CN110665005B - 一种掺铁聚合物纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,涉及纳米粒及其制备方法和应用,具体涉及一种掺铁聚合物纳米粒及其制备方法和应用。一种掺铁聚合物纳米粒,包括掺铁聚合物形成的内核和吸附在内核上的功效物质;所述掺铁聚合物含有三价铁离子,所述功效物质包括吲哚菁绿。该纳米粒子能够增加医用染料在生物体内的半衰期,并同时提高实体肿瘤微环境的氧含量,从而提高该医用染料对肿瘤的光疗效果。本技术方案提供的掺铁聚合物纳米粒可以应用于肿瘤治疗药物的制备中。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种纳米粒及其制备方法和应用,具体涉及一种掺铁聚合物纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
光疗法因其侵袭性小、副作用小、易控制等优点,在新兴的肿瘤治疗中显示出巨大的优势。光疗法包括光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT),该疗法利用具有较高光热转换效率的材料或光敏药物,并在外部光源的照射下,将光能转化为热能或者是引发光敏药物的化学反应,来杀病变组织(例如实体肿瘤)。光疗法通常采用一些医用染料作为光热转换药物或者光敏药物,例如吲哚菁绿(ICG)。但是,如果采用静脉注射的游离ICG分子的方法给药,ICG分子与血浆蛋白紧密结合,导致ICG在体内的半衰期非常短,ICG容易在体内转运过程中失活,达不到应有的治疗效果。
为解决上述问题,中国专利CN108186569A(载吲哚菁绿和阿霉素脂质体纳米颗粒的制备方法和用途)提出了一种将吲哚菁绿包裹在脂质体纳米粒中的方案,该技术方案虽然延长了吲哚菁绿在体内的保留时间,但是仍然存在以下问题:大多数实体肿瘤所处的微环境为低氧环境,而吲哚菁绿的光动力治疗效果是依赖于氧的,在肿瘤组织中,吲哚菁绿并不能完全发挥其光动力治疗作用。因此,研发出一种能够同时延长吲哚菁绿在体内的半衰期和改善实体肿瘤缺氧微环境的药物呈递系统是非常必要和急需的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种掺铁聚合物纳米粒,该纳米粒子能够增加医用染料在生物体内的半衰期,并同时提高实体肿瘤微环境的氧含量,从而提高该医用染料对肿瘤的光疗效果。
为解决上述技术问题,本发明技术方案提供了一种掺铁聚合物纳米粒,包括掺铁聚合物形成的内核和吸附在内核上的功效物质;所述掺铁聚合物含有三价铁离子,所述功效物质包括吲哚菁绿。
采用上述技术方案,技术原理为:本方案的掺铁聚合物纳米粒在注射进入生物体内后,在EPR作用下聚集于肿瘤区域。掺铁聚合物上的三价铁离子具有过氧化氢酶的活性,而在肿瘤微环境中富含过氧化氢,三价铁离子催化过氧化氢产生氧气。激光(808nm)辐照刺激下,吲哚菁绿可以将氧气分子转换成包括单线态氧(1O2)在内的活性氧(ROS),而活性氧具有强氧化性,通过氧化肿瘤组织处的生物大分子,实现对肿瘤的杀伤作用(即光动力疗法)。另外,吲哚菁绿还具有光热转化的功能,可以将激光辐照的能量转换成热能,进一步加强对肿瘤细胞的杀伤作用(即光热疗法)。吲哚菁绿本身是一种用于活体荧光成像的近红外(NIR)染料。使用本方案制备的掺铁聚合物纳米粒,可以在吲哚菁绿引导成像的作用下,同时实现对肿瘤的光动力和光热治疗。
肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME),即肿瘤细胞产生和生活的内环境,其中不仅包括了肿瘤细胞本身,还有与肿瘤细胞有密切联系的成纤维细胞、免疫和炎性细胞、胶质细胞等各种细胞,同时也包括附近区域内的细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物分子。
EPR作用即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability andretention effect),实体肿瘤相对于正常组织,某些尺寸的分子或颗粒更趋向于聚集在肿瘤组织中。
本技术方案中的掺铁聚合物纳米粒具有如下的有益效果:
(1)本技术方案的掺铁聚合物纳米粒增强了吲哚菁绿的光动力治疗作用。
大多数实体肿瘤所处的微环境为低氧环境,而低氧环境不利于吲哚菁绿的光动力作用,由于缺少底物(氧气分子),吲哚菁绿不能在激光辐照下产生大量的活性氧,吲哚菁绿的治疗作用不能完全发挥出来。所以现有技术中,人们通常都是仅仅利用吲哚菁绿的光热转化作用来治疗肿瘤,但是,单一的光热疗法无法有效杀伤肿瘤细胞,一直没有找到一种能够同时充分利用吲哚菁绿的光热治疗作用和光动力治疗作用的方法(肿瘤微环境缺少氧,导致光动力治疗作用无法完全发挥其功效,光热治疗和光动力治疗的协同增效作用无法最大限度地实现)。
现有技术中,使用含有三价铁离子的纳米粒子来增强核磁共振成像,发明人在研究过程中发现三价铁离子在肿瘤微环境中,不但可以增强核磁共振成像,还可以促进吲哚菁绿的光动力治疗作用。发明人通过大量试验来探寻产生上述现象(促进吲哚菁绿的光动力治疗作用)的原因,发现三价铁离子对过氧化氢(肿瘤微环境中含有将大量的过氧化氢)进行催化,生成氧气,进而促进吲哚菁绿的光动力治疗作用(氧气为吲哚菁绿的催化底物)。实验证明三价铁离子对吲哚菁绿的光动力治疗作用具有协同增效的效果,三价铁离子可以作为吲哚菁绿的光动力作用增强剂(即三价铁离子的新功能),从而拓展了三价铁离子在肿瘤治疗方面的应用。
