CN108143718A - 一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用，所述抗肿瘤纳米基因药物包括两亲性阳离子聚合物、酸响应功能分子和小干扰RNA，所述酸响应功能分子与两亲性阳离子聚合物偶联，所述小干扰RNA通过静电吸附附着于两亲性阳离子聚合物表面；本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物生物相容性好，毒副作用低，具有酸性pH响应性和电荷翻转特性，生物利用度高，在制备抗肿瘤药物或制备治疗血管正常化药物中具有广阔的应用前景和较高的应用价值。

Description

一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，涉及一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用。
背景技术
血管作为实体瘤微环境的重要组成成分。自1971年，哈佛大学的Judah Folkman教授指出实体瘤内部血管的生成对于其生长与发生远端转移的重要性，并提出阻断肿瘤内部血管科使得肿瘤组织严重缺氧以及营养缺失，进而导致肿瘤坏死。大量的科学家开始研究肿瘤血管的生成机制、靶标的筛选以及血管阻断药物的研发。据研究报道，超过40种分子参与到肿瘤血管生成过程，已有10种靶向血管内皮生长因子及其受体的药物被报道。然而这些药物的临床实验结果显示，无论是单独使用又或是联合化疗，效果并不理想，仅能将肿瘤患者的生存期延长一定的时间。综上所述，血管抑制剂并未实现实际意义上的靶向治疗，目前急需针对不同肿瘤模型中血管的结构和功能特征设计相应的血管靶向药物。
利用干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的特异高效降低目的基因的表达水平，可以干扰目的蛋白的表达以达到治疗目的。但是siRNA易被核酸酶降解，分子量大的特点，限制了其在体内的稳定输运，以及被细胞高效的摄取。大量功能性纳米材料以及病毒载体的出现，使得输运siRNA成为可能，他们能克服生物体内多重屏障。脂质体和聚合物等纳米材料制备简单、成本低且安全性高，通过精确调控纳米材料的理化性质以及与核酸分子的相互作用，可以大幅提高核酸分子内体输运的稳定性、靶向性和被细胞内吞效率，解决了纳米基因药物研发中的许多问题。
纳米药物是新兴的药物剂型，通过设计和调控有机或无机材料的纳米特性，制备结构稳定、功能多样和生物相容性好的纳米载体，可显著延长药物半衰期、提高靶向性、降低用药剂量并实现联合用药。聚乙烯亚胺作为一类枝状或线状的阳离子聚合物，可高效吸附带负电的核酸分子进入细胞，进而通过“质子海绵”效应实现溶酶体逃逸，进入细胞质中发挥作用达到干扰基因的作用。
此外，研究表明，恶性肿瘤组织的pH环境为微酸性，肿瘤部位pH值在6.5-7.2之间。因此，为了减少药物对于正常组织细胞的毒副作用，期望能够得到一种pH响应性纳米基因药物，其在体内运输过程中可以稳定存在，而当到达肿瘤部位时可以实现电荷翻转促进内吞以达到治疗肿瘤目的。
CN106890343A公开了一种具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物，其由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤的靶向抗体构成，具有一定的靶向治疗效果，但是此纳米基因载体复合物不具有pH响应性，并且局限于抗体靶向，有一定的局限性；CN104940949A公开了一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用，包括两亲性抗肿瘤多肽和酸响应性功能分子，但是此纳米药物不具有靶向性，并且仅仅是以多肽为载体，限制了应用。
因此，如何开发一种新型纳米基因药物，对于肿瘤部位的靶向，尤其是对血管正常化的治疗具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗肿瘤纳米基因药物，所述抗肿瘤纳米基因药物包括两亲性阳离子聚合物、酸响应功能分子和小干扰RNA，所述酸响应功能分子与两亲性阳离子聚合物偶联，所述小干扰RNA通过静电吸附附着于两亲性阳离子聚合物表面。
