CN115317607A - 单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料的制备方法。与现有技术相比，本发明在C₃N₄合成的基础上掺入铁原子，获得的纳米复合材料Fe‑C₃N₄可作为一类新型高效的声敏剂，在超声的激发下，通过提高电子和空穴的分离效率和利用Fe³⁺缩短的禁带宽度，可增强活性氧自由基(ROS)的产生效率以治疗黑色素瘤。此外，Fe‑C₃N₄纳米片可在肿瘤弱酸性环境中发挥类过氧化氢酶作用产生羟基自由基来进一步杀伤肿瘤细胞，实现其化学动力学治疗(CDT)模式。值得注意的是，超声激发Fe‑C₃N₄产生声动力治疗(SDT)效果可以增强其CDT作用，因此实现了SDT与CDT协同增强以产生更多的ROS来达到治疗肿瘤的目的。

Description

单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料、其制备方法及 应用

技术领域

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种基于单原子铁掺入石墨相氮化碳(C₃N₄)纳米复合材料(Fe-C₃N₄)的制备方法，以及在超声的激发下，其发挥的声动力与化学动力协同催化作用在肿瘤治疗中应用。

背景技术

恶性黑色素瘤是起源于胚胎期神经嵴的恶性肿瘤，起病隐匿，致死率高，预后极差。黑色素瘤的最常见的发病部位是皮肤，虽然只占皮肤癌的不到5％，但它具有高度的侵袭性，占所有皮肤癌死亡人数的75％以上，且60％以上的转移性黑色素瘤患者在发病期间发生或发展为脑转移。

黑色素瘤的传统治疗方法包括手术、化疗和放疗等，但存在疗效欠佳，不良反应明显，患者耐受性差，不能显著改善患者预后等问题。为了突破传统治疗的局限性，全球专家一直在探索新的治疗手段。随着丰富的纳米平台产生与微无创治疗理念的深入，各种新颖的治疗方式应运而生，包括光子疗法(如：光热或光动力疗法)、声触发疗法(如：声动力疗法、高强度聚焦超声消融)、纳米药物增强基因治疗以及化学动力学协同治疗。

特别是，以无创超声激发的纳米催化医学(如：催化活性、能量转化性质)和化学动力学催化的生物效应(如：过氧化氢酶模拟行为)引导产生大量的活性氧自由基从而实现安全与高效治疗肿瘤的手段，是近年来研究热点之一。

利用超声触发的声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)是指通过低强度聚焦超声作用于声敏剂以发生相关物理、化学及生物学效应来实现肿瘤的消融，具有组织穿透性强、实时可控、操作简便且安全无创等优点。目前SDT的作用机制众说纷纭，主要包括活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)学说和超声空化学说，调整基因表达和改变信号通路等途径诱导凋亡学说以及免疫学说等。其中前两者学说被普遍接受，定义为超声波通过“声致发光”或“声致发热”、“空化气泡坍塌”等作用来激发声敏剂产生电子-空穴(e^--h⁺)或自由基种类(如·OH、·O^2-、₁O²和H₂O₂等)，从而实现杀伤肿瘤细胞的作用。目前，SDT已在临床上尝试应用于转移性乳腺癌患者协同治疗，例如Wang等团队使用SDT联合光动力治疗对3例脊柱转移的乳腺癌患者行姑息性治疗，其中2例患者达到治疗后完全缓解或部分缓解；Inui等报道了对1名55岁晚期转移的女性乳腺癌患者，通过SDT、巨噬细胞活性因子疗法和激素疗法的联合治疗后，患者的临床症状得到缓解，转移瘤消失。上述案例证明了SDT有望发展成为一种极具应用前景的浅表肿瘤防治新手段。众所周知，SDT治疗效果与声敏剂的性能密切相关。目前，典型的声敏剂主要包括以血卟啉及其配合物为代表的有机声敏剂与以二氧化钛及其配合物为代表的无机声敏剂，但是上述声敏剂存在光毒性和体内滞留时间长等缺点，从而限制了它们在临床中的生物应用。因此，为加快SDT的临床转化，研制出高生物安全性及肿瘤治疗高效性的声敏剂迫在眉睫。石墨相氮化碳(C₃N₄)纳米片是一种由碳、氮元素组成的无机半导体光敏剂材料，其能利用波长460nm以下的紫外-可见光，形成电子和空穴，进而产生活性氧自由基达到疾病治疗的目的。由于C₃N₄具有低毒性、易合成、狭窄及可控的带隙宽度，以及高度稳定的性能，其将在SDT治疗肿瘤的作用中发挥巨大的潜力。然而，电子和空穴的快速复合会导致ROS的产生效率下降。研究发现将金属掺杂入C₃N₄纳米片中能促进电子与光生空穴的分离，减少其重新结合的机会，从而增强其产生ROS的效率。此外，C₃N₄利用N配位空穴的优势，以及高密度均匀的“六重空穴”，是金属离子络合或掺杂的理想场所，可牢固捕获超小团簇和/或单原子金属中心。

