KR101702227B1 - 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 음파감작제는 종래 빛을 사용하는 광감작제를 사용하는 경우에 빛이 도달할 수 있는 경우에만 사용되는 문제점을 해결할 수 있고, 암세포 내에 본 발명의 음파감작제의 축적도가 단시간에 최대치까지 올라갈 수 있어, 치료 시간을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 인체 친화적인 안정성을 가지고 있어, 암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법{Sonosensitizer composition containing titanium oxide nanoparticle as active ingredient, composition for preventing or treating cancer comprising the same, and the preparation thereof}
본 발명은 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 알려진 암 치료법으로는 외과적 수술에 의한 절제, 방사선 요법, 항암제를 사용하는 화학적 요법 등이 있으나, 화학 요법이나 수술 등과 같은 종래 암 치료법은 약물 부작용(ADR, 약물 유해 반응), 숙주 면역 시스템의 장애 및 환자의 낮은 수용 상태 등으로 인해 제한적이다.
이에, 최근에는 자연적 상태의 종양파괴를 위해 주로 에너지에 기초(energy－based)한 최소 침습성 치료 방법이 연구되고 있고, 상기 최소 침습성 치료방법으로는 레이저를 이용한 광역학 치료법(Photo Dynamic Therapy: PDT)과 빛 대신 소리(초음파)를 사용한 음파 역학 치료법(Sonar Dynamic Therapy: SDT)이 있다.
상기 광역학 치료법(photodynamic therapy: PDT)은 광감작제를 체내에 주사하고 질병 부위에 특별한 파장을 갖는 레이저 빛을 조사하여 종양을 치료하는 방법으로서, 질병부위에만 선택적으로 치료가 가능하여 부작용이 작고 시술과정이 간단하며, 여러 차례 반복시술이 가능하여 그 효과를 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라, 외과적 수술, 방사선 요법, 및 화학적 요법 등의 다른 치료법과 병행이 가능하다는 장점이 있다.
그러나 광역학 치료법에 사용되는 적색 빛으로 인해, 10 mm까지 깊이로만 인체에 침투하고, 표재성 또는 국소 영역에서 발생하는 종양 치료에만 사용되며, 현재 사용 가능한 광감작제는 정상 세포에서 낮은 속도로 대사되기 때문에, 치료 후 환자는 감광성 피부염 방지를 위해, 30 일 동안 빛으로부터 차단되어야하는 문제점이 있고, 체내 또는 종양에 광학섬유를 넣는 중재적 절차가 필요하므로 환자의 고통과 위험을 증가시키는 단점이 있을 뿐만 아니라, 생체분자들과의 부적절한 상호작용이나, 광감작제들 간의 상호엉김(aggregation)현상으로 암조직으로의 선택적 전달에 한계가 있다.
한편, 음파 역학 치료법은 비방사(non-radiative)이고, 낮은 조직 감쇠 계수를 가져 생체 조직 내로 깊게 침투할 수 있는 초음파를 이용하여, 음향과민제를 활성화시키고, 종양 세포와 같은 비정상적인 세포를 사멸시키는 기전을 바탕으로 연구가 진행되고 있고, 초음파의 특성 상 보다 깊은 조직 치료가 가능하기 때문에, 초음파의 온도 효과를 사용하는 다른 치료나 HIFU 치료 등에 사용되고 있다.
종래 밀러사(社)에서는 국소성 SDT에 사용하기 위한 종양 결합 펩티드와 콘쥬게이트된 페릴렌퀴논(perylenequinone) 색소 유도체가 개발된 바 있으나, 여전히 주목할 만한 결과를 얻지 못하고 있다.
종래 개발되어 시판되고 있는 제품보다 더 음파 역학적 치료 효과를 높이고 인체 친화적인 안정성을 가지며 광범위하게 적용 가능한 음파 감작제의 개발이 요구되고 있다.
미국 공개특허 제6627664호
본 발명은 종래 음파 역학적 치료에 적용되고 있는 제품 보다 우수한 음파 감작제를 개발하기 위한, 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물, 이를 포함하는 음파감작용 조성물 및 이를 이용한 암 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제 1 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 폴리사카라이드로 표면이 개질된 산화티타늄 나노입자를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고,
R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며,
R3은 -H 또는 -OH이다.
