CN109464671B - 一种酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，酸响应性功能分子偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物偶联在所述酸响应性功能分子上；所述药物为血管正常化药物多巴胺。本发明的酸响应介孔硅纳米药物在体内运输过程中可以稳定存在，当到达呈弱酸性的肿瘤部位时可以实现pH响应，从而释放出促进血管正常化的药物多巴胺，因此达到降低体内毒性，提高生物安全性，显著促进原位肿瘤血管的正常化的效果，且该酸响应介孔硅纳米药物的制备方法操作简单易行，稳定性好，重复率高。

Description

一种酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，涉及一种介孔硅纳米药物及其制备方法和应用，尤其涉及一种酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
1907年，Goldman发现血管围绕着肿瘤生长,提出肿瘤的生长依赖邻近的毛细血管。1968年，有学者提出肿瘤能产生弥散性血管生成物质促进新血管的生成。肿瘤血管的系统结构紊乱，这种血管结构的异常导致了血流的紊乱，从而改变了肿瘤的代谢微环境，例如酸中毒和缺氧。肿瘤血管和微环境异常是肿瘤化疗和放疗耐受的主要原因，1971年，Folkman首次提出肿瘤生长和转移是血管依赖性的,并提出阻断肿瘤血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略。
抗血管生成治疗是通过引起肿瘤缺血而饿死肿瘤，然而抗血管生成药物使得肿瘤血管严重退化，阻碍了药物与氧的传输而拮抗化疗和放疗的效果，这与抗血管新生联合化疗放疗提高疗效相矛盾。Jain对此提出了一个有悖于传统观点的解释,即肿瘤血管正常化的理论：合理地运用抗血管生成药物，能在血管消退之前修复异常的肿瘤血管系统，使肿瘤血管趋于正常，更有效地运输氧和药物到肿瘤细胞，从而提高放疗和化疗的敏感性。抗血管生成治疗具有能使异常的血管在结构和功能上趋于正常的潜能，并能改善肿瘤的微环境，最终提高抗瘤效果和抑制肿瘤转移。据研究报道，超过40种分子参与到肿瘤血管生成过程，目前也有越来越多的科研工作者关注血管正常化的研究。
多巴胺是一种交感神经递质，具有促进血管正常化从而抗血管生成的特性。多巴胺通过作用于血管多巴胺受体DR1和DR2，可上调周细胞中血管生成素-1和内皮细胞中的锌指转录因子KLF2，并且抑制外源性调节因子VEGF，使肿瘤血管正常化。与其他血管生成药物如舒尼替尼相比，多巴胺不仅具有潜在血管正常化作用进而抑制肿瘤生长，而且不会引起全身性高血压。在低剂量下，多巴胺显示出明显的血管正常化特性并且没有明显的副作用，这种相对低成本的神经递质类药物不仅能降低肿瘤微血管密度，还能增加肿瘤细胞的周细胞覆盖率，是一种潜在的血管正常化药物。
纳米药物近年来被广泛地应用于医药领域，其是通过设计和调控有机或无机材料的纳米特性，制备结构稳定、功能多样和生物相容性好的纳米载体来包载药物，可显著延长药物半衰期、提高富集量、降低用药剂量并实现联合用药。其中，介孔硅纳米粒子作为生物相容性好，安全性高的无机材料，通过对其合理的修饰，可偶联载带药物，构建纳米药物递送系统，延长体内半衰期，增强药物在肿瘤部位的富集，起到良好的体内运输载体的目的。环境响应型载体是药物递送系统中的一个重要门类，指一类能够根据其所处的环境做出特定响应的药物载体。这里的环境条件既包括温度、压力、电位、pH、氧化还原等物理化学环境，也包括酶、激素、细胞因子等生化学环境。由于环境响应型载体在表现上显示出一定的智能性，因此也被广泛地研究和应用。
CN105963702A公开了一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其制备方法，该药物运载控释系统具有三层核壳结构，内层为载阿霉素的介孔硅纳米粒子，中间层为叶酸修饰的叠氮化壳聚糖，外层为聚乙二醇。该药物运载控释系统的制备方法包括如下步骤：巯基功能化介孔硅纳米粒子的制备；双硫功能化；炔基修饰；去除模板；叶酸修饰的叠氮化壳聚糖的制备；壳聚糖包裹；PEG修饰等。该药物运载控释系统可以在正常血液循环中“隐形”、在肿瘤部位脱除PEG裸露出靶向配体叶酸，从而“激活”该系统对癌细胞的主动靶向能力。
CN102949728A公开了一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体及其制备方法。首先通过溶解凝胶法制备出介孔硅纳米颗粒，并将其开发成为药物分子的纳米储存器；而后，利用简单的化学修饰方法在介孔硅纳米储存器的表面引入二硫键，并将其作为连接纽带；其次，采用生物相容性的天然细胞外基质—胶原分子固定至介孔硅纳米储存器表面，并将其开发成为介孔硅纳米储存器的纳米封装器；最后，将乳糖酸分子修饰至介孔硅/胶原纳米复合系统表面，将其作为肝癌细胞膜表面受体(ASGP-R)的特异性受体，从而构建出一种兼具细胞特异性靶向性和还原性物质/酶响应性的介孔硅/胶原—乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。
CN104491886A公开了一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备方法，包括：介孔硅复合粒子的合成；采用化学方法在粒子表面修饰二硫键，并通过二硫键共价接透明质酸作为靶向分子；以透明质酸上的羧基为反应位点，将聚乙二醇修饰至复合粒子表面以提高粒子生物相容性，并将具有靶向作用的透明质酸分子通过二硫键连接到纳米粒子表面，制得兼具药物响应释放和成像功能的介孔硅纳米诊疗剂。本方法制备的粒子分散性好、粒径均一且方法简便，所制备的多功能诊疗剂生物相容性良好、能在肿瘤部位响应性释放药物，可实现对肿瘤的诊疗一体化。