发明人巧妙地利用肿瘤微环境中的过氧化氢,在纳米粒中加入了三价铁离子,三价铁离子可催化过氧化氢反应生成氧气,从而改善了肿瘤微环境,增加了环境中的氧含量,同时给吲哚菁绿的光动力作用提供底物。在激光辐照下,吲哚菁绿可以将产生的氧气转化成为活性氧,活性氧对肿瘤组织具有杀伤作用。
(2)缺氧微环境促进新生血管生成,促进肿瘤细胞的转移能力,诱导产生炎性环境和酸性环境,从而促进肿瘤细胞产生免疫逃逸现象。在本方案中,三价铁离子催化过氧化氢生成氧气,改善肿瘤缺氧微环境,对肿瘤的发展、转移等具有抑制作用。
(3)吲哚菁绿作为一种用于活体荧光成像的近红外(NIR)染料,具有引导成像的作用。
(4)吲哚菁绿具有光热转换作用,可以将激光辐照的能量转换成热能,实现对肿瘤的光热治疗。
(5)将吲哚菁绿吸附在掺铁聚合物形成的内核,解决了吲哚菁绿在体内不稳定且半衰期短的问题,延长了吲哚菁绿在体内的保留时间,使其能够更好的发挥肿瘤治疗作用。
(6)掺铁聚合物纳米粒中含有铁离子,可实现磁共振成像。可以在核磁共振成像的引导下,对肿瘤组织进行光热和光动力治疗。
进一步,所述掺铁聚合物的合成原料包括六水合三氯化铁和2,6-二氨基吡啶。
采用上述技术方案,六水合三氯化铁是常见的化学试剂,易于获取,成本低。2,6-二氨基吡啶可发生聚合形成聚二氨基吡啶,三价铁离子可以附着在聚二氨基吡啶形成的立体网状结构上。该结构简单且容易制备,三价铁离子可以较好的发挥其催化作用。现有技术中,将铁元素制备到纳米颗粒中,往往采用的是用生物相容性较好的脂质体或聚乳酸-羟基乙酸共聚物等去包裹含三价铁的材料(如铁的氧化物等)。但是发明人发现,采用成膜材料包裹的方案,并不能使三价铁很好发挥其催化作用,不能产生足够的氧气以促进吲哚菁绿的光动力作用。发明人分析这与成膜材料对三价铁和底物之间形成一定的阻挡有关。发明人尝试了各种纳米材料,最后发现2,6-二氨基吡啶形成的聚合物不但对三价铁离子有较为稳固的吸附作用,还能增加三价铁离子的催化作用,提高纳米粒的肿瘤杀伤作用。
进一步,所述功效物质还包括葡萄糖氧化酶。
采用上述技术方案,葡萄糖氧化酶(GOX)载于纳米粒上,在运送至肿瘤组织后,葡萄糖氧化酶可以通过消耗肿瘤微环境中的葡萄糖,来阻断肿瘤细胞的葡萄糖代谢,实现饥饿疗法。葡萄糖和氧气在葡萄糖氧化酶的催化下形成过氧化氢和葡萄糖酸。产生的过氧化氢又可以在三价铁离子的作用下继续反应生成氧气,氧气分别供给吲哚菁绿的光动力作用和葡萄糖氧化酶的分解作用。
另外,在三价铁离子的催化下,肿瘤微环境中累积氧气,底物量增加,进一步加速了葡萄糖的分解,加强了葡萄糖氧化酶对肿瘤细胞的葡萄糖代谢的阻断作用,加快了肿瘤进入饥饿状态的速度。
在本方案中,两个反应过程(指的是:三价铁离子催化过氧化氢生成水和氧气,以及葡萄糖氧化酶催化葡萄糖和氧气生成过氧化氢和葡萄糖酸)相互促进、相互补充,加强了肿瘤治疗效果。葡萄糖氧化酶阻断肿瘤细胞的能量代谢,抑制肿瘤细胞增殖;吲哚菁绿促进活性氧的生成,直接破坏肿瘤细胞;残余的肿瘤细胞可以通过吲哚菁绿光热治疗作用被杀死。
虽然葡萄糖氧化酶催化葡萄糖和氧气形成过氧化氢和葡萄糖酸的反应机理是已知,但是这个反应过程通常都被应用在一些体外环境中,将这种外源的酶应用于复杂的体内环境,特别是应用在肿瘤微环境中(相对于正常组织环境更为复杂),其催化作用是否能够发生,使其能够发生催化作用的条件是什么,即使酶能发挥其催化作用,其产物是否能够促进其下游反应,这些问题都是未知的,需要付出大量的创造性劳动才能获得的。发明人经过大量研究发现使用本方案的残铁聚合物载体,以及配合三价铁离子等纳米粒组成材料的作用,葡萄糖氧化酶具有较强的催化活性,从而促进了纳米粒的肿瘤杀伤作用。
进一步,一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将六水合三氯化铁溶解于水中,得三氯化铁溶液;然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;搅拌所述混合溶液A,得含有掺铁聚合物的溶液;
步骤(2)功效物质的吸附:将葡萄糖氧化酶溶液和吲哚菁绿溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得含有掺铁聚合物纳米粒的溶液。
采用上述技术方案,可以制得粒径均匀、性质稳定、分散度好和化疗药物包封率高的掺铁聚合物纳米粒。
进一步,在步骤(1)中,2,6-二氨基吡啶、六水合三氯化铁和水的用量比为20mmol:80mmol:400ml。
采用上述技术方案,2,6-二氨基吡啶可充分聚合形成聚合二氨基吡啶,并将三价铁离子吸附在聚合二氨基吡啶的三维网状结构上。
进一步,在步骤(1)中,室温下搅拌三氯化铁溶液1~3h后,然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A。
采用上述技术方案,在2,6-二氨基吡啶交联的同时,三价铁离子在三维网状结构上形成附着,增大三价铁离子的附着量。
