CN112807430A - 一种纳米酶基材料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用；所述纳米酶基材料，包括TiO2纳米颗粒；和锚定在所述TiO2纳米颗粒上的Cu单原子。在体内实现Cu/TiO2的荧光成像导航下，通过超声辐照，激活TiO2基表面的电子(e‑)将静止状态的Cu原子还原为活化状态Cu1+，当暴露在过表达H2O2的肿瘤微环境中，H2O2占据Cu单原子的结合位点，从而增强Cu1+诱导的催化性能并协同SDT精准治疗；Cu/TiO2在实现分子影像诊断的同时具有高催化活性的单原子纳米酶特性，大大提高了催化活性，争取为乳腺癌患者提供一种新型的、高效的、副作用小的可视化的诊断与精准治疗一体化的新的治疗方式。

Description

一种纳米酶基材料的应用
技术领域
本发明属于声敏剂技术领域，尤其涉及一种纳米酶基材料的应用。
背景技术
随着纳米科学和纳米技术的快速发展，单原子纳米酶由于原子活性金属中心的充分暴露，具有良好的催化效率最大的金属原子利用率、高活性及良好的再循环性能，备受广大研究学者的关注。纳米酶已被广泛应用于治疗活性氧(ROS)相关疾病，但作为一项重大挑战，临床应用的催化活性的探索仍在进行中。
Yan及其团队研发了一种基于纳米酶的单原子催化绷带Pt/CeO2，用于非侵入性治疗神经创伤，该纳米酶绷带可以通过清除ROS和减少脑外伤后神经元系统的炎症来保护神经元。单原子Pt/CeO2通过降低化学反应的结合能，使其具有数倍以上的多酶活性同时避免由于持续供氧而导致的活性退化。与传统的抗氧化绷带相比，该纳米酶绷带提供了一种治疗脑外伤的非侵入性治疗神经性创伤的解决方案，通过合理的设计在单原子水平，不仅提高了催化活性，同时也大大降低了毒副作用。这种基于纳米酶的绷带可以在紧急情况下提供持续的局部治疗，但单一的纳米催化治疗仍然无法满足临床治疗的需求。Huo等人合成了氮掺杂碳中单铁原子的纳米催化剂(SAF NCs)，与其他含铁纳米过氧化物酶一样，SAF NCS能有效地催化过氧化物酶样反应，通过催化H2O2，产生丰富的·OH杀死革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)。此外，结合808nm近红外激光照射对细菌灶的局部热疗，可以有效地消除细菌细胞该纳米催化剂在体内外均表现出高效抗菌性能。病原菌是严重威胁人类健康的细菌性传染病的主要病因。随着抗生素的滥用使这些细菌产生了多药耐药(MDR)，这对抗生素的升级提出了挑战。为了解决传统抗生素应用引起的多药耐药特性，出现了几种有机抗菌物质，如带正电荷的多肽和季铵盐，主要集中在细菌膜的粘附和破坏上。然而，这些抗菌药物在体内降解成有毒有机物质，严重地诱导了潜在的稳定性和生物毒性问题，从而限制了体内临床应用。因此，迫切需要开发能够克服MDR特性的高效生物相容性抗菌剂。单原子催化剂由于充分暴露了原子活性金属中心，具有极好的催化效率和稳定性，已经成为领先的纳米催化剂。SAF NCs作为一个典型的范例，由于具有催化活性的非贵金属原子高度分散并锚定在碳化的锌金属有机骨架载体上，含单原子的纳米催化剂能够在电化学氧还原反应和精细化学合成方面产生与含贵金属的催化剂相当的催化性能。此类单原子纳米酶催化剂结合光热疗法用于抗炎治疗，但因光射线的穿透深度的局限性，对深部组织的炎症或肿瘤的治疗效果仍有受限。
近年来，海南省乳腺癌发病率日渐增高，其发病有年轻化的趋势，已成为当今社会的重大公共卫生问题。目前仍以化疗及手术治疗为主，但治疗效果差，复发率高。以往的研究中已报道了多种纳米酶的合成策略，如将有机酶包裹成纳米颗粒，由于结合了天然/人工有机酶和纳米粒子的优点，具有优越的催化性能而受到广泛关注。在靶向给药、生物传感、生物成像等生物应用中，需要用亲和配体接枝纳米酶。不仅制备成本高、难度高和稳定性较差，而且在体内降解成有毒有机物质，严重地诱导了潜在的稳定性和生物毒性问题，从而限制了体内临床应用。当纳米酶的活性表面被纳米粒子覆盖，可能因此失去催化活性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米酶基材料的应用，该纳米酶基材料作为声敏剂在声动力治疗中具有较高的催化活性。
本发明提供了一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用；
所述纳米酶基材料，包括TiO2纳米颗粒；
和锚定在所述TiO2纳米颗粒上的Cu单原子。
优选地，所述纳米酶基材料中Ti元素和Cu元素的质量比为50:0.99～1.01。
优选地，所述纳米酶基材料采用甲氧基聚乙二醇氨基表面功能化修饰。
