CN104645345A - 叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管复合材料的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具体的多壁碳纳米管的修饰方法。多壁碳纳米管(MWCNT)采用加热回流的方法酸化，通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、zate电位仪、透射电镜(TEM)等手段表征，其内径大约6nm左右。同时采用均相合成法制备出叶酸壳聚糖(FA-CHI)偶联物，并将酸化的纳米管与FA-CHI偶联物反应，形成FA-CHI-MWCNT复合纳米材料，其内径大约为26nm左右。所合成的复合纳米材料在一定程度上增加了生物相容性以及靶向性，在生物和医学领域将有着较好的应用前景。此表面修饰方法工艺流程短，使用设备材料较少，应用前景好，是一种理想的多壁碳纳米管的修饰方法。
Description
技术领域：
本发明属纳米材料科学领域，涉及肿瘤靶向治疗的新型载药材料。具体涉及一种具有靶向性且生物相容性良好的新载体——叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管复合材料的制备。
背景技术：
碳纳米管(CNTs)是由碳原子构成的石墨片卷成的中空圆柱体。碳纳米管具有管状结构，因而在生物环境中比球形粒子和片状粒子更适合作为药物载体。首先，碳纳米管具有良好的柔性，能够通过弯曲作用增大与细胞的接触面积；其次，能够通过主动内吞作用和被动扩散的途径顺利跨膜进入细胞内；最后，碳纳米管表面与药物分子之间存在着较强的π-π相互作用以及静电作用，能够高效负载药物。其管状结构具有很强的吸附能力，其内部可以容纳生物活性分子及药物，且在药物递送过程中还能够保持其活性。因此，近年来碳纳米管被广泛用于药物载体的研究。然而其溶解性和生物相容性一直限制着其在生物医学领域的应用，因此对碳纳米管的改性研究成为关键。
叶酸受体(FR)是一种跨糖蛋白，它可以通过介导细胞内吞作用将叶酸(FA)或FA-偶联物由细胞外转运到细胞内发挥作用。叶酸受体在许多癌细胞过度表达，而在正常的器官中很少表达，甚至不表达。通过给药系统的叶酸与肿瘤细胞表面高表达的FR的特异性结合，来实现叶酸结合物的靶向传递，从而减少药物治疗癌症时对正常细胞的损害。叶酸与叶酸受体具有高亲和力，低免疫原性，易于改造，小尺寸，存储稳定性，与各种有机和水性溶剂的兼容性，成本低，容易获得等优点，故其在靶向给药系统中有越来越多的应用。壳聚糖(CHI)是甲壳素的脱乙酰基产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸抗溃疡及直接抑制肿瘤细胞的作用，并且便于表面修饰，与现有的抗癌药合用可增强其抗癌效果。
本发明中的叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管与传统载药材料相比制备方法简单、载药量大、靶向性好、生物相容性高。
发明内容：
本发明的目的为制备一种靶向性高、生物相容性好、载药量大的药物载体。具体涉及叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管复合载药材料的制备。
本发明中所述的叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管的具体合成方法如下：
1)将碳纳米管加入到一定体积的浓硝酸中，充分超声后在一定的温度下加热回流，得到产物A。
2)将叶酸溶于一定量的无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌下分别加入缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和一定量的三乙胺，，在一定温度下氮气保护避光反应过夜，得到溶液B。
3)称取一定量的壳聚糖，溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，缓慢滴加溶液B，滴毕，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，一定温度下避光反应过夜，得到产物C。
4)准确称取已干燥的产物A溶于一定量的蒸馏水中，充分超声使其分散均匀。将一定量的产物C溶于一定量的DMSO溶液中。将产物C的DMSO溶液缓慢滴加到A的水溶液中。再加入一定量的EDC，搅拌一定时间。反应结束后离心取下层固体。将固体用乙醇洗涤三遍后置于红外灯下干燥过夜，得到叶酸及壳聚糖修饰的多壁碳纳米管复合材料(FA-CHI-MWCNT)。
在步骤1)中，加入的浓硝酸体积为50～100ml，超声时间为30min，加热回流10～20h。
在步骤2)中，无水DMSO的体积为20～40ml，温度为45℃.反应时间为24h。
在步骤3)中，醋酸-醋酸钠缓冲溶液的体积为30ml，加入EDC的量为0.1～0.2g。温度为45℃。
在步骤4)中，产物A的量为20～40mg，蒸馏水为10～30ml，产物C为300～500mg，EDC为100～200mg。反应时间为20～30h。
本发明中的FA-CHI-MWCNT经透射电镜(TEM)检测，其内径约为26nm左右，与酸化后的MWCNT(内径6nm)相比，内径明显增加，且表面光滑、管口清晰。
本发明中，FA-CHI-MWCNT复合纳米材料与传统的载药材料相比有许多优点：
1)碳纳米管具有独特空腔结构，形貌均一，表面便于结构修饰，药物装载方便，可通过物理包封装载不同类型的抗肿瘤药物，载药量大。
2)叶酸分子可与叶酸受体结合，从而特异性地结合肿瘤组织细胞，具有良好的叶酸受体靶向性，减小对正常细胞的伤害，增加用药安全性及有效性。
3)壳聚糖分子具有良好的生物降解性和生物相容性，能使药物充分发挥药效，保证血药浓度维持恒定，且无毒副作用。
附图说明：
图1为酸化碳纳米管的红外谱图。横坐标为波数(nm-1)，纵坐标为吸光度。
图2为酸化碳纳米管的透射电镜图。
图3为CHI与FA-CHI及FA-NHS的红外吸收谱图。横坐标为波数(nm-1)，纵坐标为吸光度。
图4为FA-CHI-MWCNT1复合纳米材料的电镜图。其中MWCNT含量为25mg，FA的含量为352mg，CHI的含量为60mg。标尺为100nm。
图5为FA-CHI-MWCNT1复合纳米材料的电镜图。其中MWCNT含量为25mg，FA的含量为352mg，CHI的含量为60mg。标尺为100nm。
图6为FA-CHI-MWCNT2复合纳米材料的电镜图。其中MWCNT含量为45mg，FA的含量为176mg，CHI的含量为80mg。标尺为100nm。
图7为FA-CHI-MWCNT2复合纳米材料的电镜图。其中MWCNT含量为45mg，FA的含量为176mg，CHI的含量为80mg。标尺为50nm。
图8为FA-CHI-MWCNT2复合纳米材料的电镜图。其中MWCNT含量为45mg，FA的含量为176mg，CHI的含量为80mg。标尺为20nm。
具体实施方案：
实施例1：多壁碳纳米管的酸化。
在100ml的三颈瓶中加入多壁碳纳米管(100mg)和一定量的硝酸(50ml)，超声30min。超声完毕，在120℃条件下回流10h，停止反应，静置过夜。将上层的硝酸分离后加蒸馏水稀释，再次静置。重复上面的操作，将上层的水溶液分离后，再往剩余的反应液中加入蒸馏水稀释。将反应液在7000r/min条件下离心3min，加水稀释离心，除去上清液，重复2～3次直至上层液体为墨水色。将上清液分离，所得固体置于红外灯下干燥过夜，得到酸化的碳纳米管。
实施例2：酸化碳纳米管的表征。
酸化碳纳米管的红外数据显示，1640cm-1处为碳氧双键的伸缩振动所产生的吸收峰，3400cm-1处为氧氢伸缩振动产生的吸收峰。上述结论表明纳米管已修饰上酸性基团。(参见图1)
测量酸化前后多壁碳纳米管的zeta电位可知，酸化前碳纳米管的zeta电位值为32.4mv，酸化后的碳纳米管电位降到-28.2mv，表明碳纳米管表面已连接负电基团，即已成功连接羧基。
实施例3：叶酸活化酯的制备。
在50ml三颈瓶中加入叶酸(882mg)，无水二甲亚砜(20ml)，搅拌下分别加入缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和一定量的三乙胺，在氮气保护下45℃避光反应过夜。停止反应，将反应液静置，抽滤除去白色副产物二环己基脲，将母液滴入含30％丙酮的无水乙醚溶液中，析出黄色固体，过滤，所得固体真空干燥，得到叶酸活化酯。
实施例4：叶酸壳聚糖偶联物的制备。
准确称取壳聚糖75mg，溶于pH＝4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，缓慢滴加20ml的叶酸活性酯的二甲亚砜溶液(20mg／ml)，滴毕，加入一定量的EDC，45℃暗处避光反应过夜。得到FA-CHI偶联物1。
实施例5：叶酸壳聚糖偶联物的制备。
准确称取壳聚糖200mg，溶于pH＝4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，缓慢滴加20ml的叶酸活性酯的二甲亚砜溶液(20mg/ml)，滴毕，加入一定量的EDC，45℃暗处避光反应过夜。得到FA-CHI偶联物2。
实施例6：叶酸壳聚糖偶联物的表征。
叶酸壳聚糖偶联物的红外图谱数据显示，在1635cm-1、1549cm-1处分别出现了壳聚糖酰胺I谱带和酰胺II谱带，叶酸活化酯在1710cm-1出现了酯羰基的特征吸收峰，而当叶酸活化酯与壳聚糖发生偶联后，在1590cm-1出现了酰胺羰基的特征吸收峰，在1400～1600cm-1处出现了芳环的吸收峰，在3460～3353cm-1处出现O-H伸缩振动及N-H伸缩振动吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰。表明已经成功制备叶酸壳聚糖偶联物。(参见图3)。
实施例7：FA-CHI-MWCNT复合纳米材料的合成。
准确称取已干燥的酸化MWCNT(25mg)溶于蒸馏水(15ml)中，超声约20min使其分散均匀。取一定量的FA-CHI偶联物1(约含CHI60mg，FA352mg)溶于DMSO(20ml)中。将FA-CHI的DMSO溶液缓慢滴加到MWCNT的水溶液中。再加入一定量的EDC，搅拌24h。反应结束后离心取下层固体。将固体用乙醇洗涤三遍后置于红外灯下干燥过夜。得到产物FA-CHI-MWCNT1。
实施例8：FA-CHI-MWCNT复合纳米材料的合成。
准确称取已干燥的酸化MWCNT(45mg)溶于蒸馏水(15ml)中，超声约20min使其分散均匀。取一定量的FA-CHI偶联物2(约含CHI80mg，FA176mg)溶于DMSO(20ml)中。将FA-CHI的DMSO溶液缓慢滴加到MWCNT的水溶液中。再加入一定量的EDC，搅拌24h。反应结束后离心取下层固体。将固体用乙醇洗涤三遍后置于红外灯下干燥过夜。得到产物FA-CHI-MWCNT2。
实施例9：FA-CHI-MWCNT复合纳米材料的表征
产物FA-CHI-MWCNT1在不同倍数的透射电镜下的检测结果表明，叶酸壳聚糖偶联物包覆于多壁碳纳米管表面，但有过量叶酸分子残留及壳聚糖分子团聚现象。(参见图4-图5)
产物FA-CHI-MWCNT2在不同倍数的透射电镜下的检测结果表明，叶酸壳聚糖偶联物均匀包覆于多壁碳纳米管外壁周围，且无明显的过量叶酸分子残留以及壳聚糖团聚情况。(参见图6-图8)
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.多壁碳纳米管的一种表面修饰，具体是用叶酸壳聚糖偶联物修饰的多壁碳纳米管的制备，首先将多壁碳纳米管酸化，然后通过均相合成法合成叶酸壳聚糖偶联物，最后将偶联物包覆到酸化后多壁纳米管的表面，其特征是在多壁碳纳米管表面均匀包覆叶酸壳聚糖偶联物。
2.如权利1所述的叶酸壳聚糖偶联物的均相合成法，其特征在于合成方法简单，产率较高，包括以下步骤：准确称取一定量的壳聚糖，溶于pH＝4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，缓慢滴加一定量的叶酸活化酯的二甲亚砜溶液20mg/ml，滴毕，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，45℃暗处避光反应过夜，得到叶酸壳聚糖偶联物。
3.如权利1和权利2所述的叶酸活化酯的制备方法，包括以下步骤：
1)在50ml三颈瓶中加入叶酸882mg，无水二甲亚砜20ml，搅拌下分别加入缩合剂二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和一定量的三乙胺，在氮气保护下45℃避光反应过夜；
2)反应停止后，将反应液静置，抽滤除去白色副产物二环己基脲，将母液滴入含30％丙酮的无水乙醚溶液中，析出黄色固体，过滤，将所得固体真空干燥，得到叶酸活化酯。
4.如权利1所述的多壁碳纳米管的酸化方法，包括以下步骤：
1)在100ml的三颈瓶中加入多壁碳纳米管100mg和一定量的硝酸50ml，超声30min后在120℃条件下加热回流10h，反应结束后，静置过夜；
2)将静置后的溶液中上层硝酸分离后加蒸馏水稀释，再次静置。重复上面的操作，将上层的水溶液分离后，再往剩余的反应液中加入蒸馏水稀释，将反应液在7000r/min条件下离心3min，加水洗涤后离心，除去上清液，重复2～3次直至上层液体为墨水色，将上清液分离，所得固体置于红外灯下干燥过夜，得到酸化的碳纳米管，其特征在于酸化后的碳纳米管纯度较高，便于结构修饰。
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