KR20180082787A - 초음파역동 치료를 위한 나노 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 초음파역동 치료를 위한 나노 복합체 및 이의 제조방법에 따르면, 산화티타늄 나노입자 표면에 귀금속 나노입자가 형성된 나노 복합체; 및 상기 나노 복합체는 친수성 고분자로 표면 개질된다.

Description

초음파역동 치료를 위한 나노 복합체 및 이의 제조방법 {NANOCOMPOSITE FOR SONODYNAMIC THERAPY AND FABRICATION METHOD　OF THE SAME}

본 발명은 치료용 나노 복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 초음파 치료용 나노 복합체와 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 산소를 호흡하는 생명체에 있어서 필수 불가결한 물질이다. 활성산소종은 우리 몸 안에서 다양한 역할을 수행한다. 그 예로는 세포자멸사(apoptosis), 유전 발현, 세포 내 신호 캐스캐이드(Cascades)등이 있다. 하지만 이러한 활성산소종이 필요 이상의 농도로 우리 몸 안에 존재하게 될 경우, 다양한 질병의 원인이 될 수 있다. 그 예로는 암, 퇴행성 뇌질환, 심장질환 등이 있다.

최근 침습적인 방법인 외과적 수술 외에 비침습적으로 암 조직을 선택적으로 괴사시켜 후유증을 최소화할 수 있는 암 치료법이 주목받고 있다. 이러한 비침습적 치료법에는 대표적으로 레이저를 이용한 광역동 치료가 있다.

광역동 치료(Photodynamic therapy, PDT)란 광감각제(photosensitizer)가 빛에 의해 화학적 반응을 일으킴으로써 활성산소종의 일종인 단일항 산소(singlet oxygen) 및 이에 의해 유발되는 자유라디칼(free radical)을 이용하여 질병 부위 세포를 사멸시키는 치료법이다. 광역동 치료는 광감각제를 가시광선을 포함한 여러 영역의 특정 파장의 빛을 조사하여 활성화시킨 후, 활성화된 광감각제의 작용으로 각종 국소적 질병을 치료한다. 광역동 치료에 영향을 주는 요인으로는 광감작 물질의 종류와 농도, 도포 방법과 같은 화학적 요인과 광원의 종류, 조사 시간, 치료 간격 등과 같은 물리적 요인이 있다. 국소적으로 치료가 가능하고 시술 과정이 간단하며, 또한 반복 시술이 가능하고 항암 화학 치료와의 병행 치료로 활용도 가능하여 관련 임상 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나 광원으로 사용하는 레이저의 체내 투과율 한계로 인하여 사용할 수 있는 부위가 표재성 조직으로 제한이 있다. 이러한 광역동 치료의 한계를 개선하기 위하여 근적외선 레이저보다 깊이 침투할 수 있는 초음파(ultrasonics wave)에 의해 활성산소종을 발생시키는 음파감각제를 이용한 초음파역동 치료 기술의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 일 목적은 귀금속 산화티타늄 나노입자를 포함하는 생체 적합성 초음파 역동 치료용 나노 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 치료용 나노 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적을 위한 나노 복합체는 산화티타늄 나노입자 표면에 귀금속 나노입자가 형성된 나노 복합체 및 상기 나노 복합체는 친수성 고분자로 표면 개질된다.

일 실시예에서, 상기 나노 복합체는 음파감각제일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 나노 복합체는 초음파역동 치료용 음파감각제일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 나노 복합체는 주사제 형태로 이용될 수 있는 음파감각제 일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 위한 나노 복합체의 제조방법은 (1) 산화티타늄 나노입자 표면에 귀금속 나노입자가 형성되는 단계; 및 (2) 상기 (1)단계에서 합성된 나노입자를 친수성 고분자로 표면 개질하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 (1)단계는, 산화티타늄 나노입자를 시트르산 나트륨을 포함하는 증류수에 분산시키고, 염화금산을 첨가하여 UV 조사할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 UV는 256㎚일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 (2)단계는, 도파민으로 표면 개질 후, 촉매 존재 하에서 친수성 고분자와 결합을 형성할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 도파민은 카테콜 기를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 친수성 고분자는 카르복시메틸 덱스트란일 수 있다.