芬顿效应(Fenton)催化诱导的ROS生成属于新兴的化学动力学疗法(chemodynamic therapy，CDT)，其反应机理是在Fenton催化剂辅助下，在酸性环境下将过氧化氢(H₂O₂)转化为羟基自由基(·OH)等ROS。其中，肿瘤内超氧化物歧化酶过表达的H₂O₂是Fenton反应的重要反应物，而癌细胞糖酵解代谢过程中产生的弱酸性环境(PH值约5.4至7.0)能够有效地触发Fenton效应的发生。由于正常肿瘤细胞/组织的微环境缺乏Fenton催化效应触发的条件，因此Fenton催化效应具有高度肿瘤特异性，从而具有较高的治疗生物安全性。铁基非均相催化剂是触发Fenton反应最常用的催化体系，目前已经制备了多种铁基纳米催化剂，包括Fe₃O₄纳米材料、FeS₂纳米片和铁基纳米复合材料等，尤其是具有超小团簇和单原子中心的铁基催化剂具有极高的原子利用率而引起了人们的极大兴趣。值得注意的是，进一步增加活性中心的密度需要明智地选择新的载体材料，以提供更多的锚定位点和强大的金属-载体相互作用，以确保高分散性和稳定性。

壳聚糖是一种生物相容性和可生物降解的氨基多糖，在加入β-甘油磷酸形成凝胶前体溶液，环境温度升高时(如体温37℃)，凝胶化立即触发，归因于协同增强，包括氢键、静电相互作用和疏水相互作用，促进了溶胶-凝胶转化，采用热触发热凝胶系统可控的方式捕获声敏剂，可以实现纳米材料的缓释以及增强CDT与SDT功效，单剂量注射这种热凝胶后的继续发生CDT和重复SDT，通过“单剂量、多次治疗”带来强大的ROS产生，从而为根除肿瘤提供显著的疗效。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种将铁原子掺入C₃N₄纳米片的纳米复合材料(Fe-C₃N₄)、其制备方法及发挥声动力(SDT)协同增强化学动力(CDT)作用治疗肿瘤的应用。该Fe-C₃N₄纳米材料可作为超声响应性的声敏剂，通过提高电子和空穴的分离效率与减小C₃N₄纳米片的禁带宽度来增强ROS的产生效率以治疗肿瘤。此外，该纳米材料还发挥类过氧化氢酶作用产生羟基自由基来进一步杀伤肿瘤。值得注意的是，超声激发Fe-C₃N₄产生SDT效果可以增强其CDT作用，从而实现了SDT与CDT协同增强以产生更多的ROS来达到治疗肿瘤的目的。

