CN109662955B - 一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用。该纳米颗粒为：FA‑CS‑g‑OA负载DOX。制备方法包括：接枝叶酸的壳聚糖制备，接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒制备，齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒制备。该方法操作简单、实验条件温和，载药量更大，且该壳聚糖载药纳米颗粒能够长效缓释药物。

Description

一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于载药纳米材料及其制备方法和应用领域，特别涉及一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症仍然是世界上最主要的致命性疾病，而且未来癌症患者的预估数量是非常庞大的。根据2012年的调查，有超过1400万新的癌症病例出现，其中820万癌症患者最终死亡。虽然在过去的几十年里，癌症治疗取得了巨大的进展，但不幸的是，这种疾病治愈的病人数量仍然有限。尤其是乳腺癌，这种女性中最常见的癌症。据报道，只有23％的乳腺癌患者存活超过5年。化疗是治疗乳腺癌的主要手段。这种方法依靠化疗药物(如阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、5-FU等)的高细胞毒性，广泛的杀死肿瘤细胞。然而，大多数常用的化疗药物都存在固有的缺陷，如对正常组织的毒副作用、水溶性差、生物利用度低、免疫原性差、血液清除快、耐药癌细胞的出现等。为了解决上述局限，研究人员越来越关注可以提高抗肿瘤药物的溶解度和靶向性的治疗药物，以及保护药物免受血液/肾清除和通过EPR效应快速实现药物在肿瘤位置的积累。
另一方面，肿瘤细胞的多耐药性是癌症患者化疗失败的主要原因。其机制主要与膜转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多耐药蛋白(MRP1)的过表达有关，这些蛋白会泵出细胞内的抗癌药物，从而维持细胞中的低药物水平，这大大降低了细胞对药物的敏感性。研究结果表明，齐墩果酸(OA)可以增强许多抗癌药物的细胞毒性作用，这是由于其抑制了MRP1和P-gp活性，从而逆转了MRP1介导的抗癌药物外排，这称为“化学增敏效应”。除此之外，疏水性OA的引入可以为壳聚糖复合材料提供一个疏水核心，其在水中分散为两亲性纳米颗粒可通过自组装形成具有核壳结构的球体，并可装载疏水药物阿霉素(DOX)，在体内可发挥协同治疗乳腺癌的作用。因此，在这些抗肿瘤化疗药物的临床应用中，选择合适的药物载体是至关重要的。纳米药物传递系统的大小和细胞多耐药性的克服仍然是一项具有挑战性的任务。如何创新性地将抗肿瘤药物DOX和化疗增敏剂OA结合在一起，在肿瘤位置达到同步释放特性，值得深入研究。根据之前报道，Muhammad Sarfraz等，利用脂质体载体构建将齐墩果酸和DOX共载药的纳米药物传递系统(Muhammad Sarfraz，等.Oncotarget 8(2017)47136-47153)，进行抗肿瘤治疗，得到了较好的治疗效果和较小的副作用。但该方法操作步骤较为复杂，载药量不够，主动靶向性偏低，其载体粒径也偏大。因此对这种共载药系统的深入探究，具有广阔的研究前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备方法和应用，以克服现有技术中肿瘤细胞多耐药性的缺陷。
本发明的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒，所述纳米颗粒为：FA-CS-g-OA负载DOX，其中FA-CS-g-OA的结构式为：
Figure BDA0001963583220000021
式中n＝50～100。
本发明的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将叶酸FA经EDC和NHS活化，将活化后的FA加到溶有壳聚糖的醋酸缓冲液中，避光搅拌，透析，除去未反应的FA，冻干，得到接枝叶酸的壳聚糖FA-CS，其中FA、EDC和NHS的摩尔比(确认)为1:1～1.5:1～1.5，叶酸FA与壳聚糖的摩尔比为500:1～100:1；
(2)在DMAP的存在下，将步骤(1)中FA-CS溶解在吡啶中，加入齐墩果酸OA，搅拌反应，纯化，得到接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒FA-CS-g-OA，冻干，其中FA-CS、DMAP、吡啶和OA的摩尔比为1:0.00001～1:0.01～1:400～0.0001；
