CN114712501B - 用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及其应用。该纳米复合物以树枝状大孔二氧化硅为模板，在其基础上继续生长声敏剂二氧化钛。为了增强其声动力性能，再在光催化下，在其表面原位还原银。最后在该纳米复合物表面修饰天然抑菌剂壳聚糖，并季铵化。通过季铵化壳聚糖与细菌的亲合作用，使纳米材料吸附并进入细菌。该纳米复合物可以在低功率超声下，通过联合声动力和化学动力治疗实现对牙周炎的高效无创治疗，克服顽固性牙周炎难以治疗的难题。通过多种策略的联合，实现高效的抗菌效果。本发明方法设计合理，操作简单，能够提高对牙周治病菌的杀伤作用，增强治疗效果，具有广阔的应用前景。

Description

用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及其应用。
背景技术
牙周炎是由菌斑聚集而引起的细菌与宿主之间的免疫应答，从而造成牙周支持组织破坏的一种炎症性疾病。据文献报道，在发达国家，牙周炎在成年人中的患病率达30-50%，其中10%为重症牙周炎，牙周炎是目前成人牙齿缺失的主要原因。
牙周炎治疗的关键在于去除定植于牙齿表面的菌斑及细菌产物，清除病变的牙周组织，阻止疾病的进展。目前临床上治疗牙周炎的主要方法包括手术治疗和非手术治疗。手术治疗可有效的清除病灶，但增加患者痛苦及治疗成本，往往不易被患者接受。因此，临床上通常采用非手术治疗方式治疗牙周炎。
机械牙根清创术是牙周治疗的基础，主要包括刮治术和根面平整术，其目的是清除龈下菌斑生物膜，结合患者的口腔卫生宣教，防止细菌再附着。然而，牙周袋的局部因素如深而窄的牙周袋、根分叉等也可能会阻碍有效的机械治疗，往往难以彻底清除细菌，影响治疗效果。因此，为了提高牙周炎的治疗效果，提出了机械治疗辅助抗菌药物治疗。
抗菌药物治疗包括全身抗菌治疗和局部抗菌治疗。全身抗菌治疗主要指辅助口服抗生素。然而，全身抗菌治疗过程中，抗生素能够到达牙周袋病灶区的血药含量较少，同时其易产生较多的副作用，如青霉素类药物过敏，四环素类药物易沉积在牙齿和骨骼内等，因此，辅助全身抗菌治疗仅作为短期预防性治疗。而局部抗菌治疗主要包括局部应用各种抗菌剂和抗生素。虽然辅助使用局部给予抗菌药对临床症状有短期影响，但长期的临床效果与单独使用机械牙根清创术的效果基本一致，而且容易产生耐药性。
尽管目前牙周炎的治疗，在一定程度上能够改善临床指标，抑制致病菌生长，但仍然存在一定的局限性，并非所有病例都能得到很好的治疗效果，特别是对顽固牙周炎病例，持续活跃或反复发作的牙周炎往往很难得到良好的治疗效果。除此之外，随着人们对抗生素耐药性的关注逐渐增加，抗生素的应用也逐渐受到了限制。因此，寻求一种安全高效的无创治疗牙周炎的抗菌疗法具有很好的应用前景。
在超声作用下的声动力治疗（sonodynamic therapy，SDT)是超声联合声敏剂产生生物学效应的前沿方法。近些年来逐渐被口腔领域的专家学者所关注，并开展了一系列的研究，结果显示它是一种很有前景的治疗手段，具有无创、易聚焦、不易耐药、副作用小等优势，尤其具有较强的组织穿透性，可以穿透超过10cm的软组织。声动力治疗需要联合低强度超声和声敏剂。常用的声敏剂包括血卟啉、吲哚菁绿等有机声敏剂和二氧化钛（TiO2）、四氧化三铁等无机声敏剂。相比有机声敏化剂，无机纳米材料因其独特的物理化学性质被认为是更理想的声敏剂。其中TiO2是被研究的最广泛的无机纳米声敏剂，具有价格低廉、结构稳定、较高催化活性以及对人类和环境的安全性等优点，它能响应超声激发，产生包括超氧阴离子（·O2 -）、单线态氧（1O2）和羟基自由基（·OH）等在内的活性氧物质。然而，传统的TiO2纳米粒子，由于其能带结构中被激发的电子（e-）和空穴（h+）容易快速重组，导致活性氧的量子产率较低，使其声动力性能不很理想。因此，人们开发了各种方法来提高TiO2的量子产率，如在TiO2表面形成氧缺陷层，与半导体进行复合，或将TiO2与铂、金、银等贵金属结合以克服e--h+的复合。