바람직하게, 상기 R1은 -H 또는 -OH이고, R2는 -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린일 수 있다.
상기 산화티타늄 나노입자는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 의해 환원된다.
상기 폴리사카라이드는 카르복실메틸덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 키토산, 히알루론산, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시 에틸 프로필 셀룰로오스, 구아검, 갈락토만논검, 로커스트빈검 및 전분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 나노입자는 0.2 내지 10 MHz의 파장의 초음파에 대해 음파감작 활성을 보인다.
상기 나노입자는 제타전위가 음전하이다.
상기 나노입자는 티타늄 함량이 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 입자 크기가 10 내지 500 nm일 수 있다.
본 발명의 제 2 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 폴리사카라이드로 표면이 개질된 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용(sonosensitizer) 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00002
상기 화학식 1에서, R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고, R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
바람직하게, 상기 R1은 -H 또는 -OH이고, R2는 -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린일 수 있다.
상기 산화티타늄 나노입자는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 의해 환원된다.
상기 폴리사카라이드는 카르복실메틸덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 키토산, 히알루론산, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시 에틸 프로필 셀룰로오스, 구아검, 갈락토만논검, 로커스트빈검 및 전분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 0.2 내지 10 MHz의 파장의 초음파에 대해 음파감작 활성을 보인다.
상기 음파감작용 조성물은 제타전위가 음전하이다.
상기 음파감작용 조성물은 티타늄 함량이 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 입자 크기가 10 내지 500 nm일 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위한 음파 역학 치료에 사용되는 것일 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있고, 바람직하게는 정맥주사용일 수 있다.
상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 뇌종양, 피부암, 갑상선암, 피부 흑색종, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 및 골수암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 제 3 양태는, 하기 단계를 포함하는 상기 음파감작용 조성물 또는 음파감작용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(1) 티타늄 옥사이드 나노입자를 제1 용매에 분산시킨 후, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 첨가하여 표면이 하기 화학식 1로 개질된 티타늄 옥사이드 나노입자를 얻는 제1 단계; 및
(2) 폴리사카라이드를 제1 용매에 분산시킨 후, 커플링 시약을 첨가한 다음, 상기 제1 단계에서 얻은 개질된 티타늄 옥사이드 나노입자를 첨가하는 제2 단계를 포함한다:
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00003
상기 화학식 1에서, R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고, R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
상기 제1 용매는 포름아미드, N-메틸포름아미드, 다이메틸 설폭사이드, 및 에틸렌 글라이콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 커플링시약은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC), N-하이드록시설포석신이미드 (NHS) 설포-NHS 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 제 4 양태는, 포유류에 상기 음파감작용 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류 내의 암을 치료 또는 전이를 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제 5 양태는, 포유류에 상기 음파감작용 조성물을 유효량으로 투여한 후, 초음파에 노출시켜 음파감작용 조성물을 활성화시켜 암 세포를 사멸하는 과정을 포함하는 포유류 내의 암을 치료 또는 전이를 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 음파감작제는 종래 빛을 사용하는 광감작제를 사용하는 경우에 빛이 도달할 수 있는 경우에만 사용되는 문제점을 해결할 수 있고, 암세포 내에 본 발명의 음파감작제의 축적도가 단시간에 최대치까지 올라갈 수 있어, 치료 시간을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 인체 친화적인 안정성을 가지고 있어, 암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 초음파에 감응하여 활성 산소종을 방출하는 CMD-TiO2 나노입자 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 FT-IR 그래프를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 TEM 사진을 나타내는 도면이다.
도 4은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 생체 내 조건에서의 안정성 검사 결과를 나타내는 도면이다.
도 5은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 세포 독성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 활성 산소종 방출 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 축적 거동 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 in vivo 활성 산소종 방출 평가를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 효과 확인 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 따른 종양 조직 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 따른 주요 장기 조직 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 따른 혈청과 종양 조직에서의 활성 액상 인자 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예 1에 따른 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 따른 종양 조직 혈관의 붕괴 확인 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예 1에 따른 간 종양 모델에서의 CMD-TiO2 나노입자의 종양 축적 거동 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예 1에 따른 간 종양 모델에서의 CMD-TiO2 나노입자의 종양 치료 효과 확인 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 실시예 1에 따른 간 종양 모델에서의 치료 후 암 전이 확인 결과를 나타내는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 제 1 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 폴리사카라이드로 표면이 개질된 산화티타늄 나노입자를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00004
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고,
R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며,
R3은 -H 또는 -OH이다.