本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物克服了肿瘤基因治疗体内输运效率低的瓶颈，是一种具有肿瘤部位弱酸环境响应性、生物相容性好、稳定性强、安全性高、生物利用度高和良好抗肿瘤效果的抗肿瘤纳米基因药物。
目前存在的具有抗肿瘤性的核酸分子大多数是通过阳离子聚合物纳米载体在体内实现输运的，但是其体内细胞毒性比较大，易与血液中负电荷的蛋白以及各种酶通过静电相互作用结合，使得其在血液中不能稳定存在并且对主要脏器有毒性作用，因此，相比于现有技术，本发明对阳离子聚合物纳米载体进行改造，将两亲性阳离子聚合物胶束和酸响应分子相结合，改造成两亲性抗肿瘤酸响应基因载体，而后通过静电吸附治疗性核酸siRNA(小干扰RNA)得到的抗肿瘤纳米基因药物，相容性好，稳定，也提高了对肿瘤部位的靶向性以及肿瘤血管治疗核酸分子的生物利用度，另外，由于该药物中含有酸响应性功能分子使得所述纳米药物具有酸响应性，以在肿瘤微环境pH值为酸性的条件下，达到较好的治疗效果。
本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物，相比于现有方法，本发明中的pH响应性阳离子聚合物纳米药物，显著提高了阳离子聚合物在体内运输核酸分子的稳定性，提高了核酸分子体内转染的效率，同时降低了其在体内应用的生物毒性。就结果来看，抗肿瘤纳米基因药物不仅显著改善原位肿瘤血管正常化，进而改善药物瘤内递送效率，同时该药物还能明显抑制肿瘤发生远端转移。
此外，本发明将抗肿瘤纳米基因药物制备成阳离子聚合物纳米胶束，使得阳离子聚合物纳米胶束载带核酸效率高，肿瘤富集作用强，具有靶向性，此外，将其制备成酸响应纳米颗粒还可以使得其在生理pH条件下表面电荷为负电状态，提高了抗肿瘤核酸分子在体内的稳定性。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物为聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物PEI-(PLGA)2。
在本发明中，两亲性阳离子聚合物载体种的亲水性聚合物末端连接有氨基，其纳米胶束的合成通过纳米沉淀法实现。
在本发明中，由于PEI在生物体内的毒性很高，与PLGA偶联的PEI，不仅保持了PEI的转染特性，同时还提高了其在体内的稳定性和毒副作用。
优选地，所述酸响应功能分子通过酰胺键偶联至两亲性阳离子聚合物上。
优选地，所述酸响应功能分子通过与聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乙烯亚胺的末端氨基和/或侧链氨基形成酰胺键而偶联至聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物上。
优选地，所述酸响应功能分子为酸酐类有机分子。
优选地，所述酸响应功能分子带有与氨基反应的官能团。
优选地，所述酸响应功能分子为2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)。
在本发明中，酸响应性功能分子是指在一定酸性环境下的刺激下具有发生某种反应的能力的分子，例如，2,3-二甲基马来酸酐分子在酸性环境下可以被质子化。
在本发明中，由于阳离子聚合物PEI-(PLGA)2为富正电荷，通过设计和修饰DMMA使PEI-(PLGA)2具有微酸性pH响应性。两亲性聚合物在水溶液中倾向于将其亲水部分暴露在外层与水分子形成交界面，疏水部分则聚集于内。在中性环境中，聚合物分子主要通过疏水作用和氢键的物理相互作用力，自组装形成纳米颗粒；在微酸性环境中，酸响应分子DMMA被质子化，被水解从阳离子聚合物胶束表面脱落，使得其表面电荷实现电荷翻转，表面电荷呈现正电荷，携带治疗性核酸分子被肿瘤及血管内皮细胞内吞，核酸分子进一步在细胞内发挥功能。该方法可使抗肿瘤纳米基因药物在生理环境中保持稳定，延长其在生物体内的半衰期，纳米颗粒在微酸性的肿瘤微环境中特异性响应实现表面电荷的翻转，呈正电，通过静电作用促进被细胞内吞，在细胞内进一步发挥小干扰RNA功能敲低目的蛋白的表达，发挥抗肿瘤作用。
优选地，所述酸响应功能分子进行酸响应的pH值小于6.8，例如可以是1、2、3、4.2、5.5、6.1、6.4、6.6或6.8。
在本发明中，酸响应的弱酸性pH值是相对于人体内正常组织内的pH值而言的，人体正常组织的pH值为7.4，而肿瘤部位的pH值为6.5-7.2，因此相对于人体正常组织来说，肿瘤组织部位的pH环境为弱酸性。