优选地，所述甲氧基聚乙二醇氨基的分子量为1900～2100g/mol；
所述纳米酶基材料和甲氧基聚乙二醇氨基的质量比为1:48～52。
优选地，所述纳米酶基材料的制备方法，包括以下步骤：
将SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O溶液混合，离心分离，得到SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子；
将聚乙烯吡咯烷酮吸附在所述SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子上，离心分离，分散在乙醇-水混合溶液中，再加入氨水和正硅酸乙酯，反应，洗涤后离心，形成SiO2覆盖层，干燥，研磨，得到SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体；
将所述纳米粉体煅烧，冷却至室温后刻蚀SiO2，得到纳米酶基材料。
优选地，所述煅烧的温度为850～950℃，煅烧的时间为110～130min。
优选地，所述刻蚀SiO2的过程包括：
将冷却至室温的纳米粉体分散在碱溶液中，加热至85～95℃，反应3.5～4.5h，离心，洗涤，得到纳米酶基材料。
优选地，SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O混合具体包括：
将CuCl2·2H2O溶液以1mL/h的速度滴加至SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液中，滴加完毕后室温下搅拌170～190min。
本发明提供了一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用；所述纳米酶基材料，包括TiO2纳米颗粒；和锚定在所述TiO2纳米颗粒上的Cu单原子。在体外实现Cu/TiO2超声激活产生的电子(e-)将静止状态的Cu原子还原为活化状态Cu1+；Cu单原子的价态变化同时诱导相邻TiO2的活化，将TiO2调整至声能治疗的活跃状态，从而增强催化性能并协同声动力治疗肿瘤，实现乳腺癌的高效协同治疗；建立乳腺癌动物模型，在体内实现Cu/TiO2的荧光成像导航下，通过超声辐照，激活TiO2基表面的电子(e-)将静止状态的Cu原子还原为活化状态Cu1+，当暴露在过表达H2O2的肿瘤微环境中，H2O2占据Cu单原子的结合位点，从而增强Cu1+诱导的催化性能并协同SDT精准治疗；Cu/TiO2在实现分子影像诊断的同时具有高催化活性的单原子纳米酶特性，大大提高了催化活性，争取为乳腺癌患者提供一种新型的、高效的、副作用小的可视化的诊断与精准治疗一体化的新的治疗方式。
附图说明
图1为TiO2、Cu/TiO2纳米粒子和Cu/TiO2-PEG的粒径分布图；
图2为Cu/TiO2纳米粒子的XRD图；
图3为Cu/TiO2纳米粒子、Cu/TiO2-PEG和mPEG-NH2的红外光谱图；
图4中a为Cu/TiO2的透射电镜图；b为HADDF-STEM显像进行Cu单原子表征图；c为Cu/TiO2的Mapping元素分析；d为Cu/TiO2纳米粒子的制备过程中物料的透射电镜图；
图5为CCK8法检测不同处理方式下的纳米颗粒对乳腺癌细胞株4T1的细胞毒性；
图6为各组细胞对纳米微粒的摄取情况；
图7为共聚焦荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞经不同处理后产生的活性氧自由基情况；
图8为荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞的凋亡情况；
图9为血液学分析Cu/TiO2纳米声敏剂的生物安全性；
图10为主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色分析Cu/TiO2纳米声敏剂的组织相容性；
图11为体外超声激活并增强Cu/TiO2纳米声敏剂的酶样活性测试图；
图12为Cu/TiO2纳米酶基声敏剂在动物体内的分子显像效果图；
图13为4T1荷瘤小鼠15天内经不同处理后体内精准治疗效果评估；
图14为4T1荷瘤小鼠15天内经不同处理后的生物安全性评估。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用；
所述纳米酶基材料，包括TiO2纳米颗粒；
和锚定在所述TiO2纳米颗粒上的Cu单原子。