进一步,在步骤(1)中,在37℃的条件下,搅拌所述混合溶液A12~24h,得含有掺铁聚合物的溶液。
采用上述技术方案,可将掺铁聚合物充分分散,达到纳米级别的要求。
进一步,在步骤(2)中,葡萄糖氧化酶溶液中含有50μg/ml~2mg/ml的葡萄糖氧化酶,吲哚菁绿溶液中含有50μg/ml~2mg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液、吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1:1。
采用上述技术方案,采用上述浓度和比例的溶液,葡萄糖氧化酶和吲哚菁绿可以充分吸附到掺铁聚合物内核上,获得较高的药物包封率。
进一步,所述掺铁聚合物纳米粒的粒径为37.78~71.74nm,表面电位为-23.23~-11.97mV。
采用上述技术方案,上述粒径的纳米粒,有较好的生物利用率,并能够较为高效的穿过血管壁抵达目的组织。
进一步,一种掺铁聚合物纳米粒在肿瘤治疗药物中的应用。
采用上述技术方案,实验数据证明,本方案的掺铁聚合物纳米粒对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用,可以作为肿瘤治疗药物进行临床应用。
附图说明
图1为实施例1的Fe-PDAP/GOX/ICG透射电镜图;
图2为实施例3的Fe-PDAP透射电镜图;
图3为实施例1、实施例2和实施例3的三种纳米粒粒径分布图;
图4为实施例1、实施例2和实施例3的三种纳米粒电位分布图;
图5为实施例1的Fe-PDAP/GOX/ICG的紫外吸收图;
图6为实施例1的X射线光电子谱(XPS)分析;
图7为实验例1的葡萄糖氧化酶(GOX)酶活分析;
图8为实验例2的Fe-PDAP/GOX/ICG的产氧实验结果;
图9为实验例3的细胞内产生ROS实验结果(对照组);
图10为实验例3的细胞内产生ROS实验结果(激光辐照组);
图11为实验例3的细胞内产生ROS实验结果(Fe-PDAP/GOX/ICG组);
图12为实验例3的细胞内产生ROS实验结果(Fe-PDAP/ICG+PDT组);
图13为实验例3的细胞内产生ROS实验结果(Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组);
图14为实验例4的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体外成像实验结果图;
图15为实验例5的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验结果图(0h,T1加权成像);
图16为实验例5的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验结果图(6h,T1加权成像);
图17为实验例5的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验结果图(12h,T1加权成像);
图18为实验例5的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验结果图(24h,T1加权成像);
图19为实验例5的Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验结果图(48h,T1加权成像);
图20为实验例6的CCK-8实验结果图;
图21为实验例7的细胞染色结果图(control组);
图22为实验例7的细胞染色结果图(laser only组);
图23为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/ICG组);
图24为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/GOX/ICG组);
图25为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/ICG+PDT组);
图26为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组);
图27为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组);
图28为实验例7的细胞染色结果图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组);
图29为实验例8的体内治疗肿瘤组织体积变化曲线图;
图30为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(control对照);
图31为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(laser only组);
图32为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/ICG组);
图33为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/GOX/ICG组);
