CN113181060B - 一种具有除菌效果的复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有除菌效果的复合纳米材料及其制备方法和应用,通过介孔纳米材料氨基化修饰后负载声敏剂、表面包覆二价或/和三价铁离子,在过氧化氢存在的情况下,发生芬顿反应,产生活性氧(ROS)发挥杀菌作用。通过使用口腔诊疗常用的超声辅助手段,可激发声敏剂产生ROS,同时进一步辅助增强芬顿反应,产生大量ROS,提高清除根管细菌感染和杀菌的效率,能够达到清除根管内细菌生物膜并彻底杀灭细菌的目的。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域,具体涉及一种清除牙齿根管细菌的复合纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
牙髓炎及根尖周感染是目前口腔的常见病和高发病,不仅容易造成牙齿缺失、牙列缺损、口腔颌面部感染等口腔疾病,牙髓、根尖周感染还可能引起如细菌性心内膜炎等系统性疾病,不仅给患者身心健康造成巨大的伤害、降低患者的生活质量,也造成巨大的经济损失。目前的研究认为,细菌感染是牙髓炎的主要病因,根管治疗是目前国际公认的治疗牙髓炎及根尖周病变的首选治疗方法,即通过清除根管内感染、对根管进行彻底消毒,然后对根管系统进行严密充填,维持根管及根尖无感染的状态,促进根尖周组织恢复。随着治疗理念的不断更新和专科材料器械的发展,根管治疗的成功率不断提升,但仍存在一定的失败率,彻底清除根管内感染对根管治疗的成功至关重要,目前,利用机械清理结合化学药物冲洗对根管进行消毒是根管感染控制的重要手段。
目前临床上多采用0.5%-5.25%的次氯酸钠、氢氧化钙糊剂等对根管进行消毒。次氯酸钠(NaClO)具有广泛的抗菌谱,具有较强的组织溶解能力,能够溶解有机组织从而达到清除感染、杀灭细菌的作用,是目前根管治疗最常用的根管冲洗剂。然而,NaClO的强组织溶解能力,在冲洗牙齿根管的同时会破坏牙本质结构,对人体组织也有较强的刺激和细胞毒性。氢氧化钙生物安全性好,但细菌容易通过质子泵等机制对氢氧化钙产生耐药,因此,探寻新的根管冲洗抗菌材料对提高根管治疗成功率、方便临床诊疗具有重大的意义。
使用超声辅助根管冲洗在根管治疗中得到了广泛的应用,超声波能够在液体介质中发生空化效应,能够对根管内细菌、牙本质碎屑进行清除,促进冲洗液进入复杂、形态特殊的根管系统。然而,单独使用超声抗菌的效果有限,需要配合冲洗剂使用,加强对超声波技术的研发与探究,促进超声波技术与材料相互配合、优势互补,对开发更加高效和安全的根管冲洗材料具有极高的应用前景和临床价值。
声动力治疗是利用低频低强度超声激活声敏剂产生ROS,从而特异性地杀伤靶细胞,在肿瘤治疗中展现出极大的潜力。将超声与声敏剂结合起来发挥效用的策略在清除细菌生物膜、杀菌方面亦具有极大的优势和潜力:依靠超声激活声敏剂产生ROS从而杀死细菌,超声优良的渗透效果有利于深入组织和器械不易到达的部位清除细菌生物膜,因此,声动力抗菌在清除口腔细菌感染具有极大的优势和潜力。
因此,根据声敏材料的特性和ROS杀菌的原理,本发明设计和合成一种具有超声辅助增强产生ROS的复合纳米材料,高效清除牙齿根管内的感染的同时彻底杀灭细菌。截止目前,有关方面的研究并未有报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种清除牙齿根管细菌的复合纳米材料,利用介孔纳米材料负载声敏剂和铁离子化合物,H2O2溶液或/和超声的条件下产ROS,用于降低牙齿根管内细菌的活性,提升根管治疗的可靠性。
鉴于此,本发明的方案如下:
一种清除牙齿根管细菌的复合纳米材料,由介孔纳米材料经氨基化修饰并负载声敏剂后,再包覆二价和/或三价的铁离子后得到。
优选地,所述介孔纳米材料为纳米介孔硅。
优选地,所述声敏剂为原卟啉。
本发明还提出一种清除牙齿根管细菌的复合纳米材料的制备方法,步骤包括:对介孔纳米材料经氨基化修饰处理后,在溶剂条件下加入声敏剂进行负载,搅拌下收集沉淀并洗涤;产物分散后加入二价和/或三价的铁离子化合物进行包覆,离心收集沉淀并洗涤获得所述复合纳米材料。
优选地,所述介孔纳米材料为介孔硅纳米材料,可由CTAC模板法制备得到,也可以直接购买获得。
优选地,采用氨基硅烷对所述介孔硅纳米材料进行氨基化处理,更加优选3-氨丙基三甲氧基硅烷。
优选地,所述声敏剂为原卟啉。
优选地,负载所述声敏剂所采用的溶剂为有机溶剂,如DMF。
优选地,所述声敏剂负载过程为:将原卟啉和介孔硅溶于DMF中,避光搅拌下反应后离心收集沉淀,DMF洗涤若干次。
优选地,所述包覆过程为:将声敏剂负载产物在水中分散,加入二价和/或三价的铁离子化合物,搅拌反应后离心取沉淀,洗涤后得到。