本发明采用的纳米酶基材料具有如下多重功能：(1)Cu/TiO2缺陷层的引入可以提高超声激发下TiO2基体电子(e-)和空穴(h+)的分离效率，从而提高单线态氧(1O2)等活性氧自由基ROS的产生效率，进一步提升SDT的治疗效率；(2)Cu/TiO2中的Cu单原子锚定在TiO2纳米颗粒最稳定的Ti空位中，活性中心位于TiO2纳米颗粒表面，超声激活过程中产生的电子(e-)将静止状态的Cu原子还原为活化状态Cu1+，当暴露在过表达H2O2的肿瘤微环境中，H2O2占据Cu单原子的结合位点，与Cu1+发生Fenton催化反应生成活性氧自由基ROS，实现纳米酶样活性(如：氧化酶样活性)，协同并增强SDT疗效；(3)Cu/TiO2中Cu单原子是模拟纳米酶的活性中心，当H2O2脱离Cu单原子的活性位点，Cu单原子从活化状态恢复成初始静止状态，Cu单原子的活性位点不被消耗。(4)Cu单原子价态的改变可逆调节局部TiO2晶格，诱导相邻TiO2活化，从而显著提高SDT治疗效率；(5)Cu/TiO2良好的荧光成像特性，可以利用荧光成像等分子成像技术为后续的SDT治疗提供导航和原位监控。
在本发明中，所述Cu/TiO2中Ti元素和Cu元素的质量比为50:0.99～1.01，更优选为50:0.999～1.0。所述纳米酶基材料的粒径优选为202～204nm。
在本发明中，所述纳米酶基材料的制备方法，包括以下步骤：
将SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O溶液混合，离心分离，得到SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子；
将聚乙烯吡咯烷酮吸附在所述SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子上，离心分离，分散在乙醇-水混合溶液中，再加入氨水和正硅酸乙酯，反应，洗涤后离心，形成SiO2覆盖层，干燥，研磨，得到SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体；
将所述纳米粉体煅烧，冷却至室温后刻蚀SiO2，得到Cu/TiO2纳米酶基材料。
本发明将SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O溶液混合，离心分离，得到SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子。本发明通过以下步骤调整局部金属原子配置；具体的，将CuCl2·2H2O溶液以1mL/h的速度滴加至SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液中，滴加完毕后室温下搅拌170～190min。其中，1≤x≤2。
在本发明中，所述SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液优选按照以下方法制得：
将乙醇、水、氨水和正硅酸乙酯混合，反应，洗涤，得到SiO2纳米粒子；
将所述SiO2纳米粒子分散在乙醇中，再加入乙腈和氨水，超声处理，得到SiO2纳米粒子分散液；
将钛酸四丁酯溶解在乙醇-乙腈混合液中，得到的溶液再加入到SiO2纳米粒子分散液中，搅拌170～190min，离心，洗涤，得到SiO2@TiO2纳米粒子；
将SiO2@TiO2纳米粒子分散在水中，得到SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液。
在本发明中，SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O溶液混合的时间为170～190min。离心分离后用水洗涤。金属铜离子的吸附使得材料的颜色由白色变为淡蓝色。
得到SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子后，本发明将聚乙烯吡咯烷酮吸附在所述SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子上，离心分离，分散在乙醇-水混合溶液中，再加入氨水和正硅酸乙酯，反应，洗涤后离心，形成SiO2覆盖层，干燥，研磨，得到SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体。
所述氨水的质量分数为28～30wt％。
得到SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体后，本发明将所述纳米粉体煅烧，冷却至室温后刻蚀SiO2，得到Cu/TiO2纳米酶基材料。所述煅烧的温度优选为850～950℃，煅烧的时间为110～130min。
