CN109464421B - 功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统以及其具体制备方法，其具有两层核壳结构，内层为载药的介孔硅粒子，外层为接枝有环糊精的透明质酸；通过无机介孔硅为药物载体，采用环糊精的透明质酸对药物载体进行封装，根据肿瘤微环境的特性，构建了pH敏感型还原性敏感型药物载体，使其具有刺激‑响应控释药物的能力和良好的生物相容性，提高药物利用率，降低对正常组织的毒副作用。

Description

功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物控制释放领域，具体涉及一种功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统以及其具体制备方法的领域。
背景技术
据世界卫生组织2018年2月发布的最新消息，癌症已成为全球第二大死因，2015年，癌症死亡人数已升至880万人，因此在全球范围内大力发展癌症治疗亟不可待。
目前治疗癌症的主要措施有外科手术、放射治疗、化学药物治疗三种方式。由于癌症易转移特点，外科手术难度大且存在术后易复发等问题，相较于放疗，化疗在治疗实体肿瘤上有显著优势，然而传统的化疗“敌我”不分，也会造成对正常细胞的伤害，导致患者免疫力下降、大量脱发等毒副作用。但是肿瘤组织与正常组织存在诸多差异，利用这些差异构建具有响应的靶向药物载体，不仅进一步提高治疗效果，而且大大降低毒副作用减轻患者病痛。
为此，上世纪60年代美国科学家Hignchi和Zaffaroni提出了药物载体(DrugDelivery Systems)的概念。目前，研究最多的抗癌药物载体系统以脂质体、胶束为代表的有机/高分子载体，但载药量低、热/化学性质不稳定极大限制了其发展，而以介孔硅(MSN)为代表的无机纳米粒子作为载药系统，可有效的解决这些缺陷。同时MSN还兼有大的比表面积及空隙体积装载药物、低毒性和良好的生物相容性以及易于改性具有各种响应性的化学键和功能基团的特点。此外，MSN制备手段丰富、方法成熟简单，形状、尺寸、空隙大小在一定范围内可控，其百纳米的尺寸，经“增强渗透和滞留”效应(EPR effect)，能实现被动靶向的效果，更易富集在肿瘤组织。
在目前的报道中，肿瘤组织微环境主要有pH低于正常组织、细胞内存在还原性差异、酶代谢异常、存在影响肿瘤血管生成的因子和信号通路等特点，故通过在MSN表面修饰各种刺激响应性的“阀门”，可以赋予其不同的药物控释能力。因此“阀门”的选择至关重要，常用的“阀门”包括合成高分子材料、金属纳米粒子、各类超分子系统、脂质体、多肽、蛋白质、DNA和天然多糖等。各类“阀门”极具特点，在药物控释中均发挥巨大作用。但由于天然多糖来源广泛、种类繁多和生物相容性好，无疑成为众多“阀门”中的翘楚。不仅如此，将两种多糖beta-环糊精(β-CD)与透明质酸(hyaluronicacid，HA)结合，不仅能封装药物，而且还能达到主动靶向和进一步提高生物相容性的效果。因此，以无机纳米粒子MSN作为药物载体，在其表面锚定具有响应性的化学键，利用两种多糖接枝后进行封装和主动靶向，构建了pH敏感型还原性敏感型药物载体，能极大的解决传统化疗存在的弊端，具有研发的潜在价值和应用价值。
现有的药物控释载体研究取得了一定的进展，但同时也存在一些问题：(1)在基于肿瘤微环境的纳米靶向载体的研究中，较多采用的是单响应载体，不能充分发挥不同肿瘤微环境响应物质的之间的特点，不利于药物载体的可控释放。(2)以介孔硅纳米粒子构建的药物载体，在体内会有团聚倾向，进而导致药物载体尺寸过大，不易穿透肿瘤血管，达不到在肿瘤部位富集的目的。(3)介孔硅药物载体控释的研究目前止步于体外实验和动物实验，这些结果并不能全面的、真实的反应人体的实验情况，所以在评价以介孔硅为药物载体带来了很多不定因素，很大程度上限制了其实际的应用性。
发明内容
本发明提供了一种功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统及其制备方法，选择无机介孔硅为药物载体，采用多糖对药物载体进行封装，根据肿瘤微环境的特性，构建了pH敏感型还原性敏感型药物载体，使其具有刺激-响应控释药物的能力和良好的生物相容性的特点，从而提高药物利用率并且降低对正常组织的毒副作用。
为了达到上述技术效果，采用如下技术方案：一种功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统，其具有两层核壳结构，内层为载药的介孔硅粒子，外层为接枝有环糊精的透明质酸。
作为优选技术方案，所述载药的药物为盐酸阿霉素(DOX·HCl)。
一种功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其包括如下步骤：
S1:巯基功能化介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SH)
准确称取NaOH加入到去离子水中，再加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后超声溶解，剧烈搅拌升温至60-80℃，正硅酸四乙酯(TEOS)和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)缓慢滴加至上述溶液中，反应在80℃下剧烈搅拌2h。待冷却至室温后，离心(9500r/min×8min)收集得到白色固体物，分别用甲醇和去离子水超声清洗数次，产物冻干后，即得含有表面活性剂的介孔硅纳米粒子(CTAB@MSN-SH)；去除介孔硅纳米粒子的CTAB后，产物冻干得到介孔硅纳米粒子(MSN-SH)；