본 발명의 귀금속 산화티타늄 나노입자를 포함하는 생체 적합성 초음파 역동 치료용 나노 복합체에 따르면, 생체 적합성이 우수한 친수성 고분자의 접합을 통하여 생체 안정성 및 체내 순환 시간이 증가한 나노 복합체를 제공할 수 있다. 또한 초음파 역동 치료는 조직 손상도를 최소화하며 높은 조직 침투 효율을 나타내며, 시/공간적 관점에서 효율적인 감각제의 여기 제어가 가능하다. 그리고 기존의 음파감각제보다 개선된 활성산소종 생성 양자 수율을 가짐에 따라 부수적인 부작용의 최소화 및 우수한 치료 효능을 나타낸다.

도 1은 친수성 금-산화티타늄 나노 복합체의 개략도이다.
도 2는 친수성 금-산화티타늄 나노 복합체의 활성산소종 생성에 대한 도면이다.
도 3은 산화티타늄 입자의 형태에 대한 도면이다.
도 4는 금-산화티타늄 나노 복합체 표면을 나타내는 도면이다.
도 5는 나노입자의 FT-IR 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 나노입자의 입자 크기 분포 및 TEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7은 나노입자의 시간에 따른 입자 크기 변화를 나타낸 도면이다.
도 8은 나노입자의 고분자 층을 나타내는 도면이다.
도 9는 초음파 처리 후 나노입자의 활성산소종 생성에 대한 도면이다.
도 10은 초음파 처리 후 활성산소종 생성 및 시간에 따른 흡광도를 나타낸 도면이다.
도 11은 나노입자의 전자장 분포를 나타내는 도면이다.
도 12는 나노 복합체의 생체 내 분포를 나타내는 도면이다.
도 13은 종양 조직을 나타낸 도면이다.
도 14는 주요 장기 및 종양 조직을 나타낸 도면이다.
도 15는 종양 조직에서 활성산소종을 나타낸 도면이다.
도 16은 초음파역동 치료 요법의 개략도이다.
도 17은 시간에 따른 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다.
도 18은 종양의 치료군 별 H&E 염색(staining)을 나타낸 도면이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 나노 복합체와 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 나노 복합체는 산화티타늄 나노입자(TiO₂ nanoparticles, TiO₂ NCs) 표면에 귀금속 나노입자가 형성된 나노 복합체; 및 상기 나노 복합체는 친수성 고분자로 표면 개질된다.

이때, 상기 나노 복합체는 음파감각제(sonosensitizer)일 수 있고, 초음파역동 치료용(Sonodynamic therapy)(SDT) 음파감각제일 수 있다.

또한, 상기 나노 복합체는 주사제 형태로 이용될 수 있는 음파감각제일 수 있다.

광역학 치료(Photodynamic Therapy)(PDT)는 침투성(invasiveness), 부위 특이적 활성(site-specific activation)등으로 많은 관심을 받았다. PDT는 활성산소종(reactive oxygen species)(ROS)을 생성하기 위한 광감각제(photosensitizer)를 활성시키기 위해 빛을 사용하여 암 세포의 사멸을 직접적으로 유도한다. 그러나, 근적외선(near infrared)(NIR) 레이저는 조직 침투능의 한계가 있고, 전파 경로에 존재하는 모든 광감각제를 자극한다. 이러한 한계를 개선하기 위해서 빛 대신 초음파(ultrasonography, US)를 이용하는 초음파 역동 치료 기술의 개발이 요구된다. 초음파 역동 치료의 경우, 조직 감쇠 계수(tissue attenuation coefficient)가 낮고, 비 방사성(non-radiative)이기 때문에, 초음파는 신체 조직에 훨씬 더 깊숙하게 침투한다. 또한 무해하게 조직의 여러 층을 통과하며, 높은 공간 정밀성(high spatial precision)과 함께 오직 초점에서만 광감각제를 자극한다.

또한, 산화티타늄 나노입자는 생체 내에서 면역 반응을 자극하지 않고 화학적으로 불활성하며, 백금(Pt), 은(Ag), 및 금(Au)과 같은 귀금속과 산화티타늄의 조합은 양자 효율(quantum yield)을 향상시키는 것으로 나타났다.

본 발명에서는 정맥 내 투여 시 생체 내에서 종양을 박멸하는 초음파 역동 치료용 나노 복합체로서 초음파 역동 효과를 향상시키기 위해 금과 같은 귀금속을 산화티타늄 나노입자의 표면에 침착시켰고, 생체 적합성을 위해 카르복시메틸 덱스트란(Carboxymethyl dextran)(CM-Dex)을 화학적으로 접합시켰다.

