CN115645371A - 一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒子及其制备方法和应用，属于纳米药物技术领域。本发明通过构建一种基于压电纳米粒子的新型原位自生成ROS系统，将压电纳米粒子BaTiO₃与巯基化的葡聚糖通过Ba‑S键结合，得到BaTiO₃@Glu纳米粒子，用于无创精准动态免疫疗法治疗结肠癌，可有效抑制结肠癌的生长，减少癌细胞扩散，降低死亡率。

Description

一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒 子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

结肠癌无论从发病率还是与死亡率都是最致命的恶性肿瘤之一，且发病率和死亡率呈现上升趋势。尽管化疗是目前治疗结肠癌的最常用方法，但许多化疗药物常常由于传统给药途径缺乏特异性和存在着巨大的副作用而受到限制。因此，研究具有高有效性和低副作用的药物来替代传统的治疗方案至关重要。

近年来开发出了许多新型抗癌策略，其中涉及使用活性氧(ROS)比如光动力疗法，也称为PDT。由于其高选择性和低副作用而受到广泛关注。PDT 一般使用光敏剂(PSs)在暴露于特定波长的光时产生细胞毒性ROS，它已被批准用于多种不同实体瘤如口腔癌和皮肤癌的临床治疗。然而，光动力疗法无法成功穿透深层肿瘤，如结肠癌。因此，仍然迫切需要研究开发一种既能成功治疗深层肿瘤又能解决光穿透能力弱的ROS治疗策略。

压电材料因为其具有非中心对称的晶体结构，在受到外界力(例如，振动、压缩、声音)的作用下会产生电的功能而备受研究人员的关注。同时因其在受力下转化为电的性能为非侵入性电刺激装置提供了可能性。并且压电纳米粒子由于其独特的结构、精确可控的极化能力、巨大的空间选择性以及被细胞吞噬后以类药物形式让细胞内在受力的情况产生ROS来杀死肿瘤。最近，施剑林院士研究团队通过合成四方形状的BaTiO₃压电纳米粒子在外界作用力超声(US)作用下产生压电催化ROS，将US和压电催化化学相结合。然而，尽管它作为一种可替代无药物和非热方式治疗，但超声治疗所需的复杂和广泛的过程，以及它们可能对健康组织有害的热辐射，限制了它们的临床应用。有鉴于此，开发一种非侵入性、原位、自生成ROS策略可以打破目前的僵局，并激发未来对实现精准结肠癌动态免疫治疗策略的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒子及其制备方法和应用。本发明通过构建一种基于压电纳米粒子的新型原位自生成ROS系统，将压电纳米粒子BaTiO₃与巯基化的葡聚糖通过Ba-S键结合，得到BaTiO₃@Glu纳米粒子，用于无创精准动态免疫疗法治疗结肠癌，可有效抑制结肠癌的生长，减少癌细胞扩散，降低死亡率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧 BaTiO₃@Glu纳米粒子在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

本发明还提供了一种上述BaTiO₃@Glu纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备钛酸钡纳米颗粒和巯基化的葡聚糖；

(2)将所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖混合，溶于水中进行反应，反应结束后，经清洗、干燥，得到所述BaTiO₃@Glu纳米粒子。

优选的，所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖的质量比为0.5～2： 0.5～2。

优选的，所述钛酸钡纳米颗粒与水的质量体积比为1g：80～120ml。

优选的，所述反应的温度为20～25℃。

优选的，所述反应的时间为8～16h。

优选的，所述干燥为真空干燥，所述干燥的温度为50～100℃，所述干燥的时间为4～8h，所述干燥的真空度为10～20Pa。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的BaTiO₃@Glu纳米粒子。

本发明提供了一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧纳米粒子及其制备方法和应用。本发明的技术原理如图1所示，将压电纳米粒子BaTiO₃与巯基化的葡聚糖通过Ba-S键结合，得到BaTiO₃@Glu纳米粒子。葡聚糖可以靶向到肠道的肠上皮的褶皱细胞(M细胞)，当口服BaTiO₃@Glu 后，纳米粒子能够穿过致密的黏膜上皮，靶向M细胞进入体内。经过肠道周围巨噬细胞内吞过程后，BaTiO₃@Glu最终随着巨噬细胞归巢效应聚集在结肠癌位置。在肠道收缩和舒张作用下，在肿瘤部位的压电纳米粒子BaTiO₃@Glu可与水触发压电催化产生ROS，而无需外部电源，也不依赖肿瘤内的O₂。与目前报道的压电催化疗法不同，本发明的原位自生ROS系统具有独特的压电催化ROS能力，无需额外的外力。此外，作为免疫佐剂的葡聚糖可与部分被原位生成ROS杀死的肿瘤释放出的抗原配对，有效激活全身免疫系统以限制肿瘤扩散的潜在癌症。