S2:双硫功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-NH2)
准确称取MSN-SH，在甲醇中超声分散均匀；然后加入S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐，在室温下反应；将产物离心，并用甲醇和去离子水超声清洗数次，冻干后得到双硫功能化的介孔硅纳米粒子(MSN-SS-NH2)；
S3:腙键功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-N＝C-ph)
将MSN-SS-NH2分散于pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声使其分散均匀，然后加入苯甲醛，室温下反应24h。将产物离心收集，用pH＝8.0的PBS缓冲溶液超声清洗数次，冻干后得到腙键功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-N＝C-ph；
S4:载体粒子X@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA的制备
称取MSN-SS-N＝C-ph分散于pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声分散均匀，然后再加入药物X，在室温下避光剧烈搅拌；最后加入透明质酸嫁接的β-CD(HA-B-CD)，在室温下避光反应12-48小时，反应结束后用pH＝8.0的PBS缓冲溶液和去离子水清洗数遍，冻干后即得X@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA；
作为优选技术方案，步骤S1中去除介孔硅纳米粒子的CTAB采用甲醇酸性条件萃取法:称取CTAB@MSN-SH加入无水甲醇中，震荡、超声分散均匀后，加入浓HCl(质量分数37％)，在20-80℃条件下回流反应12-96h，经过离心用甲醇和去离子水清洗数次，产物冻干得到介孔硅纳米粒子(MSN-SH)。
作为优选技术方案，所述S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的制备方法为：将2，2-二硫二吡啶溶解在无水甲醇和乙酸中，形成溶液a；再将半胱胺盐酸盐溶解在无水甲醇中，形成溶液b；将溶液b逐滴滴加至溶液a中，要求在30min内滴完；在室温下搅拌反应24-96h后，用旋转蒸发仪浓缩旋干，得到黄色油状物，溶解在无水甲醇中，并用乙醚沉淀三次后，真空干燥。
作为优选技术方案，2，2-二硫二吡啶与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:5；
作为优选技术方案，无水甲醇与乙酸的体积比为20:0.8。
作为优选技术方案，所述透明质酸(HA)嫁接β-CD包括两个步骤A和B：
步骤A：6-氨基化的β-环糊精的制备(β-CD-NH2)
制备β-CD-NH2分两步，首先合成6-OTs化的β-环糊精和合成6-氨基化的β-环糊精；
合成6-OTs化的β-环糊精的步骤如下：将β-CD悬浮于浓度为0.4mol/L NaOH溶液中，在0℃冰水浴下缓慢加入对甲苯磺酰氯(TsCl)以确保取代发生在6号位，低温搅拌45min后将沉淀过滤两次，滤液用稀盐酸调节pH至5-6.5，有大量白色沉淀析出，4℃下保存过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在20-80℃下真空干燥12-48h；
合成6-氨基化的β-环糊精的步骤如下：将6-OTs化的β-环糊精溶解在重蒸无水乙二胺中，在60-90℃下通入N2回流24-96h，冷却至室温，用丙酮沉淀一天后，用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次，共沉淀三次后真空干燥得到β-CD-NH2；
步骤B：透明质酸嫁接β-CD的制备(HA-B-CD)
称取HA溶于去离子水中，水合过夜，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于冰浴4℃活化羧基，过夜后调节pH至4.0-6.0，然后加入β-CD-NH2于室温下反应24-72h，反应结束后用MWCO＝3.5KDa透析袋透析3-5天，期间每6h换一次水，冻干后即得HA-B-CD。
作为优选技术方案，步骤A中，β-CD与对甲苯磺酰氯的质量比为25:12-24；
作为优选技术方案，步骤A中，氢氧化钠溶液的质量为β-CD质量的10-20倍；
作为优选技术方案，步骤A中，6-OTs化的β-CD与无水乙二胺的质量体积比为10g:40-80ml；
作为优选技术方案，步骤B中，HA、EDC·HCl、NHS、β-CD-NH2的质量比为10:6-8:4-5:50-80；
作为优选技术方案，步骤B中，HA的分子量为3KDa-10KDa。