도 1은 친수성 금-산화티타늄 나노 복합체의 개략도이다. 도 1을 참조하면, 조직 내에서, 친수성 금-산화티타늄 나노 복합체가 초음파에 의해 암세포에서만 활성산소종을 발생시키는 것을 나타내고 있다.

도 2는 친수성 금-산화티타늄 나노 복합체의 활성산소종 생성 메커니즘에 대한 도면이다. 도 2를 참조하면, 산화티타늄은 초음파에 의해 전자(electron)-정공(Hole) 결합(50 ± 30 ns)으로 활성산소종을 생성하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 위한 나노 복합체의 제조방법은, (1) 산화티타늄 나노입자 표면에 귀금속 나노입자가 형성되는 단계; 및 (2) 상기 (1) 단계에서 합성된 나노입자를 친수성 고분자로 표면 개질하는 단계를 포함한다.

향상된 초음파역동 치료 효능을 구현하기 위해서, 산화티타늄 나노입자(TiO₂ nanoparticles, TiO₂ NCs)에 광환원 반응을 이용하여 귀금속 원소인 금 나노입자(gold nanoparticles, Au NPs)를 산화티타늄 나노입자 표면에 형성한다.

본 발명에 따르면, 상기 (1)단계는 산화티타늄 나노입자를 시트르산 나트륨(sodium citrate)을 포함하는 증류수에 분산시키고, 염화금산(Chloroauric acid, HAuCl₄)을 첨가하여 자외선(UV, Ultraviolet) 조사하는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 UV는 256㎚일 수 있다.

이어서, 본 발명에 따르면, 상기 (2)단계는 도파민(dopamine)으로 표면 개질 후, 친수성 고분자와 결합을 형성하는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 도파민은 카테콜 기(catechol group)를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 친수성 고분자는 카르복시메틸 덱스트란(Carboxymethyl dextran) (CM-Dex)일 수 있다. 상기 (1)단계에서 제조한 나노 복합체의 수계 분산 및 체내 순환 시간 증대를 위하여 금-산화티타늄 나노 복합체(Au-TiO₂ NCs)를 카테콜 기를 포함하는 도파민으로 1차 아민 기를 갖도록 표면 개질할 수 있다. 이어서, 1 - 에틸 - 3 - (3 - 디메틸아미노프로필)카르보디미드 · 하이드로클로라이드(1 - ethyl - 3 - (3 - dimethylaminopropyl)carbodiimide · hydrochloride) (EDC · HCl), N - 하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) (NHS) 촉매 존재 하에, 다당류 계열 고분자인 카르복시메틸 덱스트란과 아마이드 결합을 형성할 수 있다.

상기 제조방법으로 제조된 생체 적합성 친수성 고분자가 접합된 귀금속-산화티타늄 나노입자 기반의 음파감각제를 친수성 Au-TiO₂ (hydrophilized Au-TiO₂) (H-Au-TiO₂ NCs)로 명명한다.

본 발명의 나노 복합체인 H-Au-TiO₂ NCs는 초음파 자극 하에서 활성화되어 다량의 활성산소를 생성할 수 있으며, 귀금속 도입을 통해 종래의 낮은 활성산소종 양자 수율(quantum yield) 한계를 극복한다.

