CN101531800B - 癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺树状大分子/碳纳米管复合材料的制备方法，包括：碳纳米管CNT进行酸化处理；聚酰胺胺树状大分子的异硫氰酸荧光素FI和叶酸FA的修饰；通过EDC化学键合法与酸化处理后的多壁碳纳米管表面的羧基反应，得到CNT复合物；将复合物表面剩余的树状大分子的端氨基与醋酸酐进行乙酰化反应，得到表面电荷呈中性的功能性复合碳纳米管。该功能化碳纳米管能够长时间地分散在溶液中，没有团聚现象发生，且功能化的多壁碳纳米管具有良好的生物相容性，能靶向地结合到癌细胞上，可用于癌细胞的早期靶向诊断；且制备方法简单，反应条件温和，易于操作，所用的聚合物均为环境友好的高分子材料，具有产业化实施的前景。
Description
技术领域
本发明属碳纳米管复合材料的制备领域，特别是涉及一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法。
背景技术
近期的纳米科学与技术的研究进展显示，碳纳米管作为一个多功能的平台，被广泛地应用于生物医学领域，如蛋白和多肽的传递，药物和基因的输送，医学成像，以及癌症的靶向与治疗等。但是，碳纳米管表面能很高，且管与管之间作用力(范德华力和静电力)强使得碳纳米管容易聚集成大的束状，导致碳纳米管的分散性差。碳纳米管在生物医学上的应用一般以提高碳纳米管的水溶性和生物相容性为前提。
目前，比较成功的常用于提高碳纳米管在各种溶剂中分散性的方法主要有超声法、表面活性剂稳定法和共价键修饰法。而碳纳米管化学功能化修饰法(共价键修饰法)由于其能在提高碳纳米管溶解度的同时，还能赋予所制备的碳纳米管复合材料新的性能而成为制备功能性碳纳米管的、最具有前景的方法。适宜于和碳纳米管进行共价连接的典型化学物质主要有多肽、酸、氨基酸、聚合物、聚赖氨酸以及各种小分子等。国内外的研究者对碳纳米管的表面功能化修饰展开了大量的研究。朱靖等采用原位酯交换聚合的方法，在多壁碳纳米管表面接枝多羟基超枝化的聚(胺-酯)来对其进行表面修饰。对比多壁碳纳米管改性前后的分散性能发现，经超枝化聚(胺-酯)修饰过的多壁碳纳米管要更容易分散在多种溶剂中，且在水中可稳定分散一个月，没有沉淀产生。Kam N.W.S.等先将端基为氨基或马来酰亚胺的磷脂大分子聚乙二醇(PL-PEG)通过非共价键吸附的方式修饰在单壁碳纳米管的表面，形成SWNT-PL-PEG-SS复合纳米管，再将复合碳纳米管上的二硫键断裂以接枝各种生物大分子，合成功能性的碳纳米管。实验结果证实，该功能性碳纳米管在溶液中能稳定分散，具有良好的生物相容性，能够用于DNA寡核苷酸的传输、释放和转染。专利“一种制备聚噻吩或其衍生物-多壁碳纳米管复合材料的方法”(专利公开号为CN1923888A)将聚噻吩或其衍生物高分子包覆在碳纳米管表面形成以碳纳米管为核，以聚噻吩或其衍生物为壳的核壳纳米结构，其溶解性能可以通过改变噻吩环上取代基的种类进行调节。这种材料可用在光电显示、纳米器件以及场发射器件等领域。
在目前用于对碳纳米管进行功能化处理的各种聚合物高分子或生物活性分子中，树状大分子以其高度支化、球形结构和低分散性的特点使得其成为纳米生物医学领域的理想载体。聚酰胺胺(poly(amidoamine)，PAMAM)树状大分子由于独特的性能使其成为结合染料、靶向试剂以及药物分子的理想平台，以用于癌细胞的多功能成像、靶向和治疗。另外，还通过各种模板、稳定化或组装的办法，合成树状大分子包裹的、稳定化的或组装的无机纳米粒子用于生物医学领域，特别是肿瘤的早期显像和治疗。最新的进展表明，树状大分子可以共价性地修饰在碳纳米管表面，为后续纳米复合材料的合成、组装或进一步的电子或生物学应用提供中间体材料。这意味着，通过对碳纳米管表面进行树状大分子修饰和功能化，将有可能合成广泛地应用于生物医学领域的各种复合纳米材料。
检索国内外有关碳纳米管功能化处理的文献和专利结果表明，用树状大分子对碳纳米管进行功能化修饰，用于癌细胞靶向诊断治疗的研究还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法，该制备方法简单，反应条件温和，易于操作，所用的聚合物均为环境友好的高分子材料，具有产业化实施的前景，且该功能化碳纳米管能够长时间地分散在溶液中，没有团聚现象发生，且功能化的多壁碳纳米管具有良好的生物相容性，能靶向地结合到癌细胞上，可用于癌细胞的早期靶向诊断。
本发明的反应方程式如下：
本发明的一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法，包括：
(1)将碳纳米管CNT进行酸化处理2h，过滤，水洗，于60℃真空干燥，备用；
(2)聚酰胺胺树状大分子的异硫氰酸荧光素FI和叶酸FA的修饰
a.在含有60mg聚酰胺胺PAMAM的24mL无水二甲基亚砜DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mL DMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到G5.NH2-FI；
或b.①在含有60mg PAMAM的24mL无水DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mL DMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI；
②将3.7mg FA和9.3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC溶解在3mL DMSO溶液中，室温条件下磁力搅拌3小时，将反应后的溶液逐渐滴加到12mL含30mg G5.NH2-FI的DMSO溶液中，室温条件下强磁力搅拌3天，将反应后的产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI-FA；
(3)取16.68mg酸化处理后的碳纳米管分散于12mL超纯水中，随后将含有12.82mgEDC的DMSO溶液2mL滴加到碳纳米管的水溶液中，强磁力搅拌，反应3小时；
(4)将含有4.6mg步骤(2)制备的修饰PAMAM树状大分子的1mL水溶液滴加到步骤(3)的所得溶液中，强磁力搅拌下反应48小时，即得CNT/G5.NH2-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI，并分散在超纯水溶液中、离心，重复3～6次；
(5)将步骤(4)中制备的CNT/G5.NH2-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI复合物分散在10mL超纯水中，与9.8μL三乙胺溶液充分混合后，逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液1mL，强磁力搅拌下反应24小时，制得表面电荷为中性的CNT/G5.NHAc-FI-FA或CNT/G5.NHAc-FI复合物；
(6)将步骤(5)制备的复合物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后冷冻干燥保存，即可。
所述步骤(1)中的碳纳米管为单壁或多壁碳纳米管；
所述步骤(1)中酸化处理所用的酸为浓硝酸或浓硝酸与浓硫酸的混合酸，混合酸中HNO3/H2SO4＝3∶1(v/v)；
所述步骤(2)和(6)中的纤维素透析膜为MWCO10000～50000纤维素透析袋，以尽可能去除残留在所制备产物中的溶剂、过量的反应试剂以及副产物等。
本发明以端基为氨基的第5代树状大分子聚酰胺胺(PAMAM)为中间体，在其表面接枝5个异硫氰酸荧光素(FI)分子和5个叶酸分子(FA)，形成G5.NH2-FI-FA化合物，再通过EDC化学键合法将G5.NH2-FI-FA通过共价键结合到酸化处理的碳纳米管(MWCNTs)的表面，合成具有良好水溶性的多壁碳纳米管/树状大分子纳米复合物，最后将树状大分子表面的剩余端氨基通过乙酰化反应使其表面电荷呈中性，以提高生物相容性，该方法制备的多壁碳纳米管/树状大分子纳米复合物能用于癌细胞的靶向诊断。
具体涉及两步基本反应：(1)将修饰了FI和FA分子的、端基为氨基的PAMAM(G5.NH2-FI-FA)通过EDC化学键合法与酸化处理后的多壁碳纳米管表面的羧基反应，得到MWCNT/G5.NH2-FI-FA复合物；(2)将功能性MWCNT/G5.NH2-FI-FA复合物表面剩余的树状大分子的端氨基与醋酸酐进行乙酰化反应，得到表面电荷呈中性的功能性复合碳纳米管MWCNT/G5.NHAc-FI-FA。
本发明使用紫外-可见光分光光度计(UV-Vis)、核磁共振谱(NMR)、透射电子显微镜(TEM)、zeta电势测量等方法表征本发明制备的功能化碳纳米管，同时用MTT法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验功能化多壁碳纳米管对人体上皮癌细胞系KB细胞的毒性，具体测试结果如下：
(1)紫外-可见光分光光度计的测试结果
没有经过表面修饰的MWCNT在255nm处有一个吸收峰，对应于碳纳米管的特征吸收峰，对于经过靶向和非靶向修饰的MWCNT，其紫外吸收光谱上均明显显示出荧光素(FI)的吸收峰500nm，这就表明树状大分子已经成功接枝到MWCNT上，MWCNT/G5.NHAc--FI-FA在260nm处的较强吸收可能是叶酸(280nm)和MWCNT(255nm)的吸收重叠引起的；
相反，在相同波长260nm下，MWCNT/G5.NHAc-FI只有很微弱的MWCNT吸收峰。参见附图说明书1；功能化的MWCNTs能稳定分散在水和PBS缓冲液中，4℃下保存6个月没有沉淀产生，参见附图说明书2；
(2)核磁共振谱(氢谱)测试结果
核磁共振谱的测试结果表明：树状大分子已经成功地修饰在MWCNT表面，从树状大分子修饰的多壁碳纳米管的核磁共振谱图中可以看到，在1.85ppm处，有一个明显的质子峰，对应着乙酰基上甲基的特征峰，而且，乙酰化反应并没有改变MWCNT/G5.NHAc-FI-FA和MWCNT/G5.NHAc-FI上的FI和FA原有的信号峰，参考附图说明书3；
(3)TEM测试结果
TEM测试结果显示，MWCNT的形貌在树状大分子修饰前后没有明显的改变，且没有发现MWCNT的聚集，表明树状大分子均匀地修饰在碳纳米管壁上，参考附图说明书4；
(4)zeta电势测量结果
表面电势测定结果表明，乙酰化反应之后，MWCNT/G5.NH2-FI-FA的表面电势从+28.3mV降到和+3.1mV，MWCNT/G5.NH2-FI电势则从+31.6mV降低到+4.5mV，均呈现为电荷中性，进一步证实了乙酰化反应的成功进行；
(5)MTT细胞毒性测试结果
MTT法测试功能性多壁碳纳米管对KB细胞的毒性结果表明，浓度范围在0-100μg/mL时，KB细胞经过MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA处理24小时后，MTT法测试的OD值和PBS缓冲液对照组一样，参考附图说明书5；细胞形貌观察结果显示，即使在碳纳米管的浓度高达100g/mL时，所有细胞都非常健康；
(6)流式细胞术分析结果
在本发明中，FA受体高表达和低表达的KB细胞被选用于细胞的靶向诊断研究(FA受体高表达的细胞缩写为KB-HFAR，FA受体低表达的细胞缩写为KB-LFAR)。，KB-HFAR和KB-LFAR细胞经纳米复合物处理1小时后的流式细胞术分析结果显示，将KB-HFAR细胞用MWCNT/G5.NHAc-FI-FA处理后，细胞表现出巨大的荧光信号增强；
相反，相同的细胞经MWCNT/G5.NHAc-FI处理后，其荧光信号与PBS缓冲液的对照组相似，这就说明KB-HFAR与MWCNT/G5.NHAc-FI没有结合；而KB-LFAR细胞用MWCNT/G5.NHAc-FI-FA或MWCNT/G5.NHAc-FI-FA处理后，其细胞的荧光强度都和PBS对照组一样；
这些结果表明，MWCNT/G5.NHAc-FI-FA可以特异性地与KB-HFAR细胞结合，此外，细胞对FA修饰的MWCNT的吸附依赖于其浓度，对KB-LFAR细胞来说，尽管浓度增加到10g/mL，MWCNT/G5.NHAc-FI-FA和MWCNT/G5.NHAc-FI都没有显示较大的结合。参考附图说明书6；
(7)激光共聚焦显微镜测试结果
激光共聚焦显微镜的测试结果进一步显示，只有FA修饰的多壁碳纳米管MWCNT/G5.NHAc-FI-FA对KB-HFAR细胞具有较强的荧光信号，证实了功能化的多壁碳纳米管在细胞中的内化和对细胞膜的结合；
相反，用MWCNT/G5.NHAc-FI处理的细胞的荧光信号与PBS缓冲液对照组的相同。参考附图说明书7。
有益效果
(1)本发明的功能化碳纳米管能够长时间地分散在溶液中，没有团聚现象发生，且功能化的多壁碳纳米管具有良好的生物相容性，能靶向地结合到癌细胞上，可用于癌细胞的早期靶向诊断；
(2)该制备方法简单，反应条件温和，易于操作，所用的聚合物均为环境友好的高分子材料，具有产业化实施的前景。
附图说明
图1为本发明制备的MWCNTs，MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA的紫外吸收光谱图；
图2为本发明制备的MWCNTs(1)、MWCNT/G5.NHAc-FI(2)和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(3)在PBS缓冲液的图片；
图3为本发明制备的多壁碳纳米管复合物MWCNT/G5.NHAc-FI(a)和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(b)的核磁共振谱图；
图4为本发明制备的酸化后的MWCNTs(a)、MWCNT/G5.NHAc-FI(b)、MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(c)的TEM图；
图5为MTT法测试的KB细胞经过MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(浓度范围在0-100μg/mL)处理24小时后的OD值；
图6为功能化的MWCNT和KB细胞结合的流式细胞术分析结果；
a.MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(1μg/mL)对KB-HFAR细胞的结合；
b.MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(1μg/mL)对KB-LFAR细胞的结合；
1.PBS对照；2.MWCNT/G5.NHAc-FI；3.MWCNT/G5.NHAc-FI-FA；
c.依赖于剂量的MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(1μg/mL)对KB-HFA细胞结合的直方图；
d.依赖于剂量的MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(1μg/mL)对KB-LFAR细胞结合的直方图；
图7为经PBS缓冲液(a，d)、MWCNT/G5.NHAc-FI(b，e)和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(c，f)处理的KB-HFAR细胞的激光共聚焦显微镜图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)配置体积比为3∶1的浓硝酸与浓硫酸的混合液(即HNO3/H2SO4为v/v＝3∶1)，对100-200mg多壁碳纳米管进行酸化处理，2小时后，过滤，水洗，最后将酸化后的多壁碳纳米管MWCNTs置于真空条件下干燥后保存；
(2)在含有60mg PAMAM的24mL无水DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mL
DMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将所反应后的产物用MWCO10000的纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液(3次，4升)和超纯水(3次，4升)中透析3天，去除反应混合物中的过量的反应试剂和反应过程中产生的副产物，最后将纯化后的产物冷冻干燥得MG5.NH2-FI；
(3)取16.68mg酸化处理后的MWCNTs分散在12mL超纯水中，随后将含有12.82mg EDC的DMSO溶液2mL滴加到MWCNTs的水溶液中，强磁力搅拌，反应3小时；随后滴加1mL含有4.6mgG5.NH2-FI的水溶液，强磁力搅拌下反应48小时，合成MWCNT/G5.NH2-FI复合物，将复合物分散在超纯水中、离心，再次分散、离心，如此重复3次，以去除过量的反应试剂；
(4)将步骤(3)中制备的MWCNT/G5.NH2-FI复合物分散在10mL超纯水中，与9.8μL三乙胺溶液充分混合，随后逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液1mL，强磁力搅拌下反应24小时，合成表面电荷为中性的MWCNT/G5.NHAc-FI复合物。
经紫外可见光光谱及NMR分析，测试结果证实G5.NH2-FI已经成功修饰到多壁碳纳米管的表面，且MWCNT/G5.NH2-FI复合物能稳定地分散在PBS缓冲溶液中，6个月后没有沉淀产生。Zeta表面电势测定结果表明，乙酰化反应之后，MWCNT/G5.NH2-FI的表面电势从+31.6mV降到和+4.5mV，基本呈电荷中性，进一步证实了乙酰化反应的成功进行。
实施例2
(1)在含有60mg PAMAM的24mL无水DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mLDMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将所反应产物用MWCO10000的纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液(3次，4升)和超纯水(3次，4升)中透析3天，去除反应混合物中的过量的反应试剂和反应过程中产生的副产物，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI；
(2)将3.7mg FA和9.3mg EDC溶解在3mL DMSO溶液中，室温条件下磁力搅拌3小时，活化FA的γ-羧基，将所得反应溶液逐渐滴加到12mL含30mg G5.NH2-FI的DMSO溶液中，室温条件下强磁力搅拌，3天后，将反应后的产物用MWCO10000的纤维素透析膜逐次在PBS缓冲液(3次，4升)和超纯水(3次，4升)中透析3天，去除反应混合物中的过量的反应试剂和反应过程中产生的副产物，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI-FA。
实施例3
(1)配置体积比为3∶1的浓硝酸与浓硫酸的混合液(即HNO3/H2SO4为v/v＝3∶1)，对100-200mg多壁碳纳米管进行酸化处理，2小时后，过滤，水洗，最后将酸化后的多壁碳纳米管置于真空条件下干燥后保存；
(2)取16.68mg酸化处理后的MWCNTs分散在12mL超纯水中，随后将含有12.82mg EDC的DMSO溶液2mL滴加到MWCNTs的水溶液中，强磁力搅拌，反应3小时；随后滴加1mL含有4.6mg实例2中制备的G5.NH2-FI-FA的水溶液，强磁力搅拌下反应48小时，合成MWCNT/G5.NH2-FI-FA复合物，将复合物分散在超纯水中、离心，再次分散、离心，如此重复3次，以去除过量的反应试剂；
(3)将(2)中制备的MWCNT/G5.NH2-FI-FA复合物分散在10mL超纯水中，与9.8μL三乙胺溶液充分混合，随后逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液1mL，强磁力搅拌下反应24小时，合成表面电荷为中性的MWCNT/G5.NHAc-FI-FA复合物。
经紫外可见光光谱及NMR分析，测试结果证实G5.NH2-FI-FA已经成功修饰到多壁碳纳米管的表面，且MWCNT/G5.NH2-FI-FA复合物能稳定地分散在PBS缓冲溶液中，6个月后没有沉淀产生。Zeta表面电势测定结果表明，乙酰化反应之后，MWCNT/G5.NH2-FI-FA的表面电势从+28.3mV降到和+3.1mV，基本呈电荷中性，进一步证实了乙酰化反应的成功进行。
实施例4
以KB系细胞为模型细胞来检验树状大分子修饰后的多壁碳纳米管的生物毒性。将模型细胞分别在滴加有MWCNT/G5.NHAc-FI-FA、MWCNT/G5.NHAc-FI的培养液中培养24小时后，用MTT法来测试模型细胞在不同条件下的存活情况。统计分析表明，在浓度范围为0-100微克/毫升时，分别在MWCNT/G5.NHAc-FI-FA、MWCNT/G5.NHAc-FI的培养液中培养的KB细胞的存活率和PBS缓冲液对照组相比没有明显的变化，且从细胞的相差显微镜照片上可以看出，添加有MWCNT/G5.NHAc-FI-FA和MWCNT/G5.NHAc-FI的培养液中培养的KB细胞与未处理的细胞的形貌相似，细胞仍能健康地生长，而且激光共聚焦显微镜结果显示，经过MWCNT/G5.NHAc-FI-FA处理的含有较高叶酸受体表达的KB细胞表现出很强的荧光信号。表明MWCNT/G5.NHAc-FI-FA功能性碳纳米管在具有良好的生物相容性的同时，还具有癌细胞靶向诊断的功能。
Claims (3)
1.一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法，包括：
(1)将多壁碳纳米管进行酸化处理2h，过滤，水洗，于60℃真空干燥，备用；
(2)聚酰胺胺树状大分子的异硫氰酸荧光素FI和叶酸FA的修饰
a.在含有60mg聚酰胺胺PAMAM的24mL无水二甲基亚砜DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mL DMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI；
或b.①在含有60mg PAMAM的24mL无水DMSO溶剂中逐滴滴加含有4.4mg FI的24mL DMSO溶液，室温下强磁力搅拌24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲溶液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI；
②将3.7mg FA和9.3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC溶解在3mLDMSO溶液中，室温条件下磁力搅拌3小时，将反应后的溶液逐渐滴加到12mL含30mgG5.NH2-FI的DMSO溶液中，室温条件下强磁力搅拌3天，将反应后的产物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH2-FI-FA；
(3)取16.68mg酸化处理后的多壁碳纳米管分散于12mL超纯水中，随后将含有12.82mg EDC的DMSO溶液2mL滴加到多壁碳纳米管的水溶液中，强磁力搅拌，反应3小时；
(4)将含有4.6mg步骤(2)制备的修饰PAMAM树状大分子的1mL水溶液滴加到步骤(3)的所得溶液中，强磁力搅拌下反应48小时，即得CNT/G5.NH2-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI，并分散在超纯水溶液中、离心，重复3～6次；
(5)将步骤(4)中制备的CNT/G5.NH2-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI复合物分散在10mL超纯水中，与9.8μL三乙胺溶液充分混合后，逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液1mL，强磁力搅拌下反应24小时，制得表面电荷为中性的CNT/G5.NHAc-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI复合物；
(6)将步骤(5)制备的复合物用纤维素透析膜逐次在PBS缓冲液4L×3和超纯水4L×3，透析3天，最后冷冻干燥保存。
2.根据权利要求1所述的一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中酸化处理所用的酸为浓硝酸或浓硝酸与浓硫酸的混合酸，混合酸中HNO3/H2SO4＝3∶1(v/v)，多壁碳纳米管与酸的重量比为1∶5。
3.根据权利要求1所述的一种癌细胞靶向诊断聚酰胺胺/碳纳米管复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和(6)中的纤维素透析膜为MWCO10000～50000纤维素透析袋。
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