM，1878μL NaOH溶液用于中和反应过程中产生的H+以维持pH9.0；三者同时以恒速31.3μL/min加入，理论加载3000Fe；全部加进去之后反应持续5min；反应完成后，200μL,600mM柠檬酸钠被加进去蟄合游离铁；超滤离心/透析，制得载铁铁蛋白纳米粒子。
2.靶向配体连接磷脂的制备
本发明中含有端氨基的磷脂先与含有氨基反应性NHS基团的MAL-PEG-NHS反应，得到MAL-PEG-Lipid，再将含有巯基的靶向配体与MAL-PEG-Lipid中的马来酰亚胺(MAL)端基的加成反应，形成“靶向配体-聚乙二醇-磷脂”。
3.人O型血红细胞膜的制备
(1)取人O型血全血1mL(保存在等体积抗凝剂里)，(4℃)2500rpm离心5min，除去上层血清和血小板等。
(2)下层加入1mL生理盐水，反复吸出，(4℃)2500rpm离心5min，洗涤两次，缓慢吸掉上清。
(3)冰浴下向洗涤后的红细胞中加入1mL生理盐水，10mL灭菌水，轻轻混匀，静置30min(15min时取出上下晃动使分布均匀)。3500rpm离心5min，除去上层清液(血红蛋白)。1mL生理盐水复溶，冻干保存。
4.Angiopep-2靶向的红细胞膜包裹葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子的制备(A-RBC@GOD/M-HFn)的制备
将人O型血的全血经过低渗预膨胀法及低渗透析法处理得到红细胞，其机理是利用红细胞在低渗膨胀溶血时，细胞膜上会短暂形成许多直径20～50nm的膜孔，通过渗透压的作用将溶液中的纳米粒子载入红细胞膜内。具体步骤为：首先将8mg葡萄糖氧化酶及8mg载铁铁蛋白纳米笼溶于1mL水中，待其充分溶解后，加入10mg溶于100uL生理盐水中的红细胞膜，震荡混匀后，静置30min(15min时取出上下晃动使分布均匀)，使两种酶充分低渗进入膜内。随后3500rpm离心5min，除去上清液，生理盐水洗涤3次除去膜外附着的酶。将获得的红细胞膜双酶溶液与1mg DIR混合，常温下孵育30min，离心并洗涤两次除去未嵌入到细胞膜上的DIR最终获得负载两种酶及光敏试剂DIR的红细胞血影悬浮液。接下来，将红细胞血影依次通过400nm，200nm，100nm或50nm的脂质体制备仪器(Avanti miniextruder)的反复挤压成型，得到红细胞膜/DIR包裹葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子(RBC@GOD/M-HFn-DIR)；接下来上述的纳米血影与0.5mg的Angiopep-2-聚乙二醇-磷脂分子混合孵育30min，最终获得靶向化的DIR仿生协同载体(A-RBC@GOD/M-HFn-DIR)。
实施例3动物实验
1.BALB/c小鼠皮下瘤模型的构建
将以对数生长期肿瘤细胞制备单细胞悬液，以无血清培养基洗涤3次，并调整细胞浓度至1*107/mL，在超净工作台内进行动物试验。以TB空针将细胞悬液注入试验裸鼠大腿内侧皮下(选取血管丰富处)，每只小鼠接种0.1mL，含细胞数1*106，待皮下移植瘤粟粒大小(约10天，大小约60～80mm3)开始干预处理，并开始以游标卡尺测量肿瘤长径及短径。
2.实验步骤
将4～6周大小的荷瘤小鼠随机分成4组，每组6只，第一组为PBS组，第二组为非靶向包膜双酶光照组(实施例1制得的RBC@GOD/M-HFn+L)，第三组是靶向包膜双酶组(实施例1制得的A-RBC@GOD/M-HFn)，第四组为靶向包膜双酶光照组(实施例1制得的A-RBC@GOD/M-HFn+L)。均以10mg/kg的浓度每两天注射一次药物，其中第二组和第四组在每次注射后6～8小时在肿瘤部位使用808激光器1w光照2min；每两天以游标卡尺测量肿瘤长径及短径，计算肿瘤体积，计算公式为v＝长径×短径2/2，并称量小鼠体重。在第15天将小鼠处死，取出肿瘤，称量肿瘤质量，并按照组别排列拍照。
3.结果与分析
图3为小鼠随时间变化肿瘤体积/初始肿瘤体积(V/V0)的折线图，由图可知靶向光照组具有显著的肿瘤治疗效果，且效果好于非靶向光照组，这是因为靶向非光照组由于未经光照破膜，两种酶被包裹在红细胞膜内无法产生作用，基本无治疗效果。且由图4可知实验过程中各组别小鼠体重均无明显差异，表明此剂量的药物对小鼠没有明显损伤。图5和图6可以更加直观的说明各组别的肿瘤治疗效果。
实施例4血液毒性研究
将4～6周大小的BALB/c小鼠随机分成4组，每组4只，第一组为PBS组，第二组为游离双酶组(M-HFn/GOD)，第三组是包膜双酶组(R@M-HFn/GOD，即实施例1的RBC@GOD/M-HFn)，第四组为靶向包膜双酶组(A-R@M-HFn/GOD，即实施例1的A-RBC@GOD/M-HFn)，其中，第三组、第四组以10mg/kg的浓度，第二组根据13.5％的包封率以1.35mg/kg的GOD/M-HFn的浓度每两天注射一次药物，15天后通过眼眶取血收集小鼠血液，静置一小时后4000min离心5分钟取上层血清。然后使用以下检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)分别对9项血液指标进行检测：
