CN111686251B - 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法 - Google Patents

用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111686251B
CN111686251B CN202010555452.1A CN202010555452A CN111686251B CN 111686251 B CN111686251 B CN 111686251B CN 202010555452 A CN202010555452 A CN 202010555452A CN 111686251 B CN111686251 B CN 111686251B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bmsn
cau
solution
tumor
nano material
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010555452.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111686251A (zh
Inventor
吴名
张达
刘小龙
刘景丰
曾永毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Original Assignee
Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases) filed Critical Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Priority to CN202010555452.1A priority Critical patent/CN111686251B/zh
Publication of CN111686251A publication Critical patent/CN111686251A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111686251B publication Critical patent/CN111686251B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A61K41/0033—Sonodynamic cancer therapy with sonochemically active agents or sonosensitizers, having their cytotoxic effects enhanced through application of ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
    • A61K49/0067—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle quantum dots, fluorescent nanocrystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0097—Cells, viruses, ghosts, red blood cells, viral vectors, used for imaging or diagnosis in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型的用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料，其主要是利用黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒原位负载金纳米颗粒(AuNPs)，并利用其丰富的孔道结构优势负载CO气体前药分子CORM‑401，再进一步利用巨噬细胞膜进行包被，得到所述仿生纳米材料N@CAu‑BMSN。该仿生纳米材料中巨噬细胞膜的利用，能有效避免体内巨噬细胞对N@CAu‑BMSN的吞噬与清除作用，提高纳米材料在肿瘤区域富集；同时，在局部超声波介入下，该纳米材料内核能有效的在肿瘤细胞内原位产生CO气体以及1O2用于诱导肿瘤细胞凋亡，并激活机体免疫系统，实现声动力/气体协同抗肿瘤治疗。

Description

用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备 方法
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种可用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料（N@CAu-BMSN）及其制备与应用。
背景技术
据统计全国每年新发肿瘤病例约392.9万例，死亡人数约233.8万例。恶性肿瘤已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一。恶性肿瘤的治疗是亟待解决的世界性难题，具有极其重要的战略意义。常规手术切除、放疗、化疗乃至生物靶向治疗均存在一定局限性，这使肿瘤复发转移率居高不下。