바람직하게, 상기 R1은 -H 또는 -OH이고, R2는 -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린일 수 있다.
상기 산화티타늄 나노입자는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 의해 환원된다.
구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 산화티타늄 나노입자 표면을 환원시킴에 따라, 화학식 1에 표시된 R1기가 산화티타늄 나노입자 표면에 도포 되어 수성환경에서 매우 안정한 장점이 있다. 도파민의 경우, 1,2-다이올 작용기가 티타늄 원자와 5원 킬레이트 (five-membered chelate)를 형성하여 산화티타늄 나노입자 표면에 도포된다. 바람직하게는 산화티타늄에 대해, 1 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
상기 폴리사카라이드는 카르복실메틸덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 키토산, 히알루론산, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시 에틸 프로필 셀룰로오스, 구아검, 갈락토만논검, 로커스트빈검 및 전분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 폴리사카라이드는 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린 말단의 -NH2 , -OH 또는 -NHCH3 작용기와 커플링하여 산화티타늄을 친수성을 띌 수 있도록 도입된 것으로서, 상기 폴리사카라이드를 사용하게 되면, 장시간 순환성이 우수해지고, 생체적합성이 우수해지고 각종 질병에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 장점이 있다.
상기 나노입자는 0.2 내지 10 MHz의 주파수의 초음파에 대해 음파감작 활성을 보이는데, 상기 범위를 벗어나는 경우, 0.2 MHz 미만으로 조사하는 경우, 음파감각성의 효율에 문제점이 있을 수 있고, 10 MHz 초과하여 조사하는 경우, 정상조직 손상의 문제점이 있을 수 있다.
상기 나노입자는 1 내지 50 W/cm2의 세기로 초음파를 조사할 수 있다.
1 W/cm2 미만으로 조사하는 경우, 음파감각성의 효율에 문제점이 있을 수 있고, 50 W/cm2 초과하여 조사하는 경우, 정상조직 손상의 문제점이 있을 수 있다.
상기 나노입자는 제타전위가 음전하를 띈다.
본 발명에 따르면, 제타전위, 즉, 표면전하가 음전하를 띄는 경우에만 암세포에 선택적으로 적용될 수 있다. 만약 제타전위가 양전하인 경우, 모든 세포에 적용되는 문제점이 있다.
바람직하게는 제타전위가 0 내지 -50 mV일 수 있다.
상기 나노입자는 티타늄 함량이 나노입자 총 중량에 대하여, 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
티타늄 함량은 1 중량% 미만으로 포함되는 경우, 음파감응성 효율에 대한 문제점이 있을 수 있고, 50 중량% 초과하여 포함되는 경우, 수성환경에서 나노입자의 순환성에 문제점이 있을 수 있다.
본 발명에 따르면, 나노입자는 혈관을 통해 세포까지 도달하기 때문에 혈관보다 작은 크기여야 하고, 바람직하게는 상기 나노입자는 입자 크기가 10 내지 500 nm이다.
상기 범위내로 입자 크기가 조절 돼야지만, 암 부위에 생성된 엉성한 혈관 벽을 통하여 암세포에 효과적으로 도달 할 수 있다.
본 발명의 제 2 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 폴리사카라이드로 표면이 개질된 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "음파감작제(sonosensitizer)"는 적합한 주파수에 노출되었을 때 진동에너지를 흡수한 후, 활성 산소를 발생시켜 세포를 손상시키거나 파괴할 수 있는 물질을 포괄적으로 의미한다. 상기 음파감작제는 생체에 투여되는 경우 특정의 타깃 세포(예컨대, 암세포)에 특이적으로 결합한 후 초음파에 의해 활성화되어 암세포를 사멸시킬 수 있는 독성물질을 생성함으로써 암세포에 대한 선택적 독성을 나타낸다.
