CN107242996B - 一种用于肿瘤治疗的凝胶材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤治疗的凝胶材料及其制备方法，凝胶材料由微观有机‑无机杂化纳米凝胶载体，以及担载在所述微观有机‑无机杂化纳米凝胶载体上的生物酶组分组成，微观有机‑无机杂化纳米凝胶载体包括无机纳米颗粒内核，以及复合在所述无机纳米颗粒内核表面的有机凝胶层，其中，有机凝胶层由成胶因子在无机纳米颗粒内核表面沉积自组装而成，成胶因子为带芳香族取代基的Fmoc‑或Nap‑功能小分子多肽。与现有技术相比，本发明通过采用微观有机‑无机杂化纳米凝胶载体生物酶的装载和固定化提供天然保护，并在肿瘤部位葡萄糖响应特性和肿瘤等病变部位活性氧组分响应性发生高效、串联的酶催化反应，产生单线态氧，实现高效、安全的治疗。

Description

一种用于肿瘤治疗的凝胶材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用纳米生物材料技术领域，尤其是涉及一种用于肿瘤治疗的凝胶材料及其制备方法。
背景技术
近年来，我国恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，严重危害到人类的健康。当前肿瘤的主要治疗方法即为创伤性外科手术和化疗，目前的效果往往不仅未能有效抑制癌症死亡率，其长期治疗的毒副作用还会造成患者机体功能急剧下降，导致医源性、药源性疾病激增，治疗本身造成患者新的身心创伤甚至残疾。怎样实现更加安全、有效的肿瘤治疗已成为一项重大的社会问题，也是材料、化学、生物、临床、工程等多学科科研工作者们所共同面对的亟待突破的难题。
近年来，研究人员逐渐认识到，肿瘤与细胞外基质(ECM)、血管、结缔组织以及其环境中的免疫细胞，即肿瘤微环境(TME)紧密相关，直接关系着肿瘤的生长、侵袭和转移行为。基于与正常组织的差异对生物体微环境进行研究，如不同的血管异常、氧化状态、pH值和代谢状态等，已然成为提出相应最优治疗策略的先决条件。这些特异性变化在生物机制研究、药物筛选及许多疾病，尤其是肿瘤的诊断和治疗发挥着关键作用。
活性氧组分(ROS)是所有生物系统微环境中氧代谢的活性衍生物，也是免疫系统应对感染、刺激或损伤的第一响应，与许多疾病，包括癌症、炎症反应、动脉粥样硬化、哮喘和囊性纤维化等密切相关。一般主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧自由基(·O2 -)、羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)以及过氧自由基(ROO˙)和次氯酸/次氯酸根离子(HOCl/-OCl)等。生物医学和纳米技术的研究开发出一系列纳米探针和载体材料去响应性检测异常高水平的ROS，最终实现病变组织部位的响应性治疗研究。首先，在成像检测方面，由于H2O2组分较高的稳定性和含量(可达50-100μM)成为探针设计的最主要基础成分。奥塔哥大学的Winterbourn教授和加利福利亚大学的Chang CJ教授(Winterbourn,C.C.,Reconcilingthe chemistry and biology of reactive oxygen species.Nat Chem Biol 2008,4,278-286)、长春应化所谢志刚教授(Chen,X.Q.；Wang,F.；Hyun,J.Y.；Wei,T.W.；Qiang,J.；Ren,X.T.；Shin,I.；Yoon,J.,Recent progress in the development of fluorescent,luminescent and colorimetric probes for detection of reactive oxygen andnitrogen species.Chem Soc Rev 2016,45,2976-3016.)、韩国梨花女子大学JuyoungYoon和Injae Shin教授(Miller,E.W.；Tulyanthan,O.；Isacoff,E.Y.；Chang,C.J.,Molecular imaging of hydrogen peroxide produced for cell signaling.Nat ChemBiol 2007,3,263-267.)等研究者课题组基于H2O2诱导硼化物价键氧化降解的机理(Phenylboronate-to-phenol Transformation)，设计硼化物共轭的荧光素与H2O2反应断开，导致荧光素发光行为或聚集状态发生变化，最终成功实现生物体病变部位响应性荧光检测；其次，在响应性治疗方面，北卡罗莱纳大学教堂山分校Guzheng教授(Hu,X.；Yu,J.；Qian,C.；Lu,Y.；Kahkoska,A.R.；Xie,Z.；Jing,X.；Buse,J.B.；Gu,Z.,H2O2-responsivevesicles integrated with transcutaneous patches for glucose-mediated insulindelivery.ACS Nano 2017,11,613-620.)、南京大学郭子健教授课题组(Chen,H.C.；Tian,J.W.；He,W.J.；Guo,Z.J.,H2O2-activatable and O2-evolving nanoparticles forhighly efficient and selective photodynamic therapy against Hypoxic tumorcells.J Am Chem Soc 2015,137,1539-1547.)、清华大学许华平教授、乔治亚理工学院夏幼南教授(Shim,M.S.