(1)丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒(赖氏法)微板法
(2)天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒(微板法)
(3)尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法)
(4)肌酐(Cr)测定试剂盒(肌氨酸氧化酶法)(微板法)
(5)乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(微板法)
(6)葡萄糖(Glu)测试盒(手工/半自动)
(7)总胆固醇(TCH酶法)测试盒(液体)
(8)低密度脂蛋白胆固醇(LDL)测定试剂盒(双试剂直接法)(酶标仪及生化分析仪)
(9)白蛋白(ALB)测定试剂盒(带标准：溴甲酚绿法)(微板法)。
结果如图7所示，各组别小鼠9项指标均无明显差异，说明该剂量的药物对正常小鼠基本无毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcgcccat atgacgaccg cgtcc 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccggatcct tagctttcat tatcac 26

Claims (5)

1.一种仿生二元协同纳米载体，其特征在于：
包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的葡萄糖氧化酶和载铁铁蛋白纳米粒子，以及在所述的红细胞膜表面嵌入或内部包载的光敏剂；
所述的红细胞膜为人O型血红细胞膜；
所述的仿生二元协同纳米载体表面连接靶向分子；
所述的靶向分子为Angiopep-2、RGD多肽、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种；
所述的载铁铁蛋白纳米粒子通过如下制备方法制得：
在惰性气氛下，将人去铁铁蛋白与脱气NaCl溶液混合在65℃±3℃下反应，然后同时恒速加入pH 8±1的脱气硫酸亚铁铵、脱气过氧化氢溶液与NaOH溶液，反应至少持续5min，加入柠檬酸钠；超滤离心或透析，制得所述的载铁铁蛋白纳米粒子；
所述的仿生二元协同纳米载体通过包括如下方法制备得到：
当光敏剂为内部包载于红细胞膜时，将光敏剂、葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分溶解后，加入到红细胞膜的低渗溶液中，混匀并静置，使光敏剂、葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分低渗进入膜内，离心、洗涤，得到红细胞血影悬浮液，将红细胞血影依次通过400nm，200nm，100nm或50nm脂质体制备仪器反复挤压成型，即得所述的仿生二元协同纳米载体；
或者，当光敏剂为嵌入红细胞膜表面时，将葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分溶解后，加入到红细胞膜的低渗溶液中，混匀并静置，使葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子充分低渗进入膜内，离心、洗涤，得到包载了葡萄糖氧化酶、载铁铁蛋白纳米粒子的红细胞膜溶液，然后加入光敏剂混合后常温孵育，离心，洗涤，得到红细胞血影悬浮液，将红细胞血影依次通过400nm，200nm，100nm或50nm脂质体制备仪器反复挤压成型，即得所述的仿生二元协同纳米载体。
2.根据权利要求1所述的仿生二元协同纳米载体，其特征在于：
所述的光敏剂为ICG或DIR中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的仿生二元协同纳米载体，其特征在于：
ICG为红细胞膜内部包载；
DIR为表面嵌入红细胞膜。
4.根据权利要求1所述的仿生二元协同纳米载体，其特征在于：
当所述的仿生二元协同纳米载体表面还连接靶向分子时，将所述的仿生二元协同纳米载体与靶向分子混合孵育，即得所述的靶向化的仿生二元协同纳米载体。
5.权利要求1～4任一项所述的仿生二元协同纳米载体制备载体材料或制备靶向药物中的应用。
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