本发明还提供一种高效清除细菌的方法,采用上述的复合纳米材料或上述制备方法所得复合纳米材料,在H2O2溶液或/和超声的条件下进行除菌操作。
优选地,所述H2O2溶液浓度为0.01%V/V;所述超声条件为1MHz,0.5W/cm2,超声3min以上,具有较高的根管感染清除效果。
本发明还提出如上所述的复合纳米材料在制备治疗牙齿根管感染药物中的应用。
相比现有技术,本发明的有益效果为:
1.本发明提供的复合纳米材料,含声敏剂与铁金属离子(Fe2+、Fe3+),能够在H2O2溶液或/和超声的条件下产生ROS,性能稳定。
2.本发明提供的复合纳米材料可在H2O2溶液或/和超声的条件下的清除牙齿根管感染,效果好,完全可以替代传统治疗方式。
本发明提供的符复合纳米材料制备工艺简便,工艺参数易于控制,是获得根管治疗纳米复合材料的绝佳路径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1所得产物的扫描和透射电镜图,其中,图1a、1e、1i为介孔硅;图1b、1f、1j为氨基化介孔硅;图1c、1g、1k为负载原卟啉的氨基化介孔硅;图1d、1h、1l为包覆氯化铁的复合介孔硅纳米粒子;
图2是本发明介孔硅、氨基化介孔硅、负载原卟啉、包覆氯化铁的复合介孔硅纳米粒子Zeta电势检测结果图;
图3是本发明介孔硅、负载原卟啉以及负载氯化铁的复合介孔硅纳米粒子合用低浓度H2O2(0.01%V/V)或/和超声刺激下产ROS的效率对比示意图;
图4是本发明图3的局部放大图;
图5是本发明的负载原卟啉和氯化铁的复合介孔硅纳米粒子作为清除牙齿根管细菌感染的纳米材料抑制粪肠球菌(E.faecalis)的生长曲线图;
图6是本发明负载原卟啉和氯化铁的复合介孔硅纳米粒子清除根管感染的SEM图,其中6a、6b、6c、6d分别为纯水、0.01%V/V H2O2、M@P-Fe的0.01%V/V H2O2溶液(1mg/mL)、商用NaClO的杀菌效果图;图6e、6f、6g、6h为纯水、0.01%V/V H2O2、M@P-Fe的0.01%V/VH2O2溶液(1mg/mL)、商用NaClO加超声后的对应效果图。
具体实施方式
为更好的理解本发明,下面的实施例是对本发明的进一步说明,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实例用于说明本发明,但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下,对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
本发明提供一种清除牙齿根管细菌的复合纳米材料,由介孔纳米材料经电性修饰并负载声敏剂后,再包覆铁离子后得到;所述复合纳米材料在H2O2溶液或/和超声的条件下产ROS。
本发明中,所述复合纳米材料的制备方法如下:对介孔纳米材料氨基化修饰处理后,在溶剂条件下加入声敏剂进行负载,搅拌下收集沉淀并洗涤;产物分散后加入铁离子化合物进行包覆,离心收集沉淀并洗涤获得所述复合纳米材料。
在本发明中,所述氨基化修饰的目的是通过介孔纳米材料表面电势和活性基团的改变,降低复合纳米材料的整体电势,便于负载声敏剂。
声敏剂的负载是为了在超声条件下被激活产生ROS,二价和/或三价铁离子化合物的包覆是为了在H2O2条件下,发生芬顿反应产生大量ROS,超声辅助增强芬顿反应,进一步增加ROS的产生。
反应式如下:
Fe2++H2O2→Fe3++(OH)-+OH· ①
H2O2+Fe3+→Fe2++O2+2H+ ②
O2+Fe2+→Fe3++O2 - ③
本发明所述介孔纳米材料选择纳米介孔硅,粒径在150nm左右;所述声敏剂选择原卟啉,根据本领域技术人员的常识还可以选择其他的声敏剂,用于在超声条件下产生ROS;本发明所述二价、三价铁离子化合物可选择氯化铁、氯化亚铁,还可以选择硫酸铁、硫酸亚铁、硝酸铁、硝酸亚铁等常见化合物。
本发明通过介孔硅改性并负载原卟啉后,包覆氯化铁后,在H2O2溶液或/和超声的条件下的清除牙齿根管感染,效果好,完全可以替代传统治疗方式;特别地,在本发明中0.01%V/V的H2O2溶液中,超声条件下(1MHz,0.5W/cm2)下不仅能够清除生物膜,还能彻底杀死细菌。
实施例.抗菌材料的制备及表征
一、抗菌材料的制备
本实施例所述负载原卟啉和氯化铁的介孔硅复合材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)纳米介孔硅载体的合成:将10g十六烷基三甲基氯化铵(Cetyltrimethylammoniumchloride,CTAC)、0.4g三乙醇胺(TEA)溶于100mL去离子水中,95℃下用力搅拌溶解1h,然后缓慢匀速滴加7.5mL正硅酸乙酯(Tetraethyl orthosilicate,TEOS)后再搅拌1h,所得溶液11000rpm离心30分钟收集沉淀,使用去离子水和甲醇洗几次。将所得沉淀与浓盐酸混合,在回流下60℃剧烈搅拌48小时以去掉模板CTAC,然后获得介孔硅球(MSN)。