作为优选技术方案，步骤S2中，MSN-SH与S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的质量比为1:1；
作为优选技术方案，步骤S3中，MSN-SS-NH2与苯甲醛的质量比为10-20:100；
作为优选技术方案，步骤S4中，MSN-SS-N＝C-ph、HA-B-CD、药物X的质量比为100:100:1-100；
作为优选技术方案，所述药物X为盐酸阿霉素(DOX·HCl)。
本发明还保护通过上述方法制备得到的功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统，即通过制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法制备得到的功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统。
有益的技术效果：
(1)介孔硅纳米粒子(MSN)的引入可有效改善传统有机/高分子载体系统载药量小、稳定性不佳等缺陷。同时，其百纳米的尺寸，经“增强渗透和滞留”效应(EPR effect)，能实现被动靶向的效果，更易富集在肿瘤组织。
(2)通过在介孔硅表面修饰具有刺激响应的二硫键和腙键，使得药物载体在富集在肿瘤组织后，由于癌症细胞外的弱酸环境下(pH≈6.5)苯腙键水解断裂，表面裸露出的NH2带有正电荷，能够辅助载体进行跨膜；其次由于肿瘤细胞中含有极高浓度的谷胱甘肽(GSH,2—10mmol/L)，二硫键因被还原而断裂，药物从载体中释放出来，从而达到控制释药的效果。
(3)透明质酸(hyaluronicacid，HA)在已知的目前自然界的天然高分子中，其保湿性最好，同时也是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的主要组成部分，不存在免疫排斥，以HA为骨架构建的抗癌药物载体使其主动靶向并进入CD44蛋白过度表达癌细胞。通过酯键将β-环糊精(β-CD-NH2)接枝在HA的表面，然后利用β-CD作为主体包络各种适当的客体分子的特性，将β-CD与介孔硅表面的苯环进行主客载体作用，使其锚定在MSN的表面，不仅达到封装药物和赋予药物载体主动靶向能力的效果，而且改善MSN在生理环境中的团聚倾向，提高了药物载体的稳定性。
(4)对于药物的封装，主客载体的引入相比化学键连接，制备方法更简单；相比静电力相互作用和氢键能够使载体系统更加稳定。
鉴于以上几点优点，我们选择无机介孔硅为药物载体，采用多糖对药物载体进行封装，根据肿瘤微环境的特性，构建了pH敏感型还原性敏感型药物载体，使其具有刺激-响应控释药物的能力和良好的生物相容性的特点，从而提高药物利用率并且降低对正常组织的毒副作用。
附图说明
图1为介孔硅的透射电镜(TEM)图；
图2为实施例1中各步骤产物的TG图；
图3为实施例1各步骤产物的FT-IR图；
图4为实施例1中各步骤产物的氮气吸附等温线；
图5为实施例1中各步骤产物的BJH孔径分布图；
图6为实施例1所得DOX@MSN-N＝C-B-CD-HA在pH7.4和pH7.4 with1mMGSH、10mMGSH条件下的释药曲线图；
图7为实施例1所得DOX@MSN-N＝C-B-CD-HA在pH6.5和pH6.5with1mMGSH、10mMGSH条件下的释药曲线图；
图8为实施例1所得DOX@MSN-N＝C-B-CD-HA在pH6.5和pH7.4条件下的释药曲线图。
具体实施方式
为了使技术人员更加直观的了解本发明的技术方案，下面选择几个典型实施例进行介绍，这些实施例不构成对本发明保护范围的限制，今后任何不背离本发明基本构思的实施方案都在本发明保护范围内。
实施例1
1.巯基功能化介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SH)
准确称取0.8gNaOH加入到480mL去离子水中，再加入1.0g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后超声溶解，剧烈搅拌升温至80℃，5.0mL的正硅酸四乙酯(TEOS)和0.97mL3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)缓慢滴加至上述溶液中，反应在80℃下剧烈搅拌2h。待冷却至室温后，离心(9500r/min×8min)收集得到白色固体物，分别用甲醇和去离子水超声清洗数次，产物冻干后即得含有表面活性剂的介孔硅纳米粒子(CTAB@MSN-SH)。
为去除介孔硅纳米粒子的表面活性剂采用甲醇酸性条件萃取法。称取1.0gCATB@MSN-SH加入160mL无水甲醇中，震荡、超声分散均匀后，加入9.0mL的浓HCl(质量分数37％)，在60℃条件下回流反应48h，经过离心用甲醇和去离子水清洗数次，产物冻干得到介孔硅纳米粒子(MSN-SH)。
2.S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的制备
将2，2-二硫二吡啶[4.41g，20.0mmol]溶解在20mL无水甲醇和0.8mL乙酸中(溶液a)，再将半胺盐酸盐[1.14g，100.0mmol]溶解在10mL无水甲醇中(溶液b)，将溶液b逐滴滴加(30min内滴完)至溶液a中。在室温下搅拌反应48h后，用旋转蒸发仪浓缩旋干，得到黄色油状物，溶解在10mL无水甲醇中，并用200mL乙醚沉淀三次后，真空干燥。