；Xia,Y.N.,A reactive oxygen species(ROS)-responsive polymerfor safe,efficient,and targeted gene delivery in cancer cells.Angew Chem IntEdit 2013,52,6926-6929.)等课题组主要集中研究通过病变部位富集的高水平ROS诱导载体材料中硼酸基、硫醚类及硒类等功能化分子发生氧化水解反应，实现材料直接解离或亲疏水状态变化导致的解组装，实现治疗性药物、蛋白及基因的释放而达到响应性治疗效果，或利用H2O2增强氧含量而响应性增强光动力学(PDT)治疗研究。由于ROS本身特殊的病理信息指示特性，国内外研究者对其响应性体系的设计、制备及其性能研究进行了广泛研究。此外，针对肿瘤的养分葡萄糖设计制备肿瘤治疗的材料也是成为研究的热点。最近，美国NIH的陈小元教授课题组(Wenpei Fan,Nan Lu,Peng Huang,Yi Liu,Zhen Yang,Sheng Wang,Guocan Yu,Yijing Liu,Junkai Hu,Qianjun He,Junle Qu,Tianfu Wang,XiaoyuanChen.Glucose-Responsive Sequential Generation of Hydrogen Peroxide and NitricOxide for Synergistic Cancer Starving-Like/Gas Therapy.Angew Chem Int Edit2016,DOI:10.1002/anie.201610682.)利用空心介孔二氧化硅材料装载葡萄糖氧化酶，利用材料在肿瘤部位消耗葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢，切断肿瘤赖以生长的能量供应，达到“饿死”肿瘤的目的。由于药物载体本身限制和微环境成分的不稳定性，其体内循环过程中担载药物的泄漏及到达靶向区的响应性释放不完全仍然是限制体内响应性治疗的关键因素。因此，开发新的诊疗体系实现更加安全和高效的病变微环境响应性检测治疗是肿瘤诊疗研究的迫切需要。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于肿瘤治疗的凝胶材料及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种用于肿瘤治疗的凝胶材料，由微观有机-无机杂化纳米凝胶载体，以及担载在所述微观有机-无机杂化纳米凝胶载体上的生物酶组分组成，所述的微观有机-无机杂化纳米凝胶载体包括无机纳米颗粒内核，以及复合在所述无机纳米颗粒内核表面的有机凝胶层，其中，所述的有机凝胶层由成胶因子在无机纳米颗粒内核表面沉积自组装而成，所述的成胶因子为N-(9-芴甲氧羰酰基)(Fmoc-)或萘环基团(Nap-)功能化的小分子多肽(由2～4个氨基酸分子构成，分子量一般在180～480道尔顿)。
作为优选的实施方案，所述的生物酶组分为超氧岐化酶和/或葡萄糖氧化酶，与过氧化物酶的复合，其中，所述的过氧化物酶选自过氧化氢酶、氯过氧化物酶、矾过氧化物酶或髓过氧化物酶。
作为优选的实施方案，所述的无机纳米颗粒内核选自介孔氧化硅、超顺磁四氧化三铁、金纳米棒或氧化钼。分别通过溶胶-凝胶法、高温热解法、种子生长法和湿化学法等制备粒径及表面特性可控的介孔氧化硅、超顺磁四氧化三铁、金纳米棒及氧化钼MoOx等无机纳米颗粒。
用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取无机纳米颗粒内核分散于溶剂中，加入改性剂，改性处理，使无机纳米颗粒内核表面带有乙烯基、氨基、羧基或巯基，得到改性纳米颗粒内核；
(2)取改性纳米颗粒内核，加入酸性磷酸酶，在EDC和NHS的催化反应下发生酰胺反应，最终表面接枝酸性磷酸酶，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核；
(3)将步骤(2)制得的负载酸性磷酸酶的纳米内核加入带磷酸根功能化的Fmoc-或Nap-功能小分子多肽溶液中，超声分散，即得到纳米凝胶溶液；
(4)再取步骤(3)制得的纳米凝胶溶液分散于缓冲溶液中，加入生物酶组分，置于黑暗环境下搅拌，即得到目的产物。
作为优选的实施方案，步骤(1)中所述的改性纳米颗粒内核为羧基功能化的纳米颗粒内核；
所述的溶剂为乙醇和去离子水按体积比1:1配置的混合液，所述的改性剂为APTES，
无机纳米颗粒内核、溶剂和改性剂三者的添加量之比为100mg：140-180mL：4-8mL。
作为上述优选的实施方案更优选，所述的改性剂为氨基硅烷、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丁二酸酐和/或巯基PEG，其中，
无机纳米颗粒内核的氨基化改性处理具体为：取无机纳米颗粒内核(优选为MSN，即介孔二氧化硅)分散于溶剂中，加入氨基硅烷APTES，加热搅拌反应，离心收集沉淀物，洗涤，即得到氨基功能化改性纳米颗粒内核，分散于乙醇中备用；
无机纳米颗粒内核的羧基化改性处理具体为：取氨基功能化改性纳米颗粒内核分散于DMF和琥珀酸酐的混合溶液中，再加入三乙胺，搅拌反应，分离产物，洗涤，即得到羧基功能化改性纳米颗粒内核；
无机纳米颗粒内核的乙烯基化改性处理具体为：取氨基功能化改性纳米颗粒内核与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺反应，即得到乙烯基功能化改性纳米颗粒内核；
无机纳米颗粒内核的PEG功能化改性处理具体为：取无机纳米颗粒内核(优选为金纳米棒)与巯基PEG反应，即得到PEG功能化改性无机纳米颗粒内核。
所述的改性处理为羧基化改性处理，其通过以下方法制成：
以100mg无机纳米颗粒内核计，加入APTES后，在N2保护下，于60-80℃加热搅拌反应20-30h，清洗初步反应产物，得到表面氨基化的无机纳米颗粒内核，再分散于100mL DMF中，加入8-12wt％的丁二酸酐，搅拌反应16-20h，清洗，得到表面羧基功能化的纳米颗粒内核，分散于20mL去离子水中，得到羧基化纳米颗粒内核溶液备用；