本发明的BaTiO₃@Glu纳米粒子，可显著抑制结肠癌的生长，抑制肿瘤细胞向其他器官扩散，降低癌症死亡率。并且本发明的纳米粒子通过非侵入口服的方式即可治疗结肠癌及转移问题，患者可以在家中自己进行治疗，大大方便了医生和患者，更具推广和应用前景。

附图说明

图1为本发明的技术原理图。

图2为实施例1制备的BaTiO₃@Glu纳米粒子的扫描电子显微镜(SEM) 图。

图3为BaTiO₃、BaTiO₃@Glu纳米粒子的X射线粉末衍射图。

图4为Glucan、BaTiO₃和BaTiO₃@Glu纳米粒子的UV-vis图。

图5为试验例1体外实验中Control(水)和BaTiO₃@Glu纳米悬浮液中的ROS响应值。

图6为试验例2中实验期间Control组、BaTiO₃组、Glucan组和 BaTiO₃@Glu组老鼠的体重变化和生存曲线；其中，图6A为各组老鼠体重变化图，图6B为各组老鼠生存曲线图。

图7为试验例2中实验结束后正常老鼠、Control组和BaTiO₃@Glu组老鼠的治疗情况；其中，图7A为各组老鼠的腹部对比情况；图7B为各组老鼠的胃肠道和肝脏对比情况。

具体实施方式

本发明提供了一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧 BaTiO₃@Glu纳米粒子在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

本发明还提供了一种上述BaTiO₃@Glu纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备钛酸钡纳米颗粒和巯基化的葡聚糖；

(2)将所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖混合，溶于水中进行反应，反应结束后，经清洗、干燥，得到所述BaTiO₃@Glu纳米粒子。

在制备BaTiO₃@Glu纳米粒子时，本发明先制备了钛酸钡纳米颗粒和巯基化的葡聚糖。

在本发明中，所述钛酸钡纳米颗粒的制备过程优选为：制备四氯化钛的乙醇溶液，将四氯化钛的乙醇溶液逐滴加入氢氧化钡溶液中，调节pH，搅拌得到混合溶液，将混合溶液进行溶剂热反应，反应结束后离心收集产物，经洗涤、干燥，得到钛酸钡纳米颗粒。

在本发明中，所述四氯化钛的乙醇溶液的浓度优选为10～20μL/mL，进一步优选为11μL/mL。

在本发明中，所述氢氧化钡溶液的浓度优选为40～100mg/mL，进一步优选为62.08mg/mL。

在本发明中，所述四氯化钛和氢氧化钡的摩尔比优选为1：1～4，进一步优选为1：2。

在本发明中，所述pH优选>13。

在本发明中，所述搅拌的转速优选为400～600rpm，进一步优选为 500rpm。

在本发明中，所述搅拌的时间优选为100～150min，进一步优选为 120min。

在本发明中，所述溶剂热反应优选在有聚四氟乙烯内衬的反应釜中进行。

在本发明中，所述溶剂热反应的温度优选为150～200℃，进一步优选为 180℃。

在本发明中，所述溶剂热反应的时间优选为18～30h，进一步优选为24h。

在本发明中，所述洗涤优选采用去离子水与无水乙醇交替洗涤2～4次，进一步优选为采用去离子水与无水乙醇交替洗涤3次。

在本发明中，所述干燥优选为真空冷冻干燥。

在本发明中，所述干燥的温度优选为-30～-15℃，进一步优选为-20℃。

在本发明中，所述干燥的时间优选为16～30h，进一步优选为24h。

在本发明中，所述干燥的真空度优选为10～20Pa，进一步优选为15Pa。

在本发明中，所述巯基化的葡聚糖的制备过程优选为：制备葡聚糖溶液，在所述葡聚糖溶液中加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐 (DMTMM)，混合均匀后加入半胱胺盐酸盐，经搅拌、清洗后，得到巯基化的葡聚糖。