文献报道，由于介孔材料具有高比表面积和多孔结构，对气体具有优异的吸附性能，有利于提供更多的成核位点，降低空化阈值强度，因而是理想的声敏剂。同时研究表明树枝状大孔介孔硅纳米粒子（Dendritic large-pore mesoporous silicananoparticles, DLMSNs）具有高比表面积、大孔体积和形貌可控等特点，也具有一定的声敏性，因而本发明采用DLMSNs为模板，在其上继续生长TiO2，得到具有高比表面积的介孔TiO2，并将银进一步沉积在TiO2表面，实现增强声动力性能的目的。此外，沉积在TiO2表面的银还具有化学动力性能，即可以通过类芬顿反应产生活性氧物质，在超声的作用下也可显著增强其化学动力性能，从而协同提高牙周炎治疗效果。
为了使纳米粒子能较好的黏附于细菌表面或进入细菌，我们采用常用的抗菌材料壳聚糖修饰纳米粒子表面，并季铵化，使其具有高正电性，从而可以使纳米声敏剂高效吸附于细菌上。在本发明中所制备的DT-Ag-CS+纳米复合物，一方面可以通过带正电性的季铵化壳聚糖的静电相互作用使纳米粒子具有更好的入菌能力，增加其选择性。另一方面，在超声条件下TiO2/Ag可通过增强的声动力和化学动力性能产生大量的活性氧物质，巧妙的实现了多种策略的联合，达到高效的抗菌效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及其应用。该纳米复合物以DLMSNs为模板，在其基础上继续生长TiO2，然后通过光还原法在其表面原位沉积Ag，最后在纳米粒子表面修饰天然抑菌剂壳聚糖，并季铵化。通过季铵化壳聚糖的静电相互作用使纳米复合物高效吸附并进入细菌，再在低功率超声作用下，实现利用增强的声动力和化学动力联合抗牙周炎致病菌的目的。
本发明提供的用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法包括的步骤：
1）将三乙醇胺溶解在超纯水中，在80-85 ℃油浴中搅拌下加入十六烷基三甲基溴化铵，再加入地拉罗司，搅拌2-3小时后加入正硅酸四乙酯，继续反应15-20 min。终止反应，离心，沉淀用乙醇洗涤。再分散在无水甲醇/浓盐酸混合溶液（10/1，v/v）中，油浴回流5-6h，重复3次，去除模板剂，得到树枝状大孔二氧化硅纳米粒（定义为：DLMSNs）。
2）取步骤1）得到的DLMSNs分散在乙醇/乙腈混合溶液中（3/1，v/v），在搅拌下加入氨水（25wt%）。将分散在乙醇/乙腈混合溶液中（3/1，v/v）的钛酸丁酯加入到DLMSNs混合液中，搅拌0.5-1 h，停止反应，离心，沉淀用乙腈洗涤。然后将产物分散在乙腈和超纯水中（15/1，v/v），转入高压釜，在150-170 ℃下恒温5-6 h。随后离心，沉淀用乙腈洗涤，得到树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛纳米粒（定义为：DT）。
3）取步骤2）得到的DT分散在超纯水中，加入硝酸银溶液，在365 nm紫外光（45 W）照射下，搅拌反应1.5-2 h，离心，沉淀用超纯水洗涤，得到树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒（定义为：DT-Ag）。
4）将步骤3）得到的DT-Ag分散在无水乙醇中，75-80 ℃油浴搅拌，该步骤重复三次。然后用无水丙酮洗2次，再用无水甲苯洗一次，分散在无水甲苯中，加入适量三乙胺、N,N’-二甲基甲酰胺和3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，100-120 ℃油浴搅拌22-24 h。然后离心，用丙酮洗2次，收集沉淀得到环氧基团修饰的DT-Ag。
5）称取低分子量壳聚糖，将其溶于超纯水中，得到壳聚糖水溶液(1 mg/mL)；将步骤4）得到的环氧基团修饰的DT-Ag分散在无水乙腈中，将其滴加入壳聚糖水溶液中，在50℃油浴下搅拌30-32 h，得到壳聚糖修饰的树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒（定义为：DT-Ag-CS）。