本发明提供了一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳的制备方法，包括：

S1)将C₃N₄前驱体、铁盐与醇溶剂混合，除去醇溶剂，在保护气氛中煅烧，得到块状的掺铁C₃N₄；

S2)将所述掺铁C₃N₄在溶剂中通过超声剥离及酸洗，得到单原子铁掺杂的的石墨相氮化碳纳米复合材料。

优选的，所述C₃N₄前驱体选自尿素和/或三聚氰胺；所述铁盐选自氯化铁；所述醇溶剂选自甲醇。

优选的，所述C₃N₄前驱体与铁盐的质量比为1：(0.01～0.1)；所述煅烧的温度为400℃～600℃；所述煅烧的时间为1～3h。

优选的，所述步骤S2)中掺铁C₃N₄与溶剂的比例为(0.5～2)mg：1mL；所述超声剥离的功率为200～500W；所述超声剥离的时间为5～15h。

优选的，所述超声剥离为间歇式超声剥离；所述间歇式超声剥离每超声1～5s，停止1～5s。

优选的，超声剥离后，低速离心、酸性溶液浸泡后，洗涤，得到单原子铁掺杂的的石墨相氮化碳纳米复合材料；所述酸性溶液的浓度为2～5mol/L；所述浸泡的时间为60～100h。

本发明还提供了一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料，包括C₃N₄纳米材料与镶嵌在C₃N₄纳米材料上的铁原子。

本发明还提供了一种纳米声敏剂，包括上述的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料。

本发明还提供了一种上述单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料或纳米声敏剂在肿瘤治疗中的应用。

本发明还提供了一种上述单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料作为纳米声敏剂的应用。

本发明提供了一种将单原子铁掺杂的石墨相氮化碳的制备方法，包括：S1)将C₃N₄前驱体、铁盐与醇溶剂混合，除去醇溶剂，在保护气氛中煅烧，得到块状掺铁的C₃N₄(Fe@C₃N₄)；S2)将所述Fe@C₃N₄在溶剂中通过超声剥离及酸洗，得到单原子铁掺杂的石墨相氮化碳。与现有技术相比，本发明在C₃N₄合成的基础上掺入铁原子，获得的纳米复合材料Fe-C₃N₄可作为一类新型高效的声敏剂，在超声的激发下，通过提高电子和空穴的分离效率和利用Fe³⁺缩短的禁带宽度，可增强活性氧自由基(ROS)的产生效率以治疗黑色素瘤。此外，Fe-C₃N₄纳米片可在肿瘤弱酸性环境中发挥类过氧化氢酶作用产生羟基自由基来进一步杀伤肿瘤细胞，实现其化学动力学治疗(CDT)模式。值得注意的是，超声激发Fe-C₃N₄产生声动力治疗(SDT)效果可以增强其CDT作用，因此实现了SDT与CDT协同增强以产生更多的ROS来达到治疗肿瘤的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中得到的C₃N₄(图1a)、Fe-C₃N₄纳米片(图1b)的SEM谱图与Fe-C₃N₄纳米片的EDS谱图(图1c)；

图2为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄纳米片的TEM(图2a)、球差电镜及Mapping图像(图2b与图2c)、XRD(图2d)及XPS(图2e与2f)的谱图；

图3为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄纳米片的水溶液产生ROS的效率图(图3a，3b、3c、3g、3h与3i)、紫外漫反射(图3d与3e)及莫特-肖特基方程分析价带结果图(图3f)；

图4为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄纳米片材料对对正常脐血内皮细胞的安全性实验结果图；

图5为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄纳米片对B16F10黑色素瘤细胞的毒性实验，以及纳米片联合声动力杀伤B16F10黑色素瘤细胞的细胞存活率柱形图(图5a、5b与5c)、活死细胞的荧光检测图(图5d)、ROS检测的荧光显微镜图(图5e)与不同处理组B16F10细胞凋亡结果图(图5f)；

图6为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄-Gel缓释凝胶的SEM图(图6a与6b)与Mapping图像(图6c)；

图7为本发明实施例1中得到的Fe-C₃N₄-Gel相变照片图；

图8为本发明实施例1中荷瘤裸鼠在治疗期间的肿瘤变化图；

图9为本发明实施例1中Fe-C₃N₄-Gel对荷瘤鼠的治疗方案(图9a)，在治疗期间荷瘤裸鼠的体重变化(图9b)、肿瘤体积变化(图9c～9f)、生存曲线(图9g)以及黑色素瘤组织H&E、TUNEL、Ki-67染色图(图9h)；