超声具有穿透深度不受限制、组织内分布均匀、无辐射、生物安全性好、成本低、操作简便等独特优势。最近发展起来的基于超声动力学治疗(SDT)是一种借助于超声影像作用下而引导的局部治疗方法，其在超声波作用下会促进声敏剂产生细胞毒性物质——单线态氧（1O2），以及物理性空泡及热效应，可诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。然而，传统的SDT药物由于化学/生物稳定性低、肿瘤积聚不充分，导致SDT疗效较低。此外，1O2有限的半衰期(0.04 μs)和扩散范围(0.02 μm)不足以有效和完全抑制肿瘤的生长和转移。近年来，许多人致力于开发高化学/生物稳定性的SDT制剂，并与其他模式相结合，协同对抗癌症，如软X射线疗法或化疗。然而，肿瘤是处于高度复杂的肿瘤微环境（TME）中，TME中过量H2O2的存在，往往会诱发多种治疗方案的耐药，如何降低TME中H2O2的含量，对于进一步提高不同治疗方案的疗效至关重要。在这方面，原位分解H2O2并同时生成癌细胞毒性物质是一个很有希望的策略。
近年来，基于一氧化碳(CO)分子建立的肿瘤治疗方式被认为是一种新型的肿瘤治疗方法。其在安全剂量下能够有效抑制炎症的发生，并具有抗血管新生以及抗肿瘤细胞增殖等作用。CO作为小分子能够有效的扩散与深入肿瘤组织内部，便于联合其他治疗用于协同应对肿瘤增殖。已有研究报道，某些CO前体药物分子(如CORM-401)可在H2O2触发下生成CO，并可有效扩散至深层肿瘤组织，诱导细胞凋亡/死亡，但是，这类分子可强烈吸附在血红蛋白中从而产生严重毒副作用，同时对呼吸系统和其他正常细胞也有影响。而通过设计合适的药物输送系统，将CORM-401负载在纳米给药系统中，不仅能够在肿瘤微环境的H2O2的配合下产生对肿瘤细胞有毒性的CO用于肿瘤治疗，同时产生的CO气体可增强肿瘤部位的超声造影信号，故可用于超声引导下的精准治疗。
目前的纳米载体存在着生物相容性差、肿瘤富集效率不高、易被机体免疫系统识别而降低其治疗效率等难题。与靶向配体(aptamers或RGD peptide)相比，天然生物膜的仿生修饰因其同源靶向性、良好的血液相容性和较长的循环时间成为肿瘤靶向给药的一种流行且有前景的方法。在各种天然细胞膜中，巨噬细胞细胞膜通过其优异的网状内皮系统(RES)逃避能力和肿瘤归巢能力，通过对肿瘤内皮细胞的明确识别，具有独特的肿瘤靶向递送特性。近年来已有研究利用巨噬细胞膜修饰纳米粒子用于光疗和化疗，并在不同肿瘤类型上显示出良好的治疗效果。
综上所述，开发一种联合声动力治疗与气体治疗的仿生纳米材料用于肿瘤的治疗具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤声动力治疗与气体治疗联合的仿生纳米材料N@CAu-BMSN及其制备与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种仿生纳米材料N@CAu-BMSN，其是先制备黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒，然后在其上原位负载金纳米颗粒，再利用其丰富的孔道结构优势负载CO气体前药分子CORM-401，最后利用巨噬细胞膜对其进行包被，得到以巨噬细胞膜为壳的核壳结构、球状N@CAu-BMSN纳米颗粒。该N@CAu-BMSN纳米颗粒的直径为50-55 nm。
所述仿生纳米材料N@CAu-BMSN的制备方法包括以下步骤：
（1）量取6 mL含0.2 mg/mL黑磷纳米片的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分散液，在冰浴环境下，超声处理12 h，经2000 r/min离心5 min去除沉淀（即未被超声剥离的BPNs），再以40000 r/min超速离心机离心20 min后，取沉淀，获得1.2mg黑磷量子点（BPQDs），将其重悬在去离子水中；
（2）分别称取2 g十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）、20 mg三乙胺（TEA），将两者加入到步骤（1）制备好的BPQDs悬浮液中，剧烈搅拌1小时，然后将1.5 mL正硅酸乙酯（TEOS）缓慢滴入上述混合溶液中，在80℃下剧烈搅拌1小时，待溶液降至室温后，利用12000 r/min离心机离心10 min，取沉淀用乙醇洗涤三次，然后分散于含1wt%氯化钠的50 mL甲醇中，搅拌3小时，离心，沉淀重复洗涤、搅拌操作3次，去除模板CTAC，得到黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒（BMSN）；
（3）将所制备的BMSN和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）按质量比5:1加入到乙醇中，80℃剧烈搅拌24小时，离心，沉淀用乙醇洗涤三次，再用去离子水重悬，得到浓度为3mg/mL的BMSN-NH2溶液；
（4）取2 mL BMSN-NH2溶液与5 μL、20 mg/mL的氯金酸溶液混合搅拌1 h，然后加入2 mL、0.2 mM的NaBH4溶液，搅拌1h后离心去除未合成的氯金酸，沉淀用去离子水反复洗涤3次后，分散于去离子水中，得到1.5 mg/mL的Au-BMSN溶液；按Au-BMSN与CORM-401的质量比为10:1取制备好的Au-BMSN溶液与5 mg/mL的CO前药分子CORM-401溶液混合搅拌24h，得到金/黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒（CAu-BMSN）；
（5）将J774A.1细胞裂解，利用试剂盒提取其细胞膜并保存在-80 ℃备用；经BCA蛋白定量后，将CAu-BMSN与所得细胞膜按照质量比1~5：0.2~1（优选为5:1）混合并超声30min，制得N@CAu-BMSN纳米颗粒。