6）称取适量2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于超纯水中，滴加到步骤5）得到的DT-Ag-CS中，35-40 ℃油浴搅拌反应40-48 h，然后离心，沉淀用超纯水洗2次，得到季铵化壳聚糖修饰的树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒（定义为：DT-Ag-CS+）。
进一步地，在步骤1）中，所述得到的DLMSNs粒径为80–120 nm。
进一步地，在步骤2）中，所述DLMSNs与酞酸丁酯的质量比为1:10~50，优选为1:25。
进一步地，在步骤3）中，所述DT与硝酸银的质量比为1:100~200，优选为1:120。
进一步地，在步骤4）中，所述DT-Ag与3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷与三乙胺的质量比为1:10~30:10~30，优选为1:20:15，所述的试剂均为无水状态。
进一步地，在步骤5）中，所述壳聚糖的分子量在500~3000，DT-Ag与壳聚糖的质量比为1:5~20。
所述的纳米复合物DT-Ag-CS+粒径为80–150 nm。
本发明提供了上述的制备方法得到的用于超声治疗牙周炎的纳米复合物。
本发明借助DLMSNs的高比表面积和大孔体积，通过钛前体的预水解和水热法处理得到DT，然后在其表面通过光还原法修饰银，表面修饰壳聚糖后，进一步季铵化成功制备了DT-Ag-CS+。在低功率超声作用下，通过将该复合纳米粒联合声动力、化学动力和季铵化壳聚糖抗菌治疗，针对牙周炎致病菌进行多重打击，实现高效无创治疗牙周炎的目的。该方法操作简便、稳定可靠、生物安全性好，为临床治疗牙周炎提供了新方法和新思路。
本发明提供了上述的纳米复合物DT-Ag-CS+在超声治疗牙周炎药物中的应用，其主要优点为：
1）针对解决顽固性牙周炎难以治愈的问题，本发明提供了一种用于低功率超声下无创治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法及应用。通过联合声动力、化学动力和季铵化壳聚糖对细菌的粘附性等多种策略，实现高效无创抗牙周炎致病菌的目的。
2）该纳米复合物选用本身就具有一定声动力性能，且比表面积大、粒径可控、表面易于修饰的DLMSNs作为模板，通过在其上继续生长TiO2，得到具有高比表面积的声敏剂介孔TiO2，进而提高其声敏性。相比直接制备介孔二氧化钛纳米粒子，该方法更简单、更可控、比表面积更大。
3）在介孔TiO2表面进一步修饰银，不仅能阻止超声激发的电子回到空穴，提高ROS产率，同时可通过类芬顿反应发挥其化学动力性能，协同增强抗菌效果。
4）纳米粒子表面修饰季铵化壳聚糖，可以使其通过静电相互作用吸附并进入细菌，更好的发挥该纳米复合物的抗菌性能，实现对牙周炎的高效治疗。
附图说明
图1、实施例1中合成的纳米粒子的TEM图；A：DLMSNs；B：DT；C：DT-Ag；D：DT-Ag-CS+。
图2、实施例1中合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+在超声（1 W/cm2）作用下不同时间时产生的1O2水平。
图3、实施例1中合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+在有/无H2O2（1 mM）或超声（1 W/cm2，5 min）作用后产生的•OH水平。
图4、实施例1中合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+在有/无H2O2（1 mM）或超声（1 W/cm2，5 min）作用后产生的活性氧物质水平。
图5、实施例2中合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+对细菌壁膜破坏的性能表征；A.不超声；B.超声。
图6、实施例2中合成的纳米粒子DT-Ag-CS+对3T3细胞和HUVEC细胞的细胞活性影响。