所述刻蚀SiO2的过程包括：
将冷却至室温的纳米粉体分散在碱溶液中，加热至85～95℃，反应3.5～4.5h，离心，洗涤，得到Cu/TiO2纳米酶基材料。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
主要试剂及设备：钛(Iv)正丁氧烷(TBOT，Strem化工公司)、二水氯化铜(CuCl2·2H2O)、正硅酸乙酯(TEOS、Sigma Aldrich公司)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量55000，SigmaAldrich公司)、乙腈(Sigma Aldrich公司)，纯度为99.9％的乙醇、氢氧化钠(NaOH)和氨水(28～30wt％，三春化工公司)
实施例1
1、二氧化硅纳米粒子的合成:遵循
Figure BDA0002866374180000061
方法采用溶胶-凝胶法制备球形SiO2纳米粒子。在室温下，在含有乙醇(23ml)、水(4.3ml)和氨水(0.6ml)的溶液中加入0.86ml的正硅酸乙酯(TEOS)。然后将混合物在磁力搅拌机上搅拌6h。反应产物离心，用水和乙醇洗涤，分散在乙醇中。
2、用TiO2包覆SiO2纳米粒子(SiO2@TiO2)：在SiO2颗粒上涂覆了TiO2。将制备的SiO2粒子分散在40ml无水乙醇中。然后，将14ml纯乙腈和0.4ml氨水(28-30wt％)混合到SiO2纳米颗粒溶液中，称为溶液1。溶液1经超声处理10min，得到均匀分散的SiO2纳米粒子。
同时，将0.8mL的钛(Ⅳ)正丁氧烷(TBOT)溶解在含有6ml无水乙醇和2ml乙腈的混合物中(溶液2)。将溶液2加入到溶液1中，搅拌3h，包覆TiO2。将得到的白色溶液离心，分别用乙醇和水洗两次。最后，将SiO2@TiO2纳米粒子分散在40ml的水中。
3、过渡金属原子吸附在SiO2@TiO2纳米粒子上(SiO2@CuOx/TiO2)：CuCl2·2H2O作为金属前驱体。在这一金属原子吸附过程中，在先前制备的SiO2@TiO2纳米粒子的40ml胶体溶液中加入4mg CuCl2·2H2O，随后，将混合胶体溶液在室温下搅拌3h。搅拌后的材料(SiO2@CuOx/TiO2)经离心分离并用水洗净。金属离子吸附使所得材料(SiO2@CuOx/TiO2)的颜色由白色变为被吸附的金属离子CuCl2·2H2O，淡蓝色。
4、SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子包覆SiO2的工艺(SiO2@CuOx/TiO2@SiO2)：上述SiO2@Cu/TiO2纳米粒子被分散在40mL的水中。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)400mg后，溶液搅拌过夜，使PVP吸附在SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子表面。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)吸附后，经离心分离，在乙醇(46ml)和水(8.6ml)溶液中经强超声处理10min后再分散。
然后在上述溶液中加入1.2ml的氨水(28-30wt％)和1.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)。吸附在表面上的金属原子的瞬时稳定在10s内引起了迅速的颜色变化，随后形成了SiO2覆盖层。反应4h后，用乙醇和水清洗产品经过离心，得到的纳米颗粒。在80℃的干燥箱中干燥过夜，然后在砂浆中研磨，以达到均匀性。
5、金属原子再分布(SiO2@CuOx/TiO2@SiO2)焙烧过程：为在空间上限制金属原子的再分布，将干燥的SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体在900℃下煅烧2h，并缓慢降温至室温，得到SiO2@Cu/TiO2@SiO2。
6、刻蚀SiO2制备Cu/TiO2空心纳米粒子(Cu/TiO2 HNPs)剥离工艺：对于SiO2刻蚀，焙烧后的SiO2@Cu/TiO2@SiO2纳米粒子被分散在0.5M NaOH溶液中。然后用连续搅拌将分散体加热到90℃。反应4h后，离心分离产物，用水和乙醇洗涤，得到Cu/TiO2纳米粒子。置于4℃冰箱备用冰箱中保存。