现有技术对环境响应型介孔硅纳米药物递送系统的研究很多，但是缺少一种生物相容性好，毒副作用低，生物利用度高，具有酸性pH响应性，且针对血管正常化治疗的介孔硅纳米药物。因此，开发出一种具有上述功能的针对血管正常化治疗的介孔硅纳米药物是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种介孔硅纳米药物及其制备方法和应用，尤其提供一种酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种酸响应介孔硅纳米药物，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，酸响应性功能分子偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物偶联在所述酸响应性功能分子上；所述药物为血管正常化药物多巴胺。
人体正常组织的pH值为7.4左右，而肿瘤部位为弱酸性环境，其pH值为6.5-7.2，本发明所述酸响应介孔硅纳米药物在体内运输过程中可以稳定存在，当到达呈弱酸性的肿瘤部位时实现pH响应，从而释放出促进血管正常化的药物多巴胺，该酸响应介孔硅纳米药物能够降低体内毒性，生物安全性高且能显著促进原位肿瘤血管的正常化。所述酸响应介孔硅纳米药物作为一种纳米药物递送系统，其相对游离药物也具有很多自身优势，例如提高了药物的生物相容性、溶解性、生物利用度等等。
优选地，所述药物通过酯键偶联在所述酸响应性功能分子上。
优选地，所述酸响应性功能分子通过酰胺键偶联在所述介孔硅纳米粒上。
优选地，所述酸响应性功能分子通过酰胺键偶联于所述介孔硅纳米粒的氨基上。
优选地，所述酸响应性功能分子为羧基苯硼酸。
优选地，所述羧基苯硼酸为2-羧基苯硼酸、3-羧基苯硼酸或4-羧基苯硼酸。
药物多巴胺具有邻位双羟基结构，其能与酸响应性功能分子羧基苯硼酸反应形成硼酸二酯键实现偶联，而羧基苯硼酸的羧基端能与介孔硅纳米粒上的修饰氨基反应形成酰胺键实现偶联，硼酸二酯键在肿瘤弱酸性环境下易被水解，从而释放出药物多巴胺。
在本发明中，所述纳米药物的粒径为100-200nm，例如100nm、120nm、140nm、150nm、160nm、180nm、190nm或200nm等。
所述纳米药物的粒径为100-200nm，通过肿瘤部位的EPR效应(高通透性和滞留效应)，能够实现很好的被动靶向功能。
优选地，所述纳米药物的表面还修饰有主动靶向功能的分子。
优选地，所述分子包括叶酸、RGD肽、透明质酸和核酸适配体中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如叶酸和RGD肽、透明质酸和核酸适配体、RGD肽和透明质酸等。
所述纳米药物表面修饰的叶酸、RGD肽、透明质酸和核酸适配体能够与肿瘤部位高度表达的叶酸受体、整合素、CD44蛋白和核酸适配体受体特异性结合，实现纳米药物的主动靶向功能。
另一方面，本发明提供一种如上所述的纳米药物的制备方法，所述制备方法为：先将酸响应性功能分子偶联于介孔硅纳米粒上，再将药物偶联于酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒上，得到所述酸响应介孔硅纳米药物。
在本发明中，所述纳米药物的制备方法包括如下步骤：
(1)将介孔硅纳米粒进行氨基化处理，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(2)将酸响应性功能分子偶联于步骤(1)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒上，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将药物偶联于步骤(2)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒上，得到所述酸响应介孔硅纳米药物。
所述制备方法操作简单易行，稳定性好，重复率高。
在本发明中，步骤(1)所述介孔硅纳米粒是用软模板法制备得到的，其具体方法为：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中进行反应，收集沉淀，即得所述介孔硅纳米粒。
优选地，所述将四乙氧基硅烷加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液是以逐滴滴加的方式进行的。
优选地，所述反应在20-40℃搅拌中进行，例如20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或40℃等，优选25℃。
优选地，所述反应的时间为3-8h，例如3h、4h、5h、6h、7h或8h等，优选5h。
优选地，所述收集沉淀后将其重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复3-5次，此过程是为了去除沉淀表面残留的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。
在本发明中，步骤(1)所述将介孔硅纳米粒进行氨基化处理的具体方法为：
将介孔硅纳米粒溶于甲苯，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒。
优选地，所述甲苯为用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯。
优选地，所述反应的时间为40-50h，例如40h、42h、43h、44h、45h、47h、48h、49h或50h等，优选48h。
在本发明中，步骤(2)的具体操作为：
将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行第一步反应，再向其中加入步骤(1)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行第二步反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒。
优选地，所述第一步反应的时间为1-5h，例如1h、2h、3h、4h或5h等，优选2h。