图7、实施例2中合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+在有无超声和/或有无H2O2存在时对牙龈卟啉单胞菌的杀伤效应。
图8、实施例3中通过CT成像表征合成的纳米粒子DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+在超声或不超声时的体内抗牙周炎效果；A：牙周炎大鼠在不同治疗后牙槽骨三维Micro-CT图像；B：不同治疗组大鼠颊腭侧牙槽嵴顶到釉牙骨质界的距离；C：不同治疗组大鼠的骨密度（BMD）和骨体积（BV）值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：纳米复合物DT-Ag-CS+的制备和表征
1）DLMSNs的制备
将400 mg三乙醇胺溶解在20 mL超纯水中，于85 ℃油浴下加入304 mg十六烷基三甲基溴化铵，在500 rpm搅拌1 h，然后加入91 mg地拉罗司固体，继续搅拌3 h。然后加入3.2mL正硅酸四乙酯，反应2 min后终止。产物于15000 rpm，20 min条件下离心收集，沉淀用乙醇洗涤。然后将沉淀分散在无水甲醇/浓盐酸混合溶液（10/1，v/v）中，回流6 h，重复三次，除去模板剂。产物DLMSNs经离心收集，用无水乙醇洗后，重新分散在无水乙醇中。（详细制备方法也可参见中国专利文献ZL201910061043.3，微孔介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，授权公告号：CN109607554B）。DLMSNs的透射电镜图见图1A。
2）DT的制备
取8 mg DLMSNs分散在32 mL乙醇/乙腈混合液中（3/1，v/v）中，在800 rpm搅拌下加入0.2mL的氨水（25wt%）。另取0.2 mL钛酸丁酯溶于8 mL乙醇/乙腈混合液（3/1，v/v）。将酞酸丁酯混合液滴加入上述DLMSNs混合液中，搅拌1 h，停止反应，产物离心15000 rpm，20min，用乙腈洗1次。然后分散在15 mL乙腈和1 mL超纯水中，转入聚四氟乙烯反应釜，放入马弗炉中，在170 ℃恒温5 h。将反应釜冷却至室温，产物经离心收集，用乙腈洗1次，得到DT。DT的透射电镜图见图1 B。
3）DT-Ag的制备
取8 mg DT分散在40 mL超纯水中，在1000 rpm搅拌下，室温和紫外光（45 W紫外灯，中心波长365 nm）条件下，逐滴加入终浓度为0.12 mM的硝酸银溶液，800 rpm下搅拌，反应2 h。产物经离心收集，用超纯水洗3次，得到DT-Ag。DT-Ag的透射电镜图见图1 C。
4）环氧基团修饰的DT-Ag的制备
将8 mg DT-Ag分散在30 mL无水乙醇中，在80 ℃油浴500 rpm搅拌反应6 h，重复三次。产物经离心收集，依次用无水乙醇、无水丙酮和无水甲苯洗1次，最终分散在80 mL的无水甲苯（0.1 mg/mL）中，分别加入280 μL三乙胺、160 μLN,N’-二甲基甲酰胺和3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和1 mLN,N’-二甲基甲酰胺，在120 ℃油浴中搅拌反应24 h，产物经离心收集，并用无水丙酮洗2次，沉淀重新分散在乙腈中，得到环氧基团修饰的DT-Ag。
5）DT-Ag-CS的制备
称取120 mg壳聚糖，溶于120 mL超纯水中，使其浓度为1 mg/mL，超声30 min，得到壳聚糖水溶液。取环氧基团修饰的DT-Ag 8 mg，分散在80 mL无水乙腈中，超声30 min。然后用滴液漏斗滴加入上述壳聚糖水溶液中，于50 ℃下700 rpm油浴搅拌32 h，得到DT-Ag-CS反应液。
6）DT-Ag-CS+的制备
称取1.6 g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵加到上述DT-Ag-CS反应液中，40 ℃500rpm油浴搅拌反应48 h。停止反应，产物经离心收集，并用超纯水洗3次，得到DT-Ag-CS+。DT-Ag-CS+的透射电镜图见图1 D。