메커니즘적으로 살펴보면, 본 발명의 음파감작제가 종양조직에 선택적으로 축적된 후 초음파에 의해 활성화되면서 산소와 결합하여 화학적으로 반응성이 매우 높은 단일 항산소(1O2：singlet oxygen)를 발생시켜, 암세포를 직접적으로 손상시키는 메커니즘에 기인하고, 종양 주변의 미세 혈관에 손상을 주어 암조직에 영양분이 공급되지 않도록 하여 암세포를 사멸시키는 간접적인 효과를 줄 뿐만 아니라, 산화적 스트레스(oxidative stress)에 따른 2차 반응으로 세포자살(apoptosis) 또는 면역학적 반응을 유도하여 암조직을 공격하도록 면역시스템을 활성화시켜 종양 조직세포를 괴사시킬 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 음파감작제는 종래 빛을 사용하는 광감작제를 사용하는 경우에 빛이 도달할 수 있는 경우에만 사용되는 문제점을 해결하여 초음파가 도달 할 수 있는 모든 암종의 치료가 가능하며, 암세포 내에 본 발명의 음파감작제의 축적도가 단시간에 최대치까지 올라갈 수 있어, 치료 시간을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 인체 친화적인 안정성을 가지고 있어, 다양한 암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00005
상기 화학식 1에서, R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고, R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
바람직하게, 상기 R1은 -H 또는 -OH이고, R2는 -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린일 수 있다.
상기 산화티타늄 나노입자는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 의해 환원된다.
상기 폴리사카라이드는 카르복실메틸덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 키토산, 히알루론산, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시 에틸 프로필 셀룰로오스, 구아검, 갈락토만논검, 로커스트빈검 및 전분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 0.2 내지 10 MHz의 파장의 초음파에 대해 음파감작 활성을 보인다.
상기 음파감작용 조성물은 제타전위가 음전하이다.
상기 음파감작용 조성물은 티타늄 함량이 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 입자 크기가 10 내지 500 nm일 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위한 음파 역학 치료에 사용되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "음파 역학 치료(sonar dynamic therapy, SDT)"는 병적 상태(예를 들어 암)에 있는 대상(subject)에 음파감작제를 처리하고 이 음파감작제를 활성화시켜 치료 효과를 얻기 위해 광을 조사하는 과정을 포함하는 치료 방법을 의미한다.
상기 음파감작용 조성물은 암 조직에 선택적으로 축적될 수 있고, 상기 음파감작용 조성물은 활성 산소를 발생시켜 암 치료 또는 암 전이를 억제할 수 있다.
상기 음파감작용 조성물은 약제학적 조성물이고, 바람직하게는 정맥주사용일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 뇌종양, 피부암, 갑상선암, 피부 흑색종, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 및 골수암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 제 3 양태는, 하기 단계를 포함하는 상기 음파감작용 조성물 또는 음파감작용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(1) 티타늄 옥사이드 나노입자를 제1 용매에 분산시킨 후, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 첨가하여 표면이 하기 화학식 1로 개질된 티타늄 옥사이드 나노입자를 얻는 제1 단계; 및
(2) 폴리사카라이드를 제1 용매에 분산시킨 후, 커플링 시약을 첨가한 다음, 상기 제1 단계에서 얻은 개질된 티타늄 옥사이드 나노입자를 첨가하는 제2 단계를 포함한다:
[화학식 1]
Figure 112015067188358-pat00006
상기 화학식 1에서, R1은 -H, -OH 또는 C1-3의 알콜이고, R2는 -OH, -NH2 또는 -NHCH3이며, R3은 -H 또는 -OH이다.
상기 제1 용매는 포름아미드, N-메틸포름아미드, 다이메틸 설폭사이드, 및 에틸렌 글라이콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 커플링시약은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC), N-하이드록시설포석신이미드 (NHS) 설포-NHS 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
구체적으로 살펴보면, 티타늄 옥사이드 나노입자를 제1 용매에 분산시킨 후, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 첨가하여 얻은 표면이 하기 화학식 1로 개질된 티타늄 옥사이드 나노입자를 제1 용매 및 커플링 시약 존재 하에 이탈기(leaving group)가 도입된 폴리사카라이드와 반응시켜 음파감작용 조성물을 제조할 수 있다.