或通过以下方法制成：
以100mg无机纳米颗粒内核计，分散于150mL异丙醇中，再于70℃下搅拌回流0.5h，待温度稳定后，加入150μL氨基硅烷APTES，混合物在70℃下适度搅拌8小时，离心收集沉淀物，用乙醇洗涤，得到氨基功能化的无机纳米颗粒内核，分散于50mL的乙醇中备用；再将氨基功能化的无机纳米颗粒内核溶液滴加到无水琥珀酸酐的DMF溶液中(50mg无水琥珀酸酐溶于20mL DMF)，搅拌24h，分离得到沉淀物，用乙醇和水洗涤，即得到羧基化纳米颗粒内核，分散于20mL去离子水中备用。
作为上述更优选实施方案的进一步优选，步骤(2)中酸性磷酸酶的接枝为：先采用EDC/NHS活化羧基化纳米颗粒内核溶液，再加入酸性磷酸酶溶液，搅拌反应，即得到负载酸性磷酸酶的纳米内核。此步骤的作用主要为通过EDC/NHS活化表面带有大量羧基的纳米颗粒内核，使其变为活化酯，进而实现酸性磷酸酶的负载。酸性磷酸酶的接枝具体工艺可优选为：以2mL制得的羧基化纳米颗粒内核溶液计，取2mL羧基化纳米颗粒内核溶液超声分散于30-50mL 20mM pH5.8的磷酸盐缓冲液中，加入160-250mg EDC和160-250mg NHS，搅拌反应1-3小时，磁分离，清洗，再分散于16-24mL 0.8-1.2mg/L的酸性磷酸酶溶液中，搅拌反应1-3h，分离，清洗，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核，分散于10mL去离子水中并在4℃保存。
作为上述进一步优选实施方案的更进一步优选，步骤(3)中优选的工艺为：取负载酸性磷酸酶的纳米内核超声分散于浓度0.3-0.7mg/mL的带磷酸根功能化的Fmoc-或Nap-功能小分子多肽溶液中，搅拌，分离除去未反应物质，清洗，得到纳米凝胶，分散于去离子水中备用。此步骤的作用是以负载酸性磷酸酶的纳米内核为核，通过磷酸镁的酶切作用除去带磷酸根功能化的Fmoc-或Nap-功能小分子多肽中的磷酸根，使其由亲水性变为疏水性，然后，除去磷酸根的Fmoc-或Nap-功能小分子多肽因疏水性聚集，然后因为芳香族苯环间的π-πstacking作用在纳米内核上自组装，形成一层具有优良生物特性的小分子凝胶。Fmoc-或Nap-功能小分子多肽可优选为Fmoc-Tyr-OH，其磷酸功能化后为Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH。其中，本发明的Fmoc功能多肽小分子优选通过以下方法制成：向搅拌的Fmoc-lys-OH(368.44mg，1mmol)在水溶液，NaHCO3和THF(8/2,10mL)的混合物中的溶液中加入滴加用四氢呋喃稀释的丙烯酰氯(160μl，1.97mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时，用乙酸乙酯萃取，用HCl洗涤以除去残余的Fmoc-lys-OH，然后用HCl，H2O和饱和氯化钠洗涤，用旋转蒸发器除去溶剂，干燥真空，得到产物，为白色(或无色)固体(Fmoc功能多肽小分子)。Nap功能多肽小分子则优选以下方法制成：6-丙烯酰胺基-2(2-(2-(2-(萘-2-基)乙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基)己酸(NapFFK-丙烯酸)和2-(萘-2-基)通过标准固相肽合成(SPPS)在2-氯三苯甲基氯树脂上首先合成了乙酰-(L)-Phe-(L)-Phe-(L)-Lys(NapFFK)，通过连续偶联Fmoc-保护的L-氨基酸(Nap功能多肽小分子)。
作为上述更进一步优选的更优选，一次胶结构的纳米凝胶还可以酶诱导自由基聚合高分子二次交联即为“一次胶发生二次聚合反应”：
以100mg 10mM N，N-二甲基丙烯酰胺为单体，加入到一次胶中并搅拌2h，在35℃加入20mgNHS和50U漆酶(溶于1ml Tris-HCl中)搅拌，向上述溶液中加入1mg N，N'-双(丙烯酰)胱氨酸交联剂，通过加入水将体积调节至20ml，然后再反应4小时，通过离心最终收集得到酶诱导自由基聚合高分子二次交联的纳米凝胶颗粒，分散于去离子水中备用。
作为上述更进一步优选的更优选，步骤(4)中的工艺优选为：取制备的纳米凝胶溶液(一次胶或二次胶)分散于18-25mM pH 7-8的Tris·HCl缓冲液中，超声分散，再加入生物酶组分，溶解后置于黑暗环境下搅拌18-30h，利用静电吸引方法担载生物酶组分，分离除去未负载的生物酶组分，清洗，即得到目的产物凝胶材料。
或者，直接利用氨基改性或羧基改性的纳米颗粒内核，与生物酶组分上官能团反应，在EDC和NHS的催化反应下发生酰胺反应，最终担载生物酶组分。
本发明设计制备了微观有机-无机杂化纳米凝胶载体，其担载生物酶组分包括多种/串联反应酶，通过在肿瘤部位葡萄糖响应特性和肿瘤等病变部位活性氧组分响应性发生高效、串联的酶催化反应，产生单线态氧，实现高效、安全的治疗。与传统的光动力学治疗、声动力学治疗，该治疗方法也可被认为是一种新型的酶动力学治疗模式。本发明中的微观有机-无机杂化纳米凝胶载体可以为生物酶组分的装载和固定化提供天然保护，实现高效的响应性酶催化反应。
本发明在制备时，利用功能化纳米颗粒内核，经过对成胶因子的酶切反应而造成成胶因子的亲疏水性的转变，再通过芳香族功能化多肽成胶分子之间的π-πstacking、静电吸引以及氢键作用力，在无机组分表面实现成胶分子的亲疏水沉积自组装过程，形成具有优良生物特性的小分子多肽一次胶层结构。在此基础上探索酶诱导自由基聚合高分子二次交联成胶方法(此酶诱导自由基聚合高分子二次交联即为“一次胶发生二次聚合反应”)得到更加稳定的功能性有机-无机杂化纳米凝胶载体。