酸响应性功能分子在pH值为6.5-7.2时，可以被质子化，导致酸响应分子DMMA从自组装纳米颗粒表面脱落，实现纳米粒子表面电荷翻转。
由于肿瘤部位的pH值为弱酸性环境即(6.5-7.2)，该药物在pH值为6.5-7.2，会使得吸附上siRNA的药物纳米颗粒表面偶联的DMMA随着时间延长，水解脱落，纳米颗粒表面的Zeta电位由负电荷实现电荷翻转变为正电荷，表面为正电荷的纳米颗粒更容易穿越细胞膜，被血管内皮细胞和肿瘤细胞摄取，治疗性核酸分子siRNA在两种细胞内发挥作用，敲低目的蛋白的表达量，从而达到治疗的目的。
本发明中，纳米基因药物的酸响应键是指在微酸pH的环境刺激下具有发生水解能力的酰胺键，例如，PEI上氨基与DMMA通过酰胺键偶联所组成的微酸性响应键可以在微酸pH环境作用下被水解，DMMA从纳米胶束表面脱落。
本发明所述抗肿瘤纳米基因药物中，与阳离子聚合物PEI共价连接的PLGA，形成疏水性内核，PEI形成亲水层暴露在纳米胶束表面通过静电作用吸附负电核酸分子siRNA。在PEI上再通过氨基引入酸响应功能分子，这样可以在肿瘤血管靶向治疗的基因纳米载体上引入多个酸响应功能分子，例如，当亲水性PEI连接DMMA时，通过末端氨基形成酰胺键连接一个酸响应性功能分子，而当PEI不连接DMMA时，可以通过末端正电氨基静电吸附负电核酸分子siRNA。亲水性PEI连接多个酸响应功能分子和吸附负电核酸能够保证纳米载体在生理pH条件下表面电荷呈负电，并使得药物在血液循环中保持稳定，而在肿瘤部位发生酸响应，表面酸响应分子水解掉落，纳米载体表面电荷实现翻转呈正电，更高效的被肿瘤部位细胞摄取。
优选地，所述小干扰RNA为包括19-21(例如可以是19、20或21)个碱基对的双链核糖核酸。
优选地，所述双链核糖核酸为腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤核糖核苷酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述小干扰RNA为核酸分子NgBR siRNA，是一种能敲低血管以及肿瘤细胞中参与血管生成、肿瘤上皮间质转化的功能性蛋白。
在本发明中，纳米药物通过EPR效应可高效的被动靶向和富集于具有高通透性血管和间质高压的肿瘤组织，也可通过偶联主动靶向肽，实现高特异性的主动靶向，也能被设计成具有理化响应性，使药物在肿瘤部位实现定点释放和摄取，肿瘤治疗性核酸分子siRNA能敲低血管以及肿瘤细胞中参与血管生成、肿瘤上皮间质转化过程的功能性蛋白NgBR。
优选地，所述抗肿瘤纳米基因药物的粒径为60-150nm，例如可以是60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。
在本发明中，上述粒径范围内的纳米颗粒稳定，具有肿瘤富集作用，可以提高药物的靶向性以及药物的生物利用度。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗肿瘤纳米基因药物的制备方法，所述方法包括以两亲性阳离子聚合物为原料，自组装形成纳米胶束，而后将酸响应功能分子偶联到纳米胶束上，最后通过静电吸附小干扰RNA得到所述抗肿瘤基因纳米药物。
本发明提供的制备方法，实用性强，制备步骤少，制备简便。
优选地，所述自组装在中性水环境下进行。
优选地，所述自组装在超声的环境下进行。
优选地，所述超声的功率为400-800W，例如可以是400W、450W、500W、550W、600W、650W、700W、750W、780W或800W。
优选地，所述超声的时间为1-5min，例如可以是1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min或5min。
优选地，所述酸响应功能分子在碱性环境或中性环境下偶联到纳米胶束上。
优选地，所述酸响应功能分子在碱性环境下偶联到纳米胶束上。
优选地，所述碱性环境的pH值为8-9，例如可以是8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，进一步优选为8.5。
在本发明中，通过在上述碱性环境下反应，可以使得酸响应功能分子反应更充分，更有利于酸响应功能分子的偶联。
优选地，所述碱性环境由氢氧化钠溶液提供。
优选地，所述静电吸附小干扰RNA在pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中进行。