图10为本发明实施例1中不同治疗后黑色素瘤组织的照片；

图11为本发明实施例1中不同治疗后裸鼠主要脏器的H&E染色图；

图12为本发明对比例1中得到的Fe@C₃N₄的TEM(图12b)与SEM图(图12a)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料(Fe-C₃N₄)的制备方法，包括：S1)将C₃N₄前驱体、铁盐与醇溶剂混合，除去醇溶剂，在保护气氛中煅烧，得到块状的掺铁C₃N₄(Fe@C₃N₄)；S2)将所述掺铁C₃N₄在溶剂中通过超声剥离，得到单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将C₃N₄前驱体、铁盐与醇溶剂混合；所述C₃N₄前驱体为本领域技术人员熟知的C₃N₄前驱体即可，并无特殊的限制，本发明中优选为尿素和/或三聚氰胺，可避免煅烧中产生大量的有毒气体氨基同时氮气保护气氛也可避免氧原子的出现氧化铁原子，进一步优选以三聚氰胺为C₃N₄前驱体；所述铁盐优选为氯化铁，可尽可能的保证原料中不含有氧的成分，以最大程度避免铁的氧化物生成；所述醇溶剂为本领域技术人员熟知的醇溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙醇和/或甲醇；所述C₃N₄前驱体与铁盐的质量比优选为1：(0.01～0.1)，更优选为1：(0.02～0.08)，再优选为1：(0.04～0.06)，最优选为1：0.05；所述C₃N₄前驱体与醇溶剂的比例优选为1g：(10～50)mL。

混合均匀后，除去醇溶剂；所述除去醇溶剂的方法优选为烘干。

然后在保护气氛中煅烧，得到块状的掺铁C₃N₄(Fe@C₃N₄)；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，在本发明中优选为氩气；所述煅烧的温度优选为400℃～600℃，更优选为450℃～550℃，再优选为500℃；所述煅烧的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，再优选为2h。

将所述Fe@C₃N₄在溶剂中通过超声剥离；所述溶剂优选为水，更优选为去离子水；Fe@C₃N₄与溶剂的比例优选为(0.5～2)mg：1mL，更优选为(0.5～1.5)mg：1mL，再优选为(0.8～1.2)mg：1mL，最优选为1mg：1mL所述超声剥离的功率优选为200～500W，更优选为250～400W，再优选为250～350W，最优选为300W；所述超声剥离的时间优选为5～15h，更优选为7～13h，再优选为8～12h，最优选为9～10h；在本发明中所述超声剥离优选为间歇式超声剥离；所述间歇式超声剥离优选每超声1～5s停止1～5s，更优选每超声1～4s停止1～4s，再优选每超声1～3s，停止1～3s，最优选每超声2s，停止2s。

超声剥离后，优选高速离心；所述高速离心的转速优选为2000～6000rpm，更优选为3000～6000rpm，再优选为4000～5000rpm；所述高速离心的时间优选为5～15min，更优选为8～12min，再优选为10min。

高速离心后，优选采用酸性溶液浸泡；所述酸性溶液的浓度优选为2～5mol/L，更优选为3～5mol/L，再优选为4～5mol/L；所述酸性溶剂优选为盐酸和/或硫酸；所述浸泡的时间优选为60～100h，更优选为60～90h，再优选为65～80h，最优选为70～75h；通过酸性溶液浸泡可除去反应过程中残留的铁氧化物。

酸性溶液浸泡后优选洗涤，高速离心后取沉淀，得到铁原子掺入C₃N₄纳米片的石墨相氮化碳纳米复合材料(Fe-C₃N₄)；所述洗涤优选采用水与乙醇；所述洗涤的次数优选为2～4次；所述高速离心的转速优选为10000～12000rpm；所述高速离心的时间优选为5～15min，更优选为8～12min，再优选为10min。

本发明在C₃N₄合成的基础上掺入铁原子，获得的纳米复合材料Fe-C₃N₄可作为一类新型高效的声敏剂，在超声的激发下，通过提高电子和空穴的分离效率和利用Fe³⁺缩短的禁带宽度，可增强活性氧自由基(ROS)的产生效率以治疗黑色素瘤。此外，Fe-C₃N₄纳米片可在肿瘤弱酸性环境中发挥类过氧化氢酶作用产生羟基自由基(·OH)来进一步杀伤肿瘤细胞，实现其化学动力学治疗(CDT)模式。值得注意的是，超声激发Fe-C₃N₄产生声动力治疗(SDT)效果可以增强其CDT作用，因此实现了SDT与CDT协同增强以产生更多的ROS来达到治疗肿瘤的目的。