此外，在凝胶载体上担载超氧岐化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、矾过氧化物酶和髓过氧化物酶等多种串联酶组分，响应性地与肿瘤病变部位的葡萄糖和活性氧组分发生反应，催化葡萄糖生成葡萄酸和双氧水，以及催化活性氧组分产生氧气和双氧水等，经过后续的过氧化物酶(氯过氧化物酶、矾过氧化物酶和髓过氧化物酶)反应双氧水产生具有治疗作用的单线态氧，同时产生具有超声成像作用的氧气等。
本发明的功能纳米颗粒内核包括介孔二氧化硅纳米颗粒、超顺磁四氧化三铁、金纳米棒、氧化钼等，可以分别实现材料多功能的药物担载实现化疗、磁共振成像实现多模式成像、光声成像实现多模式成像、产生单线态氧实现增强治疗。
本发明的凝胶的制备过程中，无机内核表面诱导成胶方法包括对Fmoc-或Nap-功能小分子多肽的磷酸化修饰，利用磷酸酶响应性剪切作用，实现功能多肽分子从亲水态转变为疏水态，即从溶解状态到聚集态，利用静电作用在无机内核表面沉积成一次胶层结构。
本发明可以通过调节实验参数控制微观凝胶的分散性(通过控制纳米内核的大小、分散性，成胶因子的浓度，成胶反应温度、pH值调节，保证纳米凝胶在水溶液中的稳定性，避免表面电荷或纳米凝胶之间交联的影响，控制微观凝胶的分散性)，通过静脉注射后体内循环达到肿瘤等病变部位，响应性与活性氧组分酶催化产生氧气气泡和双氧水组分，进一步通过过氧化物酶等与双氧水反应产生具有治疗作用的单线态氧，实现酶新型动力学治疗的同时实现响应性肿瘤超声成像。
本发明通过工艺的条件，保证纳米凝胶层的可控制备及其高稳定性，实现功能生物酶分子的高效担载和高的酶催化反应，最终实现高效的治疗。
本发明的凝胶体系材料在体内循环中担载的生物酶分子的泄露，不会对生物体产生任何毒性；在肿瘤等病变部位则会通过凝胶层的高效物质传递作用，担载的生物酶分子与外界的ROS组分响应性发生酶催化反应，产生具体治疗作用的单线态氧组分，实现高效、安全的肿瘤治疗效果。
与现有技术相比，本发明的凝胶基质载体可以为生物酶组分的装载和固定化提供天然保护，实现高效的响应性酶催化反应。本发明的响应性酶诱导治疗，不仅包括响应性与葡萄糖反应和响应性与活性氧组分酶催化产生单线态氧实现酶诱导治疗，还包括产生氧气气泡实现酶诱导超声成像和功能无机纳米内核产生的磁共振成像、光声成像，以及担载药物分子产生的化疗治疗。
附图说明
图1为担载超氧岐化酶(SOD)-氯过氧化物酶(CPO)的功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料体系制备示意流程图。
图2-1为功能性有机-无机杂化纳米凝胶无机内核及凝胶的扫描照片。
图2-2为功能性有机-无机杂化纳米凝胶无机内核及凝胶的透射电镜照片。
图3-1为SOD-CPO自由酶的EPR图谱。
图3-2为功能性有机-无机杂化纳米凝胶的EPR图谱。
图4为功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料与荧光探针DPBF作用后的荧光光谱。
图5为功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料与HepG2人肝癌细胞共培养后细胞毒性CCK8实验。
图6-1为功能性有机-无机杂化纳米凝胶与HepG2人肝癌细胞共培养加入DCFH-DA单线态氧探针后的激光共聚焦CLSM图片。
图6-2为功能性有机-无机杂化纳米凝胶与HepG2人肝癌细胞共培养加入DCFH-DA单线态氧探针后的流式细胞结构分析。
图7-1为功能性有机-无机杂化纳米凝胶注入VX2肝肿瘤负载的新西兰大白兔模型后响应性增强超声成像结果。
图7-2为功能性有机-无机杂化纳米凝胶注入VX2肝肿瘤负载的新西兰大白兔模型后响应性增强的的灰度值数据图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中，介孔氧化硅、超顺磁四氧化三铁、金纳米棒或氧化钼的制备方法优选如下：
分别以有机硅源正硅酸乙酯、表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵及碱性催化剂三乙醇胺，采用溶胶-凝胶法制备粒径可控的介孔氧化硅SiO2(L.Pan,Q.He,J.Liu,Y.Chen,M.Ma,L.Zhang and J.Shi,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,5722–5725)；以高温热解法，以乙酰丙酮铁为原料，通过控制反应介质如十二烷基二醇、油酸、油胺等的比例和回流温度与时间等实验参数合成6-20nm的疏水性超顺磁四氧化三铁Fe3O4纳米粒子(Sun,S.H.；Zeng,H.；Robinson,D.B.；Raoux,S.；Rice,P.M.；Wang,S.X.；Li,G.X.Monodisperse MFe2O4(M＝Fe,Co,Mn)Nanoparticles.J.Am.Chem.Soc.2004,126,273–279.)；采用经典的种子生长法以氯金酸为金源、硼氢化钠为还原剂调节反应pH及温度等参数合成粒径20-50nm金纳米棒AuNRs(Zhenjiang Zhang,Liming Wang,Jing Wang,Xiumei Jiang,Xiaohui Li,Zhijian Hu,Yinglu Ji,Xiaochun Wu,and Chunying Chen Mesoporous Silica-Coated GoldNanorods as a Light-Mediated Multifunctional Theranostic Platform for CancerTreatment Adv.Mater.2012,24,1418–1423)；以钼酸铵为原料，通过控制后续酸溶解、水热及煅烧过程的参数最后得到粒径100-300nm的氧化钼MoOx无机纳米颗粒(Le Xin Song,Mang Wang,Shu Zhen Pan,Jun Yang,Jie Chen and Jing Yang.Molybdenum oxidenanoparticles:preparation,characterization,and application in heterogeneouscatalysis,J.Mater.Chem.,2011,21,7982-7989)。