优选地，所述抗肿瘤纳米基因药物的制备方法包括以下步骤：
(1)将两亲性阳离子聚合物在中性环境下，400-800W超声1-5min自组装得到两亲性阳离子聚合物纳米胶束；
(2)将步骤(1)得到的两亲性阳离子纳米胶束在碱性或中性环境下与酸响应功能分子进行偶联；
(3)将步骤(2)得到的产物在pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液下通过静电作用吸附小干扰RNA得到所述抗肿瘤纳米基因药物。
本发明为采用微乳液法制备纳米胶束，通过富正电的PEI静电吸附治疗性NgBRsiRNA，而后通过PEI上的氨基(包括末端氨基和侧链氨基)连接多个2,3-二甲基马来酸酐功能分子(DMMA)，获得偶联有酸响应性功能分子的两亲性抗肿瘤阳离子聚合物胶束。本发明所述抗肿瘤纳米基因药物的制备过程可以采用如下详细步骤完成：
(1)用于合成PEI-PLGA-DMMA阳离子聚合物纳米胶束的PEI-(PLGA)2，购自诺德派森医药科技有限公司。
(2)用于合成PEI-PLGA-DMMA酸响应阳离子聚合物纳米胶束的酸响应分子DMMA，购自Sigma有限公司。
(3)用于抗肿瘤纳米基因药物的小干扰RNA核酸分子NgBR siRNA，由苏州吉玛基因股份有限公司设计和合成。
(4)取20mg的PEI-(PLGA)2聚合物粉末溶解于800μL二甲基亚砜中，接着加入到4.2mL的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液中，将混合液于功率为600W的超声波清洗仪中超声处理2min。超声完毕后，用1M的氢氧化钠溶液将上述混合液pH调至8.5。随后称取2mg的DMMA，用200μL水溶解，逐滴加入上述混合液中，混合均匀，再用1M的氢氧化钠溶液将pH调至8.5，待pH稳定后，室温搅拌6h，搅拌期间反复检测pH，使之恒定在8.5，随后即得到阳离子聚合物胶束纳米。体系中的二甲基亚砜通过在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中透析18h除去，透析期间换两次液。
(5)将所得到的连接有酸响应性功能分子的两亲性肿瘤血管治疗阳离子聚合物在中性水环境中进行自组装形成纳米胶束体系，再静电吸附治疗核酸分子siRNA即得到所述抗肿瘤纳米基因药物。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗肿瘤纳米基因药物在制备抗肿瘤药物或制备治疗血管正常化药物中的应用。
本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物，相比于应用制备普通的抗肿瘤药物，在制备血管正常化药物中，具有更优良的效果。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物生物相容性好，毒副作用低，具有酸性pH响应性和电荷翻转特性，生物利用度高。
本发明提供的抗肿瘤纳米基因药物以聚合物和小干扰RNA为原料制备而成，具有高度的生物安全性。与裸siRNA比较，在阳离子聚合物上PEI连接多个酸响应性功能分子和吸附负电核酸能够保证纳米载体在生理pH条件下表面电荷呈负电，并使得药物在血液循环中保持稳定，而在肿瘤部位发生酸响应，表面酸响应分子水解掉落，纳米载体表面电荷实现翻转呈正电，更高效的被肿瘤部位细胞摄取。
本发明提供的制备方法简单，制备得到的抗肿瘤纳米基因药物具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中抗肿瘤纳米基因药物的傅里叶红外光谱图。
图2A是本发明实施例1中抗肿瘤纳米基因药物在中性Tris-HCl缓冲液中的电镜形貌图。
图2B是本发明实施例1中抗肿瘤纳米基因药物在中性Tris-HCl缓冲液中的粒径分布图。
图3是本发明实施例3中抗肿瘤纳米基因药物与含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液中作用不同时间后的凝胶阻滞实验结果图。
图4A是本发明实施例4中抗肿瘤纳米基因药物在含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液中作用24h的电镜形貌图。
图4B是本发明实施例4中抗肿瘤纳米基因药物在含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液中作用48h的电镜形貌图。