(2)介孔硅的氨基化:将50mg上述合成的介孔硅球分散于100mL乙醇中,然后加入500uL的3-氨丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane,APTES),回流下80℃剧烈搅拌过夜,然后离心收集沉淀,去离子水和乙醇洗几次,离心收集沉淀得氨基化修饰的介孔硅球(MSN-NH2)。
(3)原卟啉的负载:室温下,将50mg原卟啉和10mg介孔硅溶于20mL二甲基甲酰胺(DMF)中,避光搅拌下反应8h后离心收集沉淀,使用DMF洗涤几次,收集获得负载原卟啉的介孔硅纳米粒子(M@P)。
(4)铁离子的包覆:将10mg上述所得负载原卟啉的介孔硅纳米粒子(M@P)分散于10mL去离子水中,加入10mg的氯化铁,室温下搅拌反应3h后离心取沉淀,使用去离子水洗涤几次,得负载并包裹铁的介孔硅纳米粒子(M@P-Fe)。
二、复合材料的表征
由本实施例制备方法得到的介孔硅(MSN)、氨基化介孔硅(MSN-NH2)、负载原卟啉(M@P)、氯化铁的复合介孔硅纳米粒子(M@P-Fe)分别进行扫描和透射电镜的表征,结果分别如图1a、1e、1i;图1b、1f、1j;图1c、1g、1k;图1d、1h、1l所示。由图1a、1e、1i可知,所合成的介孔硅粒径150nm左右,形貌规则、分散性好。由对应的电镜图可知,氨基化修饰(MSN-NH2)、负载原卟啉(M@P)、包覆氯化铁(M@P-Fe)并不会对纳米粒子的形貌、分散性产生不利影响。
图2为本发明上述实施例提供的制备方法得到的介孔硅、氨基化介孔硅和负载原卟啉和氯化铁的复合介孔硅纳米粒子Zeta电势检测结果,检测结果显示,MSN的电势约为-14.1mV,氨基化修饰后电势翻转为24.6mV,原卟啉负载后电势变为-13.7mV,表面包覆氯化铁后电势再次转正为3.4mV,证实MSN的氨基化修饰的必要性和有效性,确定了原卟啉的成功负载以及氯化铁的成功包覆。
实验例.材料性能测试
1.产ROS效率测试
使用非荧光的2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针检测所合成的材料ROS生成情况。将0.1mg所制得的MSN、M@P和M@P-Fe溶于1mL的去离子水或0.01%V/VH2O2,然后加入20uL的DCFH-DA,超声组(US)的样本暴露于超声条件(1MHz,0.5W/cm2,持续时间3min)后,使用荧光仪在488nm波长激发下检测DCF的荧光强度,检测结果如图3-4所示,为了便于辨识,图4为图3局部放大图。
图3-4中,按照荧光强度峰值从高到底排序依次为:M@P-Fe+H2O2+US、M@P-Fe+H2O2、M@P+H2O2+US、MSN+H2O2+US、M@P+H2O2、MSN+H2O2、M@P+US、M@P-Fe+US、MSN+US、M@P-Fe、M@P、MSN。
由图3可知,不论有无超声刺激,MSN本身不产生ROS,低浓度的H2O2可产生微量的ROS,超声的辅助可促进H2O2产生ROS,但ROS的量仍然较低。介孔硅负载原卟啉后(M@P)自身产ROS的能力与MSN相当,超声刺激下,M@P产ROS的量增加,与H2O2联用,ROS产量进一步增加。表面修饰铁离子后(M@P-Fe),在无H2O2和超声刺激的情况下,M@P-Fe本身几乎不产生ROS,当联用低浓度的H2O2时,ROS产量显著增加,进一步与超声联用时,ROS的产量达到最大,证实M@P-Fe在与H2O2和超声联用时,具有较高的产ROS效率,具有抗菌、清除细菌感染的潜力。
2.抑制E.faecalis生长效果测试
本实施例以E.faecalis为例,采用连续稀释法评价所合成的MSN、M@P和M@P-Fe联合0.01%V/V H2O2和超声对E.faecalis的抑菌活性。简而言之,在第一管中加入0.5mL、1mg/mL的MSN、M@P和M@P-Fe纳米粒子的水或0.01%V/V H2O2溶液,使用PBS二倍法梯度稀释8次后待用。将培养至指数期的E.faecalis离心3min(5000rpm)收集,使用BHI培养基稀释至106CFU/mL,随后将0.5mL该细菌悬液添加到各序列稀释的纳米粒子溶液中混合均匀,超声组使用超声处理3min(1MHz,0.5W/cm2)。随后,将每组样本使用BHI稀释后取100μL接种于96孔板中,将平板置于37℃培养箱中培养24小时后使用酶标仪在600nm处记录各孔吸光度评价抗菌活性。所有实验都设置了3个复孔,计算其平均值进行比较,实验重复三次。所得结果平均OD值如表1所示,对比示意图如图5所示。