如图1所示的制备示意流程，首先采用传统的热解法制备四氧化三铁纳米内核(MNPs)，氨基化后与丁二酸酐反应得到羧基化的四氧化三铁MNPs-COOH，通过EDC/NHS活化再将酸性磷酸酶(AP)接枝在其表面。以MNPs@AP作为核，通过磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。最后将得到的纳米凝胶溶液分散于Tris·HCl缓冲液中，担载SOD和CPO，得到担载超氧岐化酶(SOD)-氯过氧化物酶(CPO)的功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料体系。
实施例1
一种担载超氧岐化酶(SOD)-氯过氧化物酶(CPO)的功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料体系，具体按照以下步骤：
(1)采用传统的热解法制备四氧化三铁纳米内核(MNPs)100mg，分散在80mL乙醇和80mL去离子水的混合液中，超声分散30min，加入6mL APTES，70℃加热搅拌下反应24h，并通入N2。反应完成后，分别用乙醇和去离子水清洗几次，得到的颗粒为表面氨基化的四氧化三铁，即MNPs-APTES。接着将所得到的MNPs-APTES分散在100mL的DMF中，加入10％的丁二酸酐，搅拌反应18h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三铁MNPs-COOH，将MNPs-COOH分散在20mL去离子水中备用，最终实现纳米内核羧基功能化。
(2)经过上述修饰，表面带有大量的羧基，可先通过EDC/NHS活化再将酸性磷酸酶(AP)接枝在其表面。取2mL上述的MNPs-COOH超声分散于40mL 20mM pH 5.8的磷酸盐缓冲液中，加入200mg EDC和200mg NHS，搅拌反应2小时，将MNPs-COOH表面羧基活化变为活化酯，磁分离，清洗三次之后得到的纳米颗粒再分散于20mL的酸性磷酸酶溶液中(1mg/ml)，搅拌反应2h。磁分离得到MNPs@AP纳米粒子，去离子水清洗三次，除去表面吸附的AP，清洗后的MNPs@AP分散于10mL去离子水中保存在4℃，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核。
(3)以MNPs@AP作为核，通过磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。将上述离心得到的MNPs@AP分散于100mL的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶液中，浓度为0.5mg/mL，超声分散后，搅拌一定时间，自组装完成后磁分离除去未反应的物质，去离子水清洗三次得到纳米凝胶，将纳米凝胶分散在150mL去离子水中备用，得到表面诱导的一次胶结构。
(4)取2mL所制备的纳米凝胶溶液分散于8mL 20mM pH 7.4的Tris·HCl缓冲液中，超声分散，再加入1mg SOD和0.2mL CPO，溶解后置于黑暗环境下搅拌24h。磁分离除去未负载的SOD和CPO，并用去离子水清洗纳米凝胶表面吸附的SOD和CPO，上清液和清洗液都收集起来，通过Bradford和紫外分光光度法分别测定SOD和CPO的未负载量，从而得到纳米凝胶中的SOD和CPO的量，实现生物酶组分的担载过程。
图2-1和图2-2分别为上述制得的功能性有机-无机杂化纳米凝胶无机内核及凝胶的扫描照片及透射电镜照片。从图中可以看出，纳米凝胶形貌呈球形，表面光滑，单分散性好，粒径大约为180nm，而MNPs形貌不是很规则，表面粗糙有颗粒感，粒径大约40nm，很容易团聚，而在表面组装小分子凝胶后表现出了很好的单分散性。TEM图也能清晰地的看到纳米凝胶的核壳结构，中心是黑色的MNPs颗粒，外面一层灰色的凝胶层，具有很明显的核壳结构，凝胶层厚度在干燥状态下大约是10nm，说明利用酶诱导表面自组装的方式能有效的制备出小分子纳米凝胶，使小分子凝胶由宏观走向微观，也为小分子凝胶的应用开辟了新的方向。
取实施例1制得的功能性有机-无机杂化纳米凝胶进行电子顺磁共振测试，测定单线态氧1O2的产生，将200μL SOD-CPO自由酶溶液和功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料溶液(其CPO浓度与自由CPO溶液浓度相同)与捕捉剂2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMP)混合均匀，再加入50μL NaCl(1M)，最后加入50μL H2O2(50mM)，调整溶液体积到500μL后迅速转移到TEOL电子顺磁共振仪(JESFA200)中测试。图3-1和图3-2分别显示了SOD-CPO自由酶和功能性有机-无机杂化纳米凝胶(nanogel@SOD/CPO)的EPR图谱，可以发现，图谱中均产生了单线态氧的1:1:1三重特征峰信号，这说明功能性有机-无机杂化纳米凝胶材料可以产生单线态氧实现后续的治疗。
以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为荧光探针，DPBF是已知活性最高的单线态氧捕获剂之一。单线态氧会进攻DPBF结构中的呋喃环，使之打开，导致其在447nm处的荧光强度降低，通过测定DPBF的荧光强度变化可以测定单线态氧。在比色皿中加入100μL NaCl(1M)，100μL H2O2(50mM)，20μL DPBF和含有等量CPO的nanogel@SOD/CPO和自由SOD/CPO，调整体积至1mL，置于荧光分光光度计中，在λex＝403nm，λem＝447nm的条件下测量体系的荧光强度变化。从图4中可以看出，随着时间的随着时间的延长，荧光强度不断减弱，也证实了nanogel@SOD/CPO中的单线态氧的不断产生。