7）DT-Ag-CS+的体外1O2生成量考察
采用紫外探针1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）检测DT-Ag-CS+在超声作用下产生的1O2水平。在1 mL浓度为100 μg/mL的DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+溶液中分别加入含有DPBF（1 mg/mL）的DMSO溶液60 μL。对各样品溶液进行不同时间（0、1、2、3、4、5 min）的超声，超声参数设置为1 W/cm2，5 min，1 MHz，50%占空比。超声后，通过紫外可见光谱检测各样品在425 nm的吸光度。
8）DT-Ag-CS+的体外•OH生成量考察
采用荧光探针对苯二甲酸（TA）检测在超声和H2O2存在下DT-Ag-CS+产生的•OH水平。实验分为12个组（对照组、DLMSNs、DT、DT-Ag、DT-Ag-CS+、对照组+U、DLMSNs+U、DT+U、DT-Ag+U、DT-Ag-CS++U、DT-Ag-CS++H2O2、DT-Ag-CS++H2O2+U），各组中TA、H2O2、样品的终浓度分别为5 mM、1 mM和100 μg/mL。超声参数设置为1 W/cm2，5 min，1 MHz，50%占空比。最后用荧光分光光度计检测各样品溶液的荧光强度，激发波长为315 nm，发射波长为435 nm。
9）DT-Ag-CS+的体外总活性氧物质生成量考察
采用荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）检测在超声和H2O2存在下DT-Ag-CS+产生的总活性氧物质生成水平。在检测前首先将DCFH-DA进行预处理，避光条件下，在DCFH-DA溶液中加入DMSO和NaOH，搅拌反应30 min后，加入PBS溶液终止反应，置于冰上待用。实验分为12个组（对照组、DLMSNs、DT、DT-Ag、DT-Ag-CS+、对照组+U、DLMSNs+U、DT+U、DT-Ag+U、DT-Ag-CS++U、DT-Ag-CS++H2O2、DT-Ag-CS++H2O2+U），其中，U代表超声。各组中ROS探针、H2O2、样品的终浓度分别为20 μM、1 mM和100 μg/mL。超声参数设置为1 W/cm2，5 min，1MHz，50%占空比。最后用荧光分光光度计检测各样品溶液的荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。
按照实施例1各步所得纳米粒子的透射电镜照片见图1，结果显示最终的DT-Ag-CS+纳米粒子平均粒径为100±10 nm。
表1为各步所得纳米粒子的水力直径，多分散系数和Zeta电位：
DLMSNs DT DT-Ag DT-Ag-CS <![CDATA[DT-Ag-CS<sup>+</sup>]]>
流体力学直径(nm) 110±2 181±2 185±4 199±2 193±4
多分散系数 0.079±0.03 0.084±0.02 0.093±0.03 0.110±0.03 0.094±0.04
Zeta电位(mV) -24.6±2.0 -29.5±5.8 -29.6±4.0 16.2±2.9 30.8±4.5
结果显示DT-Ag-CS+纳米粒子的流体力学直径为193±4 nm，多分散系数为0.094±0.04，Zeta电位为30.8±4.5 mV。
图2为不同纳米粒子在超声作用下产生1O2的水平。结果表明DT-Ag-CS+经过超声处理后，DPBF在425 nm处的吸光度值明显下降，且随着超声时间的延长，下降越明显，说明该溶液中1O2生成水平逐渐增加，表明纳米复合物DT-Ag-CS+具有优异的声敏作用。