상기 커플링 시약을 이용한 커플링 반응은 일반적으로 알려진 커플링 반응법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 제 4 양태는, 포유류에 상기 음파감작용 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류 내의 암을 치료 또는 전이를 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제 5 양태는, 포유류에 상기 음파감작용 조성물을 유효량으로 투여한 후, 초음파에 노출시켜 음파감작용 조성물을 활성화시켜 암 세포를 사멸하는 과정을 포함하는 포유류 내의 암을 치료 또는 전이를 억제시키는 방법을 제공한다.
상기 음파감작용 조성물은 정맥주사로 투여될 수 있다.
상기 음파는 주파수가 0.2 내지 10 MHz의 초음파일 수 있고, 1 내지 50 W/cm2의 세기로 조사될 수 있다.
상기 암 치료 또는 전이를 억제하는 것은 음파감작용 조성물의 투여에 반응하여 발생된 활성산소에 의해 암 세포가 사멸되는 것일 수 있다.
상기 포유류는 인간을 제외한 포유류인 것을 특징으로 한다.
상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 뇌종양, 피부암, 갑상선암, 피부 흑색종, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 및 골수암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
음향 역학 치료의 원리는 신체 내부에 존재하는 종양을 외부에서 치료하는 것으로 초음파쇄석술을 연상하면 되고, 음파감작용 조성물을 주입한 후 일정 시간이 지난 다음 외부에서 종양부위에 초음파를 조사하면 초음파가 종양 포에 축적된 음파감작용 조성물과 작용해 선택적으로 종양세포를 제거하게 된다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
실시예 1
(1) 단계 1: Dopamin-TiO2 나노입자 제조
티타늄 옥사이드(TiO2, anatase) 10 mg을 5 ml의 포름아미드(formamide)에 분산 시킨 후, 100 ㎕의 도파민 용액(Dopamin, 1.92 μM)을 천천히 첨가하고 6시간 상온에서 교반시켰다. 합성된 Dopamin-TiO2 나노입자를 포름아미드 용액으로 13,000 rpm에서 3번 세척하였다. 최종적으로 Dopamin-TiO2 나노입자를 formaide 10 ml에 분산시켰다.
(2) 단계 2: 카복실 메틸 텍스트란이 도입된 Dopamin-TiO2 나노입자의 제조
Dopamin-TiO2 나노입자에 생체적합성 물질인 카복실 메틸 텍스트란(carboxymethyl dextran, CMD) 을 도입하였다.
200 mg의 CMD를 20 ml의 포름아미드에 분산 시키고 76.7 mg의 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC) 와 57.5 mg 의 N-hydroxysulfosuccinimide(NHS)를 첨가한 후 상온에서 12 시간 교반 후 2 ml의 Dopamin-TiO2 나노입자를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 10 시간 교반 후, 0.1 M NaOH 용액을 첨가하고 sodium borate buffer(pH 8.6, 4 ℃) 와 증류수(상온)에서 50 KDa 멤브래인으로 48 시간 정제하였다. 정제 후 초음파 분쇄기를 적용하였다. 그 후, 0.8 μm 필터 하고 동결 건조하였다.
실험예 1: CMD-TiO 2 나노입자의 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 CMD-TiO2 나노입자를 FT-IR, UV, ICP, 동적 산란장치를 통해 분석하였다.
substance CMD-TiO2
크기(nm) 198.3 ± 6.34
제타 전위(mV) -15.8
티타늄 함량(%) 13.0
그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 나노입자는 198 nm의 크기를 가지며, 15.8 mv의 표면전하를 가지는 것으로 확인되었고, 전체 나노입자가 포함하는 titanium의 양은 13 wt %로 나타나는 것으로 확인되었다.
실험예 2: 투과 전자현미경(TEM)
제조된 CMD-TiO2 나노입자의 모폴로지 확인을 위해 투과 전자현미경(TEM)을 통해 관찰한 결과, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 티타늄 입자 표면에 유기물이 도포 되어 있음이 확인되었다.