取实施例1制得的功能性有机-无机杂化纳米凝胶与HepG2人肝癌细胞共培养后测定细胞毒性CCK8实验。实验中，以HepG2为细胞模型，在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱中预培养24h(37℃，5％CO2)。向培养板中加入10μL不同的待测物质未担载生物酶组分的纳米凝胶(nanogel)和功能性有机-无机杂化纳米凝胶(nanogel@SOD/CPO)，再将培养板在培养箱孵育48h。然后向每孔中加入10μL CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4h。最后用酶标仪测定450nm处的吸光度值，计算细胞的存活率，其结果如图5所示。从图中可以看出，在凝胶材料体系浓度达到291μg/mL，材料对肿瘤细胞产生了极大的杀伤作用，而未负载生物酶组分的纳米凝胶在共培养浓度达到1000μg/mL也未产生明显的毒性作用(细胞存活率90％左右)。这也从体外验证了材料的响应性酶诱导单线态氧的治疗效果。
取实施例1制得的功能性有机-无机杂化纳米凝胶与HepG2人肝癌细胞共培养后，以DCFH-DA作为探针检测加入材料之后的ROS的变化情况。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM/L。设定细胞浓度为5×105/ml,分别接种在共聚焦皿或六孔板内，待细胞贴壁后，分别加入PBS和功能性有机-无机杂化纳米凝胶。共聚焦下采用白光定位细胞，设定反应时间为30min，每间隔3min进行一次激光扫描。当加入DCFH-DA探针时设定为0min，以后实时观察荧光强度。图6-1和图6-2分别为其激光共聚焦CLSM图片和流式细胞结构分析。可以发现，随着材料浓度的增大以及共培养时间的延长，细胞的绿色荧光不断增强，这也显示出材料经过响应性反应后，产生了单线态氧组分，同时增强了细胞内部的ROS水平，而这又可以进一步增强治疗作用单线态氧的生成，这也是该酶动力学治疗模式高效性的一个重要原因。最终选定18min为反应平衡状态进行流式细胞仪检测，其结果也与荧光的照片相对应。
图7-1和图7-2分别示出实施例1制成的功能性有机-无机杂化纳米凝胶注入VX2肝肿瘤负载的新西兰大白兔模型后响应性增强超声成像结果及相应的灰度值数据图。采用IU-22(探头5-12MHz,Philips,France)研究nanogel和nanogel@SOD/CPO的体内超声成像效果。定量研究所采集的图像，通过人为限定一个相同大小的区域(ROI)，通过计算得到ROI中“平均灰度值”的大小来评价。从图中也可以看出，nanogel@SOD/CPO材料中的酶组分发生酶动力学治疗的同时，响应性产生氧气增强超声成像效果，最终实现了响应性增强成像引导下的增效酶动力学治疗。
实施例2
(1)采用传统的热解法制备四氧化三铁纳米内核(MNPs)100mg，分散在70mL乙醇和70mL去离子水的混合液中，超声分散20min，加入4mL APTES，60℃加热搅拌下反应20h，并通入N2。反应完成后，分别用乙醇和去离子水清洗几次，得到的颗粒为表面氨基化的四氧化三铁，即MNPs-APTES。接着将所得到的MNPs-APTES分散在100mL的DMF中，加入8％的丁二酸酐，搅拌反应16h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三铁MNPs-COOH，将MNPs-COOH分散在20mL去离子水中备用，最终实现纳米内核羧基功能化。
(2)经过上述修饰，表面带有大量的羧基，可先通过EDC/NHS活化再将酸性磷酸酶(AP)接枝在其表面。取2mL上述的MNPs-COOH超声分散于30mL 20mM pH 5.8的磷酸盐缓冲液中，加入160mg EDC和160mg NHS，搅拌反应1小时，将MNPs-COOH表面羧基活化变为活化酯，磁分离，清洗三次之后得到的纳米颗粒再分散于16mL的酸性磷酸酶溶液中(0.8mg/ml)，搅拌反应1h。磁分离得到MNPs@AP纳米粒子，去离子水清洗三次，除去表面吸附的AP，清洗后的MNPs@AP分散于10mL去离子水中保存在4℃，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核。
(3)以MNPs@AP作为核，通过磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。取上述离心得到MNPs@AP分散于100mL的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶液中，浓度为0.3mg/mL，超声分散后，搅拌一定时间，自组装完成后磁分离除去未反应的物质，去离子水清洗三次得到纳米凝胶，将纳米凝胶分散在150mL去离子水中备用，得到表面诱导的一次胶结构。
(4)取2mL所制备的纳米凝胶溶液分散于8mL 18mM pH 7.4的Tris·HCl缓冲液中，超声分散，再加入0.8mg SOD和0.1mL CPO，溶解后置于黑暗环境下搅拌18h。磁分离除去未负载的SOD和CPO，并用去离子水清洗纳米凝胶表面吸附的SOD和CPO，上清液和清洗液都收集起来，通过Bradford和紫外分光光度法分别测定SOD和CPO的未负载量，从而得到纳米凝胶中的SOD和CPO的量，实现生物酶组分的担载过程。
实施例3
(1)采用传统的热解法制备四氧化三铁纳米内核(MNPs)100mg，分散在90mL乙醇和90mL去离子水的混合液中，超声分散30min，加入8mL APTES，80℃加热搅拌下反应30h，并通入N2。反应完成后，分别用乙醇和去离子水清洗几次，得到的颗粒为表面氨基化的四氧化三铁，即MNPs-APTES。接着将所得到的MNPs-APTES分散在100mL的DMF中，加入12％的丁二酸酐，搅拌反应18h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三铁MNPs-COOH，将MNPs-COOH分散在20mL去离子水中备用，最终实现纳米内核羧基功能化。