本发明还提供了一种上述方法制备的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳，包括C₃N₄纳米材料与镶嵌在C₃N₄纳米材料上的铁原子。

本发明还提供了一种上述单原子铁掺杂的石墨相氮化碳作为化学反应性纳米声敏剂，实现SDT联合CDT增强治疗肿瘤的作用。

本发明还提供了一种纳米声敏剂，包括上述的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料。

本发明还提供了上述单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料或上述的纳米声敏剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳、其的制备方法及对肿瘤的毒性作用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

Fe-C₃N₄的制备：4g三聚氰胺+100ml甲醇+200mg氯化铁，烘干去除甲醇，于马弗炉中500℃，煅烧2h，充氮气，得到棕黄色产物后，即Fe@C₃N₄，取100mg粉末+100mL去离子水放入超声破碎仪(300W，2s，2s)中剥离9h，离心取上清液(5000转，10分钟)，采用5mol/L盐酸浸泡72h，水及乙醇洗3遍离心后沉淀(1万转，10分钟)，得到样品Fe-C₃N₄。以同样的方法不加入氯化铁，获得C₃N₄。

纳米材料的表征：采用SEM、TEM、球差电镜观察单纯C₃N₄与Fe-C₃N₄纳米材料的形貌、大小及分布情况(如图1，图2a,2b，2c)，证明最终获得的产物为Fe-C₃N₄纳米片，且铁原子镶嵌在C₃N₄基质上；分别采用XRD及XPS观察衍射峰，确定其化学成分及其价态(如图2d,2e,2f)，证明了该铁原子在C₃N₄基质中存在Fe²⁺、Fe³⁺两种价态，并且是以Fe²⁺为主。

验证纳米材料水溶液ROS产生：体外模拟B16F10黑色素瘤弱酸微环境下(pH＝5.4的磷酸钠缓冲液)，分为超声辐照组和无超声辐照组，验证纳米材料Fe-C₃N₄(80ppm)产生的单线态氧和羟基自由基的产生。如图3所见，以Fe-C₃N₄+US组产生的单线态氧的效率最高(图3a，3b，3c)，紫外漫反射及莫特-肖特基方程分析价带(如图3d,3e,3f)等，证明目标材料Fe-C₃N₄纳米片成功合成,带隙宽度较单纯的C₃N₄的变窄，因此在超声的刺激下可产生更多的活性氧自由基。从图3可见，以Fe-C₃N₄+H₂O₂+US组产生的羟基自由基的效率最高(图3g,3h,3i)。

B16F10黑色素瘤细胞层面杀伤作用

使用CCK-8法定量分析纳米材料的生物安全性及毒性作用。

纳米材料对细胞的毒性作用：取对数生长期的脐血内皮细胞，通过计数调整密度至1×10⁴/孔，并以每孔100μL接种于96孔板中。为了去除边缘效应，孔板周围一圈加入PBS，置于恒温细胞孵箱中培养12h。用无血清1640培养基(Dulbecco改良Eagle 1640培养基均购自Life技术公司(美国加利福尼亚州洛杉矶)将纳米材料浓度稀释为不同浓度(0、2.5、5、10、20、40和80ppm)。弃去旧培养基后，将上述100μL不同浓度的材料分别加入96孔板中，每组设置5个复孔，孵育12h后取出细胞板，吸除旧培养基，PBS洗涤2次，每孔加入含有1％CCK-8培养基100μL，孵育1h。用酶标仪检测450nm波长处各孔的吸光值(OD)。计算各实验组的细胞存活率。公式如下：细胞存活率(％)＝OD实验-OD空白组)/OD对照-OD空白组)×100％。结果表明即使与80ppm纳米片孵育48h，细胞存活率仍高于90％以上(图4)，证明Fe-C₃N₄纳米片具有优异的生物相容性。随后，采用类似的方法探索纳米片在体外对B16F10细胞杀伤作用，结果发现当Fe-C₃N₄纳米片的浓度提高至80ppm时，细胞存活率随着共孵育的时间延长逐渐降低，尤其是共孵育48h后，细胞存活率下降至65.19％(图5a)。