图3为不同纳米粒子在超声作用下产生•OH的水平。可以看出，在不超声和未加H2O2时，各纳米粒子均未显示明显的荧光强度。经过超声作用后，DT-Ag和DT-Ag-CS+均产生了明显的荧光信号，说明超声激发其在溶液中产生了较多的•OH。而当加入H2O2后，DT-Ag-CS+溶液中产生了明显的荧光信号，表明其催化H2O2产生了大量•OH，具有极强的化学动力学效应。当加入H2O2并在超声作用后，DT-Ag-CS+显示了最强的荧光强度，说明其显示了最高的•OH生成水平。
图4为不同纳米粒子在不同条件处理下产生ROS的水平。可以看出，相比对照组单纯加入各纳米粒子后均显示出较弱的荧光强度。对于DT-Ag-CS+组，在加入H2O2后荧光强度明显升高，说明DT-Ag-CS+中的Ag与H2O2发生了氧化还原反应，产生了动力学效应。当各实验组在超声（1 W/cm2，5 min，1 MHz，50%占空比）作用后，荧光强度均不同程度的显著增高。在超声激发下，DT产生的荧光强度高于DLMSNs的，证明TiO2的声动力效应强于DLMSNs的。而DT-Ag在超声作用下产生的荧光强度显著高于DT在同样条件下产生的荧光强度，表明Ag的引入促进了超声作用下在DT上产生的e--h+的分离，显著增强了活性氧的产生能力。然而，在超声作用下DT-Ag-CS+产生的荧光强度略低于DT-Ag的，这可能是由于其表面修饰的季铵化CS对荧光分子的吸附产生了一定的干扰。在超声作用下，DT-Ag-CS+联合H2O2产生的荧光强度最高，说明DT-Ag-CS+通过联合声动力与化学动力效应产生了更多的活性氧物质。
实施例2：纳米复合物DT-Ag-CS+的体外抗菌性能考察
第一步：检测从实施例1获得的纳米材料粒子破坏细菌壁膜通透性的效果。具体操作如下：将不同纳米粒子溶液（100 μg/mL）与1 mL 1×104 CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌液共孵育1 h；在不超声或超声（1 W/cm2）处理后，加入终浓度为20 μM的细菌壁膜损伤检测荧光探针N-苯基-1-萘胺（NPN），继续孵育30 min；然后用荧光分光光度计检测各组的荧光强度，NPN的激发波长为350 nm，发射波长为420 nm，通过荧光强度变化分析细菌细胞壁膜渗透性的改变。
纳米复合物DT-Ag-CS+在体外破坏细菌壁膜通透性结果参见图5。与DT-Ag-CS+共孵育的牙龈卟啉单胞菌表现出更高的NPN荧光强度，表明它可以显著增强细菌细胞膜的穿透性。进一步超声后，DT-Ag和DT-Ag-CS+培养的牙龈卟啉单胞菌中NPN的荧光信号均明显增强，说明DT-Ag-CS+介导的超声作用对细菌细胞膜具有很强的破坏性，有利于将其进细菌中发挥抗菌作用。
第二步：检测从实施例1获得的纳米复合物DT-Ag-CS+的生物相容性。具体操作如下：将小鼠成纤维细胞NIH-3T3和人脐静脉内皮细胞HUVECs接种到96孔板上，使其生长24 h后，分别加入不同浓度的DT-Ag-CS+，并继续培养24 h；然后向96孔板每孔内加入20μL浓度为5 mg/mL的四甲基偶氮唑盐溶液，并置于恒温培养箱中继续孵育4 h。随后弃去培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，避光摇床缓慢震荡，使用全波长酶标仪测定在各490 nm波长处的吸光值。
纳米复合物DT-Ag-CS+对NIH-3T3和HUVECs细胞的毒性结果参见图6。DT-Ag-CS+在0-400 μg/mL浓度范围内对细胞活力没有明显影响，说明DT-Ag-CS+在细胞水平上具有良好的生物相容性。
第三步：检测从实施例1获得的不同纳米材料对牙龈卟啉单胞菌的抑菌性能。具体操作如下：取生长状态为稳定期的牙龈卟啉单胞菌液，均匀铺在96孔板中，分别加入浓度为（100 μg/mL）的DLMSNs、DT、DT-Ag、DT-Ag-CS+纳米粒子溶液，并分为4组进行不同处理：1)对照组；2)H2O2；3)U；4)H2O2+U；其中H2O2的浓度为1 mM，U表示超声。孵育3 h后，对超声组进行超声作用，超声条件为1 W/cm2，5 min，1 MHz，50%占空比，然后放入37 ℃厌氧条件下继续孵育3 h；用酶标仪在600 nm处检测其OD值。