친수성 금 산화티타늄 나노 복합체(H-Au-TiO ₂ NCs)의 제조 및 물리화학적 특성 분석

Au-TiO₂ NCs는 25㎚의 크기를 갖는 TiO₂ NPs의 표면에 Au³⁺을 광환원(photoreduction) 반응을 통해 도포함으로써 제조하였다. 광환원 반응은 시트르산 나트륨 및 2N NaOH 함유 수용액 상에서 10mM 염화금산을 첨가한 후에 256㎚ 파장 대를 갖는 UV 조사 하에서 제조하여, UV 조사 시간을 3분(NC-1), 10분(NC-2), 12시간 (NC-3)으로 구분하여 도포되는 금 나노입자의 특성을 분석하였다. TEM(transmission electron microscopy)을 통하여 입자 크기 및 모폴로지(morphology)를 분석하고, X-ray 회절 분석법(X-ray diffraction, XRD) 및 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer, ICP-MS)을 통해 Au-TiO₂ NCs의 금 함량의 정성적, 정량적 분석을 수행하였다. 제조한 Au-TiO₂ NCs의 체내 순환 시간 증가를 위하여 생체 적합성이 우수한 친수성 고분자인 카르복시메틸 덱스트란과의 화학적 접합을 실시하였다. 금속 산화물 나노입자 표면에의 접착력이 우수한 카테콜 기를 함유한 도파민으로 Au-TiO₂ NCs가 표면에 1차 아민 기를 갖도록 개질하였으며, 도파민 : TiO₂ NPs의 비율은 25 : 1로 고정하였다. 이후에, EDC/NHS 촉매를 이용하여 카르복시기(carboxy group)를 갖는 카르복시메틸 덱스트란으로 NCs의 표면을 코팅하여 H-Au-TiO₂ NCs를 제조하였으며, 합성 및 정제 과정은 TiO₂ NPs의 광분해를 방지하기 위하여 차광 조건에서 진행하였다. 대조군으로는 Au NPs가 도포되지 않은 TiO₂ NPs를 상기와 동일한 조건으로 카르복시메틸 덱스트란과 화학적 접합을 통하여 합성한 H-TiO₂ NPs를 사용하였으며, FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy)을 이용하여 카르복시메틸 덱스트란과 도파민 간에 형성된 아마이드(amide) 결합을 확인하였다. 또한 DLS(Dynamic light scattering), TEM, EDS 맵핑(energy-dispersive X-ray spectroscopy mapping)을 이용하여 H-TiO₂ NPs 및 H-Au-TiO₂ NCs의 정성 분석 및 나노입자의 표면 특성 분석을 실시했다. 각각의 입자 크기 및 표면전하 측정 값은 아래 표 1에 나타냈다.

추가적으로 카르복시메틸 덱스트란 코팅 도입을 통해 향상된 나노 복합체의 안정성을 평가하기 위하여 TiO₂ NPs, H-TiO₂ NPs, H-Au-TiO₂ NCs를 완충 용액 내에서 6일 간 일정 시간 간격으로 입자 크기를 관찰한 결과, 카르복시메틸 덱스트란 유무에 따라 나노입자의 입체 반발력 차이로 인하여 안정성이 크게 변하였다.

시료	크기(㎚)	표면전하 (Zeta potenial, mV)
H-TiO2 NPs	197.4±3.5	-14.2
H-Au-TiO2 NPs	202.5±2.4	-15.8

도 3은 산화티타늄 입자의 형태에 대한 도면이다. 도 3을 참조하면, 도 3의 (a)는 산화티타늄 나노입자(TiO₂ NP) 표면에 Au³⁺이온이 침착된 모습을 나타내었고, 도 3의 (b)는 TiO₂ NP, NCs-1 (작은 금 나노입자-산화티타늄 나노입자)(2㎚이하), NCs-2 (작고 큰 금 나노입자-산화티타늄 나노입자), NCs-3 (큰 금 나노입자-산화티타늄 나노입자)(5㎚이상)의 TEM 이미지이다. 자외선 노출 시간을 변화시킴으로써, 증착된 금 나노입자의 크기 분포를 제어할 수 있다는 것을 알 수 있다. 12시간에 걸친 장시간 노출에서 작은 금 나노입자는 모두 성장하여 큰 나노입자로 나타난다.

도 4는 금-산화티타늄 나노 복합체 표면을 나타내는 도면이다. 도 4를 참조하면, 금 나노입자가 침착된 산화티타늄 나노입자 표면의 도파민에 카르복시메틸 덱스트란을 화학적 결합시킨 H-Au-TiO₂ NCs의 모습을 나타내는 도면이다.

도 5는 나노입자의 FT-IR 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 5를 참조하면, H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs의 FT-IR 분석 결과로, 카르복시메틸 덱스트란과 도파민 사이의 결합이 형성된 것을 확인 할 수 있다. 600㎝^-1 피크(점선화살표)는 도파민의 존재를 확인할 수 있고, 1690㎝^-1에서의 피크(실선화살표)는 카르복시메틸 덱스트란과 도파민 간의 아미드 결합을 확인할 수 있다.

도 6은 나노입자의 입자 크기 분포 및 TEM 이미지를 나타낸 도면이다. 표 1과 도 6을 참조하면, 표 1과 도 6은 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs의 제타전위(zeta potential values)와 유체역학적 반경(hydrodynamic radii)을 나타낸 것으로, 도 3(a)의 H-TiO₂ NPs는 -14.23㎷의 제타 전위와 197.4±3.45㎚의 유체역학적 반경을 보이고, 도 3(b)의 H-Au-TiO₂ NCs는 -15.82㎷의 제타전위와 202.5±2.37㎚의 유체역학적 반경을 보인다.