在本发明中，所述葡聚糖溶液的浓度优选为5～15mg/mL，进一步优选为 10mg/mL。

在本发明中，所述DMTMM与葡聚糖的质量比优选为1：1～1.5，进一步优选为1：1.4。

在本发明中，所述半胱胺盐酸盐与葡聚糖的质量比优选为1：2.5～3。

在本发明中，所述加入半胱胺盐酸盐后优选进行避光。

在本发明中，所述搅拌优选在N₂保护下进行。

在本发明中，所述搅拌的转速优选为400～600rpm，进一步优选为 500rpm。

在本发明中，所述搅拌的时间优选为18～30h，进一步优选为24h。

在本发明中，所述清洗优选为用无水乙醇离心清洗2～4次，进一步优选为用乙醇离心清洗3次。

制备得到钛酸钡纳米颗粒与巯基化的葡聚糖后，本发明将所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖混合，溶于水中进行反应，反应结束后，经清洗、干燥，得到所述BaTiO₃@Glu纳米粒子。

在本发明中，所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖的质量比优选为0.5～2：0.5～2，进一步优选为1：1。

在本发明中，所述钛酸钡纳米颗粒与水的质量体积比优选为1g： 80～120ml，进一步优选为1g：100ml。

在本发明中，所述水优选为去离子水。

在本发明中，所述反应的温度优选为20～25℃，进一步优选为25℃。

在本发明中，所述反应的时间优选为8～16h，进一步优选为12h。

在本发明中，所述清洗优选使用无水乙醇离心清洗。

在本发明中，所述乙醇离心清洗的次数优选为2～5次，进一步优选为3 次。

在本发明中，所述干燥优选为真空干燥。

在本发明中，所述干燥的温度优选为50～100℃，进一步优选为60℃。

在本发明中，所述干燥的时间优选为4～8h，进一步优选为6h。

在本发明中，所述干燥的真空度优选为10～20Pa，进一步优选为15Pa。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的BaTiO₃@Glu纳米粒子。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种上述BaTiO₃@Glu纳米粒子的制备方法，具体过程如下：

1.BaTiO₃纳米粒子的制备

取220μLTiCl₄分散于20mL乙醇中，配制成TiCl₄的乙醇溶液；取1.2416g Ba(OH)₂·8H₂O溶于20mL去离子水中，超声30min使其完全溶解，配制成Ba(OH)₂溶液；然后将所述TiCl₄的乙醇溶液逐滴加入所述Ba(OH)₂溶液中，并滴加0.2mol/L的NaOH溶液，调节溶液pH为13.5；500rpm搅拌120min 后将溶液转入100mL的聚四氟乙烯内衬的反应釜中，并将反应釜置于马弗炉中180℃下反应24h进行溶剂热反应。反应结束后，离心收集产物并用去离子水和无水乙醇交替洗涤3次。洗涤结束后，将产物在-20℃，15Pa下冷冻干燥24h，得到BaTiO₃纳米颗粒。

2.葡聚糖(glucan)巯基化处理

将1.5g glucan溶解在150mL的去离子水中，并在25℃下搅拌4h。将1.093g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)添加到溶液中，25℃下500rpm搅拌1h后，加入0.53g半胱胺酸盐后避光，用N₂保护，在25℃下搅拌24h，用乙醇离心清洗3次，得到巯基化的glucan。

3.BaTiO₃@Glu纳米粒子的制备

取1g BaTiO₃纳米粒子和1g巯基化的Glucan混合，并溶解在100mL的去离子水，并在25℃下反应12h，最后用乙醇离心清洗3次。清洗结束后转移至真空干燥箱，设置温度为60℃，真空度为15Pa，干燥6h，得到 BaTiO₃@Glu纳米粒子。

试验例1

将实施例1制备得到的材料进行表征分析。通过扫描电子显微镜、X射线粉末衍射和紫外-可见分光光度仪进行检测，检测结果如图2～4所示。

从图2所示的扫描电子显微镜(SEM)图可以看出，制备的BaTiO₃@Glu 纳米粒子粒径为200nm，形状为偏纺锤形。可使纳米粒子在口服之后有效地被巨噬细胞吞噬并带入结肠到肠癌肿瘤内，防止被胃肠道吸收进入体内。

从图3所示的X射线粉末衍射(XRD)图可以看出，制备的BaTiO₃@Glu 纳米粒子的晶型跟模拟的晶型一致。

从图4所示的紫外-可见分光光度(UV-vis)图可以看出，Glucan已成功与BaTiO₃结合。

将实施例1制备得到的BaTiO₃@Glu纳米粒子进行体外实验。在体外用气球模拟肠道蠕动，检测水(control)和0.1mg/mL BaTiO₃@Glu纳米悬浮液中ROS的响应值。结果如图5所示。