(3)将步骤(2)中冻干后的FA-CS-g-OA溶于水中，将DOX溶解于有机溶剂中，将得到的FA-CS-g-OA溶液和DOX溶液一起密封在透析袋中透析，离心去除未载上的药物，得到自组装成的齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX，其中FA-CS-g-OA溶液浓度为8～15mg/mL，DOX溶液浓度为1～3mg/mL，FA-CS-g-OA与DOX的摩尔比为4:1～6:1。
所述步骤(1)中将叶酸FA经EDC和NHS活化具体为：将叶酸FA、EDC和NHS加入到无水DMSO溶液中，在室温下搅拌0.5～2h。
所述步骤(1)中醋酸缓冲液浓度为0.8～1.5％w/v。
所述步骤(1)中溶有壳聚糖的醋酸缓冲液pH值为4～5。
所述步骤(1)中避光搅拌为：室温下避光搅拌过夜。
所述步骤(1)中透析为：用MWCO＝3000～5000的透析袋在1.0mM NaOH溶液中透析70～80小时。
所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2～5h。
所述步骤(2)中纯化具体为：旋转蒸发掉溶剂，得到的沉淀物溶解在丙酮中，用水冲洗三次。
所述步骤(3)中透析袋是用Mw＝8000～10000Da的透析袋。
所述步骤(3)中透析温度为20～30℃，透析时间为40～50h。
所述步骤(3)中有机溶剂为DMSO。
所述步骤(3)中离心为：5000～8000rpm离心20～40分钟。
本发明的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的应用。
将本发明的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒溶于PBS缓冲液中，置于透析袋。于三种不同pH值环境下测定其药物释放，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得出药物释放曲线。药物释放所需的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒为1mg，外缓冲液每次取液并补充的体积为1ml。
将本发明的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒分别应用于正常细胞和乳腺癌细胞检测细胞存活情况，验证其体外抗癌效果。检测细胞存活实验中FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的上样量为每孔加入20μl溶有DOX的PBS溶液(DOX浓度从0.001到10μg/ml)。
本发明利用壳聚糖纳米载药颗粒FA-CS-g-OA@DOX中齐墩果酸(OA)的疏水性，纳米颗粒自组装形成的疏水中心可负载大量疏水药物，合成含DOX的乳腺癌靶向的壳聚糖接枝聚合物载药复合材料。
有益效果
(1)本发明方法操作简单、实验条件温和；
(2)制备得到的载药纳米颗粒粒径160nm左右，能够通过EPR效应最大程度的在乳腺癌位置聚集；
(3)本发明的含DOX的乳腺癌靶向壳聚糖载药复合材料能够长效缓释药物。且具有pH响应性药物释放，在肿瘤位置较低的pH值环境下加速释放DOX和OA，减少损害其他正常组织，具有继续往后相关实验分析的潜力；
(4)本发明的乳腺癌靶向壳聚糖纳米载药颗粒FA-CS-g-OA@DOX释放的OA，可以减少肿瘤细胞P-gp和MPR1的表达，从而抑制肿瘤的耐药性，达到协同治疗的效果，增强抗癌作用。
附图说明
图1为本发明制备乳腺癌靶向的壳聚糖接枝纳米复合物FA-CS-g-OA的工艺过程。
图2为实施例1中FA-CS-g-OA纳米颗粒的1H NMR图谱。
图3为实施例1中FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的TEM图。
图4为实施例2中载有DOX的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒在不同pH环境下DOX(A)和OA(B)的释放曲线。
图5为实施例3中药物DOX、单纯的OA、载体FA-CS-g-OA及载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX对乳腺癌(A)和正常细胞(B)的MTT结果。
图6为实施例4中药物DOX、单纯的OA、载体FA-CS-g-OA及载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX在不同浓度下的血液相容性结果。