表1平均OD值
由表1和图5可知,0.01%V/V H2O2和超声只有微弱的抗E.faecalis生长的作用,当所构建的M@P-Fe与0.01%V/V H2O2和超声联合使用时具有很好的抑制E.faecalis生长的作用,杀菌效果高于5%NaClO。
3.牙齿根管细菌感染的清除效率检测
收集因正畸原因拔除的人类上颌单根前磨牙,切除牙冠,获得标准长度为18mm的根节段。使用ProTaper Gold镍钛器械进行根管预备,然后用0.9%NaCl清洗。将硅橡胶印模材料置于5ml离心管中,然后将牙齿根段样本嵌入硅橡胶中以模拟封闭的管系统,随后使用高压蒸汽灭菌法对样本进行灭菌。将增长至指数期的E.faecalis使用培养基稀释至OD600为0.5,然后将该细菌悬浮液接种到样本中,使牙齿根段样本完全浸入E.faecalis悬浮液中。随后,所有管在37℃下培养,每48h更换培养基。4周后,使用PBS冲洗样本,将5mL超纯水(对照组)、0.01%V/V H2O2、M@P-Fe的0.01%V/V H2O2溶液(1mg/mL)及商用NaClO(阳性对照)处理3min,超声组使用超声波牙科治疗仪(Suprasson P5 Newtron,Satelec)冲洗探头深入牙齿根管内处理3min模拟临床超声冲洗。然后用PBS轻轻冲洗,使用多聚甲醛固定,PBS冲洗,梯度乙醇脱水后喷金使用扫描电子显微镜(SEM)观察,随机选取暴露牙本质小管的三个区域进行拍照,结果如图6所示,其中,图6a、6b、6c、6d分别为纯水、0.01%V/V H2O2、M@P-Fe的0.01%V/V H2O2溶液(1mg/mL)、商用NaClO的杀菌效果图;图6e、6f、6g、6h为加超声后的对应效果图。
由图6可知,0.01%V/V H2O2清除根管内细菌和杀菌活性较为微弱,超声具有一定的清除根管细菌的作用,但杀菌活性较为微弱,当0.01%V/V H2O2和超声与所构建的M@P-Fe联合使用时,具有较高的根管感染清除效果。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述,因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改,故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下,本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。
Claims (9)
1.一种具有除菌效果的复合纳米材料在制备治疗牙齿根管感染药物中的应用,其特征在于,所述复合纳米材料由介孔纳米材料经氨基化修饰并负载声敏剂后,再包覆二价和/或三价的铁离子后得到。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述介孔纳米材料为纳米介孔硅。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述声敏剂为原卟啉。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述复合纳米材料的制备方法包括如下步骤:对介孔纳米材料氨基化修饰后,在溶剂条件下加入声敏剂进行负载,搅拌下收集沉淀并洗涤;洗涤后的产物分散后加入二价和/或三价的铁离子化合物进行包覆,离心收集沉淀并洗涤获得所述复合纳米材料。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述介孔纳米材料为介孔硅纳米材料,所述声敏剂为原卟啉。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述声敏剂负载过程为:将原卟啉和介孔硅溶于DMF中,避光搅拌下反应后离心收集沉淀,DMF洗涤至少一次。
7.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述包覆过程为:将声敏剂负载产物分散,加入二价和/或三价的铁离子化合物,搅拌反应后离心取沉淀,洗涤后得到。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,在H2O2溶液和超声的条件下进行除菌操作。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述H2O2溶液浓度为0.01%V/V;所述超声条件为1 MHz,0.5W/cm2,超声3min以上。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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