7、为提高Cu/TiO2纳米粒子在生理环境中的稳定性以及提高生物相容性以及保护Cu单原子在血液循环中的催化活性，以甲氧基聚乙二醇氨基(MPEG-Amine，mPEG-NH2，MW:2000)对其进行表面改性。将Cu/TiO2纳米粒子(2mg)与mPEG2000-NH2(100mg)溶于5ml的去离子水中，Cu/TiO2纳米粒子(2mg)与mPEG2000-NH2(100mg)的质量比约1：50。在水浴超声10min，混合均匀，并在磁力搅拌器上搅拌过夜。通过离心分离收集得到的Cu/TiO2-PEG，并用去离子水进一步洗涤2-3次，然后重新分散在10ml去离子水中以备进一步使用
上述材料分散在10ml去离子水中，通过氢氟酸溶液消解并通过电感耦合定理字体发射光谱仪(ICP-OES)分析其各元素的含量。结果显示，上述10ml Cu/TiO2溶液中，Ti元素含量约2000μg/ml，Cu元素含量40μg/ml。Ti:Cu含量的浓度比值为50:1。
本发明对TiO2、Cu/TiO2纳米粒子和Cu/TiO2-PEG的粒径分布如图1所示；图1为TiO2、Cu/TiO2纳米粒子和Cu/TiO2-PEG的粒径分布图，图1可以看出：TiO2粒径为109.55nm±2.757716；Cu/TiO2粒径为202.9667nm±1.814754；Cu/TiO2-PEG粒径为232.3333nm±1.900877。
本发明对Cu/TiO2纳米粒子进行XRD表征，见图2，图2为Cu/TiO2纳米粒子的XRD图。
图3为Cu/TiO2纳米粒子、Cu/TiO2-PEG和mPEG-NH2的红外光谱图；单独PEG红外光谱中，3427cm-1处吸收峰对应O-H伸缩振动，2883cm-1处吸收峰对应C-H伸缩振动，1112cm-1处强峰对应C-O-C伸缩振动，为PEG的特征吸收峰。单独CuTiO2中，TiO2的红外吸收峰在459cm-1和345cm-1处，由于吸收峰较弱，因此未能测出。但CuTiO2纳米粒子表面会有O-H和水吸附，因此，其红外光谱主要以吸附水在3393cm-1处O-H伸缩振动和1648cm-1处O-H弯曲振动为主。由于TiO2的作用，O-H在1648cm-1处吸收峰形发生了畸变。在本案例中，在1648cm-1处吸附水的弯曲振动峰和800～400cm-1处背景吸收宽峰为TiO2的特征吸收峰。
CuTiO2-PEG共混红外光谱中，1634cm-1处O-H的弯曲振动和800-400cm-1处背景吸收宽峰与CuTiO2相应吸收峰的波数，相对强度和吸收峰形都极为相似，因此认为共混物中CuTiO2负载成功。2870cm-1处C-H伸缩振动峰和1108cm-1处C-O-C伸缩振动峰为PEG特征峰。
图4中a为Cu/TiO2的透射电镜图；图4中b为HADDF-STEM显像进行Cu单原子表征图；图4中c为Cu/TiO2的Mapping元素分析；图4中d为Cu/TiO2纳米粒子的制备过程中物料的透射电镜图。图4中b可以看出：锚定在TiO2纳米粒子的Ti空位上的金属是单原子；图4中c可以看出：Cu元素与Ti和O元素分布吻合，说明锚定在TiO2纳米粒子上的金属是Cu单原子。
CCK-8法检测细胞活性：按照纳米颗粒的浓度(以Ti元素的浓度作为参考)分为7组，分别为3.125μg/ml组、6.25μg/ml组、12.5μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组，经不同条件处理后，酶标仪测量各组的吸光度值(OD值)并进行比较(超声辐照参数：声强：0.25～1.0W/cm2，频率：1MHz，占空比：50％，辐照时间10s，间隔5s发射超声波，总辐照时间5min)；图5为CCK8法检测不同处理方式下的纳米颗粒对乳腺癌细胞株4T1的细胞毒性，图5中左边为不同浓度的纳米颗粒对乳腺癌细胞株4T1的细胞毒性以及模拟肿瘤微环境过表达H2O2的特性，验证上述不同浓度的细胞毒性；图5中右边为不同浓度纳米颗粒经超声辐照后的细胞毒性。从图5可以看出：模拟肿瘤微环境时，随着纳米粒子浓度增加，纳米颗粒对乳腺癌细胞株4T1的细胞毒性亦随之增加，同时，经超声辐照后，纳米颗粒对4T1细胞的毒性大幅增加(超声辐照参数：1MHz，50％占空比，1.0W/cm2)。
用FITC标记的Cu/TiO2与乳腺癌细胞株的4T1共同孵育，实验组按照共孵育的时间分四组，分别为0h、2h、4h和8h，共聚焦显微镜以及流式细胞技术观察各组细胞对纳米微粒的摄取情况；图6为各组细胞对纳米微粒的摄取情况；从图6可以看出：随着Cu/TiO2纳米粒子与细胞共孵育的时间越长，细胞对其的摄取就越多。在共孵育至8h时，经流式细胞技术监测细胞对该纳米粒子的摄取高达87.8％，由此亦可确保足够的药物诱导细胞凋亡。