图5是本发明实施例5中不同N/P抗肿瘤纳米基因药物的凝胶阻滞实验结果图。
图6是本发明实施例6中不同N/P抗肿瘤纳米基因药物的Zeta电位分布图；
图7是本发明实施例7中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行微酸性响应电荷翻转测定的结果图。
图8是本发明实施例8中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行体外NgBR敲低效率的验证。
图9A是本发明实施例9中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行调控肿瘤血管正常化治疗效果的共聚焦显微镜图。
图9B是本发明实施例9中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行调控肿瘤血管正常化治疗效果的血管周皮分布图。
图10A是本发明实施例10中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行抑制肿瘤发生远端转移治疗效果的检测图。
图10B是本发明实施例10中对实施例1制备的抗肿瘤纳米基因药物进行抑制肿瘤发生远端转移治疗效果的肺转移灶面积柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在以下实施例中N/P的含义为聚合物PEI上所含氮原子数与核酸siRNA上所含磷原子数的比值。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法制备抗肿瘤纳米基因药物，所述方法为：
选用(Robert Qing Miao等，PNAS,2006,103(29):10997–11002)提供的能够抑制肿瘤血管生长和EMT进程的Mouse NgBR siRNA双链核酸碱基序列(从5’端开始的序列为：ACAUUAGCGUCACGACCAdTdT，对应的另一条链的序列为：UGGUCGUAGACGCUAAUGUdTdT)作为治疗性小干扰RNA核酸分子，按照文献中报道的成熟的微乳液法制备纳米胶束，通过富正电的PEI静电吸附治疗性NgBR siRNA，而后通过PEI上的氨基(包括末端氨基和侧链氨基)连接多个DMMA，获得偶联有酸响应性功能分子的两亲性抗肿瘤阳离子聚合物胶束。所述合成过程如下：
(1)用于合成PEI-PLGA-DMMA阳离子聚合物纳米胶束的PEI-(PLGA)2,购自诺德派森医药科技有限公司。
(2)用于合成PEI-PLGA-DMMA酸响应阳离子聚合物纳米胶束的酸响应分子DMMA,购自Sigma有限公司
(3)用于抗肿瘤纳米基因药物的治疗性核酸分子NgBR siRNA,由苏州吉玛基因股份有限公司设计和合成
(4)取20mg的PEI-(PLGA)2聚合物粉末溶解于800μL二甲基亚砜中，接着加入到4.2mL的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液中，将混合液于功率为600W的超声波清洗仪中超声处理2min。超声完毕后，用1M的氢氧化钠溶液将上述混合液pH调至8.5。随后称取2mg的DMMA,用200μL水溶解，逐滴加入上述混合液中，混合均匀，再用1M的氢氧化钠溶液将pH调至8.5，待pH稳定后，室温搅拌6h,搅拌期间反复检测pH,使之恒定在8.5，随后即得到阳离子聚合物胶束纳米载体。体系中的二甲基亚砜通过在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中透析18h除去,透析期间换两次液。
(5)收集透析后的纳米胶束体系，在pH 7.4时按照一定比例吸附NgBRsiRNA，随即得到抗肿瘤纳米基因药物。
通过傅里叶红外光谱手段证实了本实施例得到的偶联有DMMA的两亲性阳离子聚合物纳米胶束的结构为：PEI-PLGA-DMMA，如图1所示为酸响应阳离子聚合物载体的傅里叶红外光谱。
由图1的结果分析得酸响应分子DMMA成功偶联在阳离子聚合物纳米胶束上。
利用透射电镜(美国FEI，Tecnai G2 20S-TWIN，200kV)和激光粒度仪(英国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对得到的抗肿瘤纳米基因药物体系进行形态以及粒径表征，如图2A和图2B所示，其中图2A为抗肿瘤纳米基因药物体系的透射电镜图，从图中可以看出，制备得到的抗肿瘤纳米基因药物呈球形，颗粒大小较均一；图2B图为粒径分布图，所得抗肿瘤纳米基因药物的粒径分布为60-150nm，平均粒径约为130nm，分散指数(PDI)为0.083，与电镜图所测得的结果相符合。