도 7은 나노입자의 시간에 따른 입자 크기 변화를 나타낸 도면이다. 도 7을 참조하면, TiO₂ NP와 달리 H-TiO₂ NP와 H-Au-TiO₂ NC는 생체 조건하에서 6일의 시간동안 뛰어난 안정성을 보였다.

도 8은 나노입자의 고분자 층을 나타내는 도면으로, 도 8을 참조하면, H-TiO₂ NP와 H-Au-TiO₂ NC의 EDS 매핑으로 입자 표면 주위에 두꺼운 고분자 층이 존재함을 나타낸다.

초음파 자극 하에서의 H-Au-TiO ₂ NCs의 활성산소종 생성 평가

본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs의 초음파 자극 하에서의 활성산소종 생성 효율을 평가하기 위하여 분자 프로브로 1,3-디페닐이소벤조푸란(1,3-diphenylisobenzofuran, DPBF)을 이용하였다. 초음파 처리 후의 1,3-디페닐이소벤조푸란의 산화 정도를 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Vis spectrophotometer)로 413㎚에서의 흡광도를 관찰하여 계산함으로서 활성산소종 생성 정도를 평가할 수 있었다. Au-TiO₂ NCs를 1,3-디페닐이소벤조푸란(2×10^-5M) 용액에 넣고 5분 동안 초음파 조사 후에, NC-1, NC-2, NC-3의 활성산소종 생성을 비교하였으며, 이중에서 가장 우수한 활성산소종 생성 거동을 나타낸 NC-2를 추후 H-Au-TiO₂ NCs 제조에 사용하였다. 상기의 방법과 동일한 조건에서 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs를 비교하여 금 나노입자 유무에 따른 활성산소종 생성 효율을 평가하였다. H-Au-TiO₂ NCs의 경우, 금 나노입자의 비국소 전자(delocalized electrons)에 기인하여 대조군인 H-TiO₂ NPs보다 강한 전기장(electron field)을 가졌다. 초음파역동 치료에서는 활성산소종은 외부 에너지원과 감각제의 전기장의 상호작용으로 생성됨에 따라 금 나노입자 도입을 통하여 활성산소종 생성 효율이 향상되었음을 확인하였다.

도 9는 초음파 처리 후 나노입자의 활성산소종 생성에 대한 도면이다. 도 9의 NCs-1, NCs-2 및 NCs-3은 각각 1.57%, 1.65%, 및 1.71%의 비슷한 중량 퍼센트이며, 작은 금 나노입자(2㎚이하), 작고 큰 두 가지의 금 나노입자, 큰 금 나노입자(5㎚이상) 각각을 갖는 산화티타늄 나노입자 3가지이다. 그 중에서 NCs-2의 활성산소종 생성이 눈에 띄게 높았다.

수성 매질(aqueous media)에서 음파 발광(sonoluminescence) 방출 강도는 단파장에서 높고, 파장이 증가하면 점점 감소한다. NCs-1의 작은 금 나노입자는 단파장 영역(<450㎚)에서 흡광도를 높이고 여기된(excited) 전자를 산화티타늄 나노입자로 펌핑함에 의해 안테나 역할을 한다. 그러나 낮은 밀도 상태 때문에 전자-정공 재결합을 막기 위한 전자 트랩(electron trap) 역할은 할 수 없다. 반면에, NCs-3의 큰 금 나노입자는 전자 트랩 역할을 하고 표면 플라즈몬 공명(plasmon resonance)을 통해 TiO₂ 나노입자로 전자를 펌핑(pump)한다. 그러나 플라즈몬 유도 전자 주입은 가시광 영역(> 500㎚)에서만 발생한다. 대조적으로 NCs-2의 작은 금 나노입자는 짧은 파장에서 흡광도를 증가시키고 큰 금 나노입자는 전자-정공 재결합을 방지하기 위한 전자 트랩 사이트(site)로서 역할을 한다. NCs-2는 작고 큰 금 나노입자의 기여(contributions)로 NCs-1 또는 NCs-3보다 훨씬 높은 수준의 활성산소종을 생성했다.