本发明所得仿生纳米材料N@CAu-BMSN中金/黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒CAu-BMSN作为一种新的声敏剂，与CO气体前药分子CORM-401结合使用，可使所得仿生纳米材料具备声动力与CO释放的双重作用，从而可用于肿瘤的声动力/气体协同治疗。
本发明的显著优势在于：
（1）在局部超声波介入下，本发明仿生纳米材料N@CAu-BMSN内核能有效的在肿瘤细胞内原位产生CO气体以及1O2用于诱导肿瘤细胞凋亡，并产生免疫源性死亡，诱导肿瘤微环境内巨噬细胞或树突状细胞吞噬相关肿瘤抗原，以激活机体免疫系统，实现声动力/气体协同抗肿瘤治疗。
（2）本发明通过在CAu-BMSN纳米颗粒表面包覆一层巨噬细胞膜，可提高CAu-BMSN纳米颗粒的生物相容性，降低血液循环过程中网状内皮系统对其的吞噬与清除作用，进而提高CAu-BMSN在肿瘤部位的富集效率，从而进一步提高了肿瘤治疗的效率。
附图说明
图1为BMSN（A）与Au-BMSN（B）的透射电镜图。
图2为N@CAu-BMSN纳米颗粒的透射电镜图（A）、J774A.1细胞膜与N@CAu-BMSN的考马斯亮蓝染色图（B）和J774A.1与L929细胞的CD11c表达量的Western blot图（C）。
图3为ROS探针DPBF与BMSNs（A）或Au-BMSN（B）混合后经不同时间超声产生1O2的紫外可见分光光谱图。
图4为PBS+H2O2与CAu-BMSN+H2O2经超声处理后的溶液对比图（A）及CAu-BMSN溶液在超声条件下与马肌红蛋白相互作用不同时间的紫外吸收光谱图（B）。
图5为肿瘤细胞（4T1细胞）与巨噬细胞（J774A.1细胞）对CAu-BMSN或N@CAu-BMSN的摄取与吞噬实验情况图，其中(A)为4T1细胞对Cy5-NHS标记的CAu-BMSN与N@CAu-BMSN纳米颗粒吞噬作用的激光共聚焦图；（B）为J774A.1巨噬细胞对Cy5-NHS标记的CAu-BMSN与N@CAu-BMSN纳米颗粒吞噬作用的激光共聚焦图；(C)与(D)分别为相应的4T1细胞、J774A.1细胞的荧光信号定量分析图。
图6为BMSN、Au-BMSNs、CAu-BMSNs、N@CAu-BMSNs在超声条件下对4T1细胞内的线粒体膜电位影响的激光共聚焦图（利用JC-1膜电位染料染色）。
图7为不同浓度的BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN在未超声处理状态下对4T1细胞的细胞毒性实验（A）、不同浓度的BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN在未超声处理状态下对L929成纤维细胞的细胞毒性实验（B）和不同浓度的BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN在超声处理状态下对4T1细胞的细胞杀伤能力实验（C）。
图8为静脉注射N@CAu-BMSN或N@CAu-BMSN后不同时间点4T1荷瘤小鼠体内的荧光图像（A）及静脉注射8 h后小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的体外照片及荧光图像（B）。
图9为4T1荷瘤小鼠经尾静脉注射N@CAu-BMSNs，并在8 h内利用超声波介入治疗的操作示意图（A）、经不同方法处理后的小鼠肿瘤体积随时间变化的曲线图（B）及经不同方法处理后第16天的肿瘤体积大小对比（C）和肿瘤质量大小对比（D）。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：
量取6 mL含0.2 mg/mL黑磷纳米片BPNs的DMF分散液，在冰浴环境下，用细胞超声破碎仪以70%的输出功率超声处理12 h，经2000 r/min离心5 min去除沉淀（即未被超声剥离的BPNs），再以40000 r/min超速离心机离心20 min后，取沉淀，获得1.2mg黑磷量子点（BPQDs），将其重悬在1 mL去离子水中。
实施例2：
分别称取2 g CTAC、20 mg TEA，将两者加入到实施例1制备好的BPQDs悬浮液中，剧烈搅拌1小时，然后将1.5 mL TEOS缓慢滴入上述混合溶液中，在80℃下剧烈搅拌1小时，待溶液降至室温后，利用12000 r/min离心机离心10 min，取沉淀用乙醇洗涤三次，然后分散于含1wt%氯化钠的50 mL甲醇中，搅拌3小时，离心，沉淀重复洗涤、搅拌操作3次，去除模板CTAC，得到黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒（BMSN）。
将所制备的BMSN和APTES按质量比5:1加入到乙醇中，80℃剧烈搅拌24小时，离心，沉淀用乙醇洗涤三次，再用去离子水重悬，得到浓度为3 mg/mL的BMSN-NH2溶液。将2 mLBMSN-NH2溶液与5 μL、20 mg/mL的氯金酸溶液混合搅拌1 h，然后加入2 mL、0.2 mM的NaBH4溶液，搅拌1h后离心去除未合成的氯金酸，沉淀用去离子水反复洗涤3次后，分散于去离子水中，得到1.5 mg/mL的Au-BMSN溶液。取制备好的Au-BMSN溶液与5 mg/mL的CO前药分子CORM-401溶液混合搅拌24h（其中Au-BMSN与CORM-401的质量比为10:1），得到金/黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒（CAu-BMSN）