纳米材料联合声动力对细胞的杀伤作用：取对数生长期的B16F10细胞，通过计数调整密度至1×10⁴/孔，并以每孔100μL接种于96孔板中培养24h。用无血清1640培养基(Dulbecco改良Eagle 1640培养基均购自Life技术公司(美国加利福尼亚州洛杉矶)将游离Fe-C₃N₄纳米片浓度稀释至不同浓度(0、2.5、5、10、20、40和80ppm)，将原培养基替换为含Fe-C₃N₄或含Fe-C₃N₄+H₂O₂(100μmol/L)培养基后继续培养，每组设置5个复孔，在加药培养6h后给予一定强度的超声辐照(1MHz,50％duty cycle,1.5W/cm²,1min)继续培养至12h。吸除旧培养基，PBS轻洗2次，每孔加入CCK-8培养基，孵育1h。用酶标仪检测450nm波长处各孔的吸光值(OD)并计算各实验组的B16F10细胞存活率。计算各实验组的细胞存活率。公式如下：细胞存活率(％)＝((OD实验-OD空白组)/OD对照-OD空白组)×100％；得到细胞存活率柱形图如图5a与5b所示，各组在引入超声治疗后，细胞的生存率呈现明显下降的趋势。此外，再次设定以下8组：(I)Control，(II)US，(III)C₃N₄，(IV)C₃N₄+US，(V)Fe-C₃N₄，(VI)Fe-C₃N₄+US，(VII)Fe-C₃N₄+H₂O₂，(VIII)Fe-C₃N₄+H₂O₂+US，采用类似的CCK-8法以证实Fe-C₃N₄在超声的触发下，同时实现了声动力和化学动力双重作用，并且两者具有双边增强和协同作用(图5c)。

以下细胞实验分为7组：(I)Control,(II)Fe-C₃N₄,(III)Fe-C₃N₄+H₂O₂,(IV)US,(V)C₃N₄+US,(VI)Fe-C₃N₄+US,(VII)Fe-C₃N₄+H₂O₂+US.来验证Fe-C₃N₄发挥声动力协同化学动力增强治疗黑色素瘤的效果与作用机制。

活死细胞的荧光检测：B16F10细胞以密度2×10⁵个接种于共聚焦皿，待贴壁后，小心吸出培养液，加入相应的含纳米材料C₃N₄/Fe-C₃N₄(40ppm)以及H₂O₂的无血清1640培养基(Dulbecco改良Eagle培养基1640)均购自Life技术公司(美国加利福尼亚州洛杉矶)，孵育6h后，对细胞进行超声(1MHz,50％duty cycle,1.5W/cm²,1min)(纳米材料处理的空白对照组无超声)。继续孵育12h后，将培养液小心吸出，随后加入钙黄绿素(Calcein-AM)(5μl)和碘化吡啶(PI)(10μl)染色15min，用PBS轻洗3次，于荧光显微镜下观察拍摄。其中，活细胞表达为绿色荧光，死细胞表达为红色荧光。如图5d所示，Fe-C₃N₄+H₂0₂+US组的死细胞较对照组明显增多。

ROS的检测：将B16F10细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中并于37℃，5％CO₂条件下孵育12h。弃去培养基并用PBS缓冲溶液清洗，然后加入相应的含纳米材料C₃N₄/Fe-C₃N₄(40ppm)以及H₂O₂的无血清1640培养基(Dulbecco改良Eagle培养基(1640)均购自Life技术公司(美国加利福尼亚州洛杉矶)，放入培养箱中孵育12h，其中辐照组加纳米片培养6h后给予一定强度的超声辐照(1MHz,50％duty cycle,1.5W/cm²,1min)。弃去上层培养基后，加入含DCFH-DA(浓度10μM)的1640培养基后继续孵育20min。弃去培养基，用PBS缓冲溶液清洗，然后对细胞进行超声辐照，随后立即使用荧光显微镜观察。如图5e所示，Fe-C₃N₄+H₂0₂+US组产生的活性氧自由基较对照组增多。