도 10은 초음파 처리 후 활성산소종 생성 및 시간에 따른 흡광도를 나타낸 도면이다. 도 10을 보면, 5분 동안의 초음파 처리 후 H-Au-TiO₂ NCs에서 생성된 활성산소종의 양과 H-TiO₂ NPs의 양을 비교했을 때, H-Au-TiO₂ NCs에서 생성된 활성산소종이 더 높았다. 또한, 시간에 따른 활성산소종 발생을 알아보기 위해 계산한 속도 상수는 역시 H-TiO₂ NPs, H-Au-TiO₂ NCs가 각각 0.0605, 0.0781 s^-1로 H-Au-TiO₂ NCs에서 높았다.

도 11은 나노입자의 전자장 분포를 나타내는 도면이다. 도 11은 론치그램(Ronchigram)으로 입자 내부와 주변에 전자장(dark spot, bright spot)이 있음을 나타내며, H-Au-TiO₂ NCs의 전자장이 H-TiO₂ NPs보다 강하다는 것이 확인되었다.

강력한 전자장은 H-Au-TiO₂ NC의 표면에 존재하는 금 나노입자의 비 편재화된 전자에 기인한다. 외부 에너지가 감각제의 전자장과 상호작용할 때, 활성산소종이 생성되므로, H-Au-TiO₂ NC 주위의 강한 전자장은 H-TiO₂ NP보다 H-Au-TiO₂ NC의 활성산소종 생성 가능성이 더 크다는 걸 나타낸다. 또한, 전자장 벡터는 나노 복합체 내의 산화티타늄에서 금을 향하고, 이는 금 나노입자가 전자 트랩 센터로 작용할 수 있음을 나타낸다.

H-Au-TiO ₂ NCs의 세포 독성 평가

본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs의 세포 독성을 편평상피세포(squamous epithelium cell)암 SCC7 세포주에서 평가하였다. 96-well plate에 1×10⁴ cell/well의 밀도로 seeding한 후에 24시간 동안 배양하였다. 제조된 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs를 다양한 농도(10, 50, 75, 100, 200μg/ml)로 처리한 후, 24시간이 지난 후에 세포 독성 실험(MTT assay)을 이용하여 아무 시료도 처리하지 않고 배양한 세포와 세포 생존율을 측정 비교하였다. 두 실험군 모두 생체적합성이 우수한 고분자 주쇄의 사용으로 인하여 200㎍/㎖의 고농도에서도 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었다.

상기 실험과 더불어 나노입자의 세포자멸 assay를 수행하기 위하여 6-well plate에 5×10⁵ cell/well의 밀도로 seeding한 후에 단층 배양하였다. H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs를 100㎍/㎖ 농도로 처리한 후, 24시간이 지난 후에 FITC-labeled annexin V antibody 및 프로피디움 요오드화물(아이오딘화물)(propidium iodide)로 30분 동안 처리한 후, 유동세포계수법(flow cytometry)을 이용하여 세포사멸 정도를 분석한 결과 세포 독성 실험 결과와 유의하게 두 실험군 모두 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 세포 독성 평가 결과로부터 본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs의 생체적 합성이 우수한 것으로 판단할 수 있다.

H-Au-TiO ₂ NCs의 생체 내 분포거동 평가

본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs의 생체 내 분포 거동을 평가하기 위하여 질병을 유발한 동물모델을 제조하여 이용하였다. 상기 세포 독성 실험에서 사용하였던 SCC7 세포주를 동물모델의 피하에 이식함으로서 암 동물모델을 제조하여 근적외선 형광체인 Cy5.5를 표지한 나노 복합체를 정맥주사하였다. 일정 시간 간격으로 소동물 생체 이미징 시스템(in vivo imaging system)을 이용하여 나노 복합체의 생체 내 분포를 확인하였다. 그 결과, 친수성 및 음전하의 표면 전하를 갖는 H-Au-TiO₂ NCs의 특성에 기인하여 암 동물모델의 암 조직에 효과적으로 축적되는 것을 확인하였고, 또한 투여 24시간 후 장기 적출을 실시하여 정량을 통해 비교하였을 때, 월등한 타 장기 대비 암 조직 축적 비율(Tumor/liver: 3.84)을 보였다.