图34为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/ICG+PDT组);
图35为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组);
图36为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组);
图37为实验例8的体内治疗离体肿瘤组织染色图(Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明:
实施例1:掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX/ICG)的制备
1.制备过程
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将80mmol六水合三氯化铁溶解于400ml去离子水中,得三氯化铁溶液;室温下搅拌三氯化铁溶液1h后,然后在三氯化铁溶液加入20mmol 2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;在37℃的条件下,搅拌混合溶液A 24h,得含有掺铁聚合物(Fe-PDAP)的溶液。
步骤(2)功效物质的吸附:将葡萄糖氧化酶溶液和吲哚菁绿溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得含有掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX/ICG)的溶液。葡萄糖氧化酶溶液中含有50μg/ml-2mg/ml的葡萄糖氧化酶,吲哚菁绿溶液中含有2mg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液、吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1:1。
2.性质测定
在透射电镜下观察纳米粒的形态,如图1所示,并用马尔文粒径仪测量该纳米粒的粒径和电位,如图3和图4所示。采用紫外分光光度计测量本实施例制备的Fe-PDAP/GOX/ICG的吸光光度值,对比Fe-PDAP、ICG和GOX各自单独的吸光光度值,图5表明了ICG和GOX已经被吸附到了掺铁聚合物(Fe-PDAP)内核上。X射线光电子谱(XPS)分析结果,如图6所示,也表明了ICG和GOX已经被吸附到了掺铁聚合物内核上。
实施例2:不含ICG的掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX)的制备
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将80mmol六水合三氯化铁溶解于400ml去离子水中,得三氯化铁溶液;室温下搅拌三氯化铁溶液1h后,然后在三氯化铁溶液加入20mmol 2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;在37℃的条件下,搅拌混合溶液A 24h,得含有掺铁聚合物(Fe-PDAP)的溶液。
步骤(2)功效物质的吸附:将葡萄糖氧化酶溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得不含ICG的掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX)的溶液。葡萄糖氧化酶溶液中含有50μg/ml-2mg/ml的葡萄糖氧化酶,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1。
本实施例制备的纳米粒的粒径和电位,如图3和图4所示。
实施例3:掺铁聚合物(Fe-PDAP,FeⅢ-doped polydiaminopyridinenanofusiforms)的制备
将80mmol六水合三氯化铁溶解于400ml去离子水中,得三氯化铁溶液;室温下搅拌三氯化铁溶液1h后,然后在三氯化铁溶液加入20mmol 2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;在37℃的条件下,搅拌混合溶液A 24h,得含有掺铁聚合物(Fe-PDAP)的溶液。本实施例制备的Fe-PDAP纳米粒的透射电镜图像见图2。对比实施例1制备的Fe-PDAP/GOX/ICG纳米粒,本实施例制备的Fe-PDAP纳米粒边缘清晰,说明该纳米粒上没有GOX和ICG附着,而实施例1制备的Fe-PDAP/GOX/ICG纳米粒的边缘有类似“光晕”的形状,是因为GOX和ICG附着在了纳米粒的核心(核心即为掺铁聚合物内核)上。本实施例制备的纳米粒的粒径和电位,如图3和图4所示。
实施例4:不含GOX的掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/ICG)的制备