图7为共聚焦荧光显微镜和流式细胞技术观察细胞经不同处理后产生的活性氧自由基情况；从图7可以看出：当单纯使用TiO2-PEG或Cu/TiO2-PEG纳米粒子时，4T1细胞产生的活性氧自由基(ROS)的水平不高，经流式细胞技术定量仅15.17％和18.4％，当两者均经超声辐照处理后，超声的空化效应，电子的转移激活了Cu单原子和TiO2纳米声敏剂的声敏作用，从而可以产生大量的ROS，并且Cu/TiO2-PEG(58.6％)较TiO2-PEG(36.5％)明显升高，由此可见，Cu单原子起到催化产生羟基自由基的同时亦能增强TiO2的声动力效应。
Cu/TiO2纳米酶基声敏剂体外酶催化协同声动力抗癌治疗疗效及其机制研究
为观察Cu/TiO2纳米酶基声敏剂的抗癌性能，采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对处理后的细胞进行Calcein-AM和PI染色，可明显地观察乳腺癌细胞4T1的抗癌性能。将乳腺癌4T1细胞接种于共聚焦专用培养皿中，将细胞与纳米颗粒共孵育，根据体外CCK-8实验中优化出的纳米微粒的浓度以及超声辐照参数进行处理，经CLSM观察细胞的存活及死亡情况。具体分组：空白对照组、单纯超声治疗组、TiO2纳米声敏剂组、Cu/TiO2纳米声敏剂组、低强度超声+TiO2纳米声敏剂组、低强度超声+Cu/TiO2纳米声敏剂组。从而观察Cu/TiO2纳米酶基声敏剂体外酶催化协同声动力抗癌治疗疗效，并对其治疗机制进行探究。结果见图8，图8为荧光显微镜和流式细胞技术观察细胞的凋亡情况；从图8可以看出：经不同处理后，用CLSM以及流式细胞技术直接观察细胞的杀伤作用，活细胞和死细胞分别用钙黄绿素Calcein-AM(绿色)和PI(红色)染色。在Cu/TiO2-PEG结合超声组中观察到大量死亡细胞，表明Cu单原子的催化协同声动力治疗，可广泛诱导细胞凋亡和死亡，活细胞是绿色，死细胞是红色。
观察纳米微粒的生物安全性：按照纳米微粒的浓度将健康昆明小鼠分三组，分别为Control组(仅经尾静脉注射100μLPBS)、1.25mg/ml组、2.5mg/ml组和5mg/ml组，分析比较各组在注射30天后代表肝、肾及心脏功能的血液生化指标的变化情况，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)等。
图9为血液学分析Cu/TiO2纳米声敏剂的生物安全性，其中，1为Control组、2为1.25mg kg-1组、3为2.5mg kg-1组、4为5mg kg-1组；从图9可以看出：在注射不同剂量的Cu/TiO2-PEG纳米粒子后，继续喂养30天。对小鼠的各项血液指标进行分析，包括平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞(RBC)、红细胞平均体积(MCV)、中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、中间细胞(MID)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、红细胞压积(HCT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、红细胞分布宽度(RDW-SD)、红细胞体积分布宽度(RDW-CV)、平均血小板体积(MPV)、血小板(PLT)、淋巴细胞比率(LYM)、血小板分布宽度(PDW)、血小板比积(PCT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)等。在增加Cu/TiO2-PEG纳米粒子剂量后，在小鼠的各项血液指标中未见明显异常，与对照组相比变化不大，表明了Cu/TiO2-PEG纳米粒子的体内生物安全性较高。
图10为主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色分析Cu/TiO2纳米声敏剂的组织相容性；从图10可以看出：在注射不同剂量的Cu/TiO2-PEG纳米粒子后，继续喂养30天。取小鼠的主要器官包括心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色。在增加Cu/TiO2-PEG剂量后，在小鼠的主要器官未观察到明显的细胞/组织损伤，与对照组相比变化不大，表明Cu/TiO2-PEG的体内生物相容性较高。图9和图10的结果表明，Cu/TiO2-PEG具有较低的生物毒性和较高的生物安全性，进一步保证了其潜在的临床应用。
体外超声激活并增强Cu/TiO2纳米声敏剂的酶样活性测定：