实施例2
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在阳离子聚合物纳米胶束PEI-(PLGA)2上偶联酸响应DMMA分子，得到了偶联有DMMA的酸响应阳离子聚合物纳米基因载体。经与实施例1相同的吸附治疗性NgBR siRNA过程得到抗肿瘤纳米基因药物体系。
经过傅里叶红外光谱手段证实了本实施例得到的偶联有DMMA阳离子聚合物纳米胶束的结构为：PEI-PLGA-DMMA。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤纳米基因药物体系进行形态以及粒径表征，结果表明制备得到的肿瘤免疫治疗多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均一，抗肿瘤纳米基因药物的粒径分布为60-150nm，平均粒径约为130nm，分散指数(PDI)为0.083。
实施例3
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒在含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液中对其表面吸附的siRNA的保护作用。
将实施例1中得到的抗肿瘤纳米基因药物体系样品与含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液分别孵育0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h，每个时间点取10μL样品加入预先准备好的琼脂糖凝胶上样孔中，10μL体系中混入对应比例的syber green染料与上样缓冲液，随后在电压100V条件下跑凝胶电泳，大约10min后，将凝胶放置于bio-rad生物成像仪中，选择紫外模式进行成像。如图3所示，与含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液孵育不同时间后，siRNA的含量相比于对照组保持一致，这说明在含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液中，抗肿瘤纳米基因药物很好地对其表面吸附的siRNA进行了保护，没有使得siRNA被血清中的核酸酶很快降解，保证了siRNA在纳米药物体系中的稳定性。
实施例4
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒在体内的结构的完整性和稳定性。
将实施例1中得到的抗肿瘤纳米基因药物体系样品与含10％血清的中性Tris-HCl缓冲液分别孵育24h和48h后，取10μL样品，利用透射电镜对得到的抗肿瘤纳米基因药物体系进行形态表征如图4A(24h)和图4B(48h)所示，结果表明制备得到的抗肿瘤纳米基因药物经10％血清处理后，其形貌仍呈球形，颗粒大小较均一，结构没有明显的破坏，纳米结构能保持完整。
实施例5
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒携带核酸分子siRNA的效率。
将实施例1中得到的阳离子聚合物载体与不同比例的核酸siRNA混合，取不同混合比的10μL样品加入预先准备好的琼脂糖凝胶上样孔中，10μL体系中混入对应比例的sybergreen核酸染料与上样缓冲液，随后在电压100V条件下跑凝胶电泳，大约10min后，将凝胶放置于bio-rad生物成像仪中，选择紫外模式进行成像。如图5所示，与不同比例的核酸siRNA混合后，在N/P为22时，PEI-PLGA-DMMA纳米胶束完全吸附siRNA，随后的实验按N/P＝22为条件进行。
实施例6
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒在不同N/P比条件下，纳米载体表面电位分布情况。
将实施例1中得到的阳离子聚合物载体与不同比例的核酸siRNA混合，并将体系的pH调节至7.4，取不同混合比的800μL样品，利用激光粒度仪对得到的抗肿瘤纳米基因药物体系进行表面电位表征，如图6所示，结果表明制备得到的抗肿瘤纳米基因药物在N/P<24时，其表面电位为负电荷，而在N/P大于等于24时，其表面电位为正电荷。