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将80mmol六水合三氯化铁溶解于400ml去离子水中,得三氯化铁溶液;室温下搅拌三氯化铁溶液1h后,然后在三氯化铁溶液加入20mmol 2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;在37℃的条件下,搅拌混合溶液A 24h,得含有掺铁聚合物(Fe-PDAP)的溶液。
步骤(2)功效物质的吸附:将吲哚菁绿溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得不含GOX的掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/ICG)的溶液。吲哚菁绿溶液中含有2mg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1。
实施例5:掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX/ICG)的制备
本实施例基本同实施例1,不同点在于:在步骤(1)中,室温下搅拌三氯化铁溶液3h后,然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;在37℃的条件下,搅拌所述混合溶液A12h,得含有掺铁聚合物的溶液。
实施例6:掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX/ICG)的制备
本实施例基本同实施例1,不同点在于:在步骤(2)中,葡萄糖氧化酶溶液中含有2mg/ml的葡萄糖氧化酶,吲哚菁绿溶液中含有2mg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液、吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1:1。
实施例7:掺铁聚合物纳米粒(Fe-PDAP/GOX/ICG)的制备
本实施例基本同实施例1,不同点在于:在步骤(2)中,葡萄糖氧化酶溶液中含有50μg/ml的葡萄糖氧化酶,吲哚菁绿溶液中含有50μg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液、吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1:1。
实验例1:葡萄糖氧化酶(GOX)酶活分析
原理:葡萄糖被GOX催化产生葡萄糖酸,引起PH值的变化,通过检测PH的变化证明GOX的活性。
方法:用PH计测定了GOX诱导的PH值变化。简单地说,在葡萄糖溶液中(1mg/ml)中加入GOX或Fe-PDAP/GOX/ICG(均保持GOX浓度为0.05mg/ml),以蒸馏水作为对照(control),总体系为20ml。本实验共三个实验组:GOX组、Fe-PDAP/GOX/ICG组和对照组,本实验例采用实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒。
结果:GOX和Fe-PDAP/GOX/ICG组的PH值出现了明显的下降,Fe-PDAP/GOX/ICG组在70min时间点,pH值从7.28下降到7.05。相比之下,没有GOX处理的对照组溶液pH值保持在7.28不变。本实验证明了Fe-PDAP/GOX/ICG具有GOX的酶活性。(实验结果见图7)
实验例2:Fe-PDAP/GOX/ICG产氧实验
原理:Fe-PDAP/GOX/ICG的Fe3+可以催化H2O2产生O2,使用便携式溶解氧测定仪测定O2浓度的变化。
方法:在20ml的不同浓度的Fe-PDAP/GOX/ICG(采用实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒)中加入过氧化氢(100μl,30mM),并磁力搅拌,通过便携式溶解氧测定仪测定氧气浓度。对照组(control)加入蒸馏水。本实验共设置四个实验组:50μg/ml Fe-PDAP/GOX/ICG组,100μg/ml Fe-PDAP/GOX/ICG组,150μg/ml Fe-PDAP/GOX/ICG组,对照组(control)。
结果:加入不同浓度的Fe-PDAP/GOX/ICG纳米粒后,O2浓度增加,而对照组没有变化。而且氧气的增加与Fe-PDAP/GOX/ICG的浓度相关。(实验结果见图8)
实验例3:细胞内产生活性氧(ROS)实验
方法:用2',7'-二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内ROS的生成。MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)被播种在共聚焦板上,然后1ml的高葡萄糖培养基培养,待细胞生长至80%左右,加入不同的纳米粒(使用实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒或实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,均保持ICG的浓度为12.5μg/ml),孵育4h后用PBS洗三次,再加入DCFH-DA与细胞共同孵30min,然后使用PBS洗三次后用808激光照射3min(1.0W/cm2)。最后用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察荧光图像。
