CN109432450B - 一种超分子纳米化学动力药物及其在肿瘤治疗方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超分子纳米化学动力药物及其在肿瘤治疗方面的应用。本发明利用LDHs层板厚度及尺寸可控，层板金属元素可调变的性质，通过甲酰胺抑制的办法，得到了厚度在0.9nm左右的单层LDHs纳米片。由于二维材料特殊的物理化学性质，所制备得到的LDHs纳米片具有极高的表面活性，在肿瘤微环境中可高效转化生成具有治疗效果的物质，实现对肿瘤部位的特异性治疗，同时表现出对生物酶的有效负载，进一步提升治疗效果。此外，该LDHs纳米片还具有优异的磁共振成像性能，可以作为肿瘤诊断药物使用。

Description

一种超分子纳米化学动力药物及其在肿瘤治疗方面的应用

技术领域

本发明属于肿瘤药物技术领域，特别涉及一种用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物及其制备方法。

背景技术

癌症是威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。传统的癌症治疗方法主要有手术切除，放射疗法，化学疗法等方法，虽然已经得到临床应用，但是它们仍然存在较多缺陷，比如手术治疗精确度不高，放疗和化疗对正常组织伤害较大。为了进一步降低毒副作用，实现更为特异性的癌症治疗，人们对肿瘤微环境进行了深入研究，发现在肿瘤组织中细胞代谢，生物合成中间体以及生理环境均与正常组织有显著区别，比如，在肿瘤微环境中，谷胱甘肽和过氧化氢呈现过表达的状态；肿瘤微环境中的pH与正常组织相比，表现出偏弱酸性的趋势。利用这些差异性，人们开发了新型的化学动力疗法，它是以肿瘤微环境中特有物质为反应底物，设计化学反应过程，通过在肿瘤微环境中生成具有杀伤效果的产物，以此达到癌症治疗的目的。化学动力疗法技术是一种副作用极低的新兴治疗技术。该技术利用肿瘤微环境中原位的催化反应，直接对肿瘤部位进行治疗，而在正常组织中，由于缺少可反应的底物，不会进一步生成具有杀伤效果的产物，因此具有极高的治疗效率和几乎可以忽略的副作用。其具体优势如下：(1)治疗更具有针对性，由于反应条件的限制，只在肿瘤部位产生治疗效果。(2)对正常组织副作用小，区别于肿瘤微环境，正常组织环境中无法实现反应的正常进行，不会生成有毒有害物质，具有较高的生物安全性。(3)作用方式简便，药物剂型简单，可以用单一材料实现治疗目的，不仅方便药动、药代的研究，还能减少使用的复杂性，利于患者在没有专业医护人员在场的情况下也能够接受及时的治疗。

基于肿瘤微环境的化学动力中，其催化作用的反应试剂是关键因素。常见的化学动力疗法主要利用肿瘤微环境中过表达的过氧化氢，谷胱甘肽，以含铁、钴等变价金属元素的材料作为催化剂，产生氧气或羟基自由基对癌细胞进行杀伤。常见的化学动力疗法试剂有含亚铁离子的纳米粒子，比如氧化铁纳米颗粒。它在肿瘤环境偏酸性的条件下，可以催化类芬顿反应，将过氧化氢转化成羟基自由基，而在正常组织环境下，只能将过氧化氢转化成没有毒性的水和氧气。然而金属纳米粒子本身生物代谢差，在血液循环的过程中特异性较差，具有一定的生物安全问题；此外，由于铁离子与亚铁离子之间极低的氧化还原电位，含亚铁离子的纳米颗粒会经历过早的生物氧化过程，导致治疗效果降低，同时，在过氧化氢过表达的非癌症部位也极易诱发严重的毒副作用，对正常组织造成伤害。