실험예 3: 생체내 안정성 검증
제조된 CMD-TiO2 나노입자의 생체내 안정성을 검증하기 위해 안정성 테스트를 실시한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 친수성이 도입된 CMD-TiO2 나노입자는 PBS(pH 7.4) 상에서 수일 이상 안정한 형태로 존재하는 것이 확인되었다. 이에 반해, 친수성이 도입되지 않은 Titanium 나노입자는 하루 이내에 불안정한 상태가 되는 것이 확인되었다. 또한, CMD-TiO2 나노입자는 50 % 면역 혈청이 존재하는 수용액 상에서도 안정한 형태의 크기를 유지하는 것이 확인되었다.
실험예 4: 세포 독성 평가
생체적합성을 가지는 CMD-TiO2 나노입자의 세포 독성을 확인하기 위해, MTT 분석과 FACS 분석을 실시한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CMD-TiO2 나노입자는 10, 25 50, 100, 200 μg/ml의 농도에서 암세포인 SCC7과 정상세포인 NIH3T3에서 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 또한, FACS 분석에서 또한 100 ㎍/ml의 농도에서 암세포와 정상세포에서 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
실험예 5: 활성 산소 방출 평가
초고강도 직접 초음파에 반응하여 CMD-TiO2 나노입자에서 활성산소종이 발생하는 것을 형광 정량을 통해 확인하기 위해, 0.5, 1, 2 M의 CMD-TiO2 나노입자에 초음파 자극을 주었을 때 나오는 활성 산소종을 singlet oxygen detection dye를 통해 검출 한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 물질의 농도에 비례하여 활성 산소종이 방출되는 것을 확인하였다.
실험예 6: 종양 축적 거동 평가
생체적합성을 가지는 CMD-TiO2 나노입자의 생체 내 거동을 SCC7 암세포가 주사된 종양 마우스 모델을 통해 확인 확인하기 위해, 5 mg/kg의 CMD-TiO2 나노입자를 종양 마우스 모델의 정맥을 통하여 주입한 후, 동물용 형광 이미징 장비를 통해 관찰한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, CMD-TiO2 나노입자는 주입 후 1 시간부터 종양 부위에 축적되기 시작하여 12 시간에 최대로 축적되고 24 시간 이후 까지 암 부위에 축적 되어있는 것이 확인되었고, 24 시간 이후 종양 마우스 모델을 희생 시켜 나노입자의 장기 분포를 관찰한 결과, 나노입자가 간, 폐, 비장, 신장, 심장에 비해 종양 부위에 현저히 많이 축적된 것을 확인하였다.
실험예 7: in vivo 활성 산소종 방출 평가
CMD-TiO2 나노입자가 종양 부위에 최대로 축적되는 12 시간에 종양 부위의 피부를 절개하고 종양 표면을 관찰한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 나노입자가 암 혈관에서 주변 조직으로 침투되어 있는 현상이 확인되었고, Cryo-TEM 장비를 통해 종양 조직을 관찰한 결과, 나노입자가 세포 핵 부근에 존재 하는 것이 확인되었다.
초고강도 직접 초음파에 반응하여 CMD-TiO2 나노입자에서 활성산소종이 발생하는 것을 In vivo test를 통해 확인하였고, CMD-TiO2 나노입자를 정맥 주사한 후 종양 부위에 singlet oxygen detection dye을 주입한 후 초음파 처리를 한 결과, 활성 산소종이 초음파 처리한 종양 조직에서만 방출되는 것이 확인되었다. 활성 산소종이 초음파 처리한 종양에서 대조군에 비해 25 이상 방출 되는 것을 정량 분석을 통해 확인하였다.
실험예 8: 종양 치료 효과
초음파에 의해 CMD-TiO2 나노입자에서 나오는 활성 산소종에 의해 종양 마우스 모델에서 치료 효과를 확인하기 위해, 티타늄 농도별로 CMD-TiO2 나노입자를 정맥주사하고 초고강도 직접 초음파 적용을 5 회 수행하여 치료효과를 관찰한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 티타늄 농도 0.5 mg/kg부터 종양치료 효과가 나타났으며, 5 mg/kg에서는 종양의 크기가 거의 증가하지 않은 것이 확인되었다.
실험예 9: 종양 치료 따른 종양 조직 분석
치료된 조직을 H&E 분석법을 통해 조직 검사한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 티타늄 농도 5 mg/kg의 CMD-TiO2 나노입자를 주입하고 초음파 처리한 종양 조직에서 많은 괴사가 관찰되었다.