纳米复合物DT-Ag-CS+对牙龈卟啉单胞菌的抑菌性能参见图7。在没有超声作用的情况下，DLMSNs、DT组处理的细菌存活率仍保持在80%以上，说明这些纳米粒子具有良好的生物安全性。当纳米粒子中引入银后，DT-Ag与共孵育后，导致细菌的活性降低为到78.3%，显示了较弱的毒性。表面修饰季铵化CS后，DT-Ag-CS+处理的细菌存活率降低至64.4%，表现为增强的抗菌活性。当加入H2O2后，DT-Ag和DT-Ag-CS+表现为显著增强的细菌抑制作用，证明了Ag的引入导致纳米粒子产生了较强的化学动力性能。在加入纳米粒子并给与超声作用后时，相比对照组，DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+显示了依次增强的细菌抑制性能。当细菌与H2O2共孵并经过超声处理后，DT-Ag和DT-Ag-CS+组的细菌存活率显著降低，尤其是DT-Ag-CS+组，92.4%的细菌被杀死，表明超声作用不仅激发了DT-Ag-CS+的声动力性能，而且增强了其化学动力性能，从而实现了高效的抑菌效果。
实施例3：纳米复合物DT-Ag-CS+介导的超声作用体内抗菌性能考察
纳米复合物DT-Ag-CS+介导的超声作用体内抗牙周炎效果考察，具体操作如下：将建模成功的Wistar大鼠麻醉，去除结扎丝，随机分为10组，每组3只：Control（-）、Control（+）、DLMSNs、DT、DT-Ag、DT-Ag-CS+、DLMSNs+U、DT+U、DT-Ag+U、DT-Ag-CS++U。治疗时，分别使用100 μL（100 μg/mL）各组样品对各实验组中牙周炎模型大鼠上颌左侧第二磨牙充分冲洗，其中超声组中的超声条件设置为1 W/cm2，5 min，1 MHz，50%占空比。每3天治疗1次，连续治疗5次。治疗结束后，对各组大鼠进行全身麻醉，使用SkyScan1276小动物显微CT扫描仪对大鼠头部位置，包括上颌骨位置进行扫描成像，评估其牙槽骨损伤情况。使用CTVox软件进一步重建三维图像，测定骨体积（BV）和骨密度（BMD）。使用CTAn软件测量颊侧和腭侧间的距离。
纳米复合物DT-Ag-CS+介导的超声作用体内抗牙周炎作用结果参见图8。与阴性对照组大鼠相比，阳性对照组大鼠、DLMSNs与DT组治疗的牙周炎大鼠的上颌第二磨牙周围分别发生了明显的骨吸收，牙周膜间隙变宽，没有明显的修复。DT-Ag和DT-Ag-CS+组大鼠的牙槽骨显示了一定的修复迹象。而在超声作用后，各组大鼠的牙槽骨吸收均不同程度的减弱，DLMSNs、DT、DT-Ag和DT-Ag-CS+组的大鼠牙槽骨吸收依次降低，牙周膜间隙逐渐缩小。其中，DT-Ag-CS+组大鼠的牙槽骨吸收最少，说明在超声作用下DT-Ag-CS+对牙周炎的治疗效果最好。
使用CTAn软件，测量上颌第二磨牙近中到远中根面的三个点之间的距离，即牙槽嵴顶（ABC）与釉牙骨质界（CEJ）之间的距离，可以更加精确的测量各组大鼠的牙槽骨吸收情况。结果和三维CT图像显示的一致，可以看出DT-Ag-CS+介导的超声作用对牙周炎的治疗可以使牙槽骨恢复到接近正常的水平。
使用CTVox软件进一步重建三维图像，通过测定大鼠骨密度（BMD）和骨体积（BV）的变化，也可以评价不同处理方法对牙周炎的治疗效果。结果显示了同上相同趋势的治疗效果，经过DT-Ag-CS+联合超声治疗的牙周炎大鼠，牙槽骨骨体积和骨密度值最高，基本恢复到正常水平。

Claims (12)

1.一种用于超声治疗牙周炎的纳米复合物的制备方法，其特征在于包括的步骤：
1）将三乙醇胺溶解在超纯水中，在80-85 ℃油浴中搅拌下加入十六烷基三甲基溴化铵，再加入地拉罗司，搅拌2-3 h后加入正硅酸四乙酯，继续反应15-20 min；终止反应，离心，沉淀用乙醇洗涤，再分散在体积比为10:1的无水甲醇与浓盐酸混合溶液中，油浴回流5-6 h，重复3次，去除模板剂，得到树枝状大孔二氧化硅纳米粒DLMSNs；