另外，根据经典的Annexin V-FITC和PI染色方案，采用流式细胞仪对Fe-C3N4纳米片介导的SDT和Fenton效应联合应用杀伤B16F10细胞的疗效进行量化比较。同样按上述条件处理B16F10细胞，分别用Annexin V和PI染色15min，洗涤去除残留的染色剂后，最后用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果与上述活细胞和死细胞染色分析结果基本一致(图5d，5f)。

验证上述纳米材料对活体黑色素瘤治疗效果

建立裸鼠动物模型：SPF级雄性BALB/c裸鼠，5～6周龄，体重19～28g，对其右后肢进行B16F10黑色素瘤建模。取对数生长期的B16F10细胞，胰酶消化离心后收集细胞，用PBS进行细胞重悬。选择裸鼠右侧背部皮下接种，每个裸鼠接种量约1×10⁶个细胞，接种量为100μL。接种后将裸鼠随机放入己准备好的通气清洁笼IVC系统中照常饲养，每2日观察接种部位黑色素瘤生长情况，并用电子游标卡尺测量黑色素瘤的大小并进行记录，待黑色素瘤体积长至60～70mm³即可用于后续实验。黑色素瘤体积的计算公式如下：V＝L×W²/2(其中V为裸鼠黑色素瘤体积，L为瘤最长径，W为瘤最短径)。

体内抗黑色素瘤实验：为使Fe-C₃N₄纳米片在肿瘤内达到缓慢实现释放的过程，将该纳米片植入可注射性的温敏性热凝胶(Gel)中，获得的产物命名为Fe-C₃N₄-Gel(制备方法：100mg壳聚糖加入4mL醋酸(0.1M)搅拌12h，将650mgβ-甘油磷酸盐溶于1ml去离子水中，再将上述两种液体分别放进4摄氏度冰箱中20min，随后在冰浴中将β-甘油磷酸盐加入壳聚糖溶液中温和搅拌。最后，将合成好的材料Fe-C₃N₄按1：9比例加入上述混合液中，采用涡轮混合器混合，得到的反应物命名为Fe-C₃N₄-Gel，放进4摄氏度冰箱中备用)，如图6、7所示，SEM图像说明Fe-C₃N₄-Gel已成功制备，且在模拟肿瘤体温的环境下，即放置于37℃下30分钟后可由液态变为胶状物质从而有利于纳米片的缓释。成功建立B16F10黑色素瘤移植瘤模型后，将荷瘤裸鼠分为以下7组：Control组,Gel组,US组,Fe-C₃N₄-Gel组,Gel+US组,C₃N₄-Gel+US组和Fe-C₃N₄-Gel+US组。Control组通过瘤内给予生理盐水，超声组给予单纯的超声处理(1MHz,50％duty cycle,1.5W/cm²,10min)，其他组分别给予50μl相应的凝胶制剂，在瘤内给药后给予(注射后3h、3d和5d)超声处理(1MHz,50％duty cycle,1.5W/cm²,10min)。经过不同处理后，每2天对各组小鼠的黑色素瘤体积及体重进行测量并拍照记录大小的改变，如图8(G1为Control组,G2为Gel组,G3为Fe-C₃N₄-Gel组,G4为US组,G5为Gel+US组,G6为C₃N₄-Gel组+US，G7为Fe-C₃N₄-Gel+US组)，图9a～f所示；治疗结束后取出黑色素瘤并拍照如图10所示。上述结果均显示，Fe-C₃N₄-Gel+US组黑色素瘤增长的速度较其余各组变慢，证明在超声的触发下，Fe-C₃N₄可以实现治疗黑色素瘤的目的。对各治疗组的裸鼠生存时间进行曲线分析，结果证明声动力联合Fenton效应组的裸鼠存活时间超过50天，进一步证实了Fe-C₃N₄的高生物安全性(图9g)。