도 12는 나노 복합체의 생체 내 분포를 나타내는 도면이다. 도 12는 근적외선 형광 영상 기술로 H-TiO₂ NP 및 H-Au-TiO₂ NC의 생체 내 생체 분포 및 종양 표적 성을 조사한 것으로, Cy5.5- 표지 샘플을 SCC7 종양 보유 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하고 마우스의 전신 NIR 형광 이미지를 소정 시간 간격으로 촬영 하였다. 초기 시간 동안 형광 신호가 몸 전체에서 검출되어 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs가 혈액에서 순환하고 있음을 나타냈고, 시간이 경과함에 따라 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs는 결국 종양에 축적되는 것이 확인되었다.

일반적으로 나노입자의 친수성 및 음전하 표면은 옵소닌 반응(opsonization reaction)을 방지하고 혈액순환 반감기를 연장시키는데 유용하다. H-TiO₂ NP(-14.23 mV) 및 H-Au-TiO₂ NC (-15.82 mV)의 제타 전위 값을 고려할 때, 친수성 및 음전하를 띄는 카르복시메틸 덱스트란으로 변형 된 복합체는 아마도 종양 부위에 수동적으로 표적이 될 만큼 충분히 순환 할 것이다.

도 13은 종양 조직을 나타낸 도면이다. 도 13을 참조하면, 생체 내 주사 후 12시간이 지나고, 표지 된 치료제로 처리 한 생쥐에서 종양 부위가 주변 조직으로부터 명확히 구분되었으며, 또한, 종양의 현미경 이미지는 H-TiO₂ NPs와 H-Au-TiO₂ NCs가 모두 혈관 (녹색)의 종양 조직 (적색)에 깊이 침투 할 수 있음을 나타낸다.

도 14는 주요 장기 및 종양 조직을 나타낸 도면이다. 도 14를 참조하면, 주사 24시간 후, 광학이미징을 위해 주요 장기를 절제한 것으로, 생체 외 장기 이미지는 생체 내 분포 데이터와 거의 일치하는 것으로 확인되었다. 종양 대 간의 비율은 H-TiO₂ NP의 경우 3.81이었고 H-Au-TiO₂ NC의 경우 3.84였다. 이러한 결과는 친수성 복합체가 혈액 내 순환이 길고, 침투성 및 보존 효과가 높으며, 주로 종양 조직으로 효과적으로 표적화되었음을 나타내는 것으로 보인다.

동물모델을 이용한 H-Au-TiO ₂ NCs의 활성산소종 생성 거동 평가

본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs의 초음파 자극 하에서의 활성산소종 생성 거동 평가를 위하여 상기 방법과 동일하게 SCC7 세포주로 암 동물모델을 제조하였다. H-Au-TiO₂ NCs를 Ti 3㎎/㎏의 양으로(dose) 정맥 주사 하였으며, 대조군으로 생리식염수(saline) 및 H-TiO₂ NPs를 사용하여 초음파 조사 유무에 따른 활성산소종 생성 효과를 비교하였다. 투여 12시간 후, 단일항 산소(O₂) 감지용 녹색 시약(singlet oxygen sensor green reagent)을 종양 내에 주입하여 초음파를 조사하였다. 각 실험군의 암 조직을 적출 후 회수하여 10㎛ 두께의 동결절편을 제조한 후에 형광현미경으로 관찰한 결과, 초음파 조사 조건에서 H-Au-TiO₂ NCs가 생리식염수 및 H-TiO₂ NPs에 비하여 월등한 활성산소종 생성 거동을 나타내었다.

도 15는 종양 조직에서 활성산소종을 나타낸 도면이다. 도 15를 참조하면, 종양 조직에서 ROS의 생체 내 형광 현미경 이미지로, 생체 내에서 활성산소종 생성을 조사하기 위해, 초음파 치료 전에 ¹O² 센서 그린을 종양 내로 주입 하였다. 초음파 치료 후, 세포 핵은 청색으로 염색되었고, ROS는 녹색으로 염색되었다. 결과를 비교해보면, H-Au-TiO₂ NCs의 경우가 가장 초록색이 많이 생성되었음을 알 수 있다. 대조적으로 동일 조건에서 H-TiO₂NPs와 식염수(saline)로 처리된 종양에서 가장 적은 초록색 신호가 기록되었다.