2）将DLMSNs分散在体积比为3:1的乙醇/乙腈混合溶液中，在搅拌下加入25wt%氨水，再将分散在体积比为3:1的乙醇与乙腈混合溶液中的钛酸丁酯加入到DLMSNs混合液中，搅拌0.5-1 h，停止反应，离心，沉淀用乙腈洗涤；然后将产物分散在体积比为3:1的乙腈和超纯水中，转入高压釜，在150-170 ℃下恒温5-6 h，离心，沉淀用乙腈洗涤，得到树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛纳米粒DT；
3）取DT分散在超纯水中，加入硝酸银溶液，在365 nm紫外光45 W照射下，搅拌反应1.5-2h，离心，沉淀用超纯水洗涤，得到树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒DT-Ag；
4）将DT-Ag分散在无水乙醇中，75-80 ℃油浴搅拌，该步骤重复三次，然后用无水丙酮洗2次，再用无水甲苯洗一次，分散在无水甲苯中，加入三乙胺、N,N’-二甲基甲酰胺和3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，100-120℃油浴搅拌22-24 h，离心，用丙酮洗2次，收集沉淀得到环氧基团修饰的DT-Ag；
5）将低分子量壳聚糖溶于超纯水中，得到壳聚糖水溶液；将步骤4）得到的环氧基团修饰的DT-Ag分散在无水乙腈中，滴加入1 mg/mL的壳聚糖水溶液中，在50℃油浴下搅拌30-32h，得到壳聚糖修饰的树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒DT-Ag-CS；
6）将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于超纯水中，滴加到步骤5）得到的DT-Ag-CS中，35-40 ℃油浴搅拌反应40-48 h，然后离心，沉淀用超纯水洗2次，得到季铵化壳聚糖修饰的树枝状大孔二氧化硅/二氧化钛/银纳米粒DT-Ag-CS+。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）所述得到的DLMSNs粒径为80–120 nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的DLMSNs与钛酸丁酯的质量比为1:10~50。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的DLMSNs与钛酸丁酯的质量比为1:25。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的DT与硝酸银的质量比为1:100~200。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的DT与硝酸银的质量比为1:120。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4）所述DT-Ag、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷与三乙胺的质量比为1:10~30:10~30，试剂均为无水状态。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4）所述DT-Ag、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷与三乙胺的质量比为1:20:15，试剂均为无水状态。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）所述壳聚糖的分子量为500~3000，DT-Ag与壳聚糖的质量比为1:5~20。
10.权利要求1-9任一所述的制备方法得到的纳米复合物DT-Ag-CS+。
11.根据权利要求10所述的纳米复合物DT-Ag-CS+，其特征在于：该纳米复合物DT-Ag-CS+粒径为80–150 nm。
12.权利要求10所述的纳米复合物DT-Ag-CS+在用于制备超声治疗牙周炎药物中的应用。
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