病理学研究：各组瘤鼠在结束治疗时，每组随机处死1只裸鼠，切除黑色素瘤组织后，用0.9％生理盐水冲洗干净后，4％多聚甲醛溶液固定组织，石蜡包埋切片进行H&E、TUNEL凋亡与Ki-67染色，分别评估黑色素瘤细胞的凋亡、增殖情况。并取出裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器等，用0.9％生理盐水冲洗干净后，4％多聚甲醛溶液固定组织，石蜡包埋切片进行H&E染色，观察各组织的细胞形态结构变化，并如图9h(I为Control组,Ⅱ为Gel组,III为Fe-C₃N₄-Gel组,Ⅳ为US组,Ⅴ为Gel+US组,Ⅵ为C₃N₄-Gel+US组，Ⅶ为Fe-C₃N₄-Gel+US组)所示，经过治疗后，Fe-C₃N₄+US组肿瘤内见大片的坏死，Tunnel与Ki-67染色显示增殖性较对照组减低。但各治疗组的裸鼠的主要脏器未发现明显损伤，进一步证实了Fe-C₃N₄具有良好的生物安全性(图11)(图11,I为Control组,Ⅱ为Gel组,III为Fe-C₃N₄-Gel组,Ⅳ为US组,Ⅴ为Gel+US组,Ⅵ为C₃N₄-Gel+US组，Ⅶ为Fe-C₃N₄-Gel+US组)。

对比例1

Fe-C₃N₄的制备：4g三聚氰胺+100ml甲醇+400mg氯化铁，烘干去除甲醇，于马弗炉中500℃，煅烧2h，充氩气，得到棕黄色产物后，即Fe@C₃N₄，取100mg粉末+100mL去离子水放入超声破碎仪(300W，2s，2s)中剥离9h，离心取上清液(5000转，10分钟)，采用5mol/L盐酸浸泡72h，水及乙醇洗3遍离心后沉淀(1万转，10分钟)，得到样品Fe-C₃N₄。

利用TEM与SEM对对比例1中得到的样品Fe-C₃N₄进行分析，如图12所示。如果加入氯化铁的比例过高，将不利于煅烧过程中氯化铁与三聚氰胺的充分混合，反应温度和惰性气体的通入时间流量如果没有控制好，容易生成铁的氧化物，而不是铁原子，最终得到的产生为掺有铁氧化物的C₃N₄(图12a)或者造成三聚氰胺在煅烧过程中溢出，所得产物仅为铁氧化物(图12b)。

Claims (10)

1.一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括：

S1)将C₃N₄前驱体、铁盐与醇溶剂混合，除去醇溶剂，在保护气氛中煅烧，得到块状的掺铁C₃N₄；

S2)将所述掺铁C₃N₄在溶剂中通过超声剥离及酸洗，得到单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述C₃N₄前驱体选自尿素和/或三聚氰胺；所述铁盐选自氯化铁；所述醇溶剂选自甲醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述C₃N₄前驱体与铁盐的质量比为1：(0.01～0.1)；所述煅烧的温度为400℃～600℃；所述煅烧的时间为1～3h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2)中掺铁C₃N₄与溶剂的比例为(0.5～2)mg：1mL；所述超声剥离的功率为200～500W；所述超声剥离的时间为5～15h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述超声剥离为间歇式超声剥离；所述间歇式超声剥离每超声1～5s，停止1～5s。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，超声剥离后，高速离心、酸性溶液浸泡后，洗涤，得到单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料；所述酸性溶液的浓度为2～5mol/L；所述浸泡的时间为60～100h。

7.一种单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料，其特征在于，包括C₃N₄纳米材料与镶嵌在C₃N₄纳米材料上的铁原子。

8.一种纳米声敏剂，其特征在于，包括权利要求1～6任意一项制备方法所制备的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料或权利要求7所述的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料。

9.权利要求1～6任意一项制备方法所制备的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料、权利要求7所述的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料或权利要求8所述的纳米声敏剂在肿瘤治疗中的应用。

10.权利要求1～6任意一项制备方法所制备的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料或权利要求7所述的单原子铁掺杂的石墨相氮化碳纳米复合材料作为纳米声敏剂的应用。

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