基于上述问题，为了进一步将化学动力疗法应用于肿瘤治疗中，研究者不断开发新型的化学动力疗法试剂。水滑石(LDHs)即层状双金属氢氧化物，是由带正电的主体层板与带负电的层间阴离子构成。主体层板主要是通过二价和三价金属氢氧化物，以共价键构成，并且金属元素可调变，层板厚度和晶粒尺寸可控；层间均匀分布带负电的阴离子，可通过离子交换等方式实现。LDHs的特殊结构，决定了其主体层板可通过改变金属离子种类，实现层板的功能多样性，并且可以调控层板厚度，构筑单层LDHs纳米片，最大限度提升其表面活性位点以及反应空位，使其在催化反应中具有最高的活性。同时，利用层板上丰富的正电荷，可以将LDHs作为载体，实现对酶、药物的高效负载，进一步对层板进行功能强化。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物及其制备方法。基于水滑石类层状化合物的特殊结构和诸多可调控的功能，本发明提出以水滑石为主体，通过调控主体层板金属组成以及厚度，将功能性离子钴和铁引入层板，赋予层板类芬顿催化剂的性能，并且在其表面负载生物酶，尤其是葡萄糖氧化酶，通过消耗肿瘤微环境中的葡萄糖产生过氧化氢，改善传统化学动力疗法中反应物不足的缺点，利用LDHs将其高效转化为羟基自由基，实现在肿瘤微环境下的特异性治疗目的。

所述的超分子纳米化学动力药物是由单层钴铁LDHs纳米片负载生物活性酶而成。

所述生物活性酶是葡萄糖氧化酶。

所述的超分子纳米化学动力药物的制备方法为：采用双滴合成法将钴离子和铁离子引入LDHs层板中，同时在反应过程中加入甲酰胺，抑制LDHs在Z轴方向上的生长得到单层钴铁LDHs纳米片，再进一步负载生物活性酶。

所述单层钴铁LDHs纳米片的具体制备方法包括以下步骤：

1)将可溶钴盐、可溶铁盐按照摩尔比2:1-4:1称量，并溶于去离子水中，在氮气保护下搅拌完全溶解得到钴离子、铁离子的总浓度为10～30mM的钴铁无机盐水溶液；

2)配制NaOH溶液，钴离子和铁离子总量与NaOH的摩尔比范围为1：2-4；配制NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液，甲酰胺与蒸馏水的体积比范围为1：2-4；

3)将上述钴铁无机盐水溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液中，保持pH值范围9-10，在油浴60-80℃条件下反应，反应完成后使用去离子水与乙醇的混合液离心洗涤，再使用去离子水清洗离心得到单层钴铁LDHs纳米片，加入去离子水配制成单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液。

所述的可溶钴盐为硝酸钴、氯化钴或硫酸钴，可溶铁盐为硝酸铁、氯化铁或硫酸铁。

所述的负载生物活性酶的方法为：在避光室温条件下将生物活性酶水溶液与单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液混合搅拌，反应完成后使用去离子水与乙醇的混合液离心洗涤，最后使用去离子离心洗涤得到超分子纳米化学动力药物。

上述超分子纳米化学动力药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

上述超分子纳米化学动力药物在制备磁共振成像剂中的应用。

将葡萄糖氧化酶替换为其他种类具有生物活性的酶，并调整酶与LDHs的比例，制得不同比例的超分子纳米药物，并测试其最终性能。将上述制备的用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物用于对癌细胞抑制作用的测试，过程如下：上述制备的LDH生物酶复合物用量0.1～20μg/ml，将其与不同类型的肿瘤细胞共同培养，通过加入过氧化氢以及调节pH等方法模拟肿瘤微环境，观察其对肿瘤细胞生长的抑制作用，同时改变二价金属与三价金属的比例并且对比无生物酶负载的LDHs纳米片，观察其最终性能差异。

本发明利用LDHs主体层板金属种类与层板厚度可调控特点，将钴和铁引入到LDHs层板中，构筑厚度约0.9nm的单层钴铁LDHs纳米片。将其用于化学动力治疗，具有如下优势：