使用透射电镜（TEM）表征纳米材料BMSN（A）和CAu-BMSN（B）的形貌，结果如图1所示。由图1可见，BMSN与CAu-BMSN均具备清晰的介孔结构，且在CAu-BMSN介孔及表面附着有球状的AuNPs纳米颗粒。
实施例3：
将J774A.1细胞裂解，即先将J774A.1细胞置于培养皿中培养，待到细胞长满后，用细胞刮刀刮下；加入少量PBS之后将细胞转移至离心管中，300 g离心5 min得到细胞沉淀，再加入PBS洗涤两次；随后按照膜蛋白提取试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司）的操作步骤进行细胞膜的提取，将提取得到的J774A.1细胞膜保存在-80 ℃备用。经BCA蛋白定量后，将CAu-BMSN与巨噬细胞的细胞膜按照质量比5:1混合并超声30 min，制得N@CAu-BMSN。
通过透射电镜对所得N@CAu-BMSN进行表征，并利用考马斯亮蓝和Western blot进行检测，结果如图2所示。由图2中透射电镜图可见，在CAu-BMSN材料表面均匀包覆着一层物质，而经考马斯亮蓝和Western blot检测验证该物质为巨噬细胞膜。
实施例4：
将10 μL的BMSN或Au-BMSN加入到400μL含有0.25mM DPBF探针的溶液中，混合均匀后检测其紫外可见光吸收光谱(300 nm到600 nm)，然后将混合溶液置于超声装置（1WHz）中超声3、6、9min，并在每个时间点检测其紫外可见吸收光谱，结果如图3所示。由图3可见，与BMSN相比，经超声处理的含有DPBF探针的Au-BMSN的吸收光谱随着超声时间的延长而明显下降，证明其具备较高的ROS产量。
实施例5：
为证明超声及ROS能够触发CORM-401发生氧化还原反应而释放CO，将1.5 mg/mLCAu-BMSN的PBS缓冲液+1mM H2O2置于密封的透明橡胶管中，并利用医用超声发生器处理橡胶管，以空白PBS缓冲液+1mM H2O2为对照，通过数码相机拍照记录CO气体的生成。同时为进一步鉴定产生的气体为CO，利用马肌红蛋白与CO的相互作用，检测吸收光谱的变化，即将1.5 mg/mL负载有一氧化碳前药CORM-401的CAu-BMSN置于盛有57 μM马肌红蛋白的溶液中超声，并检测其520 nm到600 nm的紫外可见吸收光谱。结果如图4所示。
由图4中（A）可见，在超声介入下，CAu-BMSN溶液中存在大量气泡，证明有气体产生，而PBS对照组则无气泡产生。而由图4中（B）可见，当有CO产生时，CO能够与马肌红蛋白相互结合而导致其吸收光谱在560nm处形成凹陷，出现两个特征吸收峰（分别在541 nm与580nm处），证明产生的气体为CO。
实施例6：
采用共聚焦显微镜进行荧光成像，考察4T1细胞与J774A-1细胞对N@CAu-BMSN的摄取能力，并以CAu-BMSN为参照。其具体操作为：按照5×104 的细胞密度将4T1细胞或J774A.1细胞接种于35 mm的共聚焦专用培养皿中，在37 ℃恒温细胞培养箱中培养过夜，然后更换为含有Cy5标记的1.5 mg/mL N@CAu-BMSN或CAu-BMSN的新鲜培养基，分别孵育2、4 h后，PBS洗3次，利用Hochest33342对细胞核进行染色定位，随后置于激光扫描共聚焦显微镜中进行荧光扫描成像。结果如图5所示。
由图5中（A）和（C）可见，4T1细胞对CAu-BMSN或N@CAu-BMSN的摄取呈现时间依赖性，并且4T1细胞对N@CAu-BMSNs的吞噬效率明显高于未包膜的CAu-BMSNs；而由图中（B）和（D）可见，J774A-1细胞能有效摄取未包膜的CAu-BMSN纳米颗粒，但对于巨噬细胞包被后的N@CAu-BMSN仿生纳米颗粒则吞噬效率下降。
实施例7：
考察N@CAu-BMSN在超声波介入下产生CO对细胞内线粒体膜电位变化的影响。其具体操作为：按照5×104 的细胞密度将4T1细胞或J774A.1细胞接种于35-mm的共聚焦专用培养皿中，在37 ℃恒温细胞培养箱中培养过夜，然后更换为含有1.5 mg/mL BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN或N@CAu-BMSN的新鲜培养基（以PBS为对照），共孵育8 h，再加入JC-1线粒体膜电位染料共孵育30 min后，PBS洗3次，并将培养皿置于超声发生器上超声3 min，置于共聚焦荧光显微镜进行观测，结果如图6所示。
由图6可见，在超声作用下，与未装载CO前药分子的Au-BMSN及BMSN相比，装载了CO前药分子的CAu-BMSN及N@CAu-BMSN处理的4T1细胞的线粒体均有明显的绿色荧光，且与红光复合后均呈现黄色，且N@CAu-BMSN处理后的4T1细胞的线粒体的绿色荧光显著增强且与红光复合后呈现明亮的黄色，进一步证实了CAu-BMSN及N@CAu-BMSN在超声作用下产生了CO并影响线粒体膜电位。
实施例8：
将不同浓度的BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN与4T1细胞或L929细胞(小鼠成纤维细胞)在37 ℃恒温细胞培养箱中共培养8 h，然后置于超声波发生器中超声3 min，再继续培养24 h后用CCK-8试剂盒进行毒性检测，并利用以下公式进行计算其细胞活力：细胞存活(%)=(OD样品-OD空白)/(OD参比-OD空白)×100，结果如图7所示。
由图7中（A）、（B）可见，在未超声处理状态下，经BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN处理后的4T1细胞及L929细胞的细胞活力并未受到影响，且在最大处理浓度（60 ug/mL）下其细胞活力高于95%，证明BMSN、Au-BMSN、CAu-BMSN、N@CAu-BMSN在未超声状态下均不会对正常细胞产生明显的细胞毒性作用。由图7中（C）表明，在超声介入下的N@CAu-BMSNs表现出明显的协同抗肿瘤作用，而且其抗肿瘤作用呈现明显的浓度依赖性。