(2)经过上述修饰，表面带有大量的羧基，可先通过EDC/NHS活化再将酸性磷酸酶(AP)接枝在其表面。取2mL上述的MNPs-COOH超声分散于50mL 20mM pH 5.8的磷酸盐缓冲液中，加入250mg EDC和250mg NHS，搅拌反应3小时，将MNPs-COOH表面羧基活化变为活化酯，磁分离，清洗三次之后得到的纳米颗粒再分散于24mL的酸性磷酸酶溶液中(1.2mg/ml)，搅拌反应3h。磁分离得到MNPs@AP纳米粒子，去离子水清洗三次，除去表面吸附的AP，清洗后的MNPs@AP分散于10mL去离子水中保存在4℃，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核。
(3)以MNPs@AP作为核，通过磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。取上述离心得到MNPs@AP分散于100mL的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶液中，浓度为0.7mg/mL，超声分散后，搅拌一定时间，自组装完成后磁分离除去未反应的物质，去离子水清洗三次得到纳米凝胶，将纳米凝胶分散在150mL去离子水中备用，得到表面诱导的一次胶结构。
(4)取2mL所制备的纳米凝胶溶液分散于8mL 25mM pH 7.4的Tris·HCl缓冲液中，超声分散，再加入1.2mgSOD和0.3mL CPO，溶解后置于黑暗环境下搅拌30h。磁分离除去未负载的SOD和CPO，并用去离子水清洗纳米凝胶表面吸附的SOD和CPO，上清液和清洗液都收集起来，通过Bradford和紫外分光光度法分别测定SOD和CPO的未负载量，从而得到纳米凝胶中的SOD和CPO的量，实现生物酶组分的担载过程。
实施例4
(1)采用传统的热解法制备四氧化三铁纳米内核(MNPs)100mg，分散在75mL乙醇和75mL去离子水的混合液中，超声分散30min，加入7mL APTES，75℃加热搅拌下反应22h，并通入N2。反应完成后，分别用乙醇和去离子水清洗几次，得到的颗粒为表面氨基化的四氧化三铁，即MNPs-APTES。接着将所得到的MNPs-APTES分散在100mL的DMF中，加入11％的丁二酸酐，搅拌反应20h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三铁MNPs-COOH，将MNPs-COOH分散在20mL去离子水中备用，最终实现纳米内核羧基功能化。
(2)经过上述修饰，表面带有大量的羧基，可先通过EDC/NHS活化再将酸性磷酸酶(AP)接枝在其表面。取2mL上述的MNPs-COOH超声分散于35mL 20mM pH 5.8的磷酸盐缓冲液中，加入180mg EDC和180mg NHS，搅拌反应2.5小时，将MNPs-COOH表面羧基活化变为活化酯，磁分离，清洗三次之后得到的纳米颗粒再分散于20mL的酸性磷酸酶溶液中(1.2mg/ml)，搅拌反应2.5h。磁分离得到MNPs@AP纳米粒子，去离子水清洗三次，除去表面吸附的AP，清洗后的MNPs@AP分散于10mL去离子水中保存在4℃，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核。
(3)以MNPs@AP作为核，通过磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。取上述离心得到的MNPs@AP分散于100mL的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶液中，浓度为0.6mg/mL，超声分散后，搅拌一定时间，自组装完成后磁分离除去未反应的物质，去离子水清洗三次得到纳米凝胶，将纳米凝胶分散在150mL去离子水中备用，得到表面诱导的一次胶结构。
(4)取2mL所制备的纳米凝胶溶液分散于8mL 20mM pH 7.4的Tris·HCl缓冲液中，超声分散，再加入0.9mg SOD和0.25mL CPO，溶解后置于黑暗环境下搅拌24h。磁分离除去未负载的SOD和CPO，并用去离子水清洗纳米凝胶表面吸附的SOD和CPO，上清液和清洗液都收集起来，通过Bradford和紫外分光光度法分别测定SOD和CPO的未负载量，从而得到纳米凝胶中的SOD和CPO的量，实现生物酶组分的担载过程。
实施例5
与实施例1相比，绝大部分都一样，除了步骤(3)制得了表面诱导的一次胶结构后，再经过以下处理得到二次胶，然后，再以二次胶作为生物酶组分的载体：
以100mg N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)(≈10mM)为单体，加入到一次胶中并搅拌2h，在35℃加入20mgNHS和50U漆酶(溶于1ml Tris-HCl中)搅拌，向上述溶液中加入1mg N，N'-双(丙烯酰)胱氨酸(BAC)交联剂，通过加入水将体积调节至20ml。然后再反应4小时。通过离心最终收集得到酶诱导自由基聚合高分子二次交联的纳米凝胶颗粒。
实施例6
与实施例1相比，绝大部分都一样，除了步骤(3)中所采用的功能多肽小分子为Nap功能多肽小分子，其由6-丙烯酰胺基-2(2-(2-(2-(萘-2-基)乙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基)己酸(NapFFK-丙烯酸)和2-(萘-2-基)通过标准固相肽合成(SPPS)。在2-氯三苯甲基氯树脂上首先合成了乙酰-(L)-Phe-(L)-Phe-(L)-Lys(NapFFK)，通过连续偶联Fmoc-保护的L-氨基酸。