(1)独特的单层二维结构使LDHs纳米材料表面具有较多的空位和缺陷，利于反应底物的吸附，提升在肿瘤微环境中的反应速率。

(2)水滑石基质具有极高的生物相容性，在血液循环过程中，可以很好的在肿瘤部位积累，并且一定时间后，发生自降解，以离子形式排出体外，在保证治疗效果的同时，保障了生物安全性。

(3)LDHs纳米材料本身作为载体，可实现药物以及酶的高效负载，利用纳米材料本身的EPR效应，既可以保证其在溶剂中以胶体形式稳定存在，又保证了其潜在的协同治疗性能。

此外，本发明的用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物制备方法简单，易于操作，实现了对癌细胞的抑制作用，并且适用于多种癌细胞。本发明以LDHs单层纳米片为主体，独特的单层二维结构使其表面具有较多的空位和缺陷，使反应速率得到极大提升，能够在肿瘤微环境中高效产生具有治疗功能的物质，实现肿瘤治疗的目的；采用本发明的用于癌症治疗的超分子纳米化学动力药物应用于对肿瘤细胞的抑制，肿瘤治疗的性能得到显著提升。

附图说明

图1是实施例3制备的LDHs纳米片的透射电镜图及晶格条纹。

图2是实施例3制备的LDHs纳米片的原子力显微镜检测图。

图3是实施例3制备的LDHs纳米片的动态光散射粒径分布图。

图4是实施例3制备的LDHs纳米片在加入反应底物过氧化氢的情况下，进行的反应速率计算。

图5是Hela细胞在经过实施例5制备的超分子纳米化学动力药物处理后，进行的细胞存活率的统计图。

图6是Hela细胞分别经过实施例3、5制备的LDHs纳米片和超分子纳米化学动力药物的处理，进行Pi和Ca染色图。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明提供的一种用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物及其制备方法进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1：

1.将Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O按照摩尔比2：1称量，并溶于10ml去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述二者完全溶解，形成稳定均匀溶液，钴离子、铁离子的总浓度为20mM；

2.配制1mM的NaOH溶液，充分溶解备用，钴离子和铁离子总量与NaOH的摩尔比范围为1：2；配制NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液10ml，甲酰胺与蒸馏水的体积比为3：7，NaNO₃浓度为2mM。

3.将上述Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO₃甲酰胺混合水溶液中，保持pH为9-10，在油浴80℃条件下，敞口空气中进行机械搅拌10分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到单层钴铁LDHs纳米片，加入去离子水配制成单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液。

实施例2：

1.将Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O按照摩尔比3：1称量，并溶于10ml去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述二者完全溶解，形成稳定均匀溶液，钴离子、铁离子的总浓度为20mM；

2.配制1mM的NaOH溶液，充分溶解备用，钴离子和铁离子总量与NaOH的摩尔比范围为1：2；配制NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液10ml，甲酰胺与蒸馏水的体积比为3：7，NaNO₃浓度为2mM。

3.将上述Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO₃甲酰胺混合水溶液中，保持pH为9-10，在油浴80℃条件下，敞口空气中进行机械搅拌10分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到单层钴铁LDHs纳米片，加入去离子水配制成单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液。

实施例3：

1.将Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O按照摩尔比4：1称量，并溶于10ml去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述二者完全溶解，形成稳定均匀溶液，钴离子、铁离子的总浓度为20mM；

2.配制1mM的NaOH溶液，充分溶解备用，钴离子和铁离子总量与NaOH的摩尔比范围为1：2；配制NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液10ml，甲酰胺与蒸馏水的体积比为3：7，NaNO₃浓度为2mM。

3.将上述Co(NO₃)₂·6H₂O，Fe(NO₃)₃·9H₂O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO₃甲酰胺混合水溶液中，保持pH为9-10，在油浴80℃条件下，敞口空气中进行机械搅拌10分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到单层钴铁LDHs纳米片，加入去离子水配制成单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液。