本实验例共设置五个实验组:空白对照组(细胞中不加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,不使用激光照射);激光辐照组(细胞中不加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,使用激光照射);Fe-PDAP/GOX/ICG组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,不使用激光照射);Fe-PDAP/ICG+PDT组(细胞中加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,使用激光照射);Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,使用激光照射)。
结果:DCFH-DA可以被细胞内的活性氧氧化后生成带绿色荧光。对照组、激光辐照组、Fe-PDAP/GOX/ICG组未见明显的绿色荧光。值得注意的是,在波长808nm的激光辐照下Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组的细胞表现出强烈的绿色荧光,证明了Fe-PDAP/GOX/ICG纳米粒在激光辐照作用下有较强的产生活性氧的能力。(实验结果见图9-图13)
实验例4:Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体外成像实验
方法:将Fe-PDAP/GOX/ICG(实施例1中制备)稀释成不同浓度(根据电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)得到的Fe浓度为0.02、0.04、0.083、0.167、0.33mM),并取2ml于EP管中,进行T1磁共振成像实验。通过1/T1弛豫时间(s-1)与Fe浓度(mM)的拟合曲线,对相关性值(r)进行评估。
结果:在T1加权核磁共振图像中,随着Fe-PDAP/GOX/ICG浓度的升高,亮度增加。Fe-PDAP/GOX/ICG表现出铁浓度依赖的超顺磁性,弛豫(r1)值为2.122mM-1s-1。(实验结果如图14所示)
实验例5:Fe-PDAP/GOX/ICG的核磁共振体内成像实验
方法:向荷瘤小鼠注射(静脉注射)200μl的Fe-PDAP/GOX/ICG溶液(采用实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒Fe-PDAP/GOX/ICG,其中ICG浓度为800μg/ml)。然后在0、6、12、24、48h五个时间点采集核磁共振图像。
结果:静脉注射Fe-PDAP/GOX/ICG后,在6h和12h时间点,可见肿瘤部位明显的增亮效果,且增亮效果持续24h。通过体内外实验表明,Fe-PDAP/GOX/ICG可以有效地在肿瘤中积累,可以作为增强核磁共振的对比剂。(实验结果如图15-19所示)
实验例6:CCK-8实验
将MDA-M-231(人乳腺癌细胞)播种在共聚焦板上,待细胞生长至80%左右,加入不同的药物或者纳米粒孵育4h(根据实验分组加药),根据分组予以808nm激光辐照。分为8组:1.control组(加入PBS 20ul,总体系为1ml,不进行激光辐照);2.laser only组(加入PBS20ul,总体系为1ml,后予以2.0W/cm2,5min,不加药物或者纳米粒,只进行激光辐照);3.Fe-PDAP/ICG组(细胞中加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml);4.Fe-PDAP/GOX/ICG组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml);5.Fe-PDAP/ICG+PDT组(细胞中加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml),6.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用光动力治疗(PDT)法);7.Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用光热治疗(PTT)法),8.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用PTT和PDT治疗法,PDT和PTT是分步做的,先PDT后再PTT)。其中,PDT是指给予激光强度为1.0W/cm2的激光辐照3min,PTT是指给予激光强度为2.0W/cm2的激光辐照5min。激光辐照后加入CCK-8试剂后共同孵育2h,使用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定光吸收值,并计算细胞存活率。