图7为实施例5中药物DOX、单纯的OA、载体FA-CS-g-OA及载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX对乳腺癌细胞中耐药性相关因子P-gp、MPR1和β-action的灰度值扫描图(A)以及对P-gp、MPR1的表达水平(B)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
CS购买自Sino Pharm化学试剂有限公司(上海，中国)，分子量100kDa；DMAP，吡啶，EDC，NHS，MTT，齐墩果酸和PBS缓冲液购买自Sigma-Aldrich(MO，美国)试剂公司；叶酸由Wako Pure化学试剂公司(Osaka，日本)提供；DOX和透析袋购买自上海源叶生物技术有限公司(上海，中国)；DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，青霉素，链霉素，和胰蛋白酶购买自Gibco(CA，美国)公司；P-gp，MRP1和β-actin抗体购买自Cell SignalingTechnology(MA，美国)试剂公司；实验中所用的去离子水来自于Milli-Q Gradient A10纯水系统。
实施例1
(1)将叶酸(FA)与EDC，NHS按照摩尔比为1:1:1加入到无水DMSO溶液(DMSO与叶酸的比例为15mL：3mg)，在室温下不断搅拌，直到FA溶解，时间为1h。然后，激活的FA(3g)缓慢添加到溶有5g壳聚糖的醋酸缓冲液(500mL)(醋酸缓冲液浓度为1.0％w/v)中(pH值4.7)，得到的混合溶液在室温下避光搅拌一整夜。将混合液用透析袋(MWCO＝3500)在1.0mM NaOH溶液中透析72小时，除去未反应的FA。最后，冻干法(将透析后的FA溶液冷冻后，置于冷冻干燥机中冻干3天)得到FA-CS。
(2)通过酯化反应将齐墩果酸(OA)接枝到FA-CS上。在DMAP(0.05g)的存在下，将FA-CS(0.50g)溶解在吡啶(12mL)中，加入0.9g OA。反应在室温下搅拌3小时，然后旋转蒸发掉溶剂。得到的沉淀物溶解在丙酮中，用水冲洗三次，进一步净化。收集得到微小的晶体(FA-CS-g-OA)，产率为92.0％，将洗净后的FA-CS-g-OA冷冻后，置于冷冻干燥机中冻干3天，得到FA-CS-g-OA粉末。
(3)将冻干得到的FA-CS-g-OA纳米颗粒(100mg)溶于10ml水中，将DOX(20mg)溶解在DMSO(10ml)中，将得到的FA-CS-g-OA溶液和DOX溶液一起密封在透析袋(Mw＝8000Da)中，在25℃透析48小时。然后在6000rpm离心30分钟去除未载上的药物，得到自组装成的FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒。
图3表明：得到的FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒在透射电镜下，呈大小均匀、形状统一的球形，粒径大小在90nm左右，适合荷瘤小鼠的静脉注射治疗，能够最大限度的发挥肿瘤治疗EPR效应。
实施例2
取实施例1中FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒(3mg)溶于3mL去离子水中形成FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒(1mg/mL)溶液，将3ml FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒溶液置于一个透析袋(MWCO＝14,000Da)中，外边填充释放介质为PBS(0.1M，5ml)，加入醋酸盐溶液调节pH值分别为5.0，6.5和7.4。在37℃的环境中以100rpm的速度不断搅拌。在预定时间后，从释放介质中取出1ml的PBS缓冲液，并在释放系统中补入等量的新鲜缓冲液。使用紫外可见光谱法(UV-vis)测定了上清液中DOX或OA的释放量。
如图4(A)所示，可以发现pH对FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的药物释放有显著影响。在pH＝5.0的情况下，前24小时DOX很快就从FA-CS-g-OA@DOX NPs中释放出来，后期释放变得缓慢。在pH＝7.4的情况下，48h后只有～35％的DOX释放。体现出了FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒中DOX的pH响应性释放特性。同样，OA从FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的释放特性也受不同pH的影响较大(图4B)。在37℃条件下，72小时后FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒中OA的累积释放百分比在pH值＝7.4，6.5和5.0时，分别为30.99±3.19％，51.81±5.27％和76.00±8.23％，表明了酸性环境同样可以通过促进酯键的水解加速OA的释放。
实施例3
在96孔细胞培养板中种入乳腺癌MDA-MB-231或正常HUVEC细胞，每孔细胞密度～1×105个，并补足每孔200μL的DMEM全培养基，在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。接着倒掉旧培养基，每孔加入20μL含有不同浓度的溶有DOX，OA，FA-CS-g-OA和FA-CS-g-OA@DOX的PBS溶液(DOX浓度从0.001到10μg/ml)，并补足180μL新鲜培养基。孵育24h后，每孔加入20μL的5mg/ml的MTT溶液，在37℃培养箱中孵育4h，吸去孔内培养液，并添加200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪检测490nm处各孔的紫外吸收值。
如图5(A)所示，经过4小时孵育，在DOX(0.001-10μg/ml)的浓度范围内，相对于单纯的DOX，FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒在杀死乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出更高的治疗效果。由于FA-CS-g-OA对MDA-MB-231的细胞毒性高于单独OA，因此可以推测含有OA的载药纳米比单纯的OA更有效的促进细胞摄取药物，而且肿瘤的酸性微环境加速了FA-CS-g-OA@DOX中OA释放。如图5(B)所示，材料载体FA-CS-g-OA在这个DOX浓度范围内对正常HUVEC细胞的毒性可忽略不计(>90％的细胞活性)。综合说明FA-CS-g-OA纳米颗粒没有明显的细胞毒性，可以安全的作为抗癌药物的载体使用。且FA-CS-g-OA@DOX的共载药抗肿瘤细胞效果超过了两种单一药物疗法的理论药物治疗结合效果，这些结果也证实了文献报道的OA对DOX细胞毒性的化学增敏作用。
实施例4
收集雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的血液，用1500rpm离心15分钟分离红细胞(RBC)，然后红细胞在2％(w/v)的冷生理盐水中重新悬浮。将DOX、OA、FA-CS-g-OA和FA-CS-g-OA@DOX连续稀释至不同浓度(DOX和OA以1％DMSO稀释，FA-CS-g-OA和FA-CS-g-OA@DOX以去离子水稀释)，加入红细胞中在37℃水浴孵育30分钟或120分钟。离心(1500rpm,10min)，收集上清液。在酶标仪上读取540nm的吸光度，测定血红蛋白释放量。
如图6所示，在FA-CS-g-OA纳米颗粒浓度低于250μg/mL时，几乎没有观察到明显的溶血现象。而单纯的DOX在非常低的浓度就可以诱导明显的红细胞溶血，而FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒在浓度250μg/mL时产生了非常微弱可忽略不计的溶血(<10％)。虽然单纯的OA会对红细胞造成轻微的损伤，但是将OA接枝到FA-CS材料上，可以显著降低溶血水平。这说明FA-CS-g-OA是生物相容性和血液相容性极好的聚合物，适合作为药物传递载体的潜在应用。
实施例5
将MDA-MB-231荷瘤小鼠随机分为5组(每组8只)，每2天分别注射生理盐水(Saline)、DOX、OA、FA-CS-g-OA、FA-CS-g-OA@DOX(7.5mg/kg DOX equiv)。30天后取下裸鼠全部肿瘤，用生理盐水洗净，匀浆提取总蛋白。蛋白定量后，每组样本取40μg总蛋白质加在10％SDS–PAGE泳道上进行电泳分离。然后将目标蛋白质半干法转移到PVDF膜上，洗膜后，分别加抗体P-gp(1:1000)、MRP1(1:1000)和β-action(1:500)，4℃孵育过夜，PBS冲洗10分钟3次后，室温下孵育相应二抗2小时。加入化学发光试剂，曝光，显影，洗膜，采用ImageJ软件进行灰度值扫描。
如图7所示，与Saline组相比，DOX显著诱导P-gp蛋白增加，说明DOX通过引起P-gp水平的增加导致了乳腺癌细胞耐药性。与DOX组相比，FA-CS-g-OA@DOX、FA-CS-g-OA、和OA组肿瘤的P-gp表达水平分别降低了61.35％、36.87％和25.34％。而在MDA-MB-231肿瘤细胞中MRP1的表达水平也有类似的趋势。当使用FA-CS-g-OA@DOX处理时，MRP1的表达几乎无法检测到，如图7所示，当小鼠使用OA和含OA的材料处理后，MRP1蛋白表达量下降明显。显示出FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒降低肿瘤细胞耐药性方面的巨大潜力。所有这些都表明OA可能是治疗耐药性肿瘤的一个很好的选择，无论是作为佐剂还是作为化疗药物本身。
对比例1
根据之前的报道(Muhammad Sarfraz，等.Oncotarget 8(2017)47136-47153)，Muhammad Sarfraz课题组利用脂质体构建齐墩果酸和DOX纳米共载药系统，该方法将HSPC和CHOL以2:1的比例，以乙醇中挤压的方法制得脂质体，然后在脂质体上修饰PEG增加其稳定性。最后将齐墩果酸和DOX以5：1的比例载入脂质体内，其得到的药物传递系统ODL体外抗肿瘤半致死量IC50为1.64±0.089μg/mL，DOX载药量为11％，但不能够主动靶向于肿瘤细胞，并未验证其能否降低肿瘤细胞中P-gp和MRP1的蛋白表达水平。而本发明得到的纳米共载药系统FA-CS-g-OA@DOX的IC50为1.8±0.1μg/mL，与其抗癌效果相当，但本发明的方法操作简单、实验条件温和，具有主动靶向性，载药量更大(15.6％)，并且能够降低肿瘤细胞中P-gp和MRP1的蛋白表达水平，减少肿瘤的耐药性。

Claims (10)

1.一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为：FA-CS-g-OA负载DOX，其中FA-CS-g-OA的结构式为：
Figure FDA0002916868770000011
式中n＝50～100。
2.一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将叶酸FA经EDC和NHS活化，将活化后的FA加到溶有壳聚糖的醋酸缓冲液中，避光搅拌，透析，冻干，得到接枝叶酸的壳聚糖FA-CS，其中FA、EDC和NHS的摩尔比为1:1～1.5:1～1.5，叶酸FA与壳聚糖的摩尔比为500:1～100:1；
(2)在DMAP的存在下，将步骤(1)中FA-CS溶解在吡啶中，加入齐墩果酸OA，搅拌反应，纯化，得到接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒FA-CS-g-OA，冻干，其中FA-CS、DMAP、吡啶和OA的摩尔比为1:0.00001～1:0.01～1:400～0.0001；
(3)将步骤(2)中冻干后的FA-CS-g-OA溶于水中，将DOX溶解于有机溶剂中，将得到的FA-CS-g-OA溶液和DOX溶液一起密封在透析袋中透析，离心，得到齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX，其中FA-CS-g-OA溶液浓度为8～15mg/mL，DOX溶液浓度为1～3mg/mL，FA-CS-g-OA与DOX的摩尔比为4:1～6:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将叶酸FA经EDC和NHS活化具体为：将叶酸FA、EDC和NHS加入到无水DMSO溶液中，在室温下搅拌0.5～2h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中醋酸缓冲液浓度为0.8～1.5％w/v；溶有壳聚糖的醋酸缓冲液pH值为4～5；避光搅拌为：室温下避光搅拌过夜。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中透析为：用MWCO＝3000～5000的透析袋在1.0mM NaOH溶液中透析70～80小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2～5h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中纯化具体为：旋转蒸发掉溶剂，得到的沉淀物溶解在丙酮中，用水冲洗三次。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中透析袋是用Mw＝8000～10000Da的透析袋；透析温度为20～30℃，透析时间为40～50℃。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中有机溶剂为DMSO；离心为：5000～8000rpm离心20～40分钟。
10.一种如权利要求1所述的齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒在制备抑制肿瘤的耐药性药物和pH响应性药物中的应用。
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