实施例4：

配制浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶水溶液，搅拌至形成稳定溶液，然后与实施例3制得的单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液混合，葡萄糖氧化酶与单层钴铁LDHs纳米片质量比为0.5:1，加入机械搅拌，控制搅拌速度为200r/min，在避光室温条件下反应24小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到超分子纳米化学动力药物。

实施例5：

配制浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶水溶液，搅拌至形成稳定溶液，然后与实施例3制得的单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液混合，葡萄糖氧化酶与单层钴铁LDHs纳米片质量比为1:1，加入机械搅拌，控制搅拌速度为200r/min，在避光室温条件下反应24小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到超分子纳米化学动力药物。

实施例6：

配制浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶水溶液，搅拌至形成稳定溶液，然后与实施例3制得的单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液混合，葡萄糖氧化酶与单层钴铁LDHs纳米片质量比为2:1，加入机械搅拌，控制搅拌速度为200r/min，在避光室温条件下反应24小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次得到超分子纳米化学动力药物。

对实施例1～3中所得的单层LDHs纳米片进行性能测试，性能最好为实施例3，如图4所示，将钴铁比例优选为4:1，故对实施例3进行形貌结构表征。

本发明公开了一种用于肿瘤治疗的超分子纳米化学动力药物及其制备方法。利用LDHs层板厚度及尺寸可控，层板金属元素可调变的性质，通过甲酰胺抑制的办法，得到了厚度在0.9nm左右的单层LDHs纳米片。由于二维材料特殊的物理化学性质，所制备得到的LDHs纳米片具有极高的表面活性，在肿瘤微环境中可高效转化生成具有治疗效果的物质，实现对肿瘤部位的特异性治疗，同时表现出对生物酶的有效负载，进一步提升治疗效果。此外，该LDHs纳米片还具有优异的磁共振成像性能，可以作为肿瘤诊断药物使用。

上面结合实施例对本发明的实例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出的各种变化，也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种超分子纳米化学动力药物的制备方法，其特征在于，采用双滴合成法将钴离子和铁离子引入LDHs层板中，同时在反应过程中加入甲酰胺，抑制LDHs在Z轴方向上的生长得到单层钴铁LDHs纳米片，再进一步负载生物活性酶；

所述单层钴铁LDHs纳米片的具体制备方法包括以下步骤：

1）将可溶钴盐、可溶铁盐按照摩尔比2:1-4:1称量，并溶于去离子水中，在氮气保护下搅拌完全溶解得到钴离子、铁离子的总浓度为 10~30 mM的钴铁无机盐水溶液；

2）配制NaOH溶液，钴离子和铁离子总量与NaOH的摩尔比范围为1：2-4；配制NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液，甲酰胺与蒸馏水的体积比范围为1：2-4；

3）将上述钴铁无机盐水溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO₃和甲酰胺的混合水溶液中，保持pH值范围9-10，在油浴60-80℃条件下反应，反应完成后使用去离子水与乙醇的混合液离心洗涤，再使用去离子水清洗离心得到单层钴铁LDHs纳米片，加入去离子水配制成单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液；

所述负载生物活性酶的方法为：在避光室温条件下将生物活性酶水溶液与单层钴铁LDHs纳米片胶体溶液混合搅拌，反应完成后使用去离子水与乙醇的混合液离心洗涤，最后使用去离子离心洗涤得到超分子纳米化学动力药物；

所述生物活性酶是葡萄糖氧化酶。

2.根据权利要求1所述的超分子纳米化学动力药物的制备方法，其特征在于，所述的可溶钴盐为硝酸钴、氯化钴或硫酸钴，可溶铁盐为硝酸铁、氯化铁或硫酸铁。

3.根据权利要求1或2所述的方法制备得到的超分子纳米化学动力药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的方法制备得到的超分子纳米化学动力药物在制备磁共振成像剂中的应用。

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