3.双硫功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-NH2)
准确称取500mgMSN-SH，在100mL甲醇中超声分散均匀。然后加入500mgS-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐，在室温下反应24h。将产物离心，并用甲醇和去离子水超声清洗数次，冻干后得到双硫功能化的介孔硅纳米粒子(MSN-SS-NH2)。
4.腙键功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-N＝C-ph)
150mgMSN-SS-NH2分散于60mLpH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声使其分散均匀，然后加入1.0g苯甲醛，室温下反应24h。将产物离心收集，用pH＝8.0的PBS缓冲溶液超声清洗数次，冻干后得到腙键功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-N＝C-ph。
5. 6-氨基化的β-环糊精的制备(β-CD-NH2)
制备β-CD-NH2分两步，首先合成6-OTs化的β-环糊精和合成6-氨基化的β-环糊精。
合成6-OTs化的β-环糊精的步骤如下：将β-CD称取25g悬浮于300ml浓度为0.4mol/L NaOH溶液中。在0℃冰水浴下缓慢加入18g对甲苯磺酰氯(TsCl)以确保取代发生在6号位，低温搅拌45min后将沉淀过滤两次，滤液用稀盐酸调节pH至6，有大量白色沉淀析出，4℃下保存过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在60℃下真空干燥30h。
合成6-氨基化的β-环糊精的步骤如下：将10g6-OTs化的β-环糊精溶解在60mL无水乙二胺(重蒸)中，在80℃下通入N2回流48h，冷却至室温，用丙酮沉淀一天后，用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次共沉淀三次后真空干燥48h得到β-CD-NH2。
6.透明质酸(HA)嫁接β-CD的制备(HA-B-CD)
称取500mgHA(4-8KDa)溶于30mL去离子水中，水合过夜，加入379.4mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和227.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于冰浴4℃活化羧基，过夜后调节pH至5.0，然后加入3.0gβ-CD-NH2于室温下反应48h。反应结束后用MWCO＝3.5KDa透析袋透析3至5天，期间每6h换一次水，冻干后即得HA-B-CD。
7.载体粒子DOX@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA的制备
称取100mgMSN-SS-N＝C-ph分散于30mLpH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声分散均匀，然后再加入25mg盐酸阿霉素(DOX·HCl)，在室温下避光剧烈搅拌24h。最后加入100mgHA-B-CD，在室温下避光反应24h，反应结束后用pH＝8.0的PBS缓冲溶液和去离子水清洗数遍，冻干后得DOX@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA。
附图部分给出了实施例1各步骤产物的表征图，下表示出实施例1各步骤产物的BET、VP、BJH和和Zeta-potential数据：
Figure BDA0001840977850000081
实施例2
1.巯基功能化介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SH)
准确称取0.8gNaOH加入到480mL去离子水中，再加入1.0g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后超声溶解，剧烈搅拌升温至80℃，5.0mL的正硅酸四乙酯(TEOS)和0.97mL3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)缓慢滴加至上述溶液中，反应在80℃下剧烈搅拌2h。待冷却至室温后，离心(9500r/min×8min)收集得到白色固体物，分别用甲醇和去离子水超声清洗数次，产物冻干后即得含有表面活性剂的介孔硅纳米粒子(CTAB@MSN-SH)。
为去除介孔硅纳米粒子的表面活性剂采用甲醇酸性条件萃取法。称取1.0gCATB@MSN-SH加入160mL无水甲醇中，震荡、超声分散均匀后，加入12.0mL的浓HCl(质量分数37％)，在70℃条件下回流反应72h，经过离心用甲醇和去离子水清洗数次，产物冻干得到介孔硅纳米粒子(MSN-SH)。
2.S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的制备