从图5可以看出，BaTiO₃@Glu纳米悬浮液在体外用模拟肠道蠕动的情况下可以自产生大量的ROS。

试验例2

将实施例1制备得到的材料(BaTiO₃纳米粒子、巯基化的Glucan和 BaTiO₃@Glu纳米粒子)进行体外实验

1.原位结肠癌老鼠模型建立：

选取体重一致，生长状态相同的Balb/c小鼠，术前禁食12h，以0.5％戊巴比妥钠(35～50mg/kg)腹腔注射麻醉，常规消毒皮肤，在裸鼠右下腹切 lcm左右大小的切口，并逐层锐性分离腹壁肌肉致腹膜，用眼科镊提起腹膜，眼科剪剪开腹膜，用眼科镊挑出小鼠结肠，将CT26细胞(购自ATCC)接种于Balb/c小鼠结肠浆膜层。每只小鼠注射50mL，1×10⁷Cell/mL的CT26 细胞，回纳小鼠结肠于腹腔，最后逐层缝合腹膜(含肌层)及皮肤。使用75％的酒精及碘酊消毒皮肤。术毕观察小鼠无活动性出血后，所有小鼠暂时分笼饲养直至完全清醒，整个手术过程在制备成单细胞悬液后1h内完成。术后立即皮下注射生理盐水1.5mL以补充水分，禁食禁水6h后给予高能量饮食。接种后继续置无菌层流室中饲养，24h内观察小鼠皮肤渗血及小鼠活力，确定其是否感染。

2.原位结肠癌老鼠模型治疗：

取成功构建的原位结肠癌老鼠模型24只，随机分为Control组、BaTiO₃组、Glucan组和BaTiO₃@Glu组4组，每组6只。Control组采用生理盐水进行治疗；BaTiO₃组采用实施例1中制备的BaTiO₃纳米粒子，进行连续3 天口服10mg/kg的治疗；Glucan组采用实施例1中制备的巯基化的Glucan，进行连续3天口服10mg/kg的治疗；BaTiO₃@Glu组采用实施例1制备的BaTiO₃@Glu纳米粒子，进行连续3天口服10mg/kg的治疗。治疗后隔天开始记录各组老鼠的体重和生存曲线，结果如图6所示。

从图6A可以看出，BaTiO₃@Glu组老鼠的体重生长平稳，而其它组的老鼠体重增长的过快。表明原位结肠癌的生长会造成老鼠体重增长过快，而采用BaTiO₃@Glu纳米粒子治疗可显著抑制原位结肠癌的生长，控制老鼠体重。

从图6B可以看出，BaTiO₃@Glu组老鼠对比其它组老鼠，存活率得到明显的改善，表明采用BaTiO₃@Glu纳米粒子治疗可显著降低癌症死亡率。

治疗25天后结束实验处死老鼠，观察正常老鼠、control组(未治疗) 和BaTiO₃@Glu组(治疗)老鼠腹部外观情况，并刨出老鼠的胃肠道和肝脏观察治疗效果。结果如图7所示。

从图7A可以看出，用BaTiO₃@Glu纳米粒子口服治疗25天之后的老鼠与未治疗的老鼠对比，老鼠的腹部在治疗之后跟正常老鼠基本上一致，而未治疗的老鼠因为直肠的生长导致腹水增加腹部变大。

从图7B可以看出，用BaTiO₃@Glu纳米粒子口服治疗25天之后的老鼠胃肠道与正常老鼠一致，而未治疗的老鼠的胃肠道结肠癌组织明显。治疗后的老鼠的肝脏色泽红润，表面光滑，与正常老鼠一致，而未治疗的老鼠的肝脏表面有明显的癌组织，表明结肠癌发生了扩散。

综上表明，非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自ROS系统可以有效的治疗原位结肠癌，抑制结肠癌的生长和扩散，降低癌症死亡率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种精确非侵袭性结肠癌动态免疫治疗的自生活性氧BaTiO₃@Glu纳米粒子在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

2.一种权利要求1所述的BaTiO₃@Glu纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备钛酸钡纳米颗粒和巯基化的葡聚糖；

(2)将所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖混合，溶于水中进行反应，反应结束后，经清洗、干燥，得到所述BaTiO₃@Glu纳米粒子。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述钛酸钡纳米颗粒与所述巯基化的葡聚糖的质量比为0.5～2：0.5～2。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述钛酸钡纳米颗粒与水的质量体积比为1g：80～120ml。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为20～25℃。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为8～16h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为真空干燥，所述干燥的温度为50～100℃，所述干燥的时间为4～8h，所述干燥的真空度为10～20Pa。

8.一种权利要求2～7任一项所述制备方法制备得到的BaTiO₃@Glu纳米粒子。

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