实施例7
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒在体内对肿瘤微酸性环境的响应性所导致的电荷翻转。
将实施例1中得到的抗肿瘤纳米基因药物体系样品的pH值调整至6.8和7.4，在室温静置30min，60min，90min，120min和150min时，通过激光粒度仪测定表面电位分布。如图7所示，在生理pH 7.4条件下，随着时间推移纳米基因药物的表面电位维持在-15mV左右，当纳米基因药物体系的pH调节至6.6微酸性条件，随着时间推移纳米基因药物的表面电位维持在+13mV左右。这说明在酸性溶液中，抗肿瘤纳米基因药物表面的DMMA发生酸响应，DMMA从PEI-PLGA表面水解脱落，使得抗肿瘤纳米基因药物表面原先与DMMA偶联的富正电荷PEI得以暴露出来，最终使得纳米基因药物表面电位呈现正电荷状态。
实施例8
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物自组装纳米颗粒在体外对HUVEC细胞中NgBR的敲低效率。
利用实施例1中制备的阳离子聚合物纳米胶束按照N/P＝22，分别吸附100nMnsRNA，12.5nM，25nM，50nM，100nM的NgBR siRNA，处理人脐静脉内皮细胞(英文简称：HUVEC)48h，随后对处理完的细胞提取蛋白，在进行western blot检测，分析处理后的HUVEC细胞中NgBR的表达量。如图8所示，相比较于对照组，随着NgBR siRNA的浓度增大，NP-NgBR siRNA对HUVEC细胞中的NgBR的敲低效率逐渐增高，当NgBR siRNA为100nM时，NP-NgBR siRNA对HUVEC细胞中的NgBR的敲低效率达到约65％，这说明本发明制备的抗肿瘤纳米基因药物在体外的敲低效果比较显著。
实施例9
本实施例测定抗肿瘤纳米基因药物对肿瘤血管的正常化作用。
利用实施例1中制备的抗肿瘤纳米基因药物(简记为NP-NgBR siRNA)进行测定，以NP-nsRNA为对照样品。将BALB/c白鼠于乳腺脂肪垫处接种MDA-MB-231乳腺癌细胞，待肿瘤生长至体积为50-60mm3时，尾静脉注射NP-nsRNA和NP-NgBR siRNA，NP-nsRNA和NP-NgBRsiRNA均为每三天注射一次，每只小鼠注射的NgBR siRNA剂量均为33μg，每组5只小鼠。处理18天并继续观察2天后，将小鼠处死，取出肿瘤组织。随后对肿瘤组织进行包埋，切片，利用免疫荧光方法标记血管内皮细胞marker CD31和周皮细胞marker NG2，并用共聚焦显微镜观察和统计肿瘤组织中血管内皮和周皮的分布情况，对肿瘤中血管的正常化程度进行评价。如图9A所示和图9B所示，经过NP-NgBR siRNA处理的实验组，肿瘤血管内皮细胞被周皮细胞包被的比例明显高于NP-nsRNA处理组，同时能观察到NP-NgBR siRNA处理组的肿瘤微血管数目显著少于NP-nsRNA处理组，且NP-NgBR siRNA处理组的肿瘤血管有变粗大趋势，这说明本发明制备的抗肿瘤纳米基因药物能很好地正常化肿瘤血管，改善肿瘤微环境的高缺氧，高渗透压的恶性环境。
实施例10
本实施例测试吸附NgBR siRNA的阳离子聚合物自组装纳米颗粒抑制肿瘤远端转移。
利用实施例1中制备的抗肿瘤纳米基因药物(简记为NP-NgBR siRNA)进行测定，以NP-nsRNA为对照样品。将BALB/c白鼠于乳腺脂肪垫处接种MDA-MB-231乳腺癌细胞，待肿瘤生长至体积为50-60mm3时，尾静脉注射NP-nsRNA和NP-NgBR siRNA，NP-nsRNA和NP-NgBRsiRNA均为每三天注射一次，每只小鼠注射的siRNA剂量均为33μg，每组5只小鼠。处理18天并继续观察2天后，将小鼠处死，取出肺部组织，并将肺部组织做H&E切片以及染PCNA切片。如图10A和图10B所示，NP-NgBR siRNA每三天注射一次时抑制肿瘤发生肺部转移的效果最显著，明显优于NP-nsRNA每三天注射一次的抗转移率，NP-NgBR siRNA处理组显著减小了远端转移灶的数量与面积大小，本发明的抗肿瘤纳米基因药物很好地抑制了原位瘤发生远端转移，具有很好的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤纳米基因药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米基因药物包括两亲性阳离子聚合物、酸响应功能分子和小干扰RNA，所述酸响应功能分子与两亲性阳离子聚合物偶联，所述小干扰RNA通过静电吸附附着于两亲性阳离子聚合物表面。