实验结果:control组,laser only组,Fe-PDAP/ICG组,Fe-PDAP/GOX/ICG组没有明显的细胞毒性。808nm激光照射下(1.0W/cm2,3min),Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT的细胞毒性高于Fe-PDAP/ICG+PDT,说明PDT与饥饿治疗在Fe-PDAP/GOX/ICG治疗下具有很强的协同效应。虽然光动力效应和饥饿治疗显示出较强的协同效应,但仍有部分肿瘤细胞存活。在Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组中,约35%的细胞破坏,在Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组中,大约83%的细胞死亡,而在Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组中,细胞死亡在95%以上。说明Fe-PDAP/GOX/ICG具有良好的联合治疗效果(PDT、PTT和饥饿疗法三者联合)(见图20)。
实验例7:细胞染色实验
方法:将MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)播种在共聚焦板上,待细胞生长至80%左右,加入不同的药物或者纳米粒孵育4h(根据实验分组确定),根据分组给与或不给与808nm激光辐照。分为8组:1.control组(加入PBS 20ul,总体系为1ml,不进行激光辐照);2.laseronly组(加入PBS 20ul,总体系为1ml,后予以2.0W/cm2,5min,不加药物或者纳米粒,只进行激光辐照);3.Fe-PDAP/ICG组(细胞中加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml);4.Fe-PDAP/GOX/ICG组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml);5.Fe-PDAP/ICG+PDT组(细胞中加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml),6.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用光动力治疗(PDT)法);7.Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用光热治疗(PTT)法),8.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组(细胞中加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒,其中ICG的终浓度为12.5ug/ml,总体系为1ml,并采用PTT和PDT治疗法,PDT和PTT是分步做的,先PDT后再PTT)。其中,PDT是指给予激光强度为1.0W/cm2的激光辐照3min。激光辐照后将细胞与钙调绿素CAM(2mM)和碘化丙啶PI(4mM)溶液共染色后,用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步扫描。
结果:CAM/PI是用来区分活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)。MDA-MB-231细胞经PBS、激光、Fe-PDAP/ICG、Fe-PDAP/GOx/ICG处理后无明显细胞死亡。Fe-PDAP/GOX/ICG组在PDT+PTT治疗中,几乎所有MDA-MB-231细胞都死亡了。这些结果与CCK-8法一致,证实了Fe-PDAP/GOX/ICG具有显著的协同治疗作用。(实验结果如图21-图28所示)
实验例8:体内治疗实验
方法:荷瘤小鼠分为8组:1.control组(加入PBS 200ul);2.laser only组(加入PBS 200ul后予以2.0W/cm2辐照处理,10min);3.Fe-PDAP/ICG组(加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml);4.Fe-PDAP/GOX/ICG组(加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml);5.Fe-PDAP/ICG+PDT组(加入实施例4中制备的不含GOX的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml,并使用PDT疗法);6.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组(加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml,并使用PDT疗法);7.Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组(加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml,并使用PTT疗法);8.Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组(加入实施例1中制备的掺铁聚合物纳米粒200ul,其中ICG的浓度为800ug/ml,并同时使用PDT和PTT疗法,PDT和PTT是分步做的,先PDT后再PTT)。其中,PDT是指给予激光强度为1.0W/cm2的激光辐照10min(30s开,30s关),PTT是指给予激光强度为2.0W/cm2的激光辐照10min。采用红外热成像摄像机记录温度和红外热图像,使采用PDT疗法的实验组的温度低于43℃(用热红外成像仪检测肿瘤部位的温度),采用PTT疗法的实验组的温度高于50℃。每2天记录肿瘤体积,共14天。肿瘤体积计算公式为:肿瘤体积=长x(宽)2/2。相对肿瘤体积计算为V/V0(V0为治疗前的初始肿瘤体积,V为治疗后的肿瘤体积)。治疗后24小时,每组处死1只小鼠,取肿瘤组织用H&E染色(苏木精—伊红染色法)法进行组织病理学分析。
实验结果:control组、laser only组、Fe-PDAP/ICG组和Fe-PDAP/GOX/ICG组肿瘤体积无明显差异,说明这些纳米粒或单纯激光对肿瘤生长的治疗效果不明显。而Fe-PDAP/ICG+PDT组、Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT组、Fe-PDAP/GOX/ICG+PTT组和Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组,肿瘤生长受到不同程度的抑制。观察14天后,可见Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT较好的治疗效果,在几组实验中治疗作用最强(实验结果见图29)。
此外,H&E染色显示Fe-PDAP/GOX/ICG+PDT+PTT组肿瘤切片细胞核变形明显多于其他各组,说明癌细胞受到严重损伤(实验结果见图30-37)。
以上所述的仅是本发明的实施例,方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明结构的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种掺铁聚合物纳米粒,其特征在于,包括掺铁聚合物形成的内核和吸附在内核上的功效物质;所述掺铁聚合物含有三价铁离子,所述功效物质包括吲哚菁绿和葡萄糖氧化酶;
其由如下步骤制备而成:
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将六水合三氯化铁溶解于水中,得三氯化铁溶液;然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;搅拌所述混合溶液A,得含有掺铁聚合物的溶液;
步骤(2)功效物质的吸附:将葡萄糖氧化酶溶液和吲哚菁绿溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得含有掺铁聚合物纳米粒的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1)掺铁聚合物内核的制备:将六水合三氯化铁溶解于水中,得三氯化铁溶液;然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A;搅拌所述混合溶液A,得含有掺铁聚合物的溶液;
步骤(2)功效物质的吸附:将葡萄糖氧化酶溶液和吲哚菁绿溶液分散到步骤(1)获得的含有掺铁聚合物的溶液中,得混合溶液B;搅拌混合溶液B,得含有掺铁聚合物纳米粒的溶液。
3.根据权利要求2所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,2,6-二氨基吡啶、六水合三氯化铁和水的用量比为20mmol:80mmol:400ml。
4.根据权利要求3所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,室温下搅拌三氯化铁溶液1~3h后,然后在三氯化铁溶液加入2,6-二氨基吡啶,得混合溶液A。
5.根据权利要求4所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,在37℃的条件下,搅拌所述混合溶液A 12~24h,得含有掺铁聚合物的溶液。
6.根据权利要求5所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,在步骤(2)中,葡萄糖氧化酶溶液中含有50μg/ml~2mg/ml的葡萄糖氧化酶,吲哚菁绿溶液中含有50μg/ml~2mg/ml的吲哚菁绿,含有掺铁聚合物的溶液中含有5mg/ml的掺铁聚合物;葡萄糖氧化酶溶液、吲哚菁绿溶液和含有掺铁聚合物的溶液的体积比为1:1:1。
7.根据权利要求6所述的一种掺铁聚合物纳米粒的制备方法,其特征在于,所述掺铁聚合物纳米粒的粒径为37.78~71.74nm,表面电位为-23.23~-11.97mV。
8.根据权利要求1所述的一种掺铁聚合物纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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