H-Au-TiO ₂ NCs의 질병 동물 모델에서의 치료 효능 평가

본 발명의 H-Au-TiO2 NCs의 질병 동물 모델에서의 치료 효능을 평가하기 위하여 상기 방법과 동일하게 암 동물 모델을 제조하였다. H-Au-TiO₂ NCs를 식염수ㅡ H-TiO₂ NPs의 대조군과 함께 동일한 티타늄 함유량(Ti 3㎎/㎏)으로 매 초음파 처리 12시간 전 정맥주사 하였으며, 4일 간격으로 초음파역동 치료를 수행하여 32일 간 치료 효능 평가를 수행하였다. 그 결과, 초음파역동 치료를 병행한 H-Au-TiO₂ NCs의 경우는 H-Au-TiO₂ NCs를 주입하고 초음파 조사를 하지 않은 실험군의 암 부피의 12%로 암 성장 속도가 가장 효과적으로 억제되었으며, 동일한 초음파 조사 조건에서 H-TiO₂ NPs 주입 실험군보다 3.1배 높은 암 치료 효능을 나타내었다. 주요 장기 및 암 조직을 적출하여 H&E 염색하여 병리 조직학적 평가를 한 결과에서도 타 실험군에 비하여 암 조직에서의 넓은 세포사 영역이 관찰되었다. 초음파역동 치료의 질병 부위 특이적 활성화 특성으로 인하여 주요 장기에서의 독성은 미비하였다. 상기 결과로부터 금 나노입자가 TiO₂ NP의 초음파 조사 하에서의 활성산소종 생성 효율을 향상시킴으로써 본 발명의 H-Au-TiO₂ NCs가 효과적으로 암 조직 선택적 초음파역동 치료를 용이하게 하는 것으로 판단된다.

도 16은 초음파역동 치료 요법의 개략도이고, 도 17은 시간에 따른 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다. 도 16과 도 17을 참조하면, 식염수의 경우, 초음파 치료 여부에 관계없이 종양 크기가 급격하게 증가하였고, 초음파 치료가 없는 경우, H-TiO₂ NP 및 H-Au-TiO₂ NC 모두 종양을 억제하는데 실패했다. 치료 32일 째, TiO₂ NP와 H-Au-TiO₂ NC만으로 처리 된 평균 종양 부피는 각각 4,281.76 ㎜³ 및 4,203.82 ㎜³이었다. 치료제 투여 후 초음파 치료를 한 종양 부피는 각각 1,576.98 ㎜³와 507.11 ㎜³로 나타났다(p <0.05). 크기, 표면 전하 및 조성과 같은 물리 화학적 특성에도 불구하고, H-Au-TiO₂ NCs는 H-TiO₂ NP보다 3.11 배 높은 종양 퇴행(tumor regression)을 보였다. 또한, 생쥐의 생존율은 초음파 치료와 치료제를 함께 투여했을 때 100%였고, 식염수만을 투여한 생쥐의 생존율은 60%이하였다.

도 18은 종양의 치료군 별 H&E 염색을 나타낸 도면이다. 도 18을 참조하면, 조직학(histologic) 염색 결과는 도 17에서의 종양 퇴행(tumor regression) 데이터와 일치했다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (10)

1. 산화티타늄 나노입자(TiO₂ nanoparticles, TiO₂ NCs) 표면에 귀금속 나노입자가 형성된 나노 복합체; 및
   상기 나노 복합체는 친수성 고분자로 표면 개질된 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 나노 복합체는 음파감각제인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 나노 복합체는 초음파역동 치료용 음파감각제인 것을 특징으로 하는. 나노 복합체.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 나노 복합체는 주사제 형태로 이용될 수 있는 음파감각제인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
   
5. (1) 산화티타늄 나노입자 표면에 귀금속 나노입자가 형성되는 단계; 및
   (2) 상기 (1)단계에서 합성된 나노입자를 친수성 고분자로 표면 개질하는 단계를 포함하는, 나노 복합체의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 (1)단계는, 산화티타늄 나노입자를 시트르산 나트륨(sodium citrate)을 포함하는 증류수에 분산시키고, 염화금산(Chloroauric acid, HAuCl₄)을 첨가하여 자외선(UV, Ultraviolet) 조사하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체의 제조방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 UV는 256㎚인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체의 제조방법.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기(2)단계는, 도파민(dopamine)으로 표면 개질 후, 친수성 고분자와 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체의 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 도파민은 카테콜 기(catechol group)를 함유하는 도파민인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체의 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 카르복시메틸 덱스트란(Carboxymethyl dextran) (CM-Dex)인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체의 제조방법.

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