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米基因药物，其特征在于，所述两亲性阳离子聚合物为聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
优选地，所述酸响应功能分子通过酰胺键偶联至两亲性阳离子聚合物上；
优选地，所述酸响应功能分子通过与聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乙烯亚胺的末端氨基和/或侧链氨基形成酰胺键而偶联至聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物上。
3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤纳米基因药物，其特征在于，所述酸响应功能分子为酸酐类有机分子；
优选地，所述酸响应功能分子带有与氨基反应的官能团；
优选地，所述酸响应功能分子为2,3-二甲基马来酸酐；
优选地，所述酸响应功能分子进行酸响应的pH值小于6.8。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗肿瘤纳米基因药物，其特征在于，所述小干扰RNA为包括19-21个碱基对的双链核糖核酸；
优选地，所述小干扰RNA为核酸分子NgBR siRNA。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗肿瘤纳米基因药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米基因药物的粒径为60-150nm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗肿瘤纳米基因药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以两亲性阳离子聚合物为原料，自组装形成纳米胶束，而后将酸响应功能分子偶联到纳米胶束上，最后通过静电吸附小干扰RNA得到所述抗肿瘤基因纳米药物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述自组装在中性水环境下进行；
优选地，所述自组装在超声的环境下进行；
优选地，所述超声的功率为400-800W；
优选地，所述超声的时间为1-5min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述酸响应功能分子在碱性环境或中性环境下偶联到纳米胶束上；
优选地，所述酸响应功能分子在碱性环境下偶联到纳米胶束上；
优选地，所述碱性环境的pH值为8-9，进一步优选为8.5；
优选地，所述碱性环境由氢氧化钠溶液提供；
优选地，所述静电吸附小干扰RNA在pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中进行。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的抗肿瘤纳米基因药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将两亲性阳离子聚合物在中性环境下，400-800W超声1-5min自组装得到两亲性阳离子聚合物纳米胶束；
(2)将步骤(1)得到的两亲性阳离子纳米胶束在碱性或中性环境下与酸响应功能分子进行偶联；
(3)将步骤(2)得到的产物在pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液下通过静电作用吸附小干扰RNA得到所述抗肿瘤纳米基因药物。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的抗肿瘤纳米基因药物在制备抗肿瘤药物或制备治疗血管正常化药物中的应用。
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