실험예 10: 종양 치료 따른 주요 장기 조직 분석
치료된 마우스를 희생시켜 주요 장기 독성을 확인하기 위해, 티타늄 농도 0.5 mg/kg의 CMD-TiO2 나노입자를 정맥주사하고 초고강도 직접 초음파 적용을 5 차례 한 후 주요 장기의 관찰 한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 독성이 관찰되지 않음이 확인되었다.
실험예 11: 면역 반응 활성 액상 인자 검출여부 확인
티타늄 농도 5 mg/kg의 CMD-TiO2 나노입자를 주입하고 초음파 적용을 5 회 수행하였고, 종양 조직에 대한 면역반응을 CMD-TiO2 나노입자를 주입하고 초음파 처리한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 혈청 상에서 면역 반응을 일으키는 활성 액성 인자가 대조군과 비슷하게 검출되었으나, 종양 조직에서는 현저하게 많은 활성 액성 인자가 CMD-TiO2 나노입자를 주입한 후, 초음파 처리한 군에서 검출되었다.
실험예 12: 종양 치료 따른 종양 조직 혈관 붕괴여부 확인
티타늄 농도 5 mg/kg의 CMD-TiO2 나노입자를 주입하고 초음파 처리한 결과 종양 조직의 혈관이 붕괴되는 것을 확인한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 3 차례 적용 했을 때부터 종양 조직의 혈관이 붕괴되는 것을 관찰 하였고, 5 차례 적용부터 혈관이 완전히 붕괴되어 있는 것을 확인하였다.
실험예 13: 종양 축적 거동 평가
간 종양 모델에 CMD-TiO2 나노입자를 주입하고 생체 내 나노입자의 축적 거동을 확인한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 간 종양 부위에 CMD-TiO2 나노입자가 효과적으로 축적되는 거동이 확인되었고, 마우스를 희생한 후 간 부위를 관찰한 결과 CMD-TiO2 나노입자가 종양 부위에만 축적되어 있는 것이 확인되었다.
실험예 14: 종양 치료 효과 확인
간 종양 모델에서 CMD-TiO2 나노입자에 대한 치료 효과를 확인하기 위해, CMD-TiO2 나노입자를 정맥주사하고 초고강도 직접 초음파 적용을 2 차례 수행하여 치료 효과를 관찰하였다. 그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 치료하지 않은 대조군에 비해 치료 처리를 2 차례 한 군에서 종양이 거의 자라지 않은 것을 확인하였다.
실험예 15: 암 전이 여부 평가
간 종양 모델 치료 후 마우스를 희생 시켜 암의 전이 여부를 확인하기 위해, CMD-TiO2 나노입자를 정맥주사하고 초고강도 직접 초음파 적용을 2 차례 한 후 주요 장기를 관찰한 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 암의 전이가 일어나지 않았음을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 카르복시메틸덱스트란이 결합된 도파민으로 표면이 개질된 산화티타늄 나노입자를 유효성분으로 함유하는 음파감작용(sonosensitizer) 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 산화티타늄 나노입자는 도파민에 의해 환원된 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 0.2 내지 10 MHz의 파장의 초음파에 대해 음파감작 활성을 보이는 것인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 제타전위가 음전하인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 티타늄 함량이 나노입자 총 중량에 대하여, 1 내지 50 중량%인 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 입자 크기가 10 내지 500 nm인 조성물.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 음파감작용 조성물은 암세포에 특이적으로 작용하는 것인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 뇌종양, 피부암, 갑상선암, 피부 흑색종, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 및 골수암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 음파감작용 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 인간을 제외한 포유류에 제 1 항, 제 4 항, 제 6 항 내지 제 9 항, 및 제 11 항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 음파감작용 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류 내의 암 치료 또는 암 전이 억제 방법.
  18. 인간을 제외한 포유류에 제 1 항, 제 4 항, 제 6 항 내지 제 9 항, 및 제 11 항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 음파감작용 조성물을 유효량으로 투여한 후, 초음파에 노출시켜 음파감작용 조성물을 활성화시켜 암 세포를 사멸하는 과정을 포함하는 포유류 내의 암 치료 또는 암 전이 억제 방법.
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