过氧化物酶(POD)样活性测试：以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色反应验证过氧化物酶样活性。将TMB工作液(TMB测试液100μL、PBS缓冲液100μL，100uM H2O2溶液20μL)和Cu/TiO2纳米声敏剂(20μL)混合均匀。经超声辐照后，使用紫外-可见光光谱(UV-vis)在652nm波长处监测反应的颜色。将颜色变化数据绘制成曲线，以显示样品的过氧化物酶模拟活性。
过氧化氢酶(CAT)样活性测试：采用显色法验证在Cu/TiO2纳米声敏剂的CAT酶样活性。将Cu/TiO2溶液(100μM，40μL)与250mM过氧化氢溶液(10μL)混匀，25℃反应5min，再加入450μL过氧化氢酶终止液，终止反应。取10μL上述混合液与200μL显色液，25℃至少孵育15min后测定A520，以评估Cu/TiO2的CAT酶样活性。
超氧化物歧化酶(SOD)样活性测试：使用水溶性四唑盐WST-8评价SOD酶样活性。将WST-8/酶工作液(160μL)、酶反应启动工作液(20μL)与Cu/TiO2纳米声敏剂或PBS缓冲液(20μL)混合，37℃孵育30min，测定其在450nm处的吸光度变化，进一步确定其活性。
谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性测试：采用NADPH法通过紫外比色检测Cu/TiO2纳米声敏剂的谷胱甘肽过氧化物酶样活性。40μL的GPx工作液、Cu/TiO2纳米声敏剂或PBS缓冲液(10μL)与过氧化氢溶液(100mM，10μL)混合，上述混合液与过氧化物试剂溶液(30mM，10μL)混匀，测定其在340nm处的吸光度变化，确定其GPx酶样活性。
图11为体外超声激活并增强Cu/TiO2纳米声敏剂的酶样活性测试图；从图11可以看出：图11中a和e中表明TiO2和Cu/TiO2的过氧化物酶(POD)样活性。图11中e中发现单原子Cu/TiO2纳米粒子的POD样活性百分比较TiO2纳米粒子高约14.05％。同时，Cu/TiO2纳米粒子也具有良好的过氧化氢酶(CAT)样活性，其CAT样活性百分比较TiO2纳米粒子高约24.13％(见图11中b和f)。此外，Cu/TiO2纳米粒子的超氧化物歧化酶(SOD)样活性约为TiO2纳米粒子的6.8倍(图11中c和g)。Cu/TiO2纳米粒子比TiO2纳米粒子表现出较高谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)样活性(图11中d和h)。由此说明锚定在TiO2纳米颗粒最稳定的Ti空位中的Cu单原子可以提供催化活性中心，从而提高酶模拟活性。
观察Cu/TiO2纳米酶基声敏剂在动物体内的分子显像效果：通过Cu/TiO2纳米声敏剂注射前及注射后1h、2h、4h、8h、12h、24h等不同时间点的荧光成像性能。根据体外实验中优化出的纳米微粒的浓度进行分子成像，分析比较各时间点荧光成像前后肿瘤组织的增强显像效果及增强规律，选取最佳治疗时间点。图12为Cu/TiO2纳米酶基声敏剂在动物体内的分子显像效果图；从图12可以看出：通过荧光成像观察以5mg/kg的浓度经小鼠尾静脉注射Cu/TiO2-PEG纳米粒子前、后1h、2h、4h、8h、12h、24h等不同时间点，右侧腿部的皮下肿瘤组织的富集情况。通过荧光定量分析软件评估小鼠的内脏(心肝脾肺肾)以及肿瘤组织的不同时间点的荧光强度。图12中b显示在注射1h后肿瘤组织内的荧光强度逐渐升高，8h后肿瘤组织的荧光强度达到高峰，随后逐渐降低。图12中c和d是注射4h后，取小鼠的内脏及肿瘤组织进行离体荧光成像及其定量软件分析各组织的荧光强度分布。由此可显示经小鼠尾静脉注射Cu/TiO2-PEG纳米粒子后脏器及肿瘤组织的富集情况，确保后续的有效治疗。
建立乳腺癌动物模型，进行体内实验：
观察体内精准治疗的效果：具体分组：空白对照组(未治疗)、单纯超声治疗组(US)、单纯TiO2纳米声敏剂组(TiO2)、单纯Cu/TiO2纳米酶基声敏剂组(Cu/TiO2)、US+TiO2治疗组、US+Cu/TiO2治疗组。治疗组每隔1天经尾静脉注射治疗一次，共治疗3次(超声辐照功率和时间参考上述优化结果)，每日通过游标卡尺分别测量肿瘤最大径(L)和最小经(W)，肿瘤体积＝L·W2/2，连续观察15天，结束整个疗程，绘制肿瘤生长曲线，并通过肿瘤病理学改变分析治疗后各组乳腺癌肿瘤的治疗效果；
观察治疗的生物安全性：实验分6组，空白对照组(未治疗)、单纯超声治疗组(US)、单纯TiO2纳米声敏剂组(TiO2)、单纯Cu/TiO2纳米酶基声敏剂组(Cu/TiO2)、US+TiO2治疗组、US+Cu/TiO2治疗组，治疗后通过解剖治疗小鼠的心、肝、脾、肺、肾等内脏进行组织HE染色切片评估其治疗的生物安全性。