实施例7
与实施例1相比，绝大部分都一样，除了步骤(1)中的羧基化通过以下方法制成：
以100mgMSN(介孔二氧化硅)计，分散于150mL异丙醇中，再于70℃下搅拌回流0.5h，待温度稳定后，加入150μL氨基硅烷APTES，混合物在70℃下适度搅拌8小时，离心收集沉淀物，用乙醇洗涤，得到氨基功能化的MSN(介孔二氧化硅)，分散于50mL的乙醇中备用；再将氨基功能化的无机纳米颗粒内核溶液滴加到无水琥珀酸酐的DMF溶液中(50mg无水琥珀酸酐溶于20mL DMF)，搅拌24h，分离得到沉淀物，用乙醇和水洗涤，即得到羧基化纳米颗粒内核，分散于20mL去离子水中备用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于肿瘤治疗的凝胶材料，其特征在于，由微观有机-无机杂化纳米凝胶载体，以及担载在所述微观有机-无机杂化纳米凝胶载体上的生物酶组分组成，所述的微观有机-无机杂化纳米凝胶载体包括无机纳米颗粒内核，以及复合在所述无机纳米颗粒内核表面的有机凝胶层，其中，所述的有机凝胶层由成胶因子在无机纳米颗粒内核表面沉积自组装而成；
所述的生物酶组分为超氧岐化酶与过氧化物酶的复合，其中，所述的过氧化物酶选自过氧化氢酶、氯过氧化物酶、矾过氧化物酶或髓过氧化物酶；
所述的成胶因子为Fmoc-Tyr-OH。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料，其特征在于，所述的无机纳米颗粒内核选自介孔氧化硅、超顺磁四氧化三铁、金纳米棒或氧化钼。
3.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取无机纳米颗粒内核分散于溶剂中，加入改性剂，改性处理，使无机纳米颗粒内核表面带有羧基，得到改性纳米颗粒内核；
（2）在改性纳米颗粒内核表面接枝酸性磷酸酶，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核；
（3）将步骤（2）制得的负载酸性磷酸酶的纳米内核加入带磷酸根功能化的成胶因子溶液中，超声分散，即得到纳米凝胶溶液；
（4）再取步骤（3）制得的纳米凝胶溶液分散于缓冲溶液中，加入生物酶组分，置于黑暗环境下搅拌，即得到目的产物。
4.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的改性纳米颗粒内核为羧基功能化的纳米颗粒内核；
所述的溶剂为乙醇和去离子水按体积比1:1配置的混合液，所述的改性剂为APTES，
无机纳米颗粒内核、溶剂和改性剂三者的添加量之比为100mg：140-180mL：4-8mL。
5.根据权利要求4所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，羧基化改性处理通过以下方法制成：
以100mg无机纳米颗粒内核计，加入APTES后，在N2保护下，于60-80℃加热搅拌反应20-30h，清洗初步反应产物，得到表面氨基化的无机纳米颗粒内核，再分散于100mL DMF中，加入8-12wt%的丁二酸酐，搅拌反应16-20h，清洗，得到表面羧基功能化的纳米颗粒内核，分散于20mL去离子水中，得到羧基化纳米颗粒内核溶液备用；
或通过以下方法制成：
以100mg无机纳米颗粒内核计，分散于150mL异丙醇中，再于70℃下搅拌回流0.5h，待温度稳定后，加入150μL氨基硅烷APTES，混合物在70℃下适度搅拌8小时，离心收集沉淀物，用乙醇洗涤，得到氨基功能化的无机纳米颗粒内核，分散于50mL 的乙醇中备用；再将氨基功能化的无机纳米颗粒内核溶液滴加到20mL含50mg无水琥珀酸酐的DMF溶液中，搅拌24h，分离得到沉淀物，用乙醇和水洗涤，即得到羧基化纳米颗粒内核，分散于20mL去离子水中备用。
6.根据权利要求5所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中酸性磷酸酶的接枝具体为：
以2mL制得的羧基化纳米颗粒内核溶液计，取2mL羧基化纳米颗粒内核溶液超声分散于30-50mL 20mM pH5.8的磷酸盐缓冲液中，加入160-250 mg EDC和160-250 mg NHS，搅拌反应1-3小时，磁分离，清洗，再分散于16-24mL 0.8-1.2mg/L的酸性磷酸酶溶液中，搅拌反应1-3h，分离，清洗，得到负载酸性磷酸酶的纳米内核，分散于10 mL去离子水中并在4℃保存。
7.根据权利要求6所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，取负载酸性磷酸酶的纳米内核超声分散于浓度0.3-0.7mg/mL的带磷酸根功能化的成胶因子溶液中，搅拌，分离除去未反应物质，清洗，得到表面诱导的一次胶结构的纳米凝胶，分散于去离子水中备用。
8.根据权利要求7所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，一次胶结构的纳米凝胶还通过酶诱导自由基聚合高分子二次交联，具体为：
以100mg 10mM N，N-二甲基丙烯酰胺为单体，加入到一次胶中并搅拌2h，在35℃加入20mgNHS和50U漆酶搅拌，向上述溶液中加入1mg N，N'-双（丙烯酰）胱氨酸交联剂，通过加入水将体积调节至20ml，然后再反应4小时，通过离心最终收集得到酶诱导自由基聚合高分子二次交联的纳米凝胶颗粒，分散于去离子水中备用。
9.根据权利要求7或8所述的一种用于肿瘤治疗的凝胶材料的制备方法，其特征在于，取制得的纳米凝胶溶液分散于18-25mM pH 7.4的Tris • HCl缓冲液中，超声分散，再加入生物酶组分，溶解后置于黑暗环境下搅拌18-30h，分离除去未负载的生物酶组分，清洗，即得到目的产物凝胶材料。
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