优选地，所述第二步反应的时间为40-50h，例如40h、42h、43h、44h、45h、46h、48h、49h或50h等，优选48h。
优选地，所述第二步反应结束后将得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤3-5次，去除纳米粒表面残留的二甲基亚砜。
在本发明中，步骤(3)的具体操作为：
将步骤(2)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在保护性气体保护下进行反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物。
优选地，所述保护性气体为氮气。
优选地，所述反应的时间为20-30h，例如20h、22h、23h、24h、25h、27h、28h、29h或30h等，优选24h。
优选地，所述反应的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，优选4℃。
优选地，所述得到酸响应介孔硅纳米药物后用乙醇进行洗涤，此过程是为了去除未被包载的游离药物多巴胺。
作为本发明的优选实施方式，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷逐滴滴加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中在20-40℃搅拌下进行3-8h反应，收集沉淀，将沉淀重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复3-5次，即得所述介孔硅纳米粒；
(2)将步骤(1)得到的介孔硅纳米粒溶于用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯中，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行40-50h反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行1-5h反应，再向其中加入步骤(2)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行40-50h反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒，将其在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤3-5次；
(4)将步骤(3)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在氮气保护2-8℃下进行20-30h反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物，用乙醇洗涤，除去未包载的游离药物。
再一方面，本发明提供一种如上所述的纳米药物在制备促进血管正常化药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所述酸响应介孔硅纳米药物作为一种纳米药物递送系统，其相对游离药物具有很多自身优势，提高了药物的生物相容性、溶解性、生物利用度、降低了药物的毒副作用等等。
本发明所述酸响应介孔硅纳米药物在体内运输过程中可以稳定存在，当到达呈弱酸性的肿瘤部位时可以实现pH响应，从而释放出促进血管正常化的药物多巴胺，因此达到降低体内毒性，提高生物安全性，显著促进原位肿瘤血管的正常化的效果。
本发明所述酸响应介孔硅纳米药物的制备方法操作简单易行，稳定性好，重复率高。
附图说明
图1是实施例1中多巴胺与4-羧基苯硼酸偶联物的1H-NMR谱图；
图2是实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物的傅里叶红外光谱图；
图3是实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物的透射电镜图；
图4是实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物的粒径表征结果图；
图5是实施例3制得的酸响应介孔硅纳米药物的透射电镜图；
图6是实施例3制得的酸响应介孔硅纳米药物的粒径表征结果图；
图7是实施例4制得的酸响应介孔硅纳米药物的透射电镜图；
图8是实施例4制得的酸响应介孔硅纳米药物的粒径表征结果图；
图9是实施例5中多巴胺的体外释放试验结果图；
图10是实施例6中酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞迁移行为影响的显微镜观察图；
图11是实施例6中酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞迁移行为影响的统计结果图；
图12是实施例7中酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞成管行为影响的显微镜观察图；
图13是实施例7中酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞成管行为影响的统计结果图；
图14是实施例8中酸响应介孔硅纳米药物的体内药代动力学试验结果图；
图15是实施例9中酸响应介孔硅纳米药物对血液尿素氮的影响结果统计图；
图16是实施例9中酸响应介孔硅纳米药物对肌酸的影响结果统计图；
图17是实施例9中酸响应介孔硅纳米药物对碱性磷酸酶的影响结果统计图；
图18是实施例9中酸响应介孔硅纳米药物对低密度脂蛋白胆固醇的影响结果统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法来验证羧基苯硼酸和多巴胺的连接键酯键是否具有酸响应性，具体方法为：
取1.896mg多巴胺溶于1mL重水中(10mM)，取1.659mg 4-羧基苯硼酸溶于1mL重水中(10mM)，随后将两者混合并反应1h。将混合液分成三份，分别调整pH为pH＝5.5、pH＝6.5、pH＝7.4。随着pH的增加，溶液逐渐由乳白色变为无色。
用1H-NMR法分别对三份混合液进行表征，实验结果如图1所示，在多巴胺与4-羧基苯硼酸的偶联物中，7.5ppm处峰代表的是4-羧基苯硼酸苯环上的H原子，6.45-6.65ppm处峰代表的是多巴胺苯环上的H原子，当pH降低，多巴胺与4-羧基苯硼酸的连接键酯键水解断裂后，上述峰均发生向左的位移，说明4-羧基苯硼酸和多巴胺的连接键酯键能够随着pH的变化水解断裂，因此实现酸响应性。
实施例2
本实施例提供一种酸响应介孔硅纳米药物，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，4-羧基苯硼酸偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物多巴胺偶联在所述4-羧基苯硼酸上。其制备方法如下：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷逐滴滴加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中在25℃搅拌下进行5h反应，收集沉淀，将沉淀重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复3次，即得所述介孔硅纳米粒；
(2)将步骤(1)得到的介孔硅纳米粒溶于用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯中，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行48h反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行2h反应，再向其中加入步骤(2)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行48h反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒，将其在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤3次；
(4)将步骤(3)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在氮气保护4℃下进行24h反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物，用乙醇洗涤，除去未包载的游离药物。
利用傅里叶红外光谱仪(型号：Spectrum One生产厂家：美国Pekin Elmer)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物进行表征，结果如图2所示(图中MSN表示步骤(1)制得的介孔硅纳米粒；MSN-NH2表示步骤(2)制得的氨基修饰的介孔硅纳米粒；MSN-NH2-PBA表示步骤(3)制得的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒；MSN-NH2-PBA@DA表示步骤(4)最终制得的酸响应介孔硅纳米药物)，由图中可以看出：
MSN-NH2-PBA@DA组在1530cm-1处有明显的特征峰，说明成功将多巴胺偶联于介孔硅纳米粒子上，实现了包载。
利用透射电镜(美国FEI，Tecnai G2 20 S-TWIN，200kV)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的形态进行表征，结果如图3所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物呈球状，颗粒大小较为均一。
利用激光粒度仪(英国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的粒径进行表征，结果如图4所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物平均粒径约100nm左右(图中为激光粒度仪测定的介孔硅纳米药物的水合粒径值)，多分散系数(PDI)为0.179，且与透射电镜得到的结果相符合。
实施例3
本实施例提供一种酸响应介孔硅纳米药物，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，4-羧基苯硼酸偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物多巴胺偶联在所述4-羧基苯硼酸上。其制备方法如下：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷逐滴滴加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中在20℃搅拌下进行8h反应，收集沉淀，将沉淀重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复5次，即得所述介孔硅纳米粒；
(2)将步骤(1)得到的介孔硅纳米粒溶于用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯中，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行40h反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行1h反应，再向其中加入步骤(2)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行40h反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒，将其在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤5次；
(4)将步骤(3)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在氮气保护2℃下进行30h反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物，用乙醇洗涤，除去未包载的游离药物。
利用透射电镜(美国FEI，Tecnai G2 20 S-TWIN，200kV)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的形态进行表征，结果如图5所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物呈球状，颗粒大小较为均一。
利用激光粒度仪(英国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的粒径进行表征，结果如图6所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物平均粒径约110nm左右(图中为激光粒度仪测定的介孔硅纳米药物的水合粒径值)，多分散系数(PDI)为0.185，且与透射电镜得到的结果相符合。
实施例4
本实施例提供一种酸响应介孔硅纳米药物，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，4-羧基苯硼酸偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物多巴胺偶联在所述4-羧基苯硼酸上。其制备方法如下：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷逐滴滴加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中在40℃搅拌下进行3h反应，收集沉淀，将沉淀重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复4次，即得所述介孔硅纳米粒；
(2)将步骤(1)得到的介孔硅纳米粒溶于用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯中，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行50h反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行5h反应，再向其中加入步骤(2)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行50h反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒，将其在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤4次；
(4)将步骤(3)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在氮气保护8℃下进行20h反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物，用乙醇洗涤，除去未包载的游离药物。
利用透射电镜(美国FEI，Tecnai G2 20 S-TWIN，200kV)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的形态进行表征，结果如图7所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物呈球状，颗粒大小较为均一。
利用激光粒度仪(英国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对制备得到的酸响应介孔硅纳米药物的粒径进行表征，结果如图8所示，由图中可以看出，制备得到的介孔硅纳米药物平均粒径约115nm左右(图中为激光粒度仪测定的介孔硅纳米药物的水合粒径值)，多分散系数(PDI)为0.213，且与透射电镜得到的结果相符合。
实施例5
多巴胺的体外释放试验：
本实施例是为了探究实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物在不同pH环境下对多巴胺的体外释放行为，具体方法为：
以4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸为缓冲剂，采用高效液相色谱法测定分别在pH＝7.4、pH＝5.5和pH＝6.5下多巴胺的释放量，结果如图9所示，可以看出，随着pH值的降低，药物多巴胺的释放速率越来越快，证明了实施例2制得的介孔硅纳米药物是具有酸响应性的。
实施例6
酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞迁移行为的影响试验：
具体方法为：将1×105个HUVECs细胞接种于24孔板中培育24h，使细胞覆盖率在90％以上。在无血清培养基中，将细胞接种于Transwell中，上层小室加300μL无血清培养基，下层小室加800μL含2％的FBS培养基，使上下层培养基的pH值同时为7.4或6.8，并分别用同体积的无血清培养基和含有10μM多巴胺的实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物对细胞进行处理，孵育8h，对迁移至下层小室的细胞进行显微镜观察和数量统计。结果如图10和图11所示，与对照组相比，经过酸响应介孔硅纳米药物处理过的HUVECs细胞，其迁移行为受到了显著抑制，并且随着pH值的降低，细胞迁移行为受到的抑制程度显著增强，说明随着pH值的降低，酸响应介孔硅纳米药物对多巴胺的释放速率增加，因此对细胞迁移行为的抑制也增强。
实施例7
酸响应介孔硅纳米药物对HUVEC细胞成管行为的影响试验：
具体方法为：在24孔板底部每孔铺75μL的基质胶，在37℃下凝固1h，然后将1×105个HUVECs细胞接种于24孔板中，使基质胶的pH值为7.4或6.8，并分别用同体积的无血清培养基和含有10μM多巴胺的实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物对细胞进行处理，孵育8h，使用显微镜和图像软件测定形成小管的量。结果如图12和图13所示，与对照组相比，经过酸响应介孔硅纳米药物处理过的HUVECs细胞，其成管行为受到了显著抑制，并且随着pH值的降低，细胞成管行为受到的抑制程度显著增强，说明随着pH值的降低，酸响应介孔硅纳米药物对多巴胺的释放速率增加，因此对细胞成管行为的抑制也增强。
实施例8
酸响应介孔硅纳米药物的体内药代动力学试验：
具体方法为：
(1)构建BALB/c小鼠乳腺肿瘤模型：将BALB/c小鼠于乳腺脂肪垫处接种MDA-MB-231乳腺癌细胞，待肿瘤生长至体积为50-60mm3。
(2)药代动力学试验：将20只上述乳腺肿瘤模型小鼠平均分为两组，每组10只，雌雄各半，两组小鼠分别尾静脉注射100μL游离多巴胺溶液(给药量为2mg/Kg)、100μL实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物(给药量为2mg/Kg)。在不同的时间点从小鼠尾静脉采集10μL血样，同时用10μL肝素钠进行处理，静置2h，以3000rpm的速度对各样品离心10min，过滤得到上清液，对其进行HPLC分析，结果如图14所示，可以看出，酸响应介孔硅纳米药物组的血药浓度在0-24h中均显著高于游离多巴胺组，并且前者在24h时仍具有较高的血药浓度，说明本发明所述酸响应介孔硅纳米药物相比于游离药物，其在体内的循环时间更长，生物利用度更高。
实施例9
酸响应介孔硅纳米药物的安全性评价试验：
具体方法为：
(1)构建BALB/c小鼠乳腺肿瘤模型：将BALB/c小鼠于乳腺脂肪垫处接种MDA-MB-231乳腺癌细胞，待肿瘤生长至体积为50-60mm3。
(2)安全性评价试验：将30只上述乳腺肿瘤模型小鼠平均分为三组，每组10只，雌雄各半，三组小鼠分别尾静脉注射100μL生理盐水、100μL游离多巴胺溶液(给药量为2mg/Kg)、100μL实施例2制得的酸响应介孔硅纳米药物(给药量为2mg/Kg)，每隔一天注射一次，共进行三次注射。采集各组小鼠的血样，通过标准生化试验分析血清，共检测了血液尿素氮(BUN)、肌酸(CREA)、碱性磷酸酶(APL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)4个指标，结果如图15、图16、图17、图18所示，可以看出，药物对血液相关的指标没有明显的影响，本发明所述酸响应介孔硅纳米药物的生物安全性高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的酸响应介孔硅纳米药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (33)

1.一种酸响应介孔硅纳米药物，其特征在于，所述纳米药物以介孔硅纳米粒作为载体，酸响应性功能分子偶联在所述介孔硅纳米粒上，药物偶联在所述酸响应性功能分子上；所述药物为血管正常化药物多巴胺；所述酸响应性功能分子为4-羧基苯硼酸；
所述酸响应介孔硅纳米药物是由包括如下步骤的制备方法制得的：
(1)将介孔硅纳米粒进行氨基化处理，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(2)将酸响应性功能分子偶联于步骤(1)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒上，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将步骤(2)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在保护性气体保护下进行反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物。
2.如权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述药物通过酯键偶联在所述酸响应性功能分子上。
3.如权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述酸响应性功能分子通过酰胺键偶联在所述介孔硅纳米粒上。
4.如权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述酸响应性功能分子通过酰胺键偶联于所述介孔硅纳米粒的氨基上。
5.如权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为100-200nm。
6.如权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的表面还修饰有主动靶向功能的分子。
7.如权利要求6所述的纳米药物，其特征在于，所述分子包括叶酸、RGD肽、透明质酸和核酸适配体中的任意一种或至少两种的组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将介孔硅纳米粒进行氨基化处理，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(2)将酸响应性功能分子偶联于步骤(1)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒上，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将步骤(2)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在保护性气体保护下进行反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述介孔硅纳米粒是用软模板法制得的，其具体方法为：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中进行反应，收集沉淀，即得所述介孔硅纳米粒。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述将四乙氧基硅烷加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液是以逐滴滴加的方式进行的。
11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述反应在20-40℃搅拌中进行。
12.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述反应在25℃搅拌中进行。
13.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为3-8h。
14.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为5h。
15.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述收集沉淀后将其重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复3-5次。
16.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述将介孔硅纳米粒进行氨基化处理的具体方法为：
将介孔硅纳米粒溶于甲苯，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述甲苯为用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯。
18.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为40-50h。
19.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为48h。
20.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：
将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行第一步反应，再向其中加入步骤(1)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行第二步反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒。
21.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述第一步反应的时间为1-5h。
22.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述第一步反应的时间为2h。
23.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述第二步反应的时间为40-50h。
24.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述第二步反应的时间为48h。
25.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述第二步反应结束后将得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤3-5次。
26.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述保护性气体为氮气。
27.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的时间为20-30h。
28.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的时间为24h。
29.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的温度为2-8℃。
30.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的温度为4℃。
31.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述得到酸响应介孔硅纳米药物后用乙醇进行洗涤。
32.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水，向其中加入氨水，再将四乙氧基硅烷逐滴滴加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液中在20-40℃搅拌下进行3-8h反应，收集沉淀，将沉淀重悬于乙醇中超声处理5min，在12000rpm下离心10min，再收集沉淀，此过程重复3-5次，即得所述介孔硅纳米粒；
(2)将步骤(1)得到的介孔硅纳米粒溶于用丙酮或乙醇洗涤后的甲苯中，向其中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，进行40-50h反应，得到氨基修饰的介孔硅纳米粒；
(3)将酸响应性功能分子溶于二甲基亚砜中，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)进行1-5h反应，再向其中加入步骤(2)得到的氨基修饰的介孔硅纳米粒进行40-50h反应，得到酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒，将其在去离子水中进行72h透析，再用乙醇洗涤3-5次；
(4)将步骤(3)得到的酸响应性功能分子修饰的介孔硅纳米粒溶于乙醇溶液中，向其中加入药物，在氮气保护3-8℃下进行20-30h反应，得到所述酸响应介孔硅纳米药物，用乙醇洗涤，除去未包载的游离药物。
33.如权利要求1-7中任一项所述的纳米药物在制备促进血管正常化药物中的应用。
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