图13为4T1荷瘤小鼠15天内经不同处理后体内精准治疗效果评估。从图13可以看出：在进行不同的治疗后，监测肿瘤体积(图13中a和b)。结果表明，单纯TiO2或Cu/TiO2组或单纯超声组对肿瘤生长的治疗作用不明显。US+TiO2组治疗的小鼠肿瘤生长受到部分抑制，显示治疗15天后，肿瘤的体积较治疗前增加约11.7倍。相对而言，单原子纳米酶样催化协同声动力治疗组(US+Cu/TiO2)的肿瘤生长抑制率增强，肿瘤体积仅增加约4.8倍，其肿瘤增长率明显低于其他治疗组(图13中c)。与肿瘤体积变化相比，治疗后15天从小鼠体内切除的肿瘤重量也遵循类似的趋势(图13中d)。同时，苏木精-伊红(H&E)对肿瘤切片的染色进一步证实了协同治疗效应(图13中e)。H&E染色肿瘤切片显示，US+Cu/TiO2组细胞核变形(核固缩、核碎裂、核溶解)明显多于其他组，表明癌细胞坏死严重。
图14为4T1荷瘤小鼠15天内经不同处理后的生物安全性评估。从图14可以看出：单原子纳米酶样催化协同声动力抗肿瘤治疗期间，各组小鼠的体重波动不明显(图14中a)。治疗结束后，对各处理组小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行H&E染色。结果显示，上述各组小鼠的主要脏器中未观察到明显的组织病理学损伤(图14中b)，表明在短期和相对长期的试验剂量下，对小鼠的毒性是无法检测到的，展示了Cu/TiO2纳米粒子具有高度的生物安全性。
由以上实施例可知，一种新型的多功能单原子水平的纳米酶基声敏剂应用而生，其催化活性高、具有良好的生物安全性，同时通过超声作为激发源并协同声动力疗法，可显著增强治疗效果，该基于纳米酶的声敏剂具有更高的治疗安全性，以其不受组织深度的影响的优点，为肿瘤的微创治疗提供了一种更有前途的治疗方案。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种纳米酶基材料作为声敏剂在声动力中的应用；
所述纳米酶基材料，包括TiO2纳米颗粒；
和锚定在所述TiO2纳米颗粒上的Cu单原子。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米酶基材料中Ti元素和Cu元素的质量比为50:0.99～1.01。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米酶基材料采用甲氧基聚乙二醇氨基表面功能化修饰。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇氨基的分子量为1900～2100g/mol；
所述纳米酶基材料和甲氧基聚乙二醇氨基的质量比为1:48～52。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米酶基材料的制备方法，包括以下步骤：
将SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O溶液混合，离心分离，得到SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子；
将聚乙烯吡咯烷酮吸附在所述SiO2@CuOx/TiO2纳米粒子上，离心分离，分散在乙醇-水混合溶液中，再加入氨水和正硅酸乙酯，反应，洗涤后离心，形成SiO2覆盖层，干燥，研磨，得到SiO2@CuOx/TiO2@SiO2纳米粉体；
将所述纳米粉体煅烧，冷却至室温后刻蚀SiO2，得到Cu/TiO2纳米酶基材料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述煅烧的温度为850～950℃，煅烧的时间为110～130min。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述刻蚀SiO2的过程包括：
将冷却至室温的纳米粉体分散在碱溶液中，加热至85～95℃，反应3.5～4.5h，离心，洗涤，得到纳米酶基材料。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液和CuCl2·2H2O混合具体包括：
将CuCl2·2H2O溶液以1mL/h的速度滴加至SiO2@TiO2纳米粒子的胶体溶液中，滴加完毕后室温下搅拌170～190min。
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