将2，2-二硫二吡啶[4.41g，20.0mmol]溶解在20mL无水甲醇和0.8mL乙酸中(溶液a)，再将半胺盐酸盐[1.14g，100.0mmol]溶解在10mL无水甲醇中(溶液b)，将溶液b逐滴滴加(30min内滴完)至溶液a中。在室温下搅拌反应48h后，用旋转蒸发仪浓缩旋干，得到黄色油状物，溶解在10mL无水甲醇中，并用200mL乙醚沉淀三次后，真空干燥。
3.双硫功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-NH2)
准确称取500mgMSN-SH，在120mL甲醇中超声分散均匀。然后加入500mgS-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐，在室温下反应36h。将产物离心，并用甲醇和去离子水超声清洗数次，冻干后得到双硫功能化的介孔硅纳米粒子(MSN-SS-NH2)。
4.腙键功能化的介孔硅纳米粒子的制备(MSN-SS-N＝C-ph)
180mgMSN-SS-NH2分散于60mLpH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声使其分散均匀，然后加入1.0g苯甲醛，室温下反应24h。将产物离心收集，用pH＝8.0的PBS缓冲溶液超声清洗数次，冻干后得到腙键功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-N＝C-ph。
5. 6-氨基化的β-环糊精的制备(β-CD-NH2)
制备β-CD-NH2分两步，首先合成6-OTs化的β-环糊精和合成6-氨基化的β-环糊精。
合成6-OTs化的β-环糊精的步骤如下：将β-CD称取25g悬浮于300ml浓度为0.4mol/L NaOH溶液中。在0℃冰水浴下缓慢加入18g对甲苯磺酰氯(TsCl)以确保取代发生在6号位，低温搅拌45min后将沉淀过滤两次，滤液用稀盐酸调节pH至6，有大量白色沉淀析出，4℃下保存过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在60℃下真空干燥30h。
合成6-氨基化的β-环糊精的步骤如下：将10g6-OTs化的β-环糊精溶解在50mL无水乙二胺(重蒸)中，在80℃下通入N2回流48h，冷却至室温，用丙酮沉淀一天后，用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次共沉淀三次后真空干燥48h得到β-CD-NH2。
6.透明质酸(HA)嫁接β-CD的制备(HA-B-CD)
称取500mgHA(3-6KDa)溶于30mL去离子水中，水合过夜，加入379.4mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和227.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于冰浴4℃活化羧基，过夜后调节pH至5.0，然后加入3.0gβ-CD-NH2于室温下反应48h。反应结束后用MWCO＝3.5KDa透析袋透析3至5天，期间每6h换一次水，冻干后即得HA-B-CD。
7.载体粒子DOX@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA的制备
称取100mgMSN-SS-N＝C-ph分散于30mLpH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声分散均匀，然后再加入25mg盐酸阿霉素(DOX·HCl)，在室温下避光剧烈搅拌24h。最后加入100mgHA-B-CD，在室温下避光反应24h，反应结束后用pH＝8.0的PBS缓冲溶液和去离子水清洗数遍，冻干后得DOX@MSN-SS-N＝C-B-CD-HA。

Claims (7)

1.一种制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1:巯基功能化介孔硅纳米粒子MSN-SH的制备
准确称取NaOH加入到去离子水中，再加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后超声溶解，剧烈搅拌升温至60-80℃，正硅酸四乙酯(TEOS)和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)缓慢滴加至上述溶液中，反应在80℃下剧烈搅拌2h；待冷却至室温后，以9500r/min×8min离心收集得到白色固体物，分别用甲醇和去离子水超声清洗数次，产物冻干后，即得含有表面活性剂的介孔硅纳米粒子CTAB@MSN-SH；去除介孔硅纳米粒子的CTAB后，产物冻干得到介孔硅纳米粒子MSN-SH；
S2:双硫功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-NH2的制备
准确称取MSN-SH，在甲醇中超声分散均匀；然后加入S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐，在室温下反应；将产物离心，并用甲醇和去离子水超声清洗数次，冻干后得到双硫功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-NH2；
S3:腙键功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-N＝C-ph的制备
将MSN-SS-NH2分散于pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声使其分散均匀，然后加入苯甲醛，室温下反应24h；将产物离心收集，用pH＝8.0的PBS缓冲溶液超声清洗数次，冻干后得到腙键功能化的介孔硅纳米粒子MSN-SS-N＝C-ph；
S4:载体粒子X@MSN-SS-N＝C/B-CD-HA的制备
称取MSN-SS-N＝C-ph分散于pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，超声分散均匀，然后再加入药物X，在室温下避光剧烈搅拌；最后加入透明质酸嫁接的β-环糊精，在室温下避光反应12-48小时，反应结束后用pH＝8.0的PBS缓冲溶液和去离子水清洗数遍，冻干后即得X@MSN-SS-N＝C/B-CD-HA；
所述透明质酸嫁接β-环糊精HA-B-CD的制备包括两个步骤A和B：
步骤A：6-氨基化的β-环糊精β-CD-NH2的制备
制备β-CD-NH2分两步，首先合成6-OTs化的β-环糊精再合成6-氨基化的β-环糊精；
合成6-OTs化的β-环糊精的步骤如下：将β-CD悬浮于浓度为0.4mol/LNaOH溶液中，在0℃冰水浴下缓慢加入对甲苯磺酰氯(TsCl)以确保取代发生在6号位，低温搅拌45min后将沉淀过滤两次，滤液用稀盐酸调节pH至5-6.5，有大量白色沉淀析出，4℃下保存过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在20-80℃下真空干燥12-48h；
合成6-氨基化的β-环糊精的步骤如下：将6-OTs化的β-环糊精溶解在重蒸无水乙二胺中，在60-90℃下通入N2回流24-96h，冷却至室温，用丙酮沉淀一天后，用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次，共沉淀三次后真空干燥得到β-CD-NH2；
步骤B：透明质酸嫁接β-环糊精HA-B-CD的制备
称取HA溶于去离子水中，水合过夜，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于冰浴4℃活化羧基，过夜后调节pH至4.0-6.0，然后加入β-CD-NH2于室温下反应24-72h，反应结束后用MWCO＝3.5KDa透析袋透析3-5天，期间每6h换一次水，冻干后即得HA-B-CD。
2.根据权利要求1所述的制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：步骤S1中去除介孔硅纳米粒子的CTAB采用甲醇酸性条件萃取法:称取CTAB@MSN-SH加入无水甲醇中，震荡、超声分散均匀后，加入质量分数37％的浓HCl，在20-80℃条件下回流反应12-96h，经过离心用甲醇和去离子水清洗数次，产物冻干得到介孔硅纳米粒子MSN-SH。
3.根据权利要求1所述的制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：所述S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的制备方法为：将2，2-二硫二吡啶溶解在无水甲醇和乙酸中，形成溶液a；再将半胱胺盐酸盐溶解在无水甲醇中，形成溶液b；将溶液b逐滴滴加至溶液a中，要求在30min内滴完；在室温下搅拌反应24-96h后，用旋转蒸发仪浓缩旋干，得到黄色油状物，溶解在无水甲醇中，并用乙醚沉淀三次后，真空干燥。
4.根据权利要求3所述的制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：2，2-二硫二吡啶与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:5；无水甲醇与乙酸的体积比为20:0.8。
5.根据权利要求1所述的制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：
步骤A中，β-CD与对甲苯磺酰氯的质量比为25:12-24；氢氧化钠溶液的质量为β-CD质量的10-20倍；6-OTs化的β-CD与无水乙二胺的质量体积比为10g:40-80ml；
步骤B中，HA、EDC·HCl、NHS、β-CD-NH2的质量比为10:6-8:4-5:50-80；HA的分子量为3KDa-10KDa。
6.根据权利要求1所述的制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法，其特征在于：步骤S2中，MSN-SH与S-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐的质量比为1:1；步骤S3中，MSN-SS-NH2与苯甲醛的质量比为10-20:100；步骤S4中，MSN-SS-N＝C-ph、HA-B-CD、药物X的质量比为100:100:1-100；所述药物X为盐酸阿霉素(DOX·HCl)。
7.权利要求1-6中任一项所述制备功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统的方法制备得到的功能化介孔硅基肿瘤靶向运输控释系统。
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