实施例9：
构建BALB/c小鼠4T1乳腺癌皮下肿瘤模型，当肿瘤体积大小为100 mm3左右时，进行体内实验研究。首先为确定体内最佳超声介入时机，利用ICG-NHS标记N@CAu-BMSN或CAu-BMSN纳米颗粒，并通过小鼠尾静脉注射100 μL（1.5 mg/mL），然后利用近红外二区荧光成像进行N@CAu-BMSN或CAu-BMSN的体内代谢追踪，结果如图8所示。
由图8可见，N@CAu-BMSN在注射后的第8小时，其荧光强度最大，提示该时间点为N@CAu-BMSN有效肿瘤富集时机，可用于后期超声介入。同时，将ICG-NHS标记的CAu-BMSN经静脉注射荷瘤小鼠体内，发现其肿瘤富集效率较N@CAu-BMSN低，证明巨噬细胞膜包被的N@CAu-BMSN能够有效抵抗体内巨噬细胞的清除，进而提高其在肿瘤区域的富集效率。
实施例10：
将4T1荷瘤小鼠分为8组，即PBS、Au-BMSN、CAu-BMSN以及N@CAu-BMSN、PBS+超声3min、Au-BMSM+超声3 min、CAu-BMSM+超声3 min、N@CAu-BMSN+超声3 min（超声介入时间为注射后8h）。超声治疗结束后的第二天利用电子游标卡尺对肿瘤大小进行检测，每2天测一次，肿瘤体积计算公式如下：肿瘤体积V = A×B2/2，其中A为肿瘤长径，B为肿瘤宽径；然后在治疗后第16天手术取出小鼠肿瘤，记录肿瘤体积大小和重量，结果如图9所示。
由图9可见，在超声处理下，经N@CAu-BMSN处理的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，并在第10天呈现出良好的抑制作用，其小鼠肿瘤体积明显缩小；而经CAu-BMSN等其他材料处理虽然能够延缓小鼠肿瘤生长，但未能有效抑肿瘤，其肿瘤体积随时间延长而逐渐变大，这证实了该纳米材料协同治疗的有效性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种仿生纳米材料N@CAu-BMSN，其特征在于：先制备黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒，然后在其上原位负载金纳米颗粒，再利用其丰富的孔道结构优势负载CO气体前药分子CORM-401，最后利用巨噬细胞膜对其进行包被，得到用于肿瘤声动力/气体协同治疗的N@CAu-BMSN纳米颗粒。
2. 根据权利要求1所述仿生纳米材料N@CAu-BMSN，其特征在于：N@CAu-BMSN纳米颗粒的直径为50-55 nm。
3.一种如权利要求1所述仿生纳米材料N@CAu-BMSN的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）量取6 mL含0.2 mg/mL黑磷纳米片的DMF分散液，在冰浴环境下，超声处理12 h，经2000 r/min离心5 min去除沉淀，再以40000 r/min超速离心20 min后，取沉淀，获得1.2mg黑磷量子点BPQDs，将其重悬在去离子水中；
（2）分别称取2 g CTAC和20 mg TEA，将两者加入到步骤（1）制备好的BPQDs悬浮液中，剧烈搅拌1小时，然后将1.5 mL TEOS缓慢滴入上述混合溶液中，在80℃下剧烈搅拌1小时，待溶液降至室温后，12000 r/min离心10 min，取沉淀用乙醇洗涤三次，然后分散于含1wt%氯化钠的50 mL甲醇中，搅拌3小时，离心，沉淀重复洗涤、搅拌操作3次，最后得到黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒BMSN；
（3）将所制备的BMSN和APTES按质量比5:1加入到乙醇中，80℃剧烈搅拌24小时，离心，沉淀用乙醇洗涤三次，再用去离子水重悬，得到浓度为3 mg/mL的BMSN-NH2溶液；
（4）取2 mL BMSN-NH2溶液与5 μL、20 mg/mL的氯金酸溶液混合搅拌1 h，然后加入2 mL、0.2 mM的NaBH4溶液，搅拌1h后离心去除未合成的氯金酸，沉淀用去离子水反复洗涤3次后，分散于去离子水中，得到1.5 mg/mL的Au-BMSN溶液；按Au-BMSN与CORM-401的质量比为10:1取制备好的Au-BMSN溶液与5 mg/mL的CO前药分子CORM-401溶液混合搅拌24h，得到金/黑磷量子点杂化介孔硅纳米颗粒CAu-BMSN；
（5）将J774A.1细胞裂解，利用试剂盒提取其细胞膜并保存在-80 ℃备用；经BCA蛋白定量后，将CAu-BMSN与所得细胞膜按照质量比1~5：0.2~1混合并超声30 min，制得N@CAu-BMSN纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的仿生纳米材料N@CAu-BMSN的制备方法，其特征在于：步骤（5）中CAu-BMSN与细胞膜的混合比例为5:1。
5.一种如权利要求1所述仿生纳米材料N@CAu-BMSN在制备声动力/气体协同抗肿瘤治疗药物上的应用。
CN202010555452.1A 2020-06-17 2020-06-17 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法 Active CN111686251B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010555452.1A CN111686251B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010555452.1A CN111686251B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111686251A CN111686251A (zh) 2020-09-22
CN111686251B true CN111686251B (zh) 2022-04-12

Family

ID=72481765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010555452.1A Active CN111686251B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111686251B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112641942B (zh) * 2020-12-25 2023-05-19 深圳大学 近红光控纳米气体诊疗剂及其制备方法和应用
CN113577279A (zh) * 2021-08-19 2021-11-02 中国药科大学 一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物、制法及应用
CN114870014B (zh) * 2022-05-18 2023-07-07 南京邮电大学 一种多功能抗肿瘤高分子药物及其制备方法和用途
CN117860704B (zh) * 2024-03-12 2024-05-24 天津医科大学总医院 一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108434462A (zh) * 2018-03-13 2018-08-24 中山大学 一种介孔聚多巴胺负载羰基锰的多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用
CN108567980A (zh) * 2018-07-24 2018-09-25 南京工业大学 光动力诱导的co释放方法、co可控递送系统及其构建方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150177202A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 University Of Tennessee Research Foundation Odor threshold test
GB201707153D0 (en) * 2017-05-04 2017-06-21 Univ Ulster Therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108434462A (zh) * 2018-03-13 2018-08-24 中山大学 一种介孔聚多巴胺负载羰基锰的多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用
CN108567980A (zh) * 2018-07-24 2018-09-25 南京工业大学 光动力诱导的co释放方法、co可控递送系统及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Two dimensional semiconductors for ultrasound-mediated cancer therapy: the case of black phosphorus nanosheets;Jiang Ouyang et al;《Chem Comm》;20180222;第54卷;第2874-2877页 *
Ultrasound-Driven Biomimetic Nanosystem Suppresses Tumor Growth and Metastasis through Sonodynamic Therapy, CO Therapy, and Indoleamine 2,3-Dioxygenase Inhibition;Da Zhang et al;《ACS Nano》;20200714;第14卷;第8985-8999页 *
新型二维纳米材料联合超声相关生物医学技术在肿瘤诊疗中的应用进展;杨微 等;《肿瘤防治研究》;20191231;第46卷(第6期);第561-566页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111686251A (zh) 2020-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111686251B (zh) 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法
Zhu et al. Sonodynamic therapy with immune modulatable two-dimensional coordination nanosheets for enhanced anti-tumor immunotherapy
Chen et al. NIR-II light activated photodynamic therapy with protein-capped gold nanoclusters
Chen et al. A theranostic nrGO@ MSN-ION nanocarrier developed to enhance the combination effect of sonodynamic therapy and ultrasound hyperthermia for treating tumor
Chaudhary et al. Efficient photoacoustic imaging using indocyanine green (ICG) loaded functionalized mesoporous silica nanoparticles
CN108434462B (zh) 一种介孔聚多巴胺负载羰基锰的多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用
CN108042810B (zh) 一种酸响应释氢纳米药物及其制备方法
Xu et al. Hollow mesoporous manganese oxides: application in cancer diagnosis and therapy
CN113456613B (zh) 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用
CN110623939B (zh) 一种负载斑蝥素的肿瘤细胞膜包封碲单质纳米颗粒的制备方法
Sun et al. MnO 2 nanoflowers as a multifunctional nano-platform for enhanced photothermal/photodynamic therapy and MR imaging
CN111150853A (zh) 一种肿瘤联合治疗药物载体的制备及应用
CN115137845B (zh) 一种含动态亚胺键的金属有机框架共价同时固载阿霉素和卟啉复合物及其制备方法和应用
Gao et al. AuNRs@ MIL-101-based stimuli-responsive nanoplatform with supramolecular gates for image-guided chemo-photothermal therapy
Li et al. Colon cancer exosome-derived biomimetic nanoplatform for curcumin-mediated sonodynamic therapy and calcium overload
Chen et al. Hypoxia-alleviated nanoplatform to enhance chemosensitivity and sonodynamic effect in pancreatic cancer
Wang et al. Flexible CuS-embedded human serum albumin hollow nanocapsules with peroxidase-like activity for synergistic sonodynamic and photothermal cancer therapy
Guan et al. Iron oxide-based enzyme mimic nanocomposite for dual-modality imaging guided chemical phototherapy and anti-tumor immunity against immune cold triple-negative breast cancer
CN114073767A (zh) 一种靶向响应型治疗纳米颗粒及其制备方法与应用
CN113975391B (zh) 一种自供氧光敏剂及其制备方法和应用
Li et al. A near-infrared-II fluorescent nanocatalyst for enhanced CAR T cell therapy against solid tumor by immune reprogramming
Jiapaer et al. Disulfiram-loaded hollow copper sulfide nanoparticles show anti-tumor effects in preclinical models of colorectal cancer
Deng et al. Film-facilitated formation of ferrocenecarboxylic acid-embedded metal-organic framework nanoparticles for sonodynamic osteosarcoma treatment
Yang et al. Boosting immunotherapy of triple negative breast cancer through the synergy of mild PTT and Fe-loaded organosilica nanoparticles
Gowsalya et al. Engineered photonic near-infrared light activated photothermal theranostic nanovaccine induced targeted remodeling of tumor microenvironment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant