CN105463024A - 基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法。以聚乙烯亚胺-环糊精聚阳离子化合物为骨架，以具有氧化还原反应性的金刚烷-二硫键-聚乙二醇、具有靶向性的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽为修饰基团，利用自组装原理将聚乙烯亚胺-环糊精与金刚烷-二硫键-聚乙二醇、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽进行组合，主客体作用形成超分子基因载体。本发明的运载系统具有多功能性，即氧化还原敏感性、靶向肝癌的特异性、优秀的基因转染效率，能够携带功能基因高效治疗肝脏恶性肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一类非病毒基因转染的载体及其制备方法，具体是涉及一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法。
背景技术
肝癌是恶性程度极高的肿瘤，每年新发病例55.4万，而死亡病例也高达52.1万。肝癌治疗效果不佳、预后不良已成公认的临床治疗难题之一，这可能和肝癌复杂的恶性增殖机制有关，而miRNA表达突变是其中极其重要的调节机制。miRNA是一类长度为20-24个核苷酸的非编码RNA，作用于转录后基因调节。研究表明，部分关键miRNA通过调节癌基因表达和肿瘤信号通路来抑制恶性肿瘤的生长，多种恶性肿瘤中这些miRNA的调节通路出现异常变化，介导肿瘤的免疫逃逸和疾病的快速进展。miRNA在肝癌的发生和转移过程中发挥着非常重要的作用，肝癌中的miR-16、miR-34a、miR-199a、miR-139等miRNA表达水平明显下调，而miR-21、miR-92a、miR-126、miR-122、miR-223等miRNA表达水平却上调，形成了复杂的miRNA调控网络，涉及到线粒体介导的凋亡通路、细胞周期检查点、受体酪氨酸激酶通路等。
miR-34a是miRNA调控网络中极其重要的一个节点，主要有阻滞细胞周期、促进细胞衰老、诱导细胞凋亡、阻止细胞迁移等生理功能。miR-34a直接受上游p53的调节，正常生理环境中，DNA损伤激活的p53基因，与miR-34a启动子结合并上调miRNA的表达；在肝癌病理环境中，p53保守DNA结合序列中CpG岛被甲基化，阻碍了p53对miR-34a的激活，从而抑制了上调miR-34a的正常生理过程。在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中，miR-34a表达偏低或缺失。
经研究发现，有许多miRNA参与了肝癌发生和转移的调节网络，而且一些miRNA被证明可以用于肝癌的临床治疗，miR-34a就是其中的主要代表分子，其具有重要的临床应用前景。miR-34a替代疗法通过输送miR-34a至肝癌细胞内，恢复胞内的miR-34a表达水平，从而逆转病理情况下因p53突变导致的miR-34a表达缺失，达到负性调节肝癌细胞增殖及转移的目的。miR-34a基因疗法中有2点必不可少：(1)基因载体，裸miRNA基本不可能在体内复杂的生理环境中(如循环和组织屏障、内吞后的溶酶体分解作用等)到达肝癌细胞内产生抗肿瘤作用，需要通过合适的基因载体协助才能达到满意的药代动力学和转染效率，来发挥治疗效果；(2)运载功能性(如肝癌靶向性、控释能力等)，缺少靶向性会导致高表达miR-34a损伤正常细胞的情况，对肝癌细胞的高度特异性转染可最大程度减少此类不良反应的发生率，而缺乏控释作用可导致基因在体内循环运输过程中提前释放，造成靶器官内生物利用度降低和循环中游离基因药物的不良反应。MirnaTherapeutics公司基于miR-34a研发了一种名为MRX34的基因药物，以脂质体介导miR-34a对肝癌的转染，目前正在进行I期临床试验[15]。MRX34通过静脉给药，抑制24种已知的肝癌相关基因来治疗肝癌，但同时其靶向性的缺失导致了正常细胞中的外源性miR-34a过表达，产生脱靶的不良反应，这也正是目前临床应用载体介导的miR-34a治疗过程中亟需解决的问题。因此，研发一种同时具有高效转染能力、敏感控释和肝癌靶向性的基因药物运载系统就非常有必要。
近年来，随着功能性纳米材料研究的逐渐深入，借助纳米技术可以解决多种临床问题，特别是作为基因载体的纳米微粒研究日趋成熟，通过功能性纳米载药系统来改进基因的释药方式、体内分布、不良反应，也变得更加简单易行。在抗肿瘤基因治疗中，纳米技术带来的功能性运载具有重要的临床意义。基因载体功能性主要体现在：(1)应激控释能力；(2)以材料可降解性为主要特点的生物相容性；(3)肿瘤靶向性[16]。针对肝癌的miR-34a替代疗法迫切需要的正是此类功能性基因载体。
纳米材料的应激控释能力可使载体在某些特定的刺激因素作用下调控基因药物的释放，肿瘤微环境中的刺激因素包括pH改变、温度改变、氧化还原刺激、光刺激等。纳米载体的应激敏感性通常与其分子结构的特殊性密切相关。温度敏感性常和低临界溶解温度(LCST)下的分子构象改变有关，pH敏感载药系统多含有酸或碱反应性的化学键。氧化还原敏感性一般通过二硫键结构得以实现，载药系统在外界环境改变产生氧化还原刺激后，内部二硫键逐渐断裂，系统内纳米结构被破坏，药物释放速率获得调控。
现有技术人员一直进行氧化还原敏感型控释系统的研发：基于具有氧化还原敏感性的二硫键，构建了高分子载药颗粒核心和表面聚乙二醇(PEG)保护壳，载药并加入核酸后，带有负电的核酸和PEG壳通过静电作用结合，压缩高分子载药颗粒核心，完成药物的包封过程。在溶酶体环境的还原酶催化下，二硫键断裂导致PEG壳/核酸复合体自高分子纳米颗粒表面脱落，药物释放速率增加。氧化还原敏感性可以保证基因运载系统在肿瘤细胞中因溶酶体的氧化还原刺激而释放miRNA，而在系统循环中几乎不释放基因，大大减少了基因治疗的全身毒副作用，并且保证了较高的生物利用度。
基因运载靶向性也是目前需要着重解决的问题。国内外许多研究人员已在靶向性上进行了大量的研究，通过多种方法构建、筛选了用于基因或药物运载系统的靶向基团。CityofHope癌症中心的MarkDavis教授通过在纳米材料上修饰靶向基团来促进治疗靶标对载药纳米颗粒的吸收和利用，使得载药系统携带的基因能够特异性地作用于肿瘤细胞，并首先在体内研究中证明了其有效性。
精胺及衍生物桥连的环糊精可形成具有规整交替结构的聚阳离子纳米材料，以聚阳离子材料为基础合成了多种高效转染的基因载体，并且进一步通过主客体组装技术，对原始基因载体进行功能化修饰。
目前的问题在于，如何进一步改善优化载体材料，使其具有高效、靶向的基因药物输送能力，可以实现miR-34a替代疗法所需要的多功能性运载，以破解现有miR-34a疗法中的基因运载难题。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的是提供一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法，可用于新型的非病毒基因治疗。本发明在含环糊精的聚阳离子纳米材料上，通过主客体组装技术修饰含有靶向基团的功能化客体，并在客体中导入氧化还原敏感的二硫键，最终可形成具有氧化还原敏感性、肝癌靶向性、主客体自组装的、高效基因转染的多功能基因载体，能够携带治疗基因高效治疗肝脏恶性肿瘤。
本发明采用的技术方案如下：
一、一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统：
主要由主体聚乙烯亚胺-环糊精以及分别装载在主体聚乙烯亚胺-环糊精上的客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇和客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽而形成的复合物。
所述复合物的具体结构式如下：
其中，n1、n2、n3分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇自组装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽自组装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数，m1、m2分别代表金刚烷-二硫键-聚乙二醇中聚乙二醇单元个数和金刚烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙二醇单元个数，x1、y1分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精中伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，x2、y2分别代表客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇中聚乙烯亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，x3、y3分别代表客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙烯亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量；n1、n2、n3、m1、m2、x1、x2、x3、y1、y2、y3均为大于0的整数。
本发明复合物所形成分子的分子量大约在10000-20000左右。
所述的主体聚乙烯亚胺-环糊精是由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到，所述的客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇是由金刚烷通过二硫键与聚乙二醇结合制备得到。
所述的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽是由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶向肽制备得到。
二、一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法：
由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到聚乙烯亚胺-环糊精，由金刚烷通过二硫键与聚乙二醇结合制备得到金刚烷-二硫键-聚乙二醇，由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶向肽形成金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，再将三者按照1:0.5-2:0.5-2的摩尔比例混合，经自组装反应得到多功能超分子运载系统；其具体反应式如下：
A、金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成
B、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽的合成
C、聚乙烯亚胺-环糊精的合成
D、多功能超分子运载系统的自组装
其中，反应式中，结构1是聚乙二醇，结构2是金刚烷甲酸，结构3是金刚烷-二硫键-聚乙二醇，结构4是金刚烷胺，结构5是金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，结构6是环糊精，结构7是聚乙烯亚胺-环糊精，结构8是目标产物多功能超分子基因运载系统，CDI是连接剂N,N’-二羰基咪唑的简称，SPDP是3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的简称，SP94是靶向肽的简称。
所述金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成采用以下具体方式：
1.1)将聚乙二醇溶解于足量的二甲基亚砜中，将加入至用足量二甲亚砜溶解、含有相对于聚乙二醇的0.5-1倍量的用于活化羟基的连接剂溶液中，在氮气保护下避光搅拌反应2-4小时；
1.2)将得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置1-4小时，过滤后再次溶解于足量的二甲基亚砜中；
1.3)称取相对于聚乙二醇1-2倍量的胱胺二盐酸盐溶解于足量的二甲基亚砜中，并加入相对于聚乙二醇1-2倍量的催化剂，搅拌1-4小时；
1.4)将上述步骤1.2)中所述过滤后的二甲亚砜溶液缓慢滴加至胱胺二盐酸盐溶液中，滴加2-5h，滴加后继续反应3-8h，反应完毕后溶液在透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质；
1.5)将相对于聚乙二醇0.05-0.1倍量的金刚烷甲酸和相对于聚乙二醇0.05-0.1倍量的用于活化羟基的连接剂，溶解于足量的二氯甲烷中，常温反应1-3h，向其中加入聚乙二醇0.225-0.5倍量上述步骤1.4)得到的白色粉末状物质，继续搅拌反应1-3h，将反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤得到白色粉末状物质即金刚烷-二硫键-聚乙二醇。
所述的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽的合成采用以下具体方法：
2.1)将聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯溶解于足量的二氯甲烷中，将其缓慢滴加至用足量二氯甲烷溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯的0.1-0.3倍量的金刚烷胺溶液中，常温搅拌滴加1-3小时，继续搅拌反应0.5-2小时；
2.2)将上述步骤2.1)中得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤后混合到用足量二氯甲烷溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯1-2倍量的连接剂溶液中，常温搅拌反应1-3h；
2.3)将上述步骤2.2)中得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤并再次溶解于足量二甲基亚砜中，将其滴加至用足量二甲亚砜溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯0.1-0.2倍量的3,3'-二氨基二丙胺的溶液中，常温滴加0.5-2h，继续搅拌反应0.5-2h；
2.4)反应完毕后的溶液在透析袋中透析6-24小时，然后冰冻干燥，获得白色粉末状物质；
2.5)将上述步骤2.4)中的白色粉末状物质再次溶解于足量的pH7.4的PBS溶液中，再加入到用足量无水乙醇溶解的、相对于步骤2.4)中白色粉末状物质0.05-0.1倍量的连接剂溶液中，常温搅拌0.5-2h，加入相对于步骤2.4)中白色粉末状物质0.2-0.4倍量的靶向肽加入反应液，常温反应1-4h，反应完毕后透析袋中透析6-12小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质即金刚烷-聚乙二醇-靶向肽。
所述的聚乙烯亚胺-环糊精的合成采用以下具体方法：
3.1)将环糊精溶解于足量二甲基亚砜中配置环糊精溶液，再配置用足量二甲亚砜溶解、相对于环糊精0.2-0.5倍量的连接剂溶液，连接剂用以活化羟基，在氮气保护下于暗处将连接剂溶液加入环糊精溶液中，再加入相对于环糊精1-1.5倍量的催化剂；
3.2)将相对于环糊精1-2倍量的聚乙烯亚胺溶解于足量的二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处，将聚乙烯亚胺溶液滴加在步骤3.1)所述的环糊精溶液中，滴加4-6小时，滴加完毕后在常温下继续反应6-12小时，反应完毕后的溶液在透析袋中透析12-24小时，然后冰冻干燥，得到聚乙烯亚胺-环糊精。
所述的多功能超分子运载系统的自组装是将聚乙烯亚胺-环糊精与相对于聚乙烯亚胺-环糊精0.5-2倍量的金刚烷-二硫键-聚乙二醇和0.1-0.4倍量的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽在水中混合，常温下搅拌反应6-12h后，溶液在透析袋中透析6-12h，然后冰冻干燥得到白色粉末状物质即基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统。
所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
所述的连接剂为N,N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中任一种。
所述的聚乙烯亚胺分子量为432Da(直链型)、600Da、1200Da、2000Da、25kDa的聚乙烯亚胺中任一种。
所述的催化剂为三乙胺、吡啶、硫酸中任一种。
所述的靶向肽为SP94、PTP、RGD中任一种。
本发明以聚乙烯亚胺-环糊精聚阳离子化合物为骨架，以具有氧化还原反应性的金刚烷-二硫键-聚乙二醇、具有靶向性的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽为修饰基团，利用自组装原理将聚乙烯亚胺-环糊精与金刚烷-二硫键-聚乙二醇、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽进行组合，主客体作用形成超分子基因载体，其优点在于具有多功能性，即氧化还原敏感性、靶向肝癌的特异性、优秀的基因转染效率，能够携带功能基因高效治疗肝脏恶性肿瘤。
本发明文中的重量体积比的单位均为g/ml。倍量的单位均为质量比。
本发明的技术效果如下：
由于本发明采用的聚乙烯亚胺-环糊精材料可生物降解性，低毒性等特点，作为非病毒性基因载体材料而被广泛地研究，具有很强的改造性，从而增加新的功能。本发明采用的聚乙烯亚胺，具有三种不同的氨基形式，形成了不同的缓冲体系，氨基的存在基本作用是结合DNA，扩展的功能是在携带DNA进入细胞时不同的氨基组合成不同的缓冲对，能保护DNA免遭细胞质中的溶酶体降解。
本发明中环糊精经活化与聚乙烯亚胺连接，保留了聚乙烯亚胺的功能。
本发明采用金刚烷-二硫键-聚乙二醇和、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽与聚乙烯亚胺-环糊精自组装形成超分子结构，内层是聚阳离子材料，外层为聚乙二醇为主的保护、功能层，使得超分子载体系统功能化。
本发明采用的金刚烷通过二硫键与聚乙二醇连接，使金刚烷-二硫键-聚乙二醇具有氧化还原敏感性，能够使得多功能超分子运载系统在肿瘤细胞溶酶体内等环境中降解，并控制所运载物质的释放。
本发明采用的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，能够特异性地与肝癌细胞结合，增加了多功能超分子系统的肝癌靶向性，可用于靶向治疗。
附图说明
图1：靶向肽、金刚烷-二硫键-聚乙二醇、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽、聚乙烯亚胺-环糊精、聚乙烯亚胺-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇、多功能超分子运载系统[聚乙烯亚胺-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-靶向肽)]的核磁共振氢谱图。
图2：多功能超分子运载系统[聚乙烯亚胺-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-靶向肽)]的二维核欧沃豪斯效应谱图。
图3：多功能超分子运载系统[聚乙烯亚胺-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-靶向肽)]结合核酸(DNA或RNA)后形成纳米微粒的透射电镜图。
图4：多功能超分子运载系统结合核酸后形成纳米微粒的粒径及对氧化还原刺激的反应图。
图中，4-1是多功能超分子运载系统和核酸形成的纳米微粒曲线，4-2是聚乙烯亚胺-环糊精和核算形成的纳米微粒曲线，4-3是多功能超分子运载系统和核酸形成的纳米微粒经二硫苏糖醇氧化还原刺激后的曲线，4-4是聚乙烯亚胺-环糊精和核算形成的纳米微粒经二硫苏糖醇氧化还原刺激后的曲线图。
图5：多功能超分子运载系统结合核酸后形成纳米微粒的表面电位及对氧化还原刺激的反应图。
图中，5-1是多功能超分子运载系统和核酸形成的纳米微粒曲线，5-2是聚乙烯亚胺-环糊精和核算形成的纳米微粒曲线，5-3是多功能超分子运载系统和核酸形成的纳米微粒经二硫苏糖醇氧化还原刺激后的曲线，5-4是聚乙烯亚胺-环糊精和核算形成的纳米微粒经二硫苏糖醇氧化还原刺激后的曲线图。
图6：多功能超分子运载系统携带荧光报告基因的核酸分子转染肝癌细胞后的荧光强度分布图。
图中，6-1是生理盐水处理细胞曲线，6-2是裸核酸分子处理细胞曲线，6-3是聚乙烯亚胺-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带核酸处理细胞曲线，6-4是多功能超分子运载系统携带核酸处理细胞曲线图。
图7：多功能超分子运载系统携带治疗基因处理后的细胞活力曲线图。
图中，a是多功能超分子运载系统不携带治疗基因的曲线，b是裸治疗基因曲线，c是聚乙烯亚胺-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带治疗基因曲线，d是多功能超分子运载系统携带治疗基因曲线。
图8：多功能超分子运载系统携带治疗基因处理后的细胞划痕试验结果显微镜图。
图中，e是生理盐水组，f是裸治疗基因组，g是多功能超分子运载系统携带治疗基因组。
图9：多功能超分子运载系统携带治疗基因处理荷瘤裸鼠后的肿瘤生长曲线图。
图中，p是生理盐水组，q是裸治疗基因组，r是聚乙烯亚胺-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带治疗基因组，s是多功能超分子运载系统携带治疗基因组。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明进行详细的描述，但不限于实施例所公开的内容。
本发明的实施例如下：
实施例1：以聚乙烯亚胺-β-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-SP94)为例。
1)金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成
称取2克聚乙二醇单甲醚，溶解于30毫升二甲基亚砜中，加入1克N,N'-羰基二咪唑(CDI)，在氮气保护下避光搅拌反应3小时。
将反应液加入至体积为1升的乙醚：四氢呋喃＝4:1体积比的混合溶液中，冰浴静置2小时，过滤得到白色粉末。
然后将全部白色粉末溶解于20ml二甲基亚砜中；称取2.24克胱胺二盐酸盐溶解于10毫升二甲基亚砜中，并加入3毫升三乙胺，搅拌1小时。
将白色粉末的溶液缓慢滴加至胱胺二盐酸盐的溶液中，滴加5小时，继续反应3小时。反应完毕后，溶液在分子量2000透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质备用。
称取180毫克金刚烷甲酸和162毫克CDI，溶解于20毫升二氯甲烷中，常温反应3小时。向其中加入450毫克前述备用白色粉末，继续搅拌反应3小时。反应完毕后，将反应液加入至体积为200毫升的乙醚：四氢呋喃＝4:1体积比的混合溶液中，冰浴静置2小时，过滤得到白色粉末状物质，即金刚烷-二硫键-聚乙二醇。
2)金刚烷-聚乙二醇-SP94的合成
称取540毫克聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯溶解于20毫升二氯甲烷中，将其缓慢滴加至70.4毫克金刚烷胺的20毫升二氯甲烷溶液中，常温搅拌滴加3小时，继续搅拌反应2小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为500毫升的乙醚：四氢呋喃＝4:1体积比的混合溶液中，冰浴静置2小时，过滤得到白色粉末状物质，称取367毫克该化合物，和810毫克CDI溶解于20毫升二氯甲烷中，常温搅拌反应3小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为150毫升的乙醚：四氢呋喃＝4:1体积比的混合溶液中，冰浴静置2小时，过滤得到白色粉末状物质。将该白色粉末溶解在10毫升二甲基亚砜中，将其滴加至92毫克3,3'-二氨基二丙胺的20毫升二甲亚砜溶液中，常温滴加2小时，继续搅拌反应1.5小时。
反应完毕后，将溶液置于分子量2000的透析袋中透析12小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，称取95.8毫克该化合物，溶解于5毫升pH7.4的PBS溶液中，称取6.25毫克3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于2.5毫升无水乙醇中，将两溶液混合，常温搅拌2小时。再称取26.9毫克靶向多肽SP94溶解于2毫升pH7.4的PBS中，加入上述的反应液，常温反应4小时。反应完毕后，溶液在分子量2000的透析袋中透析12小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即金刚烷-聚乙二醇-SP94。
3)聚乙烯亚胺-β-环糊精的合成
称取1.63克β-环糊精和0.61克CDI溶解在10毫升二甲基亚砜中，加入2毫升三乙胺，在氮气保护和避光条件下，常温搅拌3小时。
称取2.17克分子量600道尔顿的聚乙烯亚胺溶解在20毫升二甲基亚砜中，将活化的β-环糊精的二甲基亚砜溶液缓慢滴加到其中，滴加4小时，继续反应12小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析12小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-β-环糊精。
4)称取48毫克聚乙烯亚胺-β-环糊精溶解于10毫升水中，34.2毫克金刚烷-二硫键-聚乙二醇溶解于5毫升水中，5.5毫克金刚烷-聚乙二醇-SP94溶解于5毫升水中，将三者混合，常温搅拌12小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析12小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-β-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-SP94)。
实施例1的SP94、金刚烷-二硫键-聚乙二醇、金刚烷-聚乙二醇-SP94、聚乙烯亚胺-β-环糊精、聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇和最终得到的多功能超分子运载系统的核磁共振氢谱如图1所示，最终产物聚乙烯亚胺-β-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-SP94)的核磁共振氢谱表明该化合物为一个整体，该图充分证明了本发明制备方法的可行性。
实施例1得到的多功能超分子运载系统的二维核欧沃豪斯效应谱如图2所示，图中横坐标位移1.0-2.0之间的吸收峰为金刚烷的亚甲基氢，纵坐标位移3.0-4.0之间的吸收峰为环糊精的亚甲基氢，二者之间有远程的相关，表明金刚烷分子是嵌入了环糊精的环中，该图进一步证实了制备方法的可行性。
实施例1得到的多功能超分子运载系统结合核酸(DNA或RNA)后形成的米微粒如图3所示，表明本发明多功能超分子运载系统能够有效结合核酸，形成类圆形的纳米微粒。
实施例1多功能超分子运载系统结合核酸后形成纳米微粒的粒径和表面电位分别如图4和图5所示，图中可见，结合核酸后粒径约为150纳米，表面电位为正；二硫苏糖醇氧化还原刺激后多功能超分子运载系统的粒径3较没有氧化还原刺激的粒径1更大，而聚乙烯亚胺-β-环糊精在氧化还原刺激前2和后4则没有类似差异；同样，二硫苏糖醇氧化还原刺激后多功能超分子运载系统的表面电位7较没有氧化还原刺激的表面电位5更正，而聚乙烯亚胺-β-环糊精在氧化还原刺激前6和后8则没有类似差异；由此表明本发明的多功能超分子运载系统具有氧化还原刺激敏感性，可在特殊的氧化还原环境中控制释放携带的物质。
实施例1多功能超分子运载系统携带荧光报告基因的核酸分子转染肝癌细胞后的荧光强度分布如图6所示，图中可见，无论含有靶向肽的多功能超分子运载系统12或不含有靶向肽的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇11，其携带荧光报告基因转染肿瘤细胞的效率均高于裸荧光报告基因转染的效率10(生理盐水处理9是阴性对照组)，由此表明本发明多功能超分子运载系统能够高效转染基因。
实施例1多功能超分子运载系统携带治疗基因处理肝癌细胞后的细胞活力曲线和划痕愈合能力试验结果分别如图7和图8。图中可见，无论含有靶向肽的多功能超分子运载系统d或不含有靶向肽的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇c，其携带治疗基因作用于肝癌细胞后，均能有效杀伤肝癌细胞，而生理盐水处理a和裸治疗基因处理b则杀伤作用弱；多功能超分子运载系统g携带治疗基因作用于肝癌细胞后，对细胞划痕愈合的抑制作用显著强于生理盐水e和裸治疗基因f，由此表明本发明多功能超分子运载系统能够携带治疗基因在体外能够有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞迁移。
实施例1还将生理盐水h、裸荧光基因i、不含有靶向肽的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带荧光基因的纳米微粒j、含有靶向肽的多功能超分子运载系统携带荧光基因的纳米微粒k分别自尾静脉注射进入肝癌荷瘤小鼠体内。通过小鼠体内的活体荧光失踪检测发现携带荧光基因的多功能超分子运载系统k能够有效靶向裸鼠体内肿瘤，上述含有靶向肽的多功能超分子运载系统携带荧光基因的纳米微粒o自尾静脉注射进入肝癌荷瘤小鼠体内，最终积聚在肿瘤组织内，而生理盐水l(阴性对照组)、裸荧光基因m、不含有靶向肽的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带荧光基因的纳米微粒n处理后最终没有在肿瘤组织中积聚，可证明本发明的多功能超分子运载系统具有肝癌靶向性，有应用于靶向治疗的可行性。
上述生理盐水p、裸治疗基因q、不含有靶向肽的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇携带裸基因的纳米微粒r、含有靶向肽的多功能超分子运载系统携带治疗基因的纳米微粒s治疗荷瘤裸鼠后的肿瘤生长曲线如图9所示，本发明运载系统携带荧光基因的纳米微粒s抑制体内肝癌生长效果显著优于生理盐水p、裸治疗基因q和携带裸基因的聚乙烯亚胺-β-环糊精/金刚烷-二硫键-聚乙二醇纳米微粒r，表明了本发明多功能超分子运载系统能够携带治疗基因靶向治疗荷瘤裸鼠体内肝癌。
实施例2：以聚乙烯亚胺-α-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-SP94)为例。
1)金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成
称取1克聚乙二醇单甲醚，溶解于30毫升二甲基亚砜中，加入1克N,N'-羰基二咪唑，在氮气保护下避光搅拌反应2小时。将反应液加入至体积为1升的乙醚：四氢呋喃＝2:1体积比的混合溶液中，冰浴静置1小时，过滤得到白色粉末。然后将全部白色粉末溶解于20ml二甲基亚砜中，称取1克胱胺二盐酸盐溶解于10毫升二甲基亚砜中，并加入1毫升三乙胺，搅拌4小时。
将白色粉末的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，滴加2小时，继续反应8小时。
反应完毕后，溶液在分子量2000透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质备用。称取50毫克金刚烷甲酸和50毫克CDI，溶解于20毫升二氯甲烷中，常温反应1小时。向其中加入500毫克前述备用白色粉末，继续搅拌反应2小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为200毫升的乙醚：四氢呋喃＝2:1体积比的混合溶液中，冰浴静置0.5小时，过滤得到白色粉末状物质，即金刚烷-二硫键-聚乙二醇。
2)金刚烷-聚乙二醇-SP94的合成
称取500毫克聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯溶解于20毫升二氯甲烷中，将其缓慢滴加至50毫克金刚烷胺的20毫升二氯甲烷溶液中，常温搅拌滴加1小时，继续搅拌反应0.5小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为500毫升的乙醚：四氢呋喃＝2:1体积比的混合溶液中，冰浴静置0.5小时，过滤得到白色粉末状物质，称取300毫克该化合物，和500毫克N,N'-羰基二咪唑溶解于20毫升二氯甲烷中，常温搅拌反应1小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为150毫升的乙醚：四氢呋喃＝2:1体积比的混合溶液中，冰浴静置0.5小时，过滤得到白色粉末状物质。将该白色粉末溶解在10毫升二甲基亚砜中，将其滴加至50毫克3,3'-二氨基二丙胺的20毫升二甲亚砜溶液中，常温滴加0.5小时，继续搅拌反应0.5小时。
反应完毕后，将溶液置于分子量2000的透析袋中透析6小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，称取50毫克该化合物，溶解于5毫升pH7.4的PBS溶液中，称取2.5毫克3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于2.5毫升无水乙醇中，将两溶液混合，常温搅拌0.5小时。再称取10毫克靶向多肽SP94溶解于2毫升pH7.4的PBS中，加入上述的反应液，常温反应1小时。反应完毕后，溶液在分子量2000的透析袋中透析6小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即金刚烷-聚乙二醇-SP94。
3)聚乙烯亚胺-α-环糊精的合成
称取1克α-环糊精和0.2克N,N'-羰基二咪唑溶解在10毫升二甲基亚砜中，加入1毫升三乙胺，在氮气保护和避光条件下，常温搅拌3小时。称取1克分子量600道尔顿的聚乙烯亚胺溶解在20毫升二甲基亚砜中，将活化的α-环糊精的二甲基亚砜溶液缓慢滴加到其中，滴加5小时，继续反应6小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-α-环糊精。
4)多功能超分子运载系统的自组装
称取50毫克聚乙烯亚胺-α-环糊精溶解于10毫升水中，25毫克金刚烷-二硫键-聚乙二醇溶解于5毫升水中，5毫克金刚烷-聚乙二醇-SP94溶解于5毫升水中，将三者混合，常温搅拌6小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析6小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-α-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-SP94)。
实施例3：以聚乙烯亚胺-γ-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-RGD)为例。
1)金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成
称取5克聚乙二醇单甲醚，溶解于200毫升二甲基亚砜中，加入3克N,N'-羰基二咪唑，在氮气保护下避光搅拌反应4小时。将反应液加入至体积为2升的乙醚：四氢呋喃＝10:1体积比的混合溶液中，冰浴静置4小时，过滤得到白色粉末。然后将全部白色粉末溶解于40ml二甲基亚砜中，称取10克胱胺二盐酸盐溶解于50毫升二甲基亚砜中，并加入10毫升三乙胺，搅拌2小时。将白色粉末的溶液缓慢滴加至胱胺二盐酸盐的溶液中，滴加3小时，继续反应5小时。
反应完毕后，溶液在分子量2000透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质备用。称取500毫克金刚烷甲酸和500毫克N,N'-羰基二咪唑，溶解于100毫升二氯甲烷中，常温反应2小时。向其中加入1.5克前述备用白色粉末，继续搅拌反应1小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为500毫升的乙醚：四氢呋喃＝10:1体积比的混合溶液中，冰浴静置1小时，过滤得到白色粉末状物质，即金刚烷-二硫键-聚乙二醇。
2)金刚烷-聚乙二醇-RGD的合成
称取1克聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯溶解于40毫升二氯甲烷中，将其缓慢滴加至300毫克金刚烷胺的20毫升二氯甲烷溶液中，常温搅拌滴加2小时，继续搅拌反应1小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为1升的乙醚：四氢呋喃＝10:1体积比的混合溶液中，冰浴静置1小时，过滤得到白色粉末状物质，称取600毫克该化合物，和2克N,N'-羰基二咪唑溶解于20毫升二氯甲烷中，常温搅拌反应2小时。
反应完毕后，将反应液加入至体积为300毫升的乙醚：四氢呋喃＝10:1体积比的混合溶液中，冰浴静置1时，过滤得到白色粉末状物质。将该白色粉末溶解在50毫升二甲基亚砜中，将其滴加至200毫克3,3'-二氨基二丙胺的50毫升二甲亚砜溶液中，常温滴加1小时，继续搅拌反应2小时。
反应完毕后，将溶液置于分子量2000的透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，称取100毫克该化合物，溶解于10毫升pH7.4的PBS溶液中，称取10毫克3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于10毫升无水乙醇中，将两溶液混合，常温搅拌1小时。再称取40毫克靶向多肽RGD溶解于10毫升pH7.4的PBS中，加入上述的反应液，常温反应4小时。反应完毕后，溶液在分子量2000的透析袋中透析8小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即金刚烷-聚乙二醇-RGD。
3)聚乙烯亚胺-γ-环糊精的合成
称取4克γ-环糊精和2克N,N'-羰基二咪唑溶解在50毫升二甲基亚砜中，加入6毫升三乙胺，在氮气保护和避光条件下，常温搅拌3小时。称取8克分子量2000道尔顿的聚乙烯亚胺溶解在100毫升二甲基亚砜中，将活化的γ-环糊精的二甲基亚砜溶液缓慢滴加到其中，滴加6小时，继续反应8小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析20小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-γ-环糊精。
4)多功能超分子运载系统的自组装
称取100毫克聚乙烯亚胺-γ-环糊精溶解于50毫升水中，200毫克金刚烷-二硫键-聚乙二醇溶解于100毫升水中，40毫克金刚烷-聚乙二醇-RGD溶解于40毫升水中，将三者混合，常温搅拌8小时。反应完毕后，溶液在分子量14000的透析袋中透析8小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即聚乙烯亚胺-γ-环糊精/(金刚烷-二硫键-聚乙二醇/金刚烷-聚乙二醇-RGD)。
由上述实施例可看出具有氧化还原敏感性、靶向肝癌的特异性、稿基因转染效率的多功能性，能够特异性地与肝癌细胞结合，增加了多功能超分子系统的肝癌靶向性，可用于肝脏恶性肿瘤的靶向治疗，具有突出显著的技术效果。
Claims (9)
1.一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统，其特征是主要由主体聚乙烯亚胺-环糊精以及分别装载在主体聚乙烯亚胺-环糊精上的客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇和客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽而形成的复合物。
2.根据权利要求1所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统，其特征是该复合物的具体结构式如下：
其中，n1、n2、n3分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇自组装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽自组装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数，m1、m2分别代表金刚烷-二硫键-聚乙二醇中聚乙二醇单元个数和金刚烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙二醇单元个数，x1、y1分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精中伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，x2、y2分别代表客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇中聚乙烯亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，x3、y3分别代表客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙烯亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量；n1、n2、n3、m1、m2、x1、x2、x3、y1、y2、y3均为大于0的整数。
3.根据权利要求1所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统，其特征是：所述的主体聚乙烯亚胺-环糊精是由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到，所述的客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇是由金刚烷通过二硫键与聚乙二醇结合制备得到。
4.根据权利要求1所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统，其特征是：所述的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽是由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶向肽制备得到。
5.一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法，其特征是：由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到聚乙烯亚胺-环糊精，由金刚烷通过二硫键与聚乙二醇结合制备得到金刚烷-二硫键-聚乙二醇，由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶向肽形成金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，再将三者按照1:0.5-2:0.5-2的摩尔比例混合，经自组装反应得到多功能超分子运载系统；其具体反应式如下：
A、金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成
B、金刚烷-聚乙二醇-靶向肽的合成
C、聚乙烯亚胺-环糊精的合成
D、多功能超分子运载系统的自组装
其中，反应式中，结构1是聚乙二醇，结构2是金刚烷甲酸，结构3是金刚烷-二硫键-聚乙二醇，结构4是金刚烷胺，结构5是金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，结构6是环糊精，结构7是聚乙烯亚胺-环糊精，结构8是目标产物多功能超分子基因运载系统，CDI是连接剂N,N’-二羰基咪唑的简称，SPDP是3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的简称，SP94是靶向肽的简称。
6.根据权利要求5所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法，其特征是：所述金刚烷-二硫键-聚乙二醇的合成采用以下具体方式：
1.1)将聚乙二醇溶解于足量的二甲基亚砜中，将加入至用足量二甲亚砜溶解、含有相对于聚乙二醇的0.5-1倍量的用于活化羟基的连接剂溶液中，在氮气保护下避光搅拌反应2-4小时；
1.2)将得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置1-4小时，过滤后再次溶解于足量的二甲基亚砜中；
1.3)称取相对于聚乙二醇1-2倍量的胱胺二盐酸盐溶解于足量的二甲基亚砜中，并加入相对于聚乙二醇1-2倍量的催化剂，搅拌1-4小时；
1.4)将上述步骤1.2)中所述过滤后的二甲亚砜溶液缓慢滴加至胱胺二盐酸盐溶液中，滴加2-5h，滴加后继续反应3-8h，反应完毕后溶液在透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质；
1.5)将相对于聚乙二醇0.05-0.1倍量的金刚烷甲酸和相对于聚乙二醇0.05-0.1倍量的用于活化羟基的连接剂，溶解于足量的二氯甲烷中，常温反应1-3h，向其中加入聚乙二醇0.225-0.5倍量上述步骤1.4)得到的白色粉末状物质，继续搅拌反应1-3h，将反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤得到金刚烷-二硫键-聚乙二醇。
7.根据权利要求5所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法，其特征是：所述的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽的合成采用以下具体方法：
2.1)将聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯溶解于足量的二氯甲烷中，将其缓慢滴加至用足量二氯甲烷溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯的0.1-0.3倍量的金刚烷胺溶液中，常温搅拌滴加1-3小时，继续搅拌反应0.5-2小时；
2.2)将上述步骤2.1)中得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤后混合到用足量二氯甲烷溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯1-2倍量的连接剂溶液中，常温搅拌反应1-3h；
2.3)将上述步骤2.2)中得到的反应液加入至足量的乙醚和四氢呋喃混合溶液中，其中乙醚和四氢呋喃体积比为2-10:1，冰浴静置0.5-2小时，过滤并再次溶解于足量二甲基亚砜中，将其滴加至用足量二甲亚砜溶解、含有相对于聚乙二醇琥珀酰亚胺单酯0.1-0.2倍量的3,3'-二氨基二丙胺的溶液中，常温滴加0.5-2h，继续搅拌反应0.5-2h；
2.4)反应完毕后的溶液在透析袋中透析6-24小时，然后冰冻干燥，获得白色粉末状物质；
2.5)将上述步骤2.4)中的白色粉末状物质再次溶解于足量的pH7.4的PBS溶液中，再加入到用足量无水乙醇溶解的、相对于步骤2.4)中白色粉末状物质0.05-0.1倍量的连接剂溶液中，常温搅拌0.5-2h，加入相对于步骤2.4)中白色粉末状物质0.2-0.4倍量的靶向肽加入反应液，常温反应1-4h，反应完毕后透析袋中透析6-12小时，然后冰冻干燥，得到金刚烷-聚乙二醇-靶向肽。
8.根据权利要求5所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法，其特征是：所述的聚乙烯亚胺-环糊精的合成采用以下具体方法：
3.1)将环糊精溶解于足量二甲基亚砜中配置环糊精溶液，再配置用足量二甲亚砜溶解、相对于环糊精0.2-0.5倍量的连接剂溶液，在氮气保护下于暗处将连接剂溶液加入环糊精溶液中，再加入相对于环糊精1-1.5倍量的催化剂；
3.2)将相对于环糊精1-2倍量的聚乙烯亚胺溶解于足量的二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处，将聚乙烯亚胺溶液滴加在步骤3.1)所述的环糊精溶液中，滴加4-6小时，滴加完毕后在常温下继续反应6-12小时，反应完毕后的溶液在透析袋中透析12-24小时，然后冰冻干燥，得到聚乙烯亚胺-环糊精。
9.根据权利要求5所述的一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法，其特征是：所述的多功能超分子运载系统的自组装是将聚乙烯亚胺-环糊精与相对于聚乙烯亚胺-环糊精0.5-2倍量的金刚烷-二硫键-聚乙二醇和0.1-0.4倍量的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽在水中混合，常温下搅拌反应6-12h后，溶液在透析袋中透析6-12h